一種基于fret探針熔解曲線法檢測aldh2基因多態(tài)性的試劑盒及方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于體外核酸檢測領域，特別涉及一種基于FRET探針熔解曲線法檢測 ALDH2基因多態(tài)性的試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人乙醛脫氫酶2 (ALDH 2)是乙醇代謝途徑中最重要的酶之一，其編碼基因ALDH2 具有高度的多態(tài)性。在亞洲的黃種人群中，ALDH2是頻率最高且最重要的突變型。最近的研 究顯示，ALDH2能在一定程度上抑制其攜帶者對酒精的依賴，并與酗酒導致的酒精性中毒、 酒精性肝病、上消化道癌及胃癌等疾病之間存在深刻的聯(lián)系。
[0003] ALDH2基因突變使乙醛脫氫酶活性也降低10倍以上，使酒精在體內(nèi)從乙醇一乙醛 -乙酸一水、二氧化碳的代謝過程受阻，大量乙醛滯留在體內(nèi)，給身體造成傷害。ALDH2基 因正常的人，能及時將酒精完全分解為水和二氧化碳；對于這些人，適度飲酒有利于健康。 ALDH2基因突變的人，不能快速的完成酒精代謝過程，導致乙醛在體內(nèi)堆積，對人的肝、腎、 心、腦造成嚴重傷害。這些人如果飲酒不當，將會對身體造成嚴重損害。在中國人中，約 30% -50 %的人為ALDH2基因異常人群。
[0004] ALDH2基因多態(tài)性不僅與酒精在人體內(nèi)的分解代謝有關(guān)，還參與硝酸甘油的代謝。 舌下含服硝酸甘油片是抗冠心病心絞痛急性發(fā)作的常規(guī)首選方法，但該藥的臨床有效性常 因人而異，有些患者服用之后并無療效。研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)的ALDH2具有硝酸酯酶活性，是 硝酸甘油的有效代謝物一氧化氮形成的關(guān)鍵，如果病人基因中攜帶有ALDH2突變，乙醛脫 氫酶2的硝酸酯酶活性會降低10倍以上，使硝酸甘油無法產(chǎn)生一氧化氮，難以發(fā)揮藥效。因 此，檢測ALDH2基因型為醫(yī)生合理使用硝酸甘油提供有力參考，減少用藥無效導致的意外 死亡。
[0005] 檢測ALDH2基因多態(tài)性，不僅能夠指導人們根據(jù)自己的基因型正確飲酒，從而減 少酒精引起的身體傷害，真正做到健康飲酒；還可以幫助醫(yī)生篩查患者是否適合服用硝酸 甘油。在臨床上具有重要的檢測意義。
[0006] 基因多態(tài)性檢測方法已經(jīng)日趨成熟，目前應用比較廣泛的技術(shù)平臺有以下幾種： 首先是傳統(tǒng)的RFLP (限制性片段長度多態(tài)性）法，通過特定限制性內(nèi)切酶識別特異的序列， 通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果即可分析基因多態(tài)性，此方法成本較低，使用普通的儀器即可完 成實驗，但是操作繁瑣，開蓋操作較容易造成氣溶膠污染，并且酶切不完全往往被誤判為雜 合子，特異性較差。第二種方法是作為"金標準"的基因測序，測序結(jié)果直觀明了，并且具有 較高的特異性，但是因為測序儀器較昂貴，無法普及。基于Taqman探針擴增曲線法，能夠有 效避免開蓋污染的問題，同時檢測儀器在眾多高校、醫(yī)院等科研醫(yī)療單位均已普及，不過特 異性不夠理想，很容易產(chǎn)生非特異信號，優(yōu)化難度較高，檢測結(jié)果受樣本質(zhì)量影響較大。使 用MGB修飾的探針，能夠解決特異性的問題，但是合成成本較高，并且合成途徑受到限制。
[0007] 故現(xiàn)有技術(shù)有待改進和發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性好，靈敏度高，通過儀器讀取的TM值 即可直觀明了地判讀結(jié)果的基于FRET探針熔解曲線法檢測ALDH2基因多態(tài)性的試劑盒及 方法。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種基于FRET探針熔解曲線法檢測ALDH2基因多態(tài)性 的試劑盒，包括特異擴增基因ALDH2(rs671)位點的正向引物和反向引物，以及一對特異區(qū) 分基因ALDH2(rs671)位點多態(tài)性的熒光標記探針；
[0010]引物、探針具體序列信息如下：
[0011] F : 5 ' -AGCAGACCCTAAATCCCTGG-3 ' ；
[0012] R :5'-CACCAGCAGACCCTCAAG-3' ；
[0013] sensorprobe:5' -TGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGT-FAM-3' ；
[0014] anchorprobe:5' -R0X-AGTGTGGGACCTGCTGGGGGCT-P-3'。
[0015] 該試劑盒還包括擴增反應試劑PCR Mix，其成分包含為：1XPCR Buffer，3mM MgC12 溶液，2. 5mM dNTP 溶液，1 y M F，1 y M R，0? 25 y M sensor probe，0? 3 y M anchor probe〇
[0016] -種基于FRET探針熔解曲線法檢測ALDH2基因多態(tài)性的試劑盒的方法，包括如下 步驟：
[0017] S1:DNA 提??；
[0018] S2 :配置PCR反應液，包含nX19. 6yL PCR Mix和nXO. 4yL酶液，其中酶液包含： 5U/ y 1 TaqHS ;依次在95°C預變性10min ;95°C變性10s，60°C退火60s，45個循環(huán)；得到擴 增產(chǎn)物；
[0019] S3 :在45°C~80°C，0. 2°C采集一次熒光做熔解曲線分析；
[0020] S4 :結(jié)果分析，陰性對照：1 X TE。
[0021] 本發(fā)明的有益效果：
[0022] 本發(fā)明采用的FRET探針熔解曲線法，特異性好，靈敏度高，通過儀器讀取的TM值 即可直觀明了地判讀結(jié)果。而且價格低廉，操作簡易，避免了開管操作帶來的污染。
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發(fā)明熔解曲線Tm值為：67±1°C ;
[0024] 圖2為本發(fā)明熔解曲線Tm值為：57. 5±1°C ;
[0025] 圖3為本發(fā)明熔解曲線有兩個熔解峰，Tm值為：57. 5±1°C和67±1°C ;
[0026] 圖4為本發(fā)明無熔解峰。
【具體實施方式】
[0027] 實施例：
[0028] -種基于FRET探針熔解曲線法檢測ALDH2基因多態(tài)性的試劑盒，包括特異擴增基 因ALDH2(rs671)位點的正向引物和反向引物，以及一對特異區(qū)分基因ALDH2(rs671)位點 多態(tài)性的熒光標記探針；
[0029] 引物、探針具體序列信息如下：
[0030] F :5' -AGCAGACCCTAAATCCCTGG-3' ；
[0031] R : 5 ' -CACCAGCAGACCCTCAAG-3 ' ；
[0032] sensor probe :5, -TGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGT-FAM-3,；
[0033] anchor probe :5' -R0X-AGTGTGGGACCTGCTGGGGGCT-P-3'。
[0034] 還包括擴增反應試劑PCR Mix，其成分包含為：1XPCR Buffer，3mM MgC12溶液， 2. 5mM dNTP 溶液，1 y M F，1 yM R，0. 25 yM sensor probe，0? 3 yM anchor probe。
[0035] 基于FRET探針熔解曲線法檢測ALDH2基因多態(tài)性的試劑盒的方法，包括如下步 驟：
[0036] S1:樣本 DNA 提取；
[0037] 將收集的口腔脫落細胞進行基因組提取，提取試劑盒使用的是口腔拭子基因組 DNA提取試劑盒，詳細操作步驟如下：
[0038] 1 ?處理材料：
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