單管聯(lián)合測定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點的試劑盒及測定方法
【專利摘要】單管聯(lián)合測定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點的試劑盒及其測定方法，屬于分子生物學(xué)檢驗領(lǐng)域。所述試劑盒包括：全血基因組DNA提取試劑、多重PCR擴(kuò)增引物、多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑、單鏈DNA分離和純化試劑、焦磷酸測序引物、焦磷酸測序試劑和盒體。所述方法：人類全血基因組DNA提取；多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)；單鏈DNA樣本分離和純化；焦磷酸測序與結(jié)果分析。用途：希望了解個體對乙醇和葉酸代謝能力情況的健康體檢者；預(yù)測個體對硝酸甘油代謝能力和療效，指導(dǎo)心?；颊吆侠磉x擇和備用血管舒張急救藥物；預(yù)測個體對葉酸的代謝能力，指導(dǎo)孕產(chǎn)婦和兒童補(bǔ)充適合劑量的葉酸補(bǔ)充劑等。
【專利說明】單管聯(lián)合測定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點的試劑盒及測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢驗領(lǐng)域，尤其是涉及一種單管聯(lián)合測定乙醛脫氫酶2(ALDH2)基因與亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因突變位點的試劑盒和方法。該技術(shù)可應(yīng)用到臨床的檢測，流行病學(xué)的篩查以及種群基因組差異的研究。尤其是其可應(yīng)用于臨床體檢與藥物基因組學(xué)檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著高通量測序的普及以及人類基因組計劃的完成，個體化診療技術(shù)正逐步邁向日常臨床診斷與治療工作，并正逐漸影響著臨床診療思維和個人健康管理的方式。單核苷酸多態(tài)性分析(SNP)是個體化診療的重要組成部分，目前主要應(yīng)用于患者的藥物基因組學(xué)檢測中，對患者的用藥劑量與用藥周期進(jìn)行指導(dǎo)。實際上，SNP分析不僅僅能作為有效的藥物基因組學(xué)標(biāo)志物，其亦可作為一種優(yōu)良的疾病篩查與防治標(biāo)志物在體檢中進(jìn)行應(yīng)用。
[0003]1、ALDH2基因的臨床研究進(jìn)展
[0004]乙醛脫氫酶ALDH是酒精代謝中將乙醛轉(zhuǎn)化為乙酸的關(guān)鍵酶，位于12號染色體的ALDH2基因是線粒體乙醛脫氫酶的主要編碼基因。當(dāng)ALDH2基因發(fā)生錯意SNP突變時，其編碼合成的ALDH酶活性將發(fā)生不同程度的降低。ALDH酶活性的降低將引起機(jī)體對乙醛代謝能力的下降，導(dǎo)致大量攝入酒精后血清乙醛濃度的急劇升高，最終導(dǎo)致對肝臟功能的急性損害，并與肝臟、胃、食管等消化系統(tǒng)癌癥的發(fā)生相關(guān)[1_4]。同時，ALDH酶已被證明在重要的急性心血管藥物一硝酸甘油的代謝活化通路中扮演著重要的角色，其活性的降低乃至喪失將引起硝酸甘油的療效降低甚至完全失效[5]。根據(jù)美國國立生物信息技術(shù)中心NCBI數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，ALDH2基因的Glu504Lys突變在中國人群中所占比例高達(dá)30%，為中國人群最常見的ALDH2點突變。近年來研究還表明，該突變可能與漢族人群中的二型糖尿病和冠心病的發(fā)病相關(guān)。
[0005]2、MTHFR基因的臨床研究進(jìn)展
[0006]亞甲基四氫葉酸還原酶MTHFR是葉酸代謝中的關(guān)鍵酶之一，可將還原型輔酶I (NADPH)相關(guān)的5，10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸。前者生物學(xué)作用為細(xì)胞內(nèi)一碳基團(tuán)的傳遞體，參與嘌呤和嘧啶的合成及DNA修復(fù)過程；而5-甲基四氫葉酸作為甲基供體，在甲硫氨酸合成酶的催化下將甲基基團(tuán)提供給同型半胱氨酸生成蛋氨酸，并進(jìn)一步復(fù)甲基化為S-腺苷甲硫氨酸，而參與體內(nèi)廣泛的甲基化反應(yīng)。當(dāng)MTHFR基因發(fā)生SNP錯意突變時，其活性下降將導(dǎo)致體內(nèi)葉酸代謝過程障礙從而引發(fā)多種疾病，包括導(dǎo)致唐氏綜合征風(fēng)險增高和新生兒發(fā)育異常[8_1CI]，伴高同型半胱氨酸血癥的梗阻性腦卒中[11]，還與深靜脈血栓的發(fā)生密切相關(guān)[12]。根據(jù)美國國立生物信息技術(shù)中心NCBI數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，MTHFR基因的C677T單核苷酸SNP多態(tài)性在中國人群中最為普遍，漢族人口攜帶者比率約為27%-46%。
[0007]3、焦磷酸測序方法學(xué)的優(yōu)點[0008]目前，對于單核苷酸多態(tài)性SNP的檢測技術(shù)主要包括基于等位基因特異性雜交的Taqman探針技術(shù)，分子信標(biāo)技術(shù)等；基于核酸內(nèi)切酶的限制性長度多態(tài)性技術(shù)，引物入侵分析技術(shù)等；基于高度特異性DNA連接酶的寡核苷酸連接分析技術(shù)；基于引物延伸的直接測序法和等位基因特異性延伸法等。但這些方法大多操作復(fù)雜，成本昂貴，因而沒有在大規(guī)模SNP檢測中得到應(yīng)用。焦磷酸測序法由于其良好的定量性能，無需電泳或熒光標(biāo)記，易于自動化等優(yōu)點已成為SNP檢測最主要的方法。但是，由于以往的焦磷酸測序中各個位點的擴(kuò)增反應(yīng)需要單獨進(jìn)行，這意味著需要檢測的項目有幾個突變位點，則需要相應(yīng)數(shù)量的擴(kuò)增反應(yīng)。這無形中大大的提高了焦磷酸測序檢測作為臨床檢測的成本和價格，被動地將大量需要進(jìn)行該檢測的患者拒之門外。本發(fā)明將ALDH2基因與MTHFR基因兩個突變點進(jìn)行單管的多位點擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行焦磷酸測序的檢測，降低了檢測的成本、簡化了技術(shù)流程，從而降低了檢測的費(fèi)用與成本，降低了個體化醫(yī)學(xué)的門檻。
[0009]參考文獻(xiàn):
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[0016]7、江春曉，陳玉國，張運(yùn)，徐峰，張鶴，薛麗.中國漢族冠心病患者乙醛脫氫酶2基因多態(tài)性與2型糖尿病的關(guān)系.中國老年學(xué)雜志，2007，27 (4):349_350。
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0022]本發(fā)明的第一目的在于提供一種單管聯(lián)合測定乙醛脫氫酶2 (ALDH2)基因與亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因突變位點的試劑盒。
[0023]本發(fā)明的第二目的在于提供一種單管聯(lián)合測定乙醛脫氫酶2 (ALDH2)基因與亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因突變位點的方法。
[0024]所述單管聯(lián)合測定乙醛脫氫酶2 (ALDH2)基因與亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因突變位點的試劑盒包括:
[0025](I)全血基因組DNA提取試劑:所述全血基因組DNA提取試劑來源于商品化的血液基因組提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司，主要成分有緩沖液GD、緩沖液GB、蛋白酶K、吸附柱CB3、漂洗液PW和洗脫緩沖液TB等。
[0026](2)多重PCR擴(kuò)增引物:所述多重PCR擴(kuò)增引物包括:`[0027]PCR 引物 I (Seq N01):
[0028]ALDH2Glu504Lys (rs671)上游引物 5，-CAGTCACCCTTTGGTGGCTACA-3，；
[0029]PCR 引物 2 (Seq N02):
[0030]ALDH2Glu504Lys (rs671)下游引物 5，-CCAGCAGGTCCCACACTCAC-3，；
[0031]PCR 引物 3 (Seq N03):
[0032]MTHFR C677T (rsl801133)上游引物 5’ -GGCTGACCTGAAGCACTTGAA-3’ ；
[0033]PCR 引物 4 (Seq N04):
[0034]MTHFR C677T (rsl801133)下游引物 5，-CAAGTGATGCCCATGTCGGT-3，。
[0035]其中引物I和引物3的5’端均進(jìn)行生物素標(biāo)記。
[0036](3)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑:所述多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑名為“2X PyroMark PCRMaster Mix”，來自德國QIAGEN公司的PyroMark PCR Kit試劑盒。具體成分主要包括熱啟動TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs、鎂離子Mg2+、鈉離子Na+以及擴(kuò)增反應(yīng)特異性增強(qiáng)劑Q-Solution。
[0037](4)單鏈DNA分離和純化試劑:所述單鏈DNA分離和純化試劑，主要包括購自美國通用健康公司GE Healthcare的高性能鏈霉親和素瓊脂糖和購自德國QIAGEN公司的PyroMark結(jié)合緩沖液、PyroMark變性溶液和PyroMark洗脫緩沖液IOX濃縮液。
[0038](5)焦磷酸測序引物:所述焦磷酸測序引物包括:[0039]測序引物I (Seq N05):
[0040]ALDH2Glu504Lys (rs671)測序引物 5，-CACACTCACAGTTTTCACTT-3，；
[0041]測序引物2 (Seq N06):
[0042]MTHFR C677T (rsl801133)測序引物 5’ -TGCGTGATGATGAAAT-3’。
[0043](6)焦磷酸測序試劑:所述焦磷酸測序試劑為DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑，購自德國QIAGEN公司，主要包括PyroMark退火緩沖液、酶復(fù)合物、底物復(fù)合物和脫氧核糖核苷三磷酸復(fù)合物dNTP，其中dATP為人工修飾的α -硫代脫氧腺苷三磷酸，其余脫氧胞苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸、脫氧胸苷三磷酸未修飾；所述酶復(fù)合物包括焦磷酸測序所有需要的酶，即DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、腺苷三磷酸雙磷酸酶；所述底物復(fù)合物為腺苷-5’-磷酸硫酸酐。
[0044](7 )盒體:全血基因組DNA提取試劑、多重PCR擴(kuò)增引物、多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑、單鏈DNA分離和純化試劑、焦磷酸測序引物、焦磷酸測序試劑設(shè)在盒體內(nèi)。
[0045]所述單管聯(lián)合測定乙醛脫氫酶2 (ALDH2)基因與亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因突變位點的方法，采用所述單管聯(lián)合測定乙醛脫氫酶2 (ALDH2)與亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因突變位點的試劑盒，包括如下步驟:
[0046](I)人類全血基因組DNA提取:采用所述單管聯(lián)合測定乙醛脫氫酶2 (ALDH2)基因與亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因突變位點試劑盒的全血基因組DNA提取部分試劑，包括利用緩沖液GB和蛋白酶K溶解外周血白細(xì)胞，緩沖液GD和漂洗液PW去除蛋白成分，最后以洗脫液TB洗脫得到DNA成分，整個提取反應(yīng)以吸附柱CB3為DNA與細(xì)胞碎片和DNA與蛋白質(zhì)分離的介質(zhì)。
[0047](2)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng):采用所述單管聯(lián)合測定乙醛脫氫酶2 (ALDH2)基因與亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因突變位點試劑盒的多重PCR引物和多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑，具體的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如表1和表2所示。
[0048]表1多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
[0049]
【權(quán)利要求】
1.單管聯(lián)合測定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點的試劑盒，其特征在于包括: (I1)全血基因組DNA提取試劑:所述全血基因組DNA提取試劑來源于商品化的血液基因組提取試劑盒，主要成分有緩沖液GD、緩沖液GB、蛋白酶K、吸附柱CB3、漂洗液PW和洗脫緩沖液TB ； (2 )多重PCR擴(kuò)增引物:所述多重PCR擴(kuò)增引物包括: PCR 引物 I (Seq NOl):
ALDH2Glu504Lys (rs671)上游引物 5’ -CAGTCACCCTTTGGTGGCTACA-3’ ； PCR 引物 2 (Seq N02):
ALDH2Glu504Lys (rs671)下游引物 5’ -CCAGCAGGTCCCACACTCAC-3’ ； PCR 引物 3 (Seq N03):
MTHFR C677T (rsl801133)上游引物 5’ -GGCTGACCTGAAGCACTTGAA-3’ ； PCR 引物 4 (Seq N04):
MTHFR C677T (rsl801133)下游引物 5’ -CAAGTGATGCCCATGTCGGT-3’ ； 其中引物I和引物3的5’端均進(jìn)行生物素標(biāo)記； (3)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑:所述多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑名為“2XPyroMark PCRMaster Mix”,具體成分包括熱啟動TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs、鎂離子Mg2+、鈉離子Na+以及擴(kuò)增反應(yīng)特異性增強(qiáng)劑Q-Solution ； (4)單鏈DNA分離和純化試劑:所述單鏈DNA分離和純化試劑，包括鏈霉親和素瓊脂糖、PyroMark結(jié)合緩沖液、PyroMark變性溶液和PyroMark洗脫緩沖液IOX濃縮液； (5)焦磷酸測序引物:所述焦磷酸測序引物包括: 測序引物I (Seq N05):
ALDH2Glu504Lys (rs671)測序引物 5’ -CACACTCACAGTTTTCACTT-3’ ； 測序引物2 (Seq N06):
MTHFR C677T (rsl801133)測序引物 5’ -TGCGTGATGATGAAAT-3’ ； (6)焦磷酸測序試劑:所述焦磷酸測序試劑為DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑，包括PyroMark退火緩沖液、酶復(fù)合物、底物復(fù)合物和脫氧核糖核苷三磷酸復(fù)合物dNTP，其中dATP為人工修飾的α -硫代脫氧腺苷三磷酸，其余脫氧胞苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸、脫氧胸苷三磷酸未修飾；所述酶復(fù)合物包括焦磷酸測序所有需要的酶，即DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、腺苷三磷酸雙磷酸酶；所述底物復(fù)合物為腺苷_5’ -磷酸硫酸酐； (7)盒體:全血基因組DNA提取試劑、多重PCR擴(kuò)增引物、多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑、單鏈DNA分離和純化試劑、焦磷酸測序引物、焦磷酸測序試劑設(shè)在盒體內(nèi)。
2.單管聯(lián)合測定乙醛脫氫酶2與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點的方法，其特征在于采用如權(quán)利要求1所述單管聯(lián)合測定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點的試劑盒，包括如下步驟: (I)人類全血基因組DNA提取:采用所述單管聯(lián)合測定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點試劑盒的全血基因組DNA提取部分試劑，包括利用緩沖液GB和蛋白酶K溶解外周血白細(xì)胞，緩沖液GD和漂洗液PW去除蛋白成分，最后以洗脫液TB洗脫得到DNA成分，整個提取反應(yīng)以吸附柱CB3為DNA與細(xì)胞碎片和DNA與蛋白質(zhì)分離的介質(zhì)；(2)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng):采用所述單管聯(lián)合測定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點試劑盒的多重PCR引物和多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑，具體的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如表1和表2所示； 表1多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
【文檔編號】C12Q1/68GK103834733SQ201410067910
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月27日
【發(fā)明者】葉輝銘, 蘇曉崧, 張忠英 申請人:廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院, 葉輝銘