一種檢測腫瘤標志物dkk1 濃度的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤診斷技術領域，特別涉及一種檢測腫瘤標志物DKK1濃度的酶聯(lián) 免疫試劑盒。
【背景技術】
[0002] 在全世界范圍內，肝細胞癌（HCC)是第六種最常見的惡性疾病和第二種與癌癥相 關的死因。而我國的肝細胞癌高風險人群，包括各種肝炎病毒長期攜帶者和肝硬化患者，高 達1. 5億。肝細胞癌的5年總生存率僅為3-5 %，這個極低的生存率的部分原因是因為缺乏 一種及時和有效的診斷，導致在確診肝細胞癌時已經(jīng)有60-70%的患者錯過了最佳治療時 機。
[0003] 上海市腫瘤研究所發(fā)現(xiàn)的血清蛋白DKK1，是一個比現(xiàn)有肝細胞癌診斷標志物甲胎 蛋白AFP性能更優(yōu)秀的標志物。該所的研究結果顯示，DKK1蛋白對肝細胞癌總體診斷的 靈敏度為69. 1%，特異度為90. 6% ;特別是對早期肝細胞癌和小肝癌的診斷靈敏度分別為 70. 9%和58. 5%，特異性分別為90. 5%和84. 7%。另外，DKK1蛋白能夠彌補AFP對肝細胞 癌診斷能力的不足，對甲胎蛋白陰性肝細胞癌的診斷靈敏度為70. 4%、特異度為90%。同 時，DKK1蛋白與AFP聯(lián)合應用，可將肝細胞癌總體診斷率提高至88%。因此迫切需要發(fā)展 一種能夠快速、準確和相對廉價地檢測DKK1蛋白的方法和產(chǎn)品，以便大規(guī)模地對肝細胞癌 進行普查，盡早診斷，提高患者的生存率和全民身體健康。
[0004] 對血清中DKK1濃度的檢測主要采用針對DKK1的抗體，利用抗原-抗體的特異性 反應，再加上特定的顯色基團對反應量進行測量。而不同的顯色基團和抗原-抗體反應的 載體決定了每種檢測方法的優(yōu)缺點。目前國內并沒有一種能夠高靈敏、高特異和相對廉價 地檢測血清DKK1蛋白的方法和試劑盒。中國專利CN101398433公布了一種基于時間分辨 熒光免疫分析方法的試劑盒，該方法需要用到大多數(shù)醫(yī)院并不配備的時間分辨熒光免疫分 析儀，并且該方法還需要用到較為昂貴的熒光標記物，不利于對DKK1的大規(guī)模普查。中國 專利CN102507951公布了一種聯(lián)合檢測腫瘤標志物的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，由包被有神經(jīng) 元特異性烯醇化物酶（NSE)、細胞角蛋白片段21-1(CYFRA21-1)和Dkkopf 1(DKK1)單克 隆抗體的多孔板，辣根過氧化物酶標的NSE、CYFRA21-1和DKK1，顯色底物TMB和底物終止 液組成；所述多孔板每孔包被NSE單克隆抗體l-4ug/ml ;每孔包被CYFRA21-1單克隆抗體 l-2ug/ml ;每孔包被DKK1單克隆抗體l-2ug/ml ;NSE、CYFRA21-1、DKK1三種檢測性抗體按 4:4:2比例加入多孔板孔中，總體積為lOOul ;該發(fā)明公布的試劑盒雖然可以同時檢測兩種 或三種腫瘤相關抗原，但由于分散了每種抗原的檢測精度及靈敏性，且針對DKK1抗原的檢 測僅采用了一種DKK1抗體，因而針對DKK1抗原的檢測精度難以滿足對腫瘤的快速、準確的 檢測。此外，國外雖然有檢測DKK1蛋白的酶聯(lián)免疫試劑盒（貨號DKK100, R&D Systems公 司，美國），但是其價格昂貴（~Y6000/試劑盒），不利于我國眾多肝細胞癌高風險人群對 DKK1大規(guī)模普查的需求。

【發(fā)明內容】

[0005] 為解決上述技術問題，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測腫瘤標志物DKK1濃度的 酶聯(lián)免疫試劑盒，以匹配自動分析系統(tǒng)實現(xiàn)快速、準確和相對廉價地用于大規(guī)模臨床檢驗 腫瘤標志物DKK1。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測腫瘤標志物DKK1濃度的酶聯(lián)免疫試劑盒的 制備方法及應用。
[0007] 為達到上述目的，本發(fā)明的技術方案如下：
[0008] -種檢測腫瘤標志物DKK1濃度的酶聯(lián)免疫試劑盒，由包被有DKK1單克隆抗體1 的多孔板、酶標記的DKK1單克隆抗體2、顯色底物和底物終止液組成；其中，DKK1單克隆抗 體1為10C3 ;DKK1單克隆抗體2為6E8 ;此處基于雙抗體夾心法的原理，包被抗體和檢測抗 體選用不同抗體。本發(fā)明總共測試了 8個不同的DKK1單克隆抗體，每兩兩配對為包被抗體 和檢測抗體，然后根據(jù)每組配對的靈敏性和特異性，選定我司與上海銳勁生物技術有限公 司合作生產(chǎn)的靈敏性和特異性均優(yōu)的10C3和6E8分別為包被抗體和檢測抗體。
[0009] 其中，所述酶標記的DKK1單克隆抗體2的保護液由pH = 7. 2的10mM磷酸鹽緩沖 液、0. 5%的牛血清白蛋白、0. 01 %的硫柳汞和50%甘油組成。
[0010] 其中，所述酶標記的DKK1單克隆抗體2的存貯條件為-20°C，且濃度大于100ug/ ml〇
[0011] 其中，所述酶標記的DKK1單克隆抗體2的工作濃度稀釋倍數(shù)為1:100-1:2500,優(yōu) 選 1 :400。
[0012] 其中，所述酶標記的DKK1單克隆抗體2所采用的酶為辣根過氧化物酶（HRP)，但不 僅限于HRP，以滿足優(yōu)異的酶標記效果為佳。
[0013] 基于上述結構的酶聯(lián)免疫試劑盒，本發(fā)明又提供了一種用于上述檢測腫瘤標志物 DKK1濃度的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，包括如下步驟：①制備包被有DKK1單克隆抗體1 的多孔板：用pH = 7-8的磷酸緩沖液將DKK1單克隆抗體1稀釋，然后將稀釋后的DKK1單克 隆抗體1溶液加入到多孔板的孔中，37°C孵育2小時；包被后用磷酸鹽緩沖液洗板拍干；用 5%牛血清白蛋白溶液加入到多孔板各孔，37°C封閉1小時；封閉后用磷酸鹽緩沖液洗板拍 干，將其保存于4°C。②制備酶標記的DKK1單克隆抗體2 :將5mg/ml的HRP (辣根過氧化物 酶）加入0. 2ml的0. 1M高碘酸鈉 NaI04溶液中，室溫避光攪拌20分鐘；將上述溶液對ImM pH4. 4的醋酸鈉緩沖液4°C透析過夜；透析后，加20 μ 1 0. 2M pH9. 5的碳酸鹽緩沖液，然后 立即加入10mg DKK1單克隆抗體2,室溫避光攪拌2小時；加入0. lml新配的4mg/ml NaBH4 溶液，混勻，4°C放置2小時；將上述溶液對10mM pH7. 2PBS緩沖液4°C透析過夜；在攪拌下 逐滴加入等體積飽和硫酸銨，4°C放置1小時；3000rpm離心半小時，棄上清；沉淀物用半飽 和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量10mM PH7. 2的PBS中；將上述溶液對酶標抗體保護 液4°C透析過夜，lOOOOrpm離心30分鐘去除沉淀后分裝冷凍保存。
[0014] 通過上述技術方案，本發(fā)明提供的一種檢測腫瘤標志物DKK1濃度的酶聯(lián)免疫試 劑盒，采用全國產(chǎn)化的試劑，包括優(yōu)質的DKK1單克隆抗體1及DKK1單克隆抗體2 (兩種抗體 均采購至上海銳勁生物技術有限公司，其中DKK1單克隆抗體1的型號為10C3，DKK1單克隆 抗體2的型號為6E8)，制造了與大多數(shù)醫(yī)院現(xiàn)有儀器相匹配的酶聯(lián)免疫試劑盒，實現(xiàn)了對 DKK1濃度極高靈敏、高特異和相對廉價的檢測，有利于大規(guī)模地對肝細胞癌進行普查，盡早 診斷，提高我國全民身體健康。
【附圖說明】
[0015] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使 用的附圖作簡單地介紹。
[0016] 圖1為本發(fā)明實施例所公開的酶聯(lián)免疫法檢測DKK1的原理示意圖；
[0017] 圖2為本發(fā)明實施例所公開的本發(fā)明與進口試劑盒的相關性示意圖。
【具體實施方式】
[0018] 下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完 整地描述。
[0019] 本發(fā)明中的抗體來源說明：作為包被抗體的DKK1單克隆抗體1為采購至上海銳勁 生物技術有限公司的型號為10C3的抗體，DKK1單克隆抗體2為采購至上海銳勁生物技術 有限公司的型號為6E8的抗體。
[0020] 實施例1 :
[0021] 基于圖1所示的酶聯(lián)免疫法檢測DKK1的原理示意圖，本發(fā)明提供了一種檢測腫 瘤標志物DKK1濃度的酶聯(lián)免疫試劑盒，由包被有DKK1單克隆抗體1的多孔板、酶標記的 DKK1單克隆抗體2、顯色底物（TMB)和底物終止液組成；其中，DKK1單克隆抗體1為10C3 ; DKK1單克隆抗體2為6E8 ;其中，所述酶標記的