高效全血基因組dna提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速、高效全血基因組DNA提取方法，屬于核酸純化領(lǐng)域。首先向全血中加入紅細(xì)胞裂解液，渦旋，直至紅細(xì)胞完全裂解，棄上清，吸干殘留液體。加入白細(xì)胞裂解液和蛋白酶K，37oC水浴裂解白細(xì)胞，直至沉淀溶解。加入氯化鈉和氯仿，離心分離DNA，并將上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈的EP管中。加入醋酸銨和冰乙醇沉淀DNA，75％乙醇洗滌后自然干燥，加入TE溶解得到DNA。本發(fā)明方法具有快速、高效和無(wú)毒的特點(diǎn)。所提取的DNA可用于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、甲基化檢測(cè)、基因克隆等多種后續(xù)分子生物學(xué)研究。
【專利說(shuō)明】高效全血基因組DNA提取方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種快速、高效全血基因組DNA提取方法，屬于核酸純化領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0003]目前，分子生物學(xué)理論和技術(shù)發(fā)展十分迅速，已經(jīng)與生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)和動(dòng)物學(xué)等多個(gè)學(xué)科密切結(jié)合，獲得高純度和完整的基因組DNA是進(jìn)行后續(xù)分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，是其它研究工作的前提。外周血可作為造血系統(tǒng)疾病研究中分子標(biāo)志，以及用于體外診斷系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)，還可用于血液系統(tǒng)外眾多系統(tǒng)疾病的分子監(jiān)測(cè)。從外周血中提取DNA，進(jìn)行核酸水平的研究是臨床分子生物學(xué)重要的研究手段。
[0004]在遺傳性疾病和腫瘤以及心腦血管病等研究中，可以利用外周血作為生物材料，檢測(cè)患病個(gè)體與正常健康個(gè)體之間的DNA差異，例如DNA甲基化分析和基因突變檢測(cè)。尋找快速、經(jīng)濟(jì)的DNA提取方法是群體分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)面臨的首要問(wèn)題。然而，從血液中提取DNA面臨的難題之一是DNA易受到多種物質(zhì)的污染，使得DNA純度下降，致使實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性降低。有些傳統(tǒng)的外周血DNA提取方法使用飽和酚等有害物質(zhì)，且操作復(fù)雜，過(guò)程繁瑣，用時(shí)過(guò)長(zhǎng)；開(kāi)放的自動(dòng)化DNA提取裝置，雖然不再使用飽和酚等有害物質(zhì)，操作過(guò)程也相對(duì)比較簡(jiǎn)單，但所用儀器和試劑極為昂貴，不適用于普通實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模DNA的提取。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種快速、高效提取全血基因組DNA方法，保證提取出的基因組DNA完整，并使提取過(guò)程高效、快速、無(wú)毒。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
一種高效全血基因組DNA提取方法，包括以下步驟:
(1)按全血:紅細(xì)胞裂解液=1:1的體積比，向EP管中的全血中加入紅細(xì)胞裂解液，渦旋2分鐘后靜置5分鐘以上，直至溶液澄清透明，然后對(duì)溶液進(jìn)行離心分離，轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為2分鐘，棄去上清液；
(2)向步驟(1)的EP管中再加入占全血體積1/3的紅細(xì)胞裂解液，渦旋I分鐘，直至沉淀完全散開(kāi)，然后對(duì)溶液進(jìn)行離心分離，轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，分離時(shí)間為I分鐘，棄去上清液；重復(fù)本步驟一次，并用吸水紙吸干殘留液體；
(3)向步驟(2)的EP管中加入占全血體積1/3的白細(xì)胞稀釋液，另加入占全血體積1/600的蛋白酶K，混勻，37°C水浴60-90分鐘，直至沉淀完全溶解；
(4)向步驟(3)的EP管中分別加入占全血體積1/12的5摩爾/升氯化鈉溶液和占全血體積2/3的氯仿，充分搖勻，然后對(duì)溶液進(jìn)行離心分離，離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為5分鐘，將上層液體轉(zhuǎn)移至另一潔凈的EP管中；
(5)向步驟(4)的潔凈的EP管中加入占管內(nèi)溶液I/ 10體積的醋酸銨溶液和2倍體積的冰乙醇，充分搖勻，沉淀DNA，然后對(duì)溶液進(jìn)行離心分離，離心分離的轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，分離時(shí)間為I分鐘,棄去上清液；
(6)向步驟(5)的潔凈的EP管中加入占全血體積1/3的75%乙醇，對(duì)DNA沉淀洗滌，然后進(jìn)行離心分離，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為I分鐘，棄去上清液；重復(fù)本步驟兩次；
(7)將步驟(6)的潔凈的EP管倒立放置在放有吸水紙的水平實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，自然干燥5分
鐘；
(8)向步驟(7)的潔凈的EP管中加入與全血同等體積的TE緩沖液，溶解DNA沉淀。
[0007]采用上述技術(shù)方案的本發(fā)明，與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)是:
①本發(fā)明個(gè)步驟中涉及的離心時(shí)間、離心機(jī)轉(zhuǎn)速，使全血中基因組DNA的提取過(guò)程具有高效、快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)；
②本發(fā)明整個(gè)過(guò)程不需要使用有毒的苯酚的試劑，且所有試劑成本較低，使整個(gè)過(guò)程不僅安全可靠，而且比較經(jīng)濟(jì)；
②使用本發(fā)明方法純化的基因組DNA完整性好，純度高，可用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(Real Time PCR)、芯片分析、分子克隆等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
[0008]作為優(yōu)選，本發(fā)明更進(jìn)一步的技術(shù)方案是:
所述紅細(xì)胞裂解液中各組分的配方為:
Tris-HCl (PH7.6 或 8.0)0.01M
Sucrose320mM
MgCl25mM
TritonXlOO1%。
[0009]所述白細(xì)胞裂解液中各組分的配方為:
Tris-HCl (PH7.6 或 8.0)0.01M
EDTA (PH8.0)4mM
SDS0.2%
NaCl50mM。
·[0010]所述TE緩沖液中各組分的配方為:
Tris-HCl (PH7.6*8.0)IM
EDTA (ΡΗ8.0)0.5Μ。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，目的僅在于更好地理解本
【發(fā)明內(nèi)容】
。因此，所舉之例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0012]實(shí)施例1:從人的全血中提取DNA。
[0013](I)向600微升人全血中加入紅細(xì)胞裂解液600微升，加入的體積比為全血:紅細(xì)胞裂解液=1:1，渦旋2分鐘，靜置5分鐘以上，直至溶液澄清透明。對(duì)溶液進(jìn)行離心分離，轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為2分鐘，棄去上清液。其中紅細(xì)胞裂解液按下述方法制備:取 IOmllMTris-HCl (ΡΗ7.6)，109.54g Sucrose，1.0lg MgCl2，加 IOml TritonX 100,力卩水至800ml，溶解定容至1000ml。
[0014](2)向步驟(1)的EP管中加入200微升的紅細(xì)胞裂解液，渦旋I分鐘，直至沉淀完全散開(kāi)。對(duì)溶液進(jìn)行離心分離，轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，分離時(shí)間為I分鐘，棄上清。重復(fù)一次，并用吸水紙吸干殘留液體。
[0015](3)向步驟(2)的EP管中加入200微升白細(xì)胞稀釋液，I微升蛋白酶K，混勻，37°C水浴60-90分鐘，直至沉淀完全溶解。其中白細(xì)胞裂解液按下述方法制備:加IOmlIMTris-HCl (PH7.6), 8ml 0.5 M EDTA, 20ml 10% SDS, IOml 5M NaCl，定容至 1000ml。
[0016](4)向步驟(3)的EP管中加入50微升5摩爾/升氯化鈉溶液和400微升氯仿，充分搖勻。對(duì)溶液進(jìn)行離心分離，離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為5分鐘。將上層液體轉(zhuǎn)移至另一潔凈EP管中。
[0017](5 )向步驟(4)的EP管中加入I / 10體積醋酸銨溶液和2倍體積冰乙醇，充分搖勻，沉淀DNA。對(duì)溶液進(jìn)行離心分離，離心分離的轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，分離時(shí)間為I分鐘，
棄上清。
[0018](6)向步驟(5)的EP管中加入200毫升75%乙醇，對(duì)DNA沉淀洗滌，于12000轉(zhuǎn)/
分離心I分鐘，棄上清。重復(fù)兩次。
[0019](7)將步驟(6)的EP管倒立放置與放有吸水紙的水平實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，自然干燥5分鐘。
[0020](8)加入600微升TE溶解DNA沉淀。其中TE緩沖液按下述方法制備:取IOml IMTris-HCl (PH8.6), 2ml 0.5 M EDTA，加水至 1000ml。
[0021]依照實(shí)施例1所述方法從600微升人全血中提取的DNA，通過(guò)其1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DNA在23130bp處有一條單一亮條帶。
[0022]實(shí)施例2:從小鼠的全血中提取DNA。
[0023](I)向600微升小鼠全血中加入紅細(xì)胞裂解液600微升，加入的體積比為全血:紅細(xì)胞裂解液=1:1，渦旋2分鐘，靜置5分鐘以上，直至溶液澄清透明。對(duì)溶液進(jìn)行離心分離，轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為2分鐘，棄去上清液。其中紅細(xì)胞裂解液，其制備方法是:取 IOmllMTris-HCl (PH7.6), 109.54g Sucrose，1.0lg MgCl2，加 IOml TritonXlOO,加水至800ml，溶解定容至1000ml。
[0024](2)向步驟(1)的EP管中加入200微升的紅細(xì)胞裂解液，渦旋I分鐘，直至沉淀完全散開(kāi)。對(duì)溶液進(jìn)行離心分離，轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，分離時(shí)間為I分鐘，棄上清。重復(fù)一次，并用吸水紙吸干殘留液體。
[0025](3)向步驟(2)的EP管中加入200微升白細(xì)胞稀釋液，I微升蛋白酶K，混勻，37°C水浴60-90分鐘，直至沉淀完全溶解。其中白細(xì)胞裂解液，其制備方法是:加IOmlIMTris-HCl (PH7.6), 8ml 0.5 M EDTA, 20ml 10% SDS, IOml 5M NaCl，定容至 1000ml。
[0026](4)向步驟(3)的EP管中加入50微升5摩爾/升氯化鈉溶液和400微升氯仿，充分搖勻。對(duì)溶液進(jìn)行離心分離，離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為5分鐘。將上層液體轉(zhuǎn)移至另一潔凈EP管中。
[0027](5 )向步驟(4)的EP管中加入1 / 10體積醋酸銨溶液和2倍體積冰乙醇，充分搖勻，沉淀DNA。對(duì)溶液進(jìn)行離心分離，離心分離的轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，分離時(shí)間為I分鐘，
棄上清。
[0028](6)向步驟(5)的EP管中加入200毫升75%乙醇，對(duì)DNA沉淀洗滌，于12000轉(zhuǎn)/
分離心I分鐘，棄上清。重復(fù)兩次。
[0029](7)將步驟(6)的EP管倒立放置與放有吸水紙的水平實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，自然干燥5分鐘。[0030](8)加入600微升TE溶解DNA沉淀。其中TE緩沖液，其制備方法是:取IOml IMTris-HCl (PH8.6), 2ml 0.5 M EDTA，加水至 1000ml。[0031]依照實(shí)施例2所述方法從從600微升小鼠全血中提取的DNA，通過(guò)其1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA在23130bp處有一條單一較亮帶。
【權(quán)利要求】
1.一種高效全血基因組DNA提取方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)按全血:紅細(xì)胞裂解液=1:1的體積比，向EP管中的全血中加入紅細(xì)胞裂解液，渦旋2分鐘后靜置5分鐘以上，直至溶液澄清透明，然后對(duì)溶液進(jìn)行離心分離，轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為2分鐘，棄去上清液； (2)向步驟(1)的EP管中再加入占全血體積1/3的紅細(xì)胞裂解液，渦旋I分鐘，直至沉淀完全散開(kāi)，然后對(duì)溶液進(jìn)行離心分離，轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，分離時(shí)間為I分鐘，棄去上清液；重復(fù)本步驟一次，并用吸水紙吸干殘留液體； (3)向步驟(2)的EP管中加入占全血體積1/3的白細(xì)胞稀釋液，另加入占全血體積1/600的蛋白酶K，混勻，37°C水浴60-90分鐘，直至沉淀完全溶解； (4)向步驟(3)的EP管中分別加入占全血體積1/12的5摩爾/升氯化鈉溶液和占全血體積2/3的氯仿，充分搖勻，然后對(duì)溶液進(jìn)行離心分離，離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為5分鐘，將上層液體轉(zhuǎn)移至另一潔凈的EP管中； (5)向步驟(4)的潔凈的EP管中加入占管內(nèi)溶液I/ 10體積的醋酸銨溶液和2倍體積的冰乙醇，充分搖勻，沉淀DNA，然后對(duì)溶液進(jìn)行離心分離，離心分離的轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，分離時(shí)間為I分鐘,棄去上清液； (6)向步驟(5)的潔凈的EP管中加入占全血體積1/3的75%乙醇，對(duì)DNA沉淀洗滌，然后進(jìn)行離心分離，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為I分鐘，棄去上清液；重復(fù)本步驟兩次； (7)將步驟(6)的潔凈的EP管倒立放置在放有吸水紙的水平實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，自然干燥5分鐘； (8)向步驟(7)的潔凈的EP管中加入與全血同等體積的TE緩沖液，溶解DNA沉淀。
2.如權(quán)利要求1所述的高效全血基因組DNA提取方法，其特征在于，所述紅細(xì)胞裂解液中各組分的配方為: Tris-HCl (ΡΗ7.6*8.0)0.01M Sucrose320mMMgCl25mM TritonXlOO1%。
3.如權(quán)利要求1所述的高效全血基因組DNA提取方法，其特征在于，所述白細(xì)胞裂解液中各組分的配方為: Tris-HCl (PH7.6 或 8.0)0.01M EDTA (PH8.0)4mM SDS0.2% NaCl50mM。
4.如權(quán)利要求1所述的高效全血基因組DNA提取方法，其特征在于，所述TE緩沖液中各組分的配方為: Tris-HCl (PH7.6*8.0)IM EDTA (ΡΗ8.0)0.5Μ。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103571826SQ201310593112
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月23日
【發(fā)明者】張雪梅, 張志 , 曹蕾 申請(qǐng)人:河北聯(lián)合大學(xué)