檢測(cè)糞便中細(xì)菌dna的試劑盒及其在大腸癌診斷中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及疾病診斷領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)糞便中細(xì)菌DNA的試劑盒及其在大 腸癌的篩查、診斷或輔助診斷中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸癌在所有腫瘤發(fā)病率中排名第三。目前對(duì)大腸癌的診斷依賴于大腸鏡活檢。 然而大腸鏡活檢為有創(chuàng)性檢查，并不能大規(guī)模地用于人群篩查。理想的腫瘤篩查指標(biāo)應(yīng)具 有較高的敏感性和特異性，同時(shí)盡可能為無(wú)創(chuàng)性檢查。近年科研進(jìn)展提示大腸癌患者和正 常健康人的腸道菌群在分布上有顯著差異，腸道菌群可能參與了大腸癌的發(fā)生發(fā)展。如果 僅用受試者的糞便進(jìn)行分析，就能確定是否可能患有大腸癌，就能很好地對(duì)普通人群進(jìn)行 篩查，從而做到對(duì)大腸癌早發(fā)現(xiàn)早治療。因此，找到一種能無(wú)創(chuàng)性篩選診斷大腸癌的方法， 能盡早盡大可能地發(fā)現(xiàn)人群中的大腸癌患者，從而極大地增加人群的生存期，降低患者的 治療費(fèi)用。目前，已在臨床上應(yīng)用的無(wú)創(chuàng)性地篩查大腸癌的方法主要是：1)糞便隱血試驗(yàn) (F0BT):F0BT是目前最常用的大腸癌篩查方法，也是唯一一個(gè)有前瞻性隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)證明 有效的篩查方法。大腸癌組織或者大的腺瘤通常會(huì)滲出少量血液，血液進(jìn)入大便中被排出。 糞便隱血試驗(yàn)就可檢測(cè)大便中的少量血液成分。但糞便中帶有血液為非特異性表現(xiàn)，故 F0BT對(duì)本病的診斷并不具有特異性。而且有時(shí)單個(gè)糞便樣本并不能檢測(cè)到血液。2)血清癌 胚抗原CEA測(cè)定：1965年發(fā)現(xiàn)血清中檢測(cè)CEA篩查大腸癌的方法。在大腸癌患者血清中，可以 檢測(cè)到癌胚抗原CEA，這是一種糖蛋白，常出現(xiàn)于惡性腫瘤患者血清中，并非大腸癌的特異 性相關(guān)抗原，故血清CEA測(cè)定對(duì)本病的診斷不具有特異性。但用放射免疫法測(cè)定CEA，做定量 動(dòng)態(tài)觀察，對(duì)判定大腸癌的手術(shù)效果與檢測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)有一定意義。如大腸癌經(jīng)手術(shù)將腫瘤 完全切除后，血清CEA則逐漸下降；若復(fù)發(fā)，又可再度升高。然而在浸潤(rùn)性腫瘤中CEA的敏感 性低于35%，它也不能用于檢測(cè)早期大腸癌，特異性不夠，在許多病理中都有CEA水平的升 高。3)最近還發(fā)現(xiàn)CA19-9抗原，CA19-9是一種糖蛋白類的腫瘤標(biāo)記物，在消化道腫瘤患者的 血清中含量明顯升高。血清CA-19-9濃度與Duke分期呈正相關(guān)，隨著分期的升級(jí)濃度升高， 因此濃度的大小對(duì)于判斷大腸癌的預(yù)后有臨床應(yīng)用價(jià)值。但血清檢測(cè)CA19-9的陽(yáng)性率較 低，僅有22.39%，在各Duke分期中，血清與組織中CA19-9的陽(yáng)性率差異情況與CEA相同。 Duke A~Duke C期中，通過(guò)血清檢測(cè)CA19-9的陽(yáng)性率均明顯低于術(shù)后組織，尤其是在Duke A期患者，檢測(cè)血清CA19-9的結(jié)果為陰性。CA19-9對(duì)大腸癌的早期診斷價(jià)值不高，但對(duì)結(jié)直 腸的療效觀察和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)具有重要臨床意義。4)CA50以脂或脂蛋白結(jié)合的形式存在于細(xì)胞 膜，屬于鞘糖脂類標(biāo)記物，是胰腺和大腸癌的標(biāo)記物，特異性不夠。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)糞便中細(xì)菌DNA的試劑盒及 其在大腸癌的篩查、診斷或輔助診斷中的應(yīng)用，技術(shù)方案如下：
[0004] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)糞便中細(xì)菌DNA的試劑盒，試劑盒包括以16S rDNA的V1-V3 可變區(qū)設(shè)計(jì)并帶有5'-454A、B接頭-特異引物-3'的通用融合引物
[0005] 27F 57-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-37
[0006] 533R 57-TTACCGC GGCTGCTGGCAC-37 ,
[0007] 上述試劑盒通過(guò)16S rDNA測(cè)序得到運(yùn)算分類單位，可不經(jīng)過(guò)與已知微生物種屬的 比對(duì)與合并，直接采用貝葉斯DMNB文本算法預(yù)測(cè)大腸癌。
[0008] 本發(fā)明還提供了上述試劑盒在大腸癌的篩查、診斷或輔助診斷中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)糞便中細(xì)菌DNA的試劑盒在大腸癌的篩查、診斷或輔助 診斷中的應(yīng)用，包括以下步驟：
[0010] 步驟1、提供取自受試者的糞便樣品；
[0011] 步驟2、對(duì)步驟1中的糞便樣品進(jìn)行糞便細(xì)菌基因組抽提；
[0012] 步驟3、以16S rDNA的V1-V3可變區(qū)設(shè)計(jì)并合成帶有5'-454A、B接頭-特異引物-3' 的通用融合引物
[0013] 27F 57-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-37
[0014] 533R 57-TTACCGC GGCTGCTGGCAC-37 ,
[0015] 對(duì)步驟2中得到的糞便細(xì)菌基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序獲得測(cè)序數(shù)據(jù)；
[0016] 步驟4、優(yōu)化步驟3中得到的測(cè)序數(shù)據(jù)獲得優(yōu)化序列；
[0017] 步驟5、將步驟4中得到的優(yōu)化序列進(jìn)行0TU聚類分析；0TU( Operat ional Taxonomic Units，運(yùn)算分類單位)是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn) 行分析，人為給某一個(gè)分類單元（品系，種，屬，分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志，在生物信息分析 中，一般來(lái)說(shuō)，測(cè)序得到的每一條序列來(lái)自一個(gè)菌，要了解一個(gè)樣品測(cè)序結(jié)果中的菌種、菌 屬等數(shù)目信息，就需要對(duì)序列進(jìn)行歸類操作(cluster)，通過(guò)歸類操作，將序列按照彼此的 相似性分歸為許多小組，一個(gè)小組就是一個(gè)0TU，根據(jù)指定的相似度例如96%、97%或者 98%，對(duì)所有序列進(jìn)行0TU劃分并進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析；
[0018] 步驟6、將步驟5中得到的0TU采用貝葉斯網(wǎng)狀算法、貝葉斯DMNB文本算法或隨機(jī)森 林算法中的一種進(jìn)行分析；
[0019] 步驟7、由分類器預(yù)測(cè)受試者是否為大腸癌類別。
[0020] 進(jìn)一步地，上述步驟3中使用的測(cè)序方法為菌類16s測(cè)序法或基因組DNA測(cè)序法。
[0021] 進(jìn)一步地，上述步驟4中，將步驟3中得到的測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)初級(jí)除雜得到有效序列， 再精確去雜，得到優(yōu)化序列。
[0022]進(jìn)一步地，上述步驟5中，按照97%的相似度將優(yōu)化序列進(jìn)行0TU聚類分析。
[0023] 進(jìn)一步地，上述步驟6中，采用貝葉斯DMNB文本算法對(duì)步驟5中得到的OUT進(jìn)行分 析。
[0024]進(jìn)一步地，對(duì)于上述應(yīng)用中的0TU聚類分析，用分類后未合并的0TU結(jié)果比合并后 的0TU結(jié)果能更好地預(yù)測(cè)大腸癌。在0TU聚類之后，會(huì)和SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，某個(gè)0TU對(duì)應(yīng)何種 菌，有可能幾個(gè)0TU如0TU1，0TU188，0TU19657對(duì)應(yīng)的都是同一個(gè)菌如具核梭桿菌，合并是指 將這幾個(gè)0TU都?xì)w納為一個(gè)，未合并就是還是按三個(gè)變量算。
[0025] 進(jìn)一步地，大腸癌為結(jié)腸癌和/或直腸癌。
[0026] 本發(fā)明的第一方面是基于以往未認(rèn)識(shí)到的事實(shí)，即取自普通人群的糞便標(biāo)本即可 作為大腸癌篩選的樣品。更具體地，本發(fā)明第一次指出用WEKA平臺(tái)中的貝葉斯DMNB文本算 法可以很好的預(yù)測(cè)樣品是否為大腸癌類別。更具體地，本發(fā)明第一次指出用未合并的οτυ結(jié) 果比用合并后的0TU結(jié)果能更好地預(yù)測(cè)是否為大腸癌類別?；谝约S便細(xì)菌種類和豐度特 征判斷是否為大腸癌類別有若干優(yōu)點(diǎn)。與目前已應(yīng)用于臨床的無(wú)創(chuàng)性篩查大腸癌方法相 比，用糞便細(xì)菌種類和豐度特征預(yù)測(cè)大腸癌的特異性和敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他方法。我們發(fā) 現(xiàn)用貝葉斯DMNB文本算法分析未合并的腸菌0TU數(shù)據(jù)，其預(yù)測(cè)大腸癌的AUC高達(dá)0.994,遠(yuǎn)遠(yuǎn) 高于糞便隱血試驗(yàn)的AUC 0.633。網(wǎng)狀貝葉斯和隨機(jī)森林分類方法的AUC也在0.9以上，高于 糞便隱血試驗(yàn)，但是低于我們所發(fā)現(xiàn)的貝葉斯DMNB文本算法。表明用糞便細(xì)菌種類和豐度 特征對(duì)預(yù)測(cè)大腸癌有很好的敏感性和特異性。因此，用糞便腸菌基因組測(cè)序結(jié)果來(lái)篩查大 腸癌，可以大大地提高診斷的敏感性和特異性，大大地減少漏診率，能很好的有助于判斷受 試者是否需要進(jìn)一步的結(jié)腸鏡檢查。
[0027] 以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以充分說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)特征和 技術(shù)效果。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1示出了本發(fā)明較優(yōu)實(shí)施例中的測(cè)序及統(tǒng)計(jì)分析流程圖；
[0029]圖2示出了貝葉斯網(wǎng)狀算法、貝葉斯DMNB文本算法和隨機(jī)森林算法三種算法預(yù)測(cè) 人群A(N=141例)里大腸癌類別的準(zhǔn)確率，用R0C曲線下面積(AUC)表示；
[0030]圖3a示出了用人群A的0TU分類后合并前（未合并）的0TU結(jié)果比合并的0TU結(jié)果能 更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)大腸癌；圖3b示出了貝葉斯DMNB文本算法利用人群A的0TU結(jié)果合并前后兩組 數(shù)據(jù)分別預(yù)測(cè)大腸癌類別的R0C曲線圖；AUC的最高值來(lái)源于0TU結(jié)果合并前的貝葉斯DMNB 文本算法，達(dá)到0.994，合并后的AUC為0.943;
[0031]圖4示出了貝葉斯網(wǎng)狀算法(AUC = 0.93)和隨機(jī)森林算法(AUC = 0.94)預(yù)測(cè)人群A 里大腸癌類別的ROC曲線圖，糞便隱血試驗(yàn)的準(zhǔn)確率作為對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述。
[0033] 1、病人和組織樣本
[0034] 1)人群A:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院2012年1月1日至2012年7月30日期間 行電子全結(jié)腸鏡檢查及大腸癌手術(shù)患者的糞便標(biāo)本。
[0035] 納入標(biāo)準(zhǔn)為：
[0036] (1)年齡 2 50歲；
[0037] (2)具有正常的結(jié)腸運(yùn)動(dòng)節(jié)律，排便頻率不多于1天2次，不少于2天1次；
[0038] (3)全結(jié)腸鏡檢查由經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)生按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范操作，且退鏡時(shí)間充分。
[0039] 排除標(biāo)準(zhǔn)為：
[0040] (1)既往有大腸腺瘤、大腸癌、腸易激綜合征（IBS)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)或克羅恩病 (CD)病史；
[0041 ] (2)既往有消化道手術(shù)史，包括胃、膽道、腸道等；
[0042] (3)遺傳性大腸癌高危人群，指來(lái)自以下多種疾病家系成員：胃腸道腫瘤家族史； 家族性腺瘤性息肉病(FAP)、遺傳性非息肉病性大腸癌(HNPCC)以及P-J綜合征等；
[0043 ] (4)伴有心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、血液系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)疾??；
[0044] (5)伴有肝腎功能損害、肝硬化及門(mén)脈高壓性胃病；
[0045] (6)6個(gè)月內(nèi)應(yīng)用過(guò)抗生素、阿司匹林等非留體抗炎藥(NSAIDs)、炎皮質(zhì)激素類藥 物、促胃腸動(dòng)力藥以及調(diào)整腸道菌群的藥物；
[0046] (7)6個(gè)月內(nèi)接受過(guò)系統(tǒng)性的放療或化療。
[0047]我們將符合上述條件，經(jīng)全結(jié)腸鏡及病理證實(shí)為大腸癌者納入結(jié)直腸癌組（CRC 組），而經(jīng)腸鏡證實(shí)無(wú)明顯異常表現(xiàn)者納入正常對(duì)照組(negative control，NC)組。共收集 糞便標(biāo)本141例，其中包括NC組99例和CRC組42例。
[0048] 2、糞便細(xì)菌基因組抽提
[0049]使用OMEGAS便基因組DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.Stool DNA Kit):
[0050] (1)稱取200mg的玻璃珠 (glass beads)于2ml離心管中，加入200mg奠便樣品，再加 入700μ1緩沖液SP1，用最大速度渦旋3~5min，充分溶解樣品；
[00511 (2)加入100μΙ DS緩沖液渦旋混和；
[0052] (3) 70 °C水浴鍋溫育1 Omin，在此期間渦旋2次；
[0053] (4)室溫下離心3，000rpmX 3min，取400μ1上清液于一個(gè)新的2ml離心管中并加入 500μ1 SP2,渦旋充分混勻；
[0054] (5)冰浴5min，4°C離心，14,000rpmX 3min，轉(zhuǎn)移上清于一個(gè)新的2ml離心管中并加 入〇. 7倍體積異丙醇，顛倒混勻20~30次，一20°C放置lh;
[0055] (6)4°C離心，14,000rpmX10m