專利名稱：：使用全血的血液成分測定方法及測定試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及受到葡萄糖和/和其衍生物造成的干擾的血液成分的測定方法，其特征在于使用全血，將全血與將葡萄糖和/或其衍生物轉變?yōu)椴桓蓴_測定的物質的物質相互接觸，并且同時或隨后分離血細胞；測定使用的裝置；以及包括該裝置的試劑盒。'，
背景技術：
血液中電解質、蛋白質、非蛋白氮化合物、糖、脂質、酶等的測定稱為臨床化學檢查，是疾病診斷、治療及預防的重要檢驗。在用作試樣的血液中除待測的目標物質以外還存在相當多的物質，經常干擾目標物質的測定。因此，采用在測定目標物質之前用試劑處理樣本以避免干擾的技術。此時，通常對采集的全血進行離心等以預先得到血漿或血清。這是因為，當使用需要消除或轉換干擾測定的成分的全血作為試樣進行血液成分分析時，細胞成分如血細胞可能影響測定，由于溶血，血細胞的分離可能變得困難，大量存在于血細胞中的具有過氧化物酶活性的血紅蛋白可能干擾測定，等等。近年來，隨著飲食變得更加豐富，糖尿病患者數量也在增加。為了預防糖尿病患者的并發(fā)癥，血糖水平需要保持在接近健康人的水平，血糖水平自測定裝置被廣泛使用，使得患者可以在家里監(jiān)測自己的血糖水平。但是，由于血糖水平隨進食而改變，并且測定需要頻繁進行，因此患者遭受沉重的負擔。對于患者而言，由于知識的缺乏也難以解釋測定值。同時，1,5-脫水葡萄糖醇是不受進食的影響、檢査糖尿病患者在過去的一周內血糖控制狀態(tài)的極佳標記物，開發(fā)使用1,5-脫水葡萄糖醇的自測定試劑盒，其在家里只要一周一次測定就能夠準確檢査血糖控制狀態(tài)，這對于患者將是極大的優(yōu)勢。另外，這在普查中也是有用的。但是，由于血液中1，5-脫水葡萄糖醇的濃度與血糖水平相比極低，并且血糖，即葡萄糖，干擾1,5-脫水葡萄糖醇的測定，因此，開發(fā)自測定試劑盒，包括直接使用痕量全血作為試樣的自測定試劑盒，還沒有實現。另外，葡萄糖以高濃度存在于血細胞的細胞內液中，并且與跨細胞膜的細胞外液中的葡萄糖保持平衡。如果將細胞外液中的葡萄糖轉變?yōu)椴桓蓴_測定的物質，則血細胞的細胞內液中的葡萄糖就會通過細胞膜釋放并且干擾測定。需要消除或轉換干擾測定的成分的血成分分析例子包括以下公報中記載的那些。在專利文獻中1，從全血中分離血細胞，然后通過抗壞血酸氧化酶除去干擾測定的成分抗壞血酸，測定肌酸酐。在專利文獻2、3和4中，使用血清而非全血作為樣本來測定專利文獻2中的山梨醇、專利文獻3中的甘露糖和專利文獻4中的肌醇。任何情況下，干擾測定的成分葡萄糖都在預處理中被消除或轉變。當測定1,5-脫水葡萄糖醇時，在專利文獻5、6、7、8等中記載了使用血清而非全血作為樣本。葡萄糖在專利文獻5中被葡萄糖氧化酶氧化或者還被己糖激酶或葡萄糖激酶磷酸化，在專利文獻6中被葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶氧化，在專利文獻7和8中被己糖激酶、己糖磷酸異構酶、和6-磷酸基果糖激酶或葡萄糖異構酶、果糖激酶和6-磷酸基果糖激酶轉變?yōu)楣?l,6-二磷酸，然后測定1,5-脫水葡萄糖醇。注意到在這些公報中，葡萄糖轉變?yōu)槠咸烟撬?l,5-內酯、葡萄糖-6-磷酸、葡糖酸、果糖-6-磷酸、果糖等。在這些血液成分的測定中，不直接使用全血作為試樣，并且需要使用離心機和大量血液來分離血細胞，處理步驟很多。另外，在專利文獻1中記載了一種通過外部操作而結合構件的裝置。專利文獻1;專利文獻2:專利文獻3:專利文獻4:專利文獻專利文獻6:專利文獻7:專利文獻8:JP-B-07-36756JP-A-08-298996JP-A-2001-197900JP-A-2001-190299日本專利2983015號JP-A-2001-78797日本專利3170320號日本專利3217180號
發(fā)明內容發(fā)明要解決的問題無論如何，近來，稱為即時檢驗(PointofCareTesting)的在床邊或門診的快速測定以及患者自己在家中的測定已經日益實行。由于在這樣的情況下難以使用離心機等，因此希望使用全血本身作為試樣的測定方法。特別是患者自己在家里的測定中，使用刺血針裝置采集的例如不超過幾十pL的痕量血液用作試樣。因此，使用離心機獲得血清的測定方法不能應用。解決問題的手段本發(fā)明人為了解決上述問題進行了各種各樣的研究。結果，他們發(fā)現了受到由葡萄糖和/或其衍生物造成的干擾的血液成分的測定方法，其中，使用全血作為試樣并且不使用離心機等分離血細胞，并且完成了本發(fā)明。艮口，本發(fā)明涉及以下各項。(1)一種測定受到由葡萄糖和/或其衍生物造成的干擾的血液成分的方法，其特征在于，將全血與將葡萄糖和/或其衍生物轉變?yōu)椴桓蓴_測定的物質的物質相互接觸，并且同時或隨后分離血細胞。(2)根據上述(1)的血液成分的測定方法，其中，全血的量不超過20pL。(3)根據上述(1)或(2)的血液成分的測定方法，其特征在于，通過使用血細胞分離過濾材料分離血細胞。(4)根據上述(3)的血液成分的測定方法，其特征在于，血細胞分離過濾材料為玻璃纖維濾紙、纖維素濾紙、微孔材料、聚合物材料或,為亭組合的構件。(5)根據上述(1)至(4)中任一項的血液成分的測定方法，其中，將葡萄糖和/或其衍生物轉變?yōu)椴桓蓴_測定的物質的物質是用于葡萄糖的酶促氧化或酶促磷酸化的物質。(6)根據上述(1)至(5)中任一項的血液成分的測定方法，其特征在于，轉變葡萄糖和/或其衍生物的物質包含選自由磷酸烯醇丙酮酸、a-酮戊二酸、草酰乙酸、乙酰磷酸、丙酮酸、3-磷酸甘油酸、磷酸肌酸、腺苷-5，-二磷酸、腺苷-5，-三磷酸、氧化或還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、和氧化或還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸組成的化合物組中的一種或多種化合物。(7)根據(1)至(6)中任一項的血液成分的測定方法，其中，血液成分為1,5-脫水葡萄糖醇。(8)—種用于根據(1)至(7)中任一項的血液成分測定方法的裝置，其特征在于，包含血細胞分離部件和檢測部件。(9)根據(8)的裝置，其中，血細胞分離部件和檢測部件在測定前不接觸，并且將這些部件相互接觸以進行檢測和定量。(10)根據(8)的裝置，其中，檢測部件是使用涂布了試劑的電極的檢測部件。(11)一種測定試劑盒，包含根據(8)至(10)中任一項的裝置和用于采集血液的刺血針裝置，其中，血液成分為1，5-脫水葡萄糖醇。發(fā)明效果在受到葡萄糖和/或其衍生物造成的干擾的血液成分的測定方法中，通過將全血與將葡萄糖和/或其衍生物轉變?yōu)椴桓蓴_測定的物質的物質接觸并且同時或者隨后分離血細胞，測定可以不受細胞成分如全血中的血細胞影響或者不引起干擾測定的溶血進行。另外，由于不使用離心機等，測定變得方便，并且可以簡化測定裝置或測定試劑盒的結構，從而降低成本。圖1是實施例1所用裝置的簡化圖！，圖2是實施例2所用裝置的簡化圖。符號說明1檢測部件2.檢測部件支撐體3.血細胞分離部件4.支撐體具體實施方式以下，詳細地說明本發(fā)明。本發(fā)明是測定受到葡萄糖和/或其衍生物造成的干擾的血液成分的測定方法，其特征在于，將全血與將葡萄糖和/或其衍生物轉變?yōu)椴桓蓴_測定的物質的物質相互接觸，并且同時或隨后分離血細胞。本發(fā)明中使用的全血是處于未從中分離紅血球的采集狀態(tài)的血液，可以含有采血用的釆血管中所含的抗凝血劑、糖解抑制劑等，如肝素、氟化鈉和一碘乙酸。當使用保存血液時，優(yōu)選通過含有氟化鈉和肝素的采血管采血。另外，本發(fā)明的全血包括不使用采血管等，通過自測血糖使用的刺血針裝置等收集的血液。采血部位沒有特別限制，包括指尖以及前臂外側、腹壁或上臂外側。根據本發(fā)明的測定方法，甚至可以使用少量的全血測定血液成分。例如，3至50pL、優(yōu)選3至20pL就足夠了。通過本發(fā)明的測定方法測定的全血中的血液成分的例子包括1,5-脫水葡萄糖醇、山梨醇、甘露糖或肌醇，但是不限于這些糖或糖醇，只要在可能被葡萄糖和/或其衍生物干擾的全血的測定中，它們可以被測定即可。本發(fā)明中將葡萄糖和/或其衍生物轉變?yōu)椴桓蓴_測定的物質的物質沒有特別限制，只要其不影響目標血液成分的測定即可。其例子包括專利文獻2至8中所述的將葡萄糖和/或其衍生物轉變?yōu)椴桓蓴_測定的物質的上述物質，優(yōu)選用于葡萄糖的酶促氧化或酶促磷酸化的物質。例如，可以使用下文對于葡萄糖的酶促氧化或酶促磷酸化的說明中所述的物質。本發(fā)明中將葡萄糖和/或其衍生物轉變?yōu)椴桓蓴_測定的物質的物質是這樣的物質，其通過諸如滲透壓的作用使血細胞收縮或凝集，降低血細胞比容(血液粘度)并且因而促進血細胞從全血中分離，從而從較少量的全血中可以得到較大量的血漿和血清。其例子包括含有選自磷酸烯醇丙酮酸、a-酮戊二酸、草酰乙酸、乙酰磷酸、丙酮酸、3-磷酸甘油酸、磷酸肌酸、腺苷-5'-二磷酸(ADP)、腺苷-5，-三磷酸(ATP)、氧化型或還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD(H))、和氧化型或還原型的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP(H))組成的化合物組中的一種或多種化合物的物質。上述葡萄糖的酶促氧化或酶促磷酸化的例子包括包括葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖的方法；包括在輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或磷酸煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的存在下，通過葡萄糖脫氫酶氧化葡萄糖的方法；包含通過己糖激酶或葡萄糖激酶將葡萄糖磷酸化，并且在輔酶NAD+或NADP+的存在下通過葡萄糖-6-磷酸脫氫酶將得到的葡萄糖-6-磷酸氧化的方法；包括在腺苷-5，-二磷酸或腺苷-5，-三磷酸的存在下，使己糖激酶、磷酸己糖異構酶和6-磷酸果糖激酶起使用而將葡萄糖轉變?yōu)楣?l,6-二磷酸的方法；以及包括在二磷酸核苷(NDP)或三磷酸核苷(NTP)的存在下，使葡萄糖異構酶、果糖激酶和6-磷酸果糖激酶起作用而將葡萄糖轉變?yōu)楣?l,6-二磷酸的方法。上述轉變中使用的酶沒有特別的限制，只要根據IUPAC-IUB命名法它們被分類為葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4)、葡萄糖脫氫酶(EC1丄1.47，EC1.1.1.118，EC1.1.1.119，EC1.99.10)、己糖激酶(EC2.7丄1)、葡萄糖激酶(EC2.7丄2);作為磷酸己糖異構酶的葡萄糖-6-磷酸酮醇異構酶(EC5.3丄9)，葡萄糖異構酶(EC5.3丄18)和果糖激酶(EC2.7丄4);和作為磷酸果糖激酶的磷酸己糖激酶(EC2.7丄11)即可，并且也可以使用市售品。另外，在包括葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶氧化葡萄糖的方法中，也可以使用葡糖酸內酯酶(EC3丄1.17)，將產生的葡萄糖酸-l,5-內酯完全轉變?yōu)槠咸烟撬幔绻枰?，可以組合使用變旋酶(EC5丄3.3)。使用NDP依賴性己糖激酶作為己糖激酶沒有問題，特別是例如ADP依賴性己糖激酶。在本發(fā)明的測定方法中，葡萄糖的酶促氧化或磷酸化的優(yōu)選例子包括包括由己糖激酶將葡萄糖磷酸化的方法，其特別優(yōu)選的例子是在鎂離子、ATP、磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶的存在下，使用己糖激酶的酶循環(huán)法。在本發(fā)明的測定方法中，血細胞的分離主要是指紅血球的分離，其優(yōu)選的例子包括適于在床邊或門診的上述快速測定如即時檢驗(PointofCareTesting)以及患者自已在家中測定、并且使用在極微量的全血測定中特別有效的血細胞分離過濾材料的血液分離方法。血細胞分離過濾材料沒有特別限制，只要它們能夠分離血細胞即可，可以使用公知的過濾材料。其例子包括玻璃纖維濾紙、纖維素濾紙、多微孔材料、聚合物材料及作為它們的組合的構件。玻璃纖維濾紙優(yōu)選密度為約0.02至0.09，保留粒徑為約1至5pm。玻璃纖維的表面可以用親水聚合物、作為糖結合蛋白的卵磷脂、作為兩親性脂質的卵磷脂或磷脂酰膽堿等處理。纖維素濾紙沒有特別限制，其例子包括常用的濾紙。微孔材料的例子包括微孔膜和微孔載體，并且也能使用具有高度非對稱結構的那些材料。微孔膜的例子包括聚砜膜和氟化聚合物膜。微孔載體的例子包括具有納米/微米粒徑的凝膠和微球(例如，珠和膠乳)，其基礎材料的粒子包括聚合物如聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(羥基甲基丙烯酸酯)和聚乙烯醇、和二氧化硅。微孔材料可以通過使其表面進行活性處理如氧等離子體處理而變得親水。聚合物材料優(yōu)選親水性聚合物材料，其例子包括纖維素衍生物如羧甲基纖維素、聚乙烯基吡咯垸酮、聚乙烯醇、明膠、瓊脂糖、聚丙烯酸、馬來酸酐的聚合物、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚賴氨酸和聚苯乙烯磺酸。上述玻璃纖維濾紙、纖維素濾紙和微孔材料可以用聚合物材料浸漬，使表面親水，或者可以使聚合物材料自身象聚離子復合膜一樣形成膜。上述血細胞分離過濾材料可以單獨使用或者作為其組合的構件使用。另外，上述血細胞分離過濾材料可以提供到剌血針裝置中，或者作為通過直接施加在下述檢測使用的電極等之上或者施加在檢測使用的電極的酶層等上而形成的膜狀構件。在本發(fā)明中，將葡萄糖和/或其衍生物轉變?yōu)椴桓蓴_測定的物質的物質與全血，可以通過在血細胞分離前將這些物質混合而相互接觸，或者通過使血細胞分離過濾材料負載將葡萄糖和/或其衍生物轉變?yōu)椴桓蓴_測定的物質的物質而相互接觸。另外，本發(fā)明包括這樣的情況，其中將葡萄糖和/或其衍生物轉彎為^干擾測定的物質的物質的一部分被負載，并且葡萄糖和/或其衍生物與施加的試樣中所含的物質一起轉變?yōu)椴桓蓴_測定的物質。在本發(fā)明的血液成分測定方法中，血液成分的檢測方法沒有特別限制，其例子包括通常的臨床化學檢查中使用的吸光度測定、使用電極等的電化學檢測、以及免疫化學檢驗中使用的化學發(fā)光和電化學發(fā)光技術。以下將進一步說明本發(fā)明的測定方法測定的血液成分是1,5-脫水葡萄糖醇的情況。1,5-脫水葡糖醇的測定方法包括已知方法，例如，包括在電子受體的存在下，使具有1,5-脫水葡萄糖醇氧化能力的酶起作用，并且測定反應后的耗氧量、還原的電子受體或反應產物的方法；以及包括使用1，5-脫氫葡萄糖醇脫氫酶進行定量的方法，所述1，5-脫氫葡萄糖醇脫氫酶在不存在電子受體的情況下，催化還原性著色材料的直接還原。另外，測定方法可以是這樣的方法，其包括由1，5-脫氫葡萄糖醇-6-磷酸化酶將1，5-脫氫葡萄糖醇轉變?yōu)?,5-脫氫葡糖醇-6-磷酸，在氧化輔酶的存在下由1,5-脫氫葡萄糖醇-6-磷酸脫氫酶將1,5-脫氫葡萄糖醇-6-磷酸脫氫，并且定量該反應中產生的成分或減少的成分。具有1,5-脫氫葡萄糖醇氧化能力的酶的例子包括根據IUPAC-IUB命名法分類為吡喃糖氧化酶(EC1丄3.10)和L-山梨糖氧化酶(EC1丄3.11)的酶。其具體例子包括JP-A-63-185397所述的由鈍頭多孔菌(Polypomsobtusus)ATCC26733產生的吡喃糖氧化酶和由血紅色陀螺孔菌(Trametessanguinea)IF04923產生的L-山梨糖氧化酶，JP-A-62-79780所述的由假單孢菌(Pseudomonassp.)NK-85001產生的氧化酶，JP-A-2-268679所述的由真菌如皮殼正青霉(Eupenicilliumcrustaceum)(IFO-8938)產生的1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶，以及日本專利2872983號所述的由農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)NT1130株產生的1,5-脫水葡萄糖醇脫氫酶，其可以無需電子受體而將1，5-脫水葡萄糖醇脫氫。另外，作為用于將1，5-脫水葡萄糖醇轉變?yōu)?,5-脫水葡萄糖醇-6-磷酸的方法或酶，可以直接使用為了消除或轉變葡萄糖而由上述的己糖激酶或葡萄糖激酶將葡萄糖磷酸化的方法或試劑。具體使用的酶的例子包括己糖激酶、葡萄糖激酶和ADP依賴性己糖激酶。ADP依賴性己糖激酶的例子包括JP-A-2002-186497所述的由高嗜熱古細菌(Pyrococcusfuriosus)DSM3638株產生的酶。1,5-脫水葡萄糖醇-6-磷酸脫氫酶的優(yōu)選例子包括JP-A-10-191998所述的由大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)DH1(ATCC33849)產生的酶。另外，可以使用市售的1,5-脫水-D-葡萄糖醇測定用試劑(Lana1,5-AGAutoLiquid:日本化藥株式會社)。另外，定量1,5-脫水葡萄糖醇的測定方法沒有特別限制，可以使用吸光光度法、電化學檢測法、化學發(fā)光技術、電化學發(fā)光技術等。例如，對于吸光度檢測使用的氧化發(fā)色基質，單獨使用的色原例子包括N-羧甲基氨基羰基-4,4，-雙(二甲氨基)聯(lián)苯胺鈉鹽(DA64)、10-羧甲基氨基羰基-3，7-雙(二甲氨基)吩噻嗪鈉鹽(DA67)、雙[3-雙(4-氯苯基)-甲基-4-二甲氨基苯基]胺(BCMA)、雙[3-雙(4-氯苯基)甲基-4-羧乙氨基苯基]胺、10-N-甲基氨基甲酰基-3,7-二甲氨基-10H-吩噻嗪(MCDP)、10-N-羧甲基氨基甲?；?3,7-二甲氨基-10H-吩噻嗪(CCAP)、3,3，,5，5，-四甲基聯(lián)苯胺(TMBZ)和N,N,N，,N，,N",N"-六(3-磺基丙基)-4，4，,4"-三氨基三苯基甲垸六鈉鹽(TPM-PS)。對于偶合色原，偶合體例子包括4-氨基安替比林(4AA)、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)和氨基聯(lián)苯基化合物(NCP),Trinder試劑的例子包括N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N，-琥珀酰乙二胺(EMSE)、^乙基-^(2-羥基-3-磺基丙基)-3-甲氧基苯胺(TOOS)等。另外，對于還原發(fā)色底物，色原的例子包括2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑氯化物(INT)、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物(MTT)、3,3，-[3，3，-二甲氧基-(1,1，-聯(lián)苯)-4，4，-二基]-雙[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑氯化物](NTB)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑單鈉鹽(WST-1)、和2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5—(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑單鈉鹽(WST-3)。電化學檢測用的電極例子包括金、鉑、碳、鈀和銀。測定方法的例子包括安培法(電流測定法)、庫侖法(電量測定法)、電位掃描法(potentialsweepmethod)和循環(huán)伏安法。另外，當然可以使用電子授受媒介的介體，并且氧化介體和還原介體均可以使用。其中，更優(yōu)選氧化介體，可以使用已知的化合物。優(yōu)選的例子包括氰鐵酸鹽、醌化合物、鋨(III)絡合物和其鋨(III)聚合物。另外，作為本發(fā)明的測定方法，也可以使用這樣的方法，其中使ADP依賴性己糖激酶在ADP的存在下起作用，將葡萄糖和1,5-脫水葡萄糖醇分別轉變?yōu)槠咸烟?6-磷酸和1,5-脫水葡萄糖醇-6-磷酸；使磷酸葡萄糖異構酶(磷酸己糖異構酶)和6-磷酸果糖激酶起作用，將葡萄糖-6-磷酸轉變?yōu)楣?l,6-二磷酸；和使1,5-脫水葡萄糖醇-6-磷酸脫氫酶在輔酶NAD+或NADP+的存在下起作用，測定1,5-脫水葡萄糖醇-6-磷酸。本發(fā)明還包括可以用于上述血液成分測定方法的具有血細胞分離部件和檢測部件的裝置。血細胞分離部件用于進行上述的血細胞分離，而檢測部件用于進行上述的血液成分檢測。裝置中這些部件'的布置可以是垂直的或水平的，并且這些部件可以相互接觸或者不接觸。當這些部件不接觸時，其形狀和位置沒有特別限制，只要部件在檢測時能夠相互接觸即可。例如，當這些部件的整個表面相互不接觸時，血細胞分離部件和檢測部件可以完全分離或者一端或兩端的一部分可以接觸。"在檢測時能夠相互接觸"的表述是指在添加試樣后，部件可以手動或自動地相互接觸，從而可以在葡萄糖和/或其衍生物轉變?yōu)椴桓蓴_測定的物質或血細胞分離所需的時間后，進行檢測和定量。在簡便的測定中，這些部件優(yōu)選在添加試樣后相互接觸數秒至數分鐘。血細胞分離部件和檢測部件的整個表面或其部分可以相互接觸。另外，當血細胞分離部件和檢測部件相互接觸時，可以在血細胞分離前，預先使全血與將葡萄糖和/或其衍生物轉變?yōu)椴桓蓴_測定的物質的物質接觸。檢測部件沒有限制，只要其具有基于上述檢測方法如吸光光度法、使用電極等的電化學檢測法、化學發(fā)光法和電化學發(fā)光法的結構即可。作為本發(fā)明裝置的例子，圖1和圖2中示出了簡圖。本發(fā)明還包括1,5-脫水葡萄糖醇測定試劑盒，其包含上述的裝置和采血用的刺血針裝置。刺血針裝置沒有特別限制，只要其可以收集約數十pL或以下的全血即可，并可以是與血糖水平自測定裝置附帶的刺血針裝置相同的裝置。實施例參考以下實施例更具體地說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明的范圍不限于這些實施例。實施例11)葡萄糖轉變試劑在25.0mM2-(4-(2-羥基乙基)-l-哌嗪基)乙烷磺酸(HEPES)緩沖液(pH7.5)中，將如下各成分以如下組成溶解7.38mMMgCl2、49.6mMKC1、24.0mM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、l.OmMATP、10U/mL丙酮酸激酶(PK)、8U/mL葡萄糖激酶、lOOmMNaCl、O.lmM亞乙基二氧基四乙酸二鈉鹽(EDTA'2Na)、0.1%NaN3、0.6g/L牛血清白蛋白(BSA)、0.05%非離子表面活性劑HS210(NOF公司)、O.lmM氰鐵酸鉀和5U/mL辣根過氧化物酶(HRP)，將pH調至7.5，制備成葡萄糖轉變試劑。2)著色劑8mMNCP-04(N-甲基-N-苯基對苯二胺)和8mMTOOS以該組成溶解于70%(v/w)乙醇，制備成著色試劑。3)酶試劑500U/mL1,5-脫水葡萄糖醇氧化酶和500U/mLHRP以該組成溶解于l.OM磷酸鹽緩沖液中，將pH調至7.5，制備成酶試劑。4)酶發(fā)色試驗紙BiodyneA膜(PALL公司)10mmX45mm室溫下在上述2)得到的著色試劑中浸漬IO分鐘，并在5(TC干燥20分鐘。然后，將膜在上述3)得到的酶試劑中浸漬過夜，并同樣地在5(TC干燥20分鐘。將膜切成5mmX5mm片，得到酶發(fā)色試驗紙。5)裝置如圖1所示，將血細胞分離部件3(血細胞分離用的HemasepL5mmX16mm:PALL公司)粘貼到支撐體4(白色PET5mmX50mm)的粘合面上，同時把其左端對齊。另外，將上述酶發(fā)色試驗紙作為檢測部件1粘貼到檢測部件支撐體2(Arcare8192透明PET5mmX40mm:AdhesivesResearchInc.)的粘合面上，同時把其左端對齊。'最后，將檢測部件支撐體2粘貼到支撐體4(白色PET5mmX50mm)的粘合面上，使得檢測部件1的整個表面與血細胞分離部件3的右端重疊。從而制備了裝置。6)校準曲線制作，為了制作1,5-脫水葡萄糖醇的校準曲線，將3個各15pL的已知濃度全血樣本(通過后述參考例1的程序得到的試樣中1，5-脫水葡萄糖醇的濃度為8.9、18.5和28.5ng/mL)與15|iL的葡萄糖轉變試劑在Eppendorf管中混合，并靜置5分鐘。然后，將反應混合物各15pL滴加到圖1中血細胞分離部件3的試樣施加位置。當血細胞分離后的血漿到達可以接觸檢測部件1(酶發(fā)色試驗紙)的血細胞分離部件3的部位時，檢測部件1受壓，并且60秒后通過使用反射光度計(測色計SUPERCOLORSP-80:東京電色株式會社制)測定吸光度。由吸光度和1,5-脫水葡萄糖醇的濃度制作校準曲線。7)測定程序準備測定1，5-脫水葡萄糖醇的6名正常受試者的全血各15pL，與15nL葡萄糖轉變試劑在Eppendorf管中混合并靜置5分鐘。然后，將反應混合物各15jiL滴加到圖1中血細胞分離部件3的試樣施加位置。當血細胞分離后的血漿到達可以接觸檢測部件1(酶發(fā)色試驗紙)的血細胞分離部件3的部位時，檢測部1受壓，并且60秒后通過使用反射光度計測定吸光度。6個全血試樣中的1，5-脫水葡萄糖醇量由校準曲線得到。結果如表l所示。參考例1將用于實施例1的7)中測定的6名正常志愿者的相同全血樣本、在3000rpm下離心5分鐘，并通過使用1，5-脫水-D-葡萄糖醇測定試劑(Lana1,5AGAutoLiquid:日本化藥株式會社)和自動分析儀7150(日立株式會社)的通常方法，利用以下參數測定上清液中的1，5-脫水葡萄糖醇。結果如表l所示。分析方法2端點法(2pointends)讀取點24-50樣本體積8pLLana1，5AGAutoLiquid的預處理試劑(Rl)240pLLana1,5AGAutoLiquid的發(fā)色試劑(R2)120^L溫度37°C測定波長(副/主)700/546nm[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>使葡萄糖轉變試劑對其起作用而將葡萄糖轉變?yōu)椴桓蓴_測定的物質、從其中分離血細胞、并且其進一步與檢測試劑接觸的全血中，1,5-脫水葡萄糖醇的測定值與通過已知方法得到的參考例1的測定值非常一致，說明1,5-脫水葡糖醇可以通過本發(fā)明測定。實施例21)葡萄糖轉變試劑在lO.OmM的2-嗎啉代乙磺酸(MES)緩沖劑中，以如下組成溶解各成分17.6mMMgCl2、17.6mMKC1、175.7mM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、17.6mMATP、123U/mL丙酮酸激酶(PK)、97U/mL己糖激酶和20U/mL抗壞血酸氧化酶，將pH調至7.0，得到葡萄糖轉變試劑。2)電極試劑16mg/mL鋨(III)絡合物([Os(III)(二吡啶基)2(咪唑基)2Cl]Cl2)和465.2U/mL1，5-脫水葡萄糖醇氧化酶以該組成溶解于純水，制備成電極試劑。3)傳感器芯片碳電極的檢測部件1涂敷4pL上述2)得到的電極試劑，并在50'C干燥13分鐘，得到傳感器芯片。4)裝置如圖2所示，將血細胞分離部件3(血細胞分離用的HemasepL5mmX15mm:PALL公司)粘貼到傳感器芯片的檢測部件1上，使得最遠端被覆蓋。由此，制備了裝置。5)校準曲線制作為了制作1,5-脫水葡萄糖醇的校準曲線，將3個各20pL的已知濃度全血樣本(通過上述參考例1的程序得到的樣本中1,5-脫水葡萄糖醇的濃度為9.4、18.6和42.6(ig/mL)與lO[iL的葡萄糖轉變試劑在Eppendorf管中混合，并靜置5分鐘。然后，將反應混合物各20^L滴加到圖2中血細胞分離部件3的樣本添加位置。80秒后，血細胞分離后的血漿到達檢測部件l(電極試劑)，將0.15V的電壓施加10秒。5秒后使用電化學檢測器(帶GPIBRS232C的8-channelmultipotentiostat，MODELPS-08:東方技研)測定電流。由電流值和1,5-脫水葡萄糖醇的濃度制作校準曲線。6)測定程序準備測定1,5-脫水葡萄糖醇的4名正常受試者的全血各2(HiL，與10pL葡萄糖轉變試劑在Eppendorf管中混合并靜置5分鐘。然后，將反應混合物各20pL滴加到圖2中血細胞分離部件3的試樣添加位置。80秒后，血細胞分離后的血漿到達檢測部件1(電極試劑)，將0.15V的電壓施加10秒。5秒后通過使用電化學檢測器測定電流。4個全血試樣中的1,5-脫水葡萄糖醇量由校準曲線得到。結果如表2所示。參考例2'通過參考例1相同的方法，測定與實施例2的6)中測定的相同全血試樣中的1，5-脫水葡萄糖醇。結果如表2所示。表21,5-脫水葡萄糖醇濃度(pg/mD_參考例2_實施例2全血樣本717.5li^全血樣本824.424.5全血樣本928.226.8全血樣本1031.532.5使葡萄糖轉變試劑對其起作用而將葡萄糖轉變?yōu)椴桓蓴_測定的物質、從其中分離血細胞、并且其進一步與電極試劑反應的全血中，1，5-脫水葡糖醇的測定值與通過已知方法得到的參考例2的測定值非常一致，說明1,5-脫水葡萄糖醇可以通過本發(fā)明測定。權利要求1.一種測定受到由葡萄糖和/或其衍生物造成的干擾的血液成分的方法，其特征在于，將全血與將葡萄糖和/或其衍生物轉變?yōu)椴桓蓴_測定的物質的物質相互接觸，并且同時或隨后分離血細胞。2.根據權利要求1的血液成分的測定方法，其中，全血的量不超過20(iL。3.根據權利要求1或2的血液成分的測定方法，其特征在于，通過使用血細胞分離過濾材料分離血細胞。4.根據權利要求3的血液成分的測定方法，其特征在于，血細胞分離過濾材料為玻璃纖維濾紙、纖維素濾紙、微孔材料、聚合物材料或作為其組合的構件。5.根據權利要求1至4中任一項的血液成分的測定方法，其中，將葡萄糖和/或其衍生物轉變?yōu)椴桓蓴_測定的物質的物質是用于葡萄糖的酶促氧化或酶促磷酸化的物質。6.根據權利要求1至5中任一項的血液成分的測定方法，其特征在于，轉變物質包含選自由磷酸烯醇丙酮酸、a-酮戊二酸、草酰乙酸、乙酰磷酸、丙酮酸、3-磷酸甘油酸、磷酸肌酸、腺苷-5'-二磷酸、腺苷-5，-三磷酸、氧化或還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、和氧化或還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸組成的化合物組中的一種或多種化合物。7.根據權利要求1至6中任一項的血液成分的測定方法，其中，血液成分為1,5-脫水葡萄糖醇。8.—種用于根據權利要求1至7中任一項的血液成分的測定方法的裝置，其特征在于，包含血細胞分離部件和檢測部件。9.根據權利要求8的裝置，其中，血細胞分離部件和檢測部件在測定前不接觸，并且將這些部件相互接觸以進行檢測和定量。10.根據權利要求8的裝置，其中，檢測部件是使用涂布了試劑的電極的檢測部件。11.一種測定試劑盒，包含根據權利要求8至10中任一項的裝置和用于采集血液的剌血針，其中，血液成分為1,5-脫水葡萄糖醇。全文摘要在床邊或診室中迅速測定受到葡萄糖和/或其衍生物干擾的血液成分或者由患者在自己家中對其測定時，需要不使用離心分離機等而可以使用全血作為試樣的測定方法。一種血液成分測定方法，用于測定受葡萄糖和/或其衍生物干擾的血液成分，其特征在于，包括將全血與能夠將葡萄糖和/或其衍生物轉變?yōu)椴桓蓴_測定的另一種物質的物質接觸，并且同時或隨后分離血細胞；一種用于該測定方法的裝置；和一種包含該裝置的試劑盒。文檔編號C12Q1/54GK101238374SQ20068002893公開日2008年8月6日申請日期2006年6月12日優(yōu)先權日2005年6月13日發(fā)明者入江彌生,梅香家佳彥,田邊敏雄,町田禮子申請人:日本化藥株式會社