檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及獸藥殘留檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是檢測蔬菜中吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]卩比蟲啉(imidacloprid),化學(xué)名稱1-(6_氯_3_卩比唆基甲基)-N-硝基亞咪唑烷-2-基胺。吡蟲啉具有廣譜殺蟲活性，對飛虱、蚜蟲、葉蟬等刺吸式口器害蟲有特效，對其他種類的害蟲也有良好的防治效果。吡蟲啉是蔬菜種植過程中常用的農(nóng)藥，對吡蟲啉殘留檢測成為國家對蔬菜類植物中農(nóng)藥殘留監(jiān)控的必要手段。日本規(guī)定吡蟲啉在蔬菜中的最高殘留限量(MRL)為0.5mg/kg。
[0003]酶聯(lián)免疫吸附法是一種準(zhǔn)確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大批樣品的快速篩選，近年來已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測行業(yè)。本發(fā)明旨在建立一種檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服色譜法的不足，本發(fā)明提供一種檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法。該方法靈敏、準(zhǔn)確、快速，操作簡便、特異性強(qiáng)，適用于大批樣品的快速檢測。
[0005]本發(fā)明檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括酶標(biāo)板、吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品、吡蟲啉抗體工作液、吡蟲啉酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液。
[0006]本發(fā)明檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備，包括以下步驟:酶標(biāo)板的制備、吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品的制備、批蟲啉抗體工作液的制備、批蟲啉酶標(biāo)二抗工作液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備、濃縮稀釋液的制備和濃縮洗滌液的制備。
[0007]其進(jìn)一步特征在于:所述的酶標(biāo)板經(jīng)由吡蟲啉抗原包被制備，具體步驟是將吡蟲啉半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到包被抗原，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將吡蟲啉包被抗原稀釋成1:40000比例，100 μ L/孔，37°C避光孵育2 h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，加入經(jīng)稀釋的濃縮洗滌液300 μ L/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，150 μ L/孔，37°C放置1.5 h，甩掉封閉液直接拍干，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25°C)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封于4°C條件下保存。
[0008]批蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為O mg/kg、0.1 mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg。
[0009]所述吡蟲啉抗體工作液是采用吡蟲啉人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1:60000比例制備。
[0010]所述吡蟲啉酶標(biāo)二抗工作液由酶標(biāo)二抗加稀釋液稀釋成1:2000比例，所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氣脲的梓檬酸-磷酸氣二鈉緩沖溶液，所述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液，所述終止液為2 mol/L的硫酸，所述濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，為0.1 mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，為含 0.5% 吐溫-20，0.1 mol/L 的 PBST，pH 值范圍 7.0-7.5 之間。
[0011]檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，基于抗原抗體的間接競爭酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理，該方法包括以下步驟:
(1)預(yù)處理待測樣品，即將待測試的樣品處理為液體樣品，或者用有機(jī)溶劑提取待測樣品，并將其復(fù)溶于樣品稀釋液中；
(2)將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20?25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；
(3)取包被有吡蟲啉抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μ L/孔到對應(yīng)的微孔中，加入吡蟲啉酶標(biāo)二抗工作液，50 μ L/孔，然后加入吡蟲啉抗體工作液，50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25 °C避光環(huán)境中反應(yīng)30 min ；
(4)小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液260μ L/孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10 S，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)；
(5)加入底物液A50 μ L/孔，底物液B 50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15?20 min ；
(6)加入終止液50μ L/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長450/630nm檢測，測定每孔吸光度值(請在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))；
(7)以的標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中吡蟲啉的含量。
[0012]其中，所述待測樣品用以下方法進(jìn)行預(yù)處理:
a、取20g樣品，經(jīng)組織搗碎勻漿后置于250 mL三角瓶內(nèi)；
b、加入40mL丙酮,超聲波提取30 min,加入16 g無水硫酸鈉，，震蕩潤旋I min ；
C、室溫離心4000r/min以上，1min ；
d.、取5ml上清液到離心管中，加入5 mL 二氯甲烷，在密封的容器里混合，震蕩渦旋Imin,室溫離心 4000r/min 以上，1min ；
e、取ImL上清液，加入ImL稀釋后的樣品稀釋液充分振蕩混合30 S，混勻待測。
[0013]本發(fā)明檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法的測定原理:樣品中的吡蟲啉與酶標(biāo)板上固定的抗原特異性競爭抗體，加入酶標(biāo)二抗，與抗體反應(yīng)，通過酶催化顯色劑顯色，根據(jù)顯色的深淺來判斷樣品中吡蟲啉的含量。如果樣品中的吡蟲啉含量少，顯色深；反之，則顯色淺。本發(fā)明的試劑盒檢測方法操作簡便，檢測靈敏、準(zhǔn)確、快速，適用于大批量樣品的快速檢測。
【具體實施方式】
[0014]吡蟲啉蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的制備:
采用琥珀酸酐法得到帶羧基的吡蟲啉半抗原衍生物，之后取0.05 mmol與載體蛋白BSA按10:1的結(jié)合比混合在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)中，然后加入0.15mmol碳二亞胺,攪拌置室溫反應(yīng)24 h,最后于0.2 mol/L pH 7.6的PBS緩沖液中透析兩天，除去未反應(yīng)的半抗原，將得到的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液于_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0015]吡蟲啉抗體的制備: 選用健康成年純種BALA/C小鼠，取與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備的免疫抗原50 μ g與等量完全弗氏佐劑混合采用腹腔注射進(jìn)行初次免疫，之后每隔3周用相同劑量免疫抗原加等量不完全弗氏佐劑采用腹腔注射進(jìn)行二次、三次免疫，每次免疫6天后尾靜脈采血測定抗血清效價至一定滴度后，用相同劑量不加佐劑進(jìn)行末次免疫，3天后取脾制備脾細(xì)胞懸浮液與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系進(jìn)行克隆化，選擇處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行凍存，用于腹水制備，先腹腔注射0.5 ml液體石蠟于BALB/C鼠致敏，2周后腹腔注射IXlO6個雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7-10天后可產(chǎn)生腹水，待腹水盡可能多時用注射器抽取腹水，反復(fù)收集數(shù)次，4000 rpm離心15 min,收集上清，采用辛酸-硫酸銨法純化腹水對單克隆抗體進(jìn)行純化，冷凍干燥得凍干粉后于-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0016]制備包被有吡蟲啉包被抗原的酶標(biāo)板:
包被抗原是將吡蟲啉半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到的，用0.05mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將吡蟲啉抗原稀釋成1:40000比例，100?/孔，37 °C放置2 h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μ?/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，150 μ?7孔，37°C放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25°C)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封后置4°C下保存。
[0017]批蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為O mg/kg、0.1 mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7mg/kg、8.1 mg/kg。
[0018]吡蟲啉抗體工作液的制備:采用吡蟲啉人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1:60000比例制備。
[0019]吡蟲啉酶標(biāo)二抗工作液由酶標(biāo)二抗加稀釋液稀釋成1:2000比例，底物液A為含有
0.5 m