專利名稱：用于眼變性的細(xì)胞療法的制作方法
用于眼變性的細(xì)胞療法發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及用于眼科疾病和障礙的基于細(xì)胞的療法或再生療法
的領(lǐng)域。具體地講，本發(fā)明提供間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell)和方法，任選藥物組合物，再生或修復(fù)眼細(xì)胞和組織的裝置。
背景技術(shù)：
眼作為復(fù)雜而敏感的人體器官，會(huì)罹患影響其發(fā)揮正常功能的能力的各種疾病和其它有害病癥。許多這類病癥與特定眼細(xì)胞和由這些細(xì)胞組成的組織受損或變性有關(guān)。例如， 一見(jiàn)神經(jīng)和^L網(wǎng)膜疾病和變性病癥在全世界都是失明的首要原因。角膜、晶狀體和有關(guān)眼組織受損和變性是視覺(jué)喪失的另一個(gè)重要原因。視網(wǎng)膜含有七層交互的細(xì)胞，可將光信號(hào)轉(zhuǎn)化成神經(jīng)信號(hào)。視網(wǎng)膜光感受器和鄰近視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium, RPE)形成功能單位，在很多疾病中因基因突變或環(huán)境條件(包括衰老)而失衡。這導(dǎo)致光感受器的損失通過(guò)細(xì)胞凋亡或繼發(fā)變性，這導(dǎo)致進(jìn)行性視力減退，某些情況下導(dǎo)致失明(有關(guān)綜述參見(jiàn)Lund， R.D.等，2001, Progress in Retinal and EyeResearch 20: 415-449)。屬于這種模式的兩類眼病是年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)和一見(jiàn)網(wǎng)膜色素變性(retinitispigmentosa, RP)。
AMD在美國(guó)是50歲以上人群視覺(jué)喪失的最常見(jiàn)原因；其發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而增加。AMD的主要病癥看來(lái)是由于RPE功能障礙和布魯赫膜(Bruch'smembrane)變化，例如脂質(zhì)沉積、蛋白質(zhì)交聯(lián)和對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通透性降低而引起的(Lund等，2001)。很多因素可導(dǎo)致黃斑變性，包括基因組成、年齡、營(yíng)養(yǎng)、吸煙和日曬。RP大體上被認(rèn)為是遺傳病超過(guò)100個(gè)突變與光感受器損失相關(guān)(Lund等，2001)。盡管大多數(shù)突變都靶向光感受器，但是某些突變卻直接影響RPE細(xì)胞?？傊?，這些突變影響光感受器和RPE細(xì)胞間的分子交換和光轉(zhuǎn)換等過(guò)程。
其它不常見(jiàn)的衰弱性視網(wǎng)膜病也包括進(jìn)行性細(xì)胞再生，導(dǎo)致視覺(jué)喪失和失明。這些包括例如糖尿病性視網(wǎng)膜病和脈絡(luò)膜新生血管膜(choroidal neovascular membrane, CNVM)。沖唐尿病'l"生一見(jiàn)網(wǎng)膜病可分為l)非增殖性或背景型視網(wǎng)膜病，特征是毛細(xì)血管通透性增加、水肺、出血、微動(dòng)脈瘤和滲出物，或2)增殖性視網(wǎng)膜病，特征是從視網(wǎng)膜延伸到玻璃體的新生血管形成、瘢疤形成、纖維組織形成并有可能視網(wǎng)膜脫離。在CNVM中，從脈絡(luò)膜長(zhǎng)出的異常血管生長(zhǎng)到視網(wǎng)膜層上。脆性新血管容易破裂，導(dǎo)致血和流體匯集到視網(wǎng)膜層內(nèi)。
眼睛的視神經(jīng)和視力相關(guān)神經(jīng)受損或進(jìn)行性變性，是視覺(jué)喪失和失明的另一個(gè)主要原因。 一個(gè)重要實(shí)例就是青光眼，這是通過(guò)視神經(jīng)損傷？ 1起#見(jiàn)覺(jué)喪失的 一 大類眼病所組成的眼科病癥。因不適當(dāng)?shù)难鄄刻?流而造成的眼內(nèi)壓(intraocular pressure, IOP)升高，是青光眼的主要原因，但它也可能在沒(méi)有眼內(nèi)壓升高的情況下發(fā)生。
青光眼可隨眼齡增長(zhǎng)而發(fā)展，或可因眼損傷、炎癥、肺瘤、白內(nèi)障或糖尿病而發(fā)生，或可由某些藥物(例如甾體類)引發(fā)。青光眼的視神經(jīng)病變的主要特征包括視神經(jīng)頭的特征性變化，存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少和視覺(jué)喪失。已有人提出，級(jí)聯(lián)事件將視神經(jīng)頭變性與在該病中觀察到的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的緩慢死亡聯(lián)系起來(lái)，而且可通過(guò)使用神經(jīng)保護(hù)藥來(lái)減緩或防止這些級(jí)聯(lián)事件的發(fā)生(Osbome等,2003， Eur. J, Ophthalmol, 13 (增刊3): S19-S26)。
細(xì)胞損傷和變性病癥也影響眼睛的其它部分。例如，白內(nèi)障是因?yàn)檠劬铙w逐漸混;;蟲(chóng)所致。據(jù)信一旦開(kāi)始發(fā)病，白內(nèi)障的發(fā)展按照一個(gè)或多個(gè)常見(jiàn)途徑進(jìn)行，最終損害晶狀體纖維。該病目前用手術(shù)切除和置換受累晶狀體進(jìn)行治療。另一個(gè)實(shí)例涉及構(gòu)成眼表面的角膜和
6周圍結(jié)膜(conjuctiva)。位于角膜和球結(jié)膜(bulbar conju.ctiva)之間的緣上皮含有角膜上皮干細(xì)胞。緣上皮細(xì)胞缺陷(limbal epithelial celldeficiency, LECD)是發(fā)生在史蒂文斯-約翰遜綜合征(Stevens-Johnsonsyndrome)和熱灼傷或化學(xué)灼傷的病癥。LECD經(jīng)常導(dǎo)致角膜上皮和結(jié)膜上皮間失衡，其中角膜被入侵的結(jié)膜上皮細(xì)胞所覆蓋，嚴(yán)重危害角膜表面并影響視敏度(Nakamura, T. & Kinoshita， S.， 2003. Cornea 22(增刊1): S75-S80)。
最近出現(xiàn)的用于組織修復(fù)和再生的基于干細(xì)胞的療法，為許多上述細(xì)胞變性病理和其它眼病提供有前途的療法。干細(xì)胞能自我更新并分化產(chǎn)生多種成熟細(xì)胞譜系。這類細(xì)胞移植可用作重建靶組織的臨床工具，從而恢復(fù)生理學(xué)和解剖學(xué)上的功能。干細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用廣泛，包括組織工程、基因治療遞送和細(xì)胞治療藥，也就是說(shuō)，通過(guò)外源供應(yīng)的產(chǎn)生或含有那些藥物的活細(xì)胞或細(xì)胞組分，將生物治療藥遞送到靶位置(有關(guān)綜述可參見(jiàn)Tresco, P.A.等，2000, Advanced Drug DeliveryReviews 42: 2-37)。
獲取足夠數(shù)量的干細(xì)胞一直是實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞技術(shù)治療潛力的一個(gè)阻礙。干細(xì)胞的一個(gè)來(lái)源是胚胎或胎兒組織。已經(jīng)從多種哺乳動(dòng)物(包括人)中分離出胚胎干細(xì)胞和祖細(xì)胞， 一些這類細(xì)胞類型已經(jīng)顯示出具有自我更新和擴(kuò)增的能力，并能適當(dāng)分化為多種細(xì)胞譜系。在動(dòng)物模型系統(tǒng)中，已經(jīng)報(bào)道胚胎干細(xì)月包分化成RPE細(xì)胞表型，并在移植后能提高宿主光感受器的存活率(Hamta, M.等，2004, Investig. Ophthalmol.Visual Sci. 45: 1020-1025; Schraermeyer, U.等，2001， CellTransplantation 10: 673- 680)。但是，胚胎或胎兒來(lái)源的干細(xì)胞衍生引發(fā)許多倫理學(xué)問(wèn)題，最好通過(guò)鑒定其它來(lái)源的多能干細(xì)胞或多潛能干細(xì)胞來(lái)避免這些問(wèn)題。
成體組織也能獲取干細(xì)胞，用于基于細(xì)胞的眼科療法。例如，視網(wǎng)膜干細(xì)胞和角膜干細(xì)胞本身可以用于眼睛的細(xì)胞替代治療。另外，已經(jīng)報(bào)道來(lái)自海馬的神經(jīng)干細(xì)胞與宿主視網(wǎng)膜結(jié)合，具有某些神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)的特性(有關(guān)綜述參見(jiàn)Lund, R丄.等，2003, J. LeukocyteBiol. 74: 151-160)。已經(jīng)知道，由大鼠胎兒皮層制備的神經(jīng)干細(xì)胞，在移植后通過(guò)RPE細(xì)胞途徑分化為成體大鼠視網(wǎng)膜下腔(Enzmann, V.等,2003, Investig. Ophthalmol. Visual Sci. : 5417-5422)。
已經(jīng)報(bào)道，在骨髓干細(xì)胞移植到宿主視網(wǎng)膜之后，它們分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞和光感受器(Tomita， M.等，2002, Stem Cells 20: 279-283;Kicic, A.等，2003, J. Neurosci. 23: 7742-7749)。 Kicic, A.等人報(bào)道CD90+間充質(zhì)干細(xì)胞能整合到宿主^L網(wǎng)膜中。這些細(xì)胞經(jīng)歷分化，形成類似于光感受器層的結(jié)構(gòu)，并表達(dá)了光感受器特異性標(biāo)記。
Friedlander等(已公布的美國(guó)專利申請(qǐng)US2005/0063961 ，已轉(zhuǎn)讓給Scripps研究所，CA)報(bào)道，通過(guò)往眼內(nèi)注射Lin7CD31+造血干細(xì)胞來(lái)杏》救眼內(nèi)血管和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。
已經(jīng)報(bào)道，在兔子模型系統(tǒng)中，眼表面重建利用培養(yǎng)的粘膜上皮干細(xì)胞(Nakamura， T. & Kinoshita, S., 2003，出處同上)。盡管這些報(bào)道顯示出有望在基于細(xì)胞的眼科療法中使用成體祖細(xì)胞和干細(xì)胞，但是必須注意，成體干細(xì)胞群體相當(dāng)稀有，通常僅通過(guò)侵入性手術(shù)才能得到。
此外，成體干細(xì)胞在培養(yǎng)物中的擴(kuò)增能力比胚胎干細(xì)胞更低。因此，需要合適的細(xì)胞供應(yīng)的替代性來(lái)源，該類細(xì)胞具有支持、增加或取代眼內(nèi)喪失的細(xì)胞功能的能力?？煽康?、良好表征且供應(yīng)充足的這類基本均一的細(xì)胞群體，在眼修復(fù)和再生的多種診斷和治療應(yīng)用中都將會(huì)是有利條件，所述應(yīng)用包括藥物篩選測(cè)定、眼睛和其它有用細(xì)胞類型的離體或體外營(yíng)養(yǎng)支持、以及體內(nèi)基于細(xì)胞的治療。
最后，本發(fā)明涉及細(xì)胞系在眼病治療中的用途。按照已公布的美國(guó)專利申請(qǐng)US2005/0037491所公開(kāi)的方法，在視網(wǎng)膜色素變性的嚙齒動(dòng)物模型中，已經(jīng)對(duì)若干細(xì)胞系進(jìn)行了測(cè)試。本發(fā)明描述了人間充質(zhì)干細(xì)胞在眼病治療中的用途。
8發(fā)明概述
本發(fā)明提供了用于眼科疾病和障礙的基于細(xì)胞的療法或再生療法的組合物和方法。具體地講，本發(fā)明的特征在于間充質(zhì)干細(xì)胞、任選藥物組合物或裝置，用于修復(fù)或再生眼細(xì)胞或組織。 一旦將本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞移植到眼內(nèi)靶部位，它們可在原位給眼細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)支持，或者它們本身可分化成一種或多種表型，或者它們可以這兩種方式發(fā)揮有益效果，但是細(xì)胞并不形成類似于光感受器層的結(jié)構(gòu)，也不表達(dá)光感受器特異性標(biāo)記，例如視紫紅質(zhì)。
本發(fā)明一方面的特征在于治療眼變性性疾病患者的方法，該方法包括給予患者治療眼變性性疾病有效量的多能間充質(zhì)干細(xì)胞或多潛能間充質(zhì)干細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，眼變性性疾病是急性眼變性性疾病，例如腦創(chuàng)傷、枧神經(jīng)創(chuàng)傷或眼損傷，在其它實(shí)施方案中，是慢性或進(jìn)行性變性性疾病，例如黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病、青光眼、緣上皮細(xì)胞缺陷或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞缺陷。在某些實(shí)施方案中，在給藥之前，在體外誘導(dǎo)細(xì)胞分化為神經(jīng)譜系細(xì)胞或上皮譜系細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，間充質(zhì)干細(xì)胞提高眼內(nèi)內(nèi)源光感受器的存活率或增殖。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)內(nèi)源干細(xì)胞或前體細(xì)胞分化成光感受器。
在一個(gè)實(shí)施方案中，間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)至少一種以下標(biāo)記的表達(dá)呈
陽(yáng)性CD29、 CD44、 CD105或CD166。所述細(xì)胞對(duì)至少一種以下標(biāo)記的表達(dá)呈陰性CD14、 CD34或CD45。
在某些實(shí)施方案中，間充質(zhì)干細(xì)胞可以與至少 一種其它細(xì)胞類型一起給予，所述其它細(xì)胞類型例如星形細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)祖細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、-見(jiàn)網(wǎng)膜上皮干細(xì)胞、角膜上皮干細(xì)胞、或者其它多能干細(xì)胞或多潛能干細(xì)胞。在這些實(shí)施方案中，可以在給予間充質(zhì)干細(xì)胞同時(shí)、或之前、或之后給予其它細(xì)胞類型。同樣，在這些和其它實(shí)施方案中，間充質(zhì)干細(xì)胞可以與至少 一種其它藥物 一起給
9予，所述藥物例如用于眼科治療的藥物，或另一種有益藥物，例如抗炎藥、抗凋亡藥、抗氧化劑或生長(zhǎng)因子。在這些實(shí)施方案中，可以在給予間充質(zhì)干細(xì)胞同時(shí)、之前或之后給予其它藥物。
適用于本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞可來(lái)源于諸如下列的各種組織骨髓、臍帶血、羊膜囊、羊水、胎盤(pán)、皮膚、脂肪、肌肉、脈管系統(tǒng)、肝臟、胰腺或外周血。細(xì)胞來(lái)源可以是異種、同種異體或自體的。細(xì)胞可從供體分離出來(lái)并立即進(jìn)4亍移植?；蛘?，也可在移植前先將細(xì)胞在體外擴(kuò)增。
本發(fā)明的細(xì)胞可以超低溫冷藏。移植前，將細(xì)胞解凍并立即進(jìn)行移植?；蛘撸谝浦睬皩⒔鈨黾?xì)胞在體外培養(yǎng)和/或擴(kuò)增?；蛘?，可將細(xì)胞以冷凍沉淀物形式進(jìn)行移才直。
在各種實(shí)施方案中，可將細(xì)胞給予眼表面，或者將其給予眼內(nèi)或接近眼睛的部位，例如眼后或視網(wǎng)膜下腔。
可通過(guò)插管或通過(guò)在眼內(nèi)或眼附近植入患者體內(nèi)的裝置來(lái)給予細(xì)胞，或者可通過(guò)植入含有細(xì)胞的基質(zhì)或支持物而給予細(xì)胞。
本發(fā)明的另 一 方面的特征在于治療眼變性性疾病患者的藥物組合物，該組合物包含藥學(xué)上可4妾受的載體和治療眼變性性疾病有效量的本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞。眼變性性疾病可以是急性、慢性或者進(jìn)行性病癥。在某些實(shí)施方案中，組合物包含本發(fā)明的間充質(zhì)細(xì)胞，所述細(xì)胞配制組合物之前已經(jīng)體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)譜系細(xì)胞或上皮譜系細(xì)胞?；蛘撸M合物包含本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞，所述細(xì)胞在移植后在原位分化為神經(jīng)譜系細(xì)胞或上皮譜系細(xì)胞。
在某些實(shí)施方案中，藥物組合物可包含至少一種其它細(xì)胞類型，如星形細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)祖細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、視網(wǎng)膜上皮干細(xì)胞、角膜上皮干細(xì)胞、或者其它多能或多潛能干細(xì)胞。在這些或其它實(shí)施方案中，藥物組合物可包含至少一種其它藥物，例如治療眼變性性障礙的藥物或其它有益藥物，例如抗炎藥、抗凋亡藥、抗氧化劑或生長(zhǎng)因子。在某些實(shí)施方案中，可將藥物組合物配制成用于眼表面給藥。或 者，它們也可配制成用于眼內(nèi)或眼附近(例如眼后)給藥。組合物還可 配制成含有細(xì)胞的基質(zhì)或支持物。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，^是供治療眼變性性疾病患者的藥盒。藥 盒包括藥學(xué)上可接受的載體、間充質(zhì)干細(xì)胞群體和在患者治療方法中 使用藥盒的說(shuō)明書(shū)。藥盒也可包括一種或多種額外成分，例如培養(yǎng)細(xì) 胞的試劑和說(shuō)明書(shū)，或者至少一種其它細(xì)胞類型的群體，或一種或多 種用于治療眼變性性疾病的藥物。
本發(fā)明另 一 方面的特征在于提高移植細(xì)胞的存活率、生長(zhǎng)或活力 以治療眼變性性疾病的方法。該方法包括使間充質(zhì)干細(xì)胞接觸至少一 種藥物，例如生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)因子、條件培養(yǎng)基、抗炎藥、抗凋亡藥、 抗氧化劑、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)再生藥物或神經(jīng)保護(hù)藥物?；蛘?，該 方法可包括在移植前將間充質(zhì)干細(xì)胞與至少一種其它細(xì)胞類型共培 養(yǎng)，所述其它細(xì)胞類型例如星形細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng) 祖細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、視網(wǎng)膜上皮干細(xì)胞、角膜上皮干細(xì)胞、或者其 它多能或多潛能干細(xì)胞?？梢约尤胫苿缟L(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)因子、 條件培養(yǎng)基、抗炎藥、抗凋亡藥、抗氧化劑、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)再 生藥物或神經(jīng)保護(hù)藥物。還提供了實(shí)施該方法的藥盒。藥盒包括間充 質(zhì)干細(xì)胞和說(shuō)明書(shū)，該說(shuō)明書(shū)上注明使用至少一種能有效提高移植細(xì) 胞的存活率、生長(zhǎng)及活力的制劑來(lái)處理細(xì)胞。該藥盒可包括至少一種 其它細(xì)胞類型和將至少 一 種其它細(xì)胞類型與間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng) 的說(shuō)明書(shū)。
附圖簡(jiǎn)述


圖1:接受細(xì)胞移植的RCS大鼠的ERG記錄概述。所示數(shù)據(jù)是 得自移植后60天(圖A)和90天(圖B)大鼠的ERG記錄(mV)的平均振 幅(每種條件下n=5只動(dòng)物)。,人接受臍帶衍生細(xì)胞的大鼠眼(黑色條帶) 和對(duì)側(cè)假手術(shù)眼(黑色帶點(diǎn)條帶)采集記錄。從接受Cambrex MSC(POIETICS ,目錄號(hào)PT-2501)的大鼠目艮(灰色條帶)和對(duì)側(cè)假手術(shù)眼 (灰色帶點(diǎn)條帶)采集記錄。從接受胎盤(pán)衍生細(xì)胞的大鼠眼(白色條帶) 和對(duì)側(cè)假手術(shù)眼(灰色橫紋條帶)采集記錄。
圖2:接受本發(fā)明MSC的RCS大鼠的視敏度。所示數(shù)據(jù)是假手 術(shù)大鼠(白色條帶)或本發(fā)明MSC (黑色條帶)的4月齡動(dòng)物的視敏度 (n=7)。
圖3:接受本發(fā)明MSC的RCS大鼠的視閾值。所示數(shù)據(jù)是左眼 (A)或右眼(令)接受MSC移植的4月齡動(dòng)物的視敏度(11=7)。對(duì)側(cè)假手 術(shù)眼(左A:右匿)的數(shù)據(jù)作為對(duì)照。
圖4:接受本發(fā)明MSC的動(dòng)物的視網(wǎng)膜組織學(xué)切片。組織切片 得自術(shù)后100天的移植動(dòng)物。
發(fā)明詳述
術(shù)語(yǔ)"眼的"、"眼科的"、"視覺(jué)的"在本文中可互換使用，用于定 義"目艮的、有關(guān)眼的或涉及眼睛的"。術(shù)語(yǔ)"眼變性性疾病，，(或"障礙") 包括急性和慢性眼科病癥、障礙或疾病在內(nèi)的涵蓋性術(shù)語(yǔ)，包括眼睛 與大腦間的神經(jīng)連接，包括細(xì)胞損傷、變性或喪失。眼變性性疾病可 以與年齡相關(guān)，或者可因損傷或創(chuàng)傷所致，或者涉及特定疾病或障礙。
的病癥，包括以下原因引起的病癥腦血管機(jī)能不全、局灶性和彌散 性腦創(chuàng)傷、彌散性腦損傷、眼睛感染或炎癥、視網(wǎng)膜裂孔或脫離、眼 內(nèi)損傷(挫傷、穿透?jìng)?、受壓、撕裂?或其它物理?yè)p傷(例如物理或化 學(xué)灼傷)。慢性眼變性性疾病(包括進(jìn)行性病癥)包括但不限于視網(wǎng)膜病 和其它視網(wǎng)膜/黃斑障礙，例如視網(wǎng)膜色素變性(RP)、年齡相關(guān)性黃斑 變性(AMD)、脈絡(luò)膜新生血管膜(CNVM);視網(wǎng)膜病，例如糖尿病性 視網(wǎng)膜病、阻塞性視網(wǎng)膜病、鐮狀細(xì)胞性視網(wǎng)膜病和高血壓性視網(wǎng)膜 病、^L網(wǎng)膜中央靜脈阻塞、頸動(dòng)脈狹窄、 一見(jiàn)神經(jīng)病，例如青光眼和相 關(guān)綜合征；晶狀體和外眼障礙，例如緣干細(xì)胞缺陷(LSCD)，也稱為緣上皮細(xì)胞缺陷(LECD)(例如在化學(xué)傷害或熱傷害中發(fā)生)、史蒂文斯-
約翰遜綜合征、隱形眼鏡引起的角膜病、眼瘢痕性類天皰瘡、無(wú)虹膜 I缺損或外胚層發(fā)育不良的先天性疾病、以及多發(fā)性內(nèi)分泌缺陷相關(guān) 角膜炎。術(shù)語(yǔ)治療眼變性性疾病是指改善本文所定義的眼變性性疾病 的影響，或者延遲、終止或逆轉(zhuǎn)其發(fā)展，或者延遲或防止其發(fā)作。
術(shù)語(yǔ)"有效量"是指生長(zhǎng)因子、分化劑、營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞群體或其 它藥物等試劑或藥物組合物能有效產(chǎn)生預(yù)期結(jié)果的濃度或數(shù)量，所述 結(jié)果包括細(xì)胞在體外或體內(nèi)生長(zhǎng)和/或分化，或治療本文所述的眼變性 性疾病。對(duì)于生長(zhǎng)因子，有效量范圍為約1毫微克/毫升至約1毫克/
毫升。對(duì)于給予患者體內(nèi)的MSC,有效量范圍從幾百個(gè)甚至更少到幾 百萬(wàn)個(gè)甚至更多。在具體實(shí)施方案中，有效量范圍為103個(gè)細(xì)胞，尤 其是至少約104個(gè)細(xì)胞。可以理解，所給予的細(xì)胞數(shù)量因待治療疾病 的具體情況而異，包括但不限于待治療部位的大小或總體積/表面積， 以及給藥部位與治療部位的接近程度，以及醫(yī)藥生物學(xué)家所熟悉的其 它因素。
術(shù)語(yǔ)"有效期"(或"時(shí)間")和"有效條件"是指一段時(shí)間或其它可控 條件(例如用于體外方法的溫度、濕度)，對(duì)于要達(dá)到預(yù)期結(jié)果的試劑 或藥物組合物而言是必要或優(yōu)選的。
術(shù)語(yǔ)"患者"或"受試者"是指用藥物組合物或按照本文所述的方法 進(jìn)行治療的動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。
本文所用的"干細(xì)胞"是指定義為既能自我更新又能分化產(chǎn)生后 代細(xì)胞的未分化細(xì)胞，包括自我更新的祖細(xì)胞、非自我更新的祖細(xì)胞 和終末分化的細(xì)胞。干細(xì)胞的特征還在于它們?cè)隗w外能由多胚層(內(nèi)胚 層、中胚層和外胚層)分化成各種細(xì)胞譜系的功能細(xì)胞，并在移植后能 產(chǎn)生多胚層組織，以及在注射到胚泡內(nèi)能基本上有助于大多數(shù)(如果不 是全部)組織。
干細(xì)胞可以是全能干細(xì)胞、多潛能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、少能干 細(xì)胞或單能干細(xì)胞。全能細(xì)胞能產(chǎn)生所有胚胎細(xì)胞類型和胚外細(xì)胞類
13型。多潛能細(xì)胞能產(chǎn)生所有胚胎細(xì)胞類型。多能細(xì)胞包括能產(chǎn)生細(xì)胞 譜系亞類的細(xì)胞，但是在特定組織、器官或生理系統(tǒng)(如造血干細(xì)胞，
HSC)內(nèi)的所有細(xì)胞都可產(chǎn)生后代，所述后代包括HSC(自我更新)、血
細(xì)胞限制的少能祖細(xì)胞、以及所有細(xì)胞類型和血液正常組分(例如血小
板)。少能細(xì)胞可產(chǎn)生比多能千細(xì)胞更有限的細(xì)胞譜系亞類；而單能細(xì) 胞能產(chǎn)生單一細(xì)胞i普系(例如4青原干細(xì)胞)。也可根據(jù)獲取干細(xì)胞的來(lái) 源，將干細(xì)胞進(jìn)行分類。成體干細(xì)胞通常是在含有多種分化細(xì)胞類型 的組織中存在的 多能未分4匕纟田月包。成體干纟田月包可以自我更新。在正常 環(huán)境下，它也可分化產(chǎn)生其來(lái)源組織和(可能的)其它組織類型的特化 細(xì)胞類型。
"間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell)" ("MSC")是指源自哺乳動(dòng) 物中胚葉的細(xì)胞，它并未完全分化，具有分化成包括以下各種細(xì)胞和 組織的潛力結(jié)締組織、骨、軟骨、肌肉、血液和血管、淋巴器官和 淋巴樣器官、脊索、胸膜、心包膜、腎和生殖腺。
"祖細(xì)胞"是指由干細(xì)胞經(jīng)分化衍生而來(lái)的細(xì)胞，其能進(jìn)一步分化 成更成熟的細(xì)胞類型。祖細(xì)胞通常具有比干細(xì)胞更有限的增殖能力。
"條件培養(yǎng)基"是指細(xì)胞群體生長(zhǎng)在培養(yǎng)基并將可溶性因子分泌 到培養(yǎng)基中。在這類應(yīng)用中，將細(xì)胞從培養(yǎng)基中移除，但仍然保留這 些細(xì)胞所產(chǎn)生的可溶性因子。然后，在最初細(xì)胞群體所產(chǎn)生的可溶性 因子存在下，將該培養(yǎng)基用于滋養(yǎng)不同細(xì)胞群體。
本文所用的"標(biāo)記"是在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)的核酸分子或多肽 分子。在本文中，差異表達(dá)是指對(duì)于正標(biāo)記而言標(biāo)記水平升高，而對(duì) 于負(fù)標(biāo)記而言則水平降低。與其它細(xì)胞相比，在目標(biāo)細(xì)胞中可檢測(cè)的 標(biāo)記核酸或多肽水平足夠高或者低，使得可以采用本領(lǐng)域已知的各種 方法中的任一種，來(lái)鑒定和區(qū)分目標(biāo)細(xì)胞和其它細(xì)胞。
"分化簇(Cluster of Differentiation)" (CD)分子是細(xì)胞表面標(biāo)記，可 由特定抗體類型識(shí)別，用于鑒定細(xì)胞類型、分化期和細(xì)胞活性狀態(tài)。 CD標(biāo)記的功能和名稱在本領(lǐng)域是眾所周知的(參見(jiàn)The LeukocyteAntigen Fact Book,第2版,Barclay, A. N,等.Academic Press, London 1997)。
"CD14"是脂多糖(LPS)和LPS結(jié)合蛋白(LBP)復(fù)合物的高親和力 受體。CD14抗原是由CD14、 TLR4和MD-2組成的功能性異聚體LPS 受體復(fù)合物的組成部分。CD14在人外周血、其它體液和各種組織(例
如淋巴結(jié)和脾)的大多數(shù)人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)。CD14在人 嗜中性粒細(xì)胞和骨髓樹(shù)突細(xì)胞亞群中弱表達(dá)。 "CD29"也稱為"纖連蛋白受體卩多肽"。
"CD34，，是在內(nèi)皮細(xì)胞和造血干細(xì)胞中組成型表達(dá)的跨膜糖蛋白。 這類含有富含絲氨酸和蘇氨酸的粘蛋白樣結(jié)構(gòu)域的高度糖基化分子 與L-選擇素結(jié)合。
"CD44"也稱為"Hermes抗原"，是透明質(zhì)酸的主要細(xì)胞表面受體。 這種CD主要在除肝細(xì)胞、某些上皮細(xì)胞和心肌等細(xì)胞/組織之外的大 多數(shù)細(xì)胞類型中表達(dá)。
"CD45"是指白細(xì)胞共同抗原，其具有公開(kāi)于Genbank檢索號(hào) Y00638的序列，或其天然存在的變異體序列(例如等位變異體)。
"CD105"也稱為"內(nèi)皮糖蛋白"，主要在內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨 噬細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。
"CD166"是在活化T細(xì)月包、B細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)的I型糖蛋 白，并且看來(lái)是CD6的配體(1，2)。人CD166對(duì)T細(xì)胞的活化可能很 重要。
術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的載體"(或"介質(zhì)")，可與術(shù)語(yǔ)"生物學(xué)上相容 的載體，，或"介質(zhì)"互換使用，是指不僅與有待治療性給予的細(xì)胞和其它 藥物相容，而且在合理的醫(yī)療判斷范圍內(nèi)適用于接觸人體組織和動(dòng)物 組織而沒(méi)有過(guò)度的毒性、刺激性、變態(tài)反應(yīng)或其它并發(fā)癥并且具有相 當(dāng)合理的利益風(fēng)險(xiǎn)比的試劑、細(xì)胞、化合物、材料、組合物和/或劑型。
本文所用的一些術(shù)語(yǔ)涉及細(xì)胞替代治療。術(shù)語(yǔ)"自體轉(zhuǎn)移"、"自 體移植"、"自體移植物"等是指細(xì)胞供體也是細(xì)胞替代治療的受體的治療。術(shù)語(yǔ)"同種異體轉(zhuǎn)移"、"同種異體移植"、"同種異體移植物"等是 指細(xì)胞供體與細(xì)胞替代治療的受體是同 一物種、但卻不是同 一個(gè)體的 治療。供體細(xì)胞與受體已經(jīng)進(jìn)行組織相容性匹配的細(xì)胞轉(zhuǎn)移，有時(shí)稱
為"同源轉(zhuǎn)移(syngeneic transfer)"。 術(shù)i吾"異種壽爭(zhēng)移(xenogeneic transfer)","異種移植"、"異種移植物"等是指細(xì)胞供體與細(xì)胞替代治 療的受體是不同物種的治療。
間充質(zhì)干細(xì)J包的分離和表征
適用于本發(fā)明方法的間充質(zhì)干細(xì)胞可采用本領(lǐng)域眾所周知的方 法得自例如以下組織骨髓、臍帶血、羊膜嚢、羊水、胎盤(pán)、皮膚、 脂肪、肌肉、脈管系統(tǒng)、肝、胰臟或外周血。采用MSC表面表達(dá)的 單克隆抗體特異性蛋白質(zhì)，可以對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞群體進(jìn)行分離。單克 隆抗體可能粘附在基質(zhì)上，便于分離結(jié)合的細(xì)胞。本領(lǐng)域普通對(duì)支術(shù)人 員可選擇用于分離適用于本發(fā)明的MSC的方法。這類方法的實(shí)例可 參見(jiàn)US6087113 、 US6261549 、 US5914262 、 US5908782 和 US20040058412。
MSC可以按照以下特性來(lái)表征例如生長(zhǎng)特性(例如群體倍增效 率、倍增時(shí)間、傳代至衰老)、核型分析(例如正常核型；母體譜系或 新生兒譜系)、流式細(xì)胞儀分析(例如FACS分析)、免疫組織化學(xué)和/ 或免疫細(xì)胞化學(xué)(例如表位的檢測(cè))、基因表達(dá)譜分析(例如基因芯片陣 列；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(例如逆轉(zhuǎn)錄酶PCR、實(shí)時(shí)PCR和常規(guī)PCR))、 蛋白質(zhì)陣列、蛋白質(zhì)分泌-19 (例如通過(guò)血漿凝塊測(cè)定或PDC條件培養(yǎng) 基分析，例如通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA))、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(例 如測(cè)定PBMC的刺激)和/或本領(lǐng)域已知的其它方法。
適用于本發(fā)明方法的間充質(zhì)干細(xì)胞也可包括商業(yè)來(lái)源的細(xì)胞，例 如商品名為POIETICS 的人間充質(zhì)干細(xì)胞(目錄號(hào)PT-2501, Cambrex)。這些間充質(zhì)千細(xì)胞對(duì)以下標(biāo)記的表達(dá)呈陽(yáng)性CD29、 CD44、 CD105和CD166。該類細(xì)胞對(duì)標(biāo)記CD14、 CD34和CD45的表達(dá)呈陰
16性。
分離的MSC或獲取MSC的組織，都可用于開(kāi)始或接種細(xì)胞培養(yǎng)。 分離的細(xì)胞可移至無(wú)菌組織培養(yǎng)容器中，這類培養(yǎng)容器可包被或未包 被胞外基質(zhì)或配體，例如層粘連蛋白、膠原蛋白(天然、變性或交聯(lián))、
明膠、纖連蛋白和其它胞外基質(zhì)蛋白。可在能維持MSC生長(zhǎng)的任何 培養(yǎng)基中培養(yǎng)MSC,這類培養(yǎng)基例如DMEM (高或低葡萄糖)、改良 DMEM、 DMEM/MCDB201、 Eagle基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Ham氏F10培養(yǎng)基 (FIO)、 Ham氏F-12培養(yǎng)基(F12)、 Iscove改良Dulbecco-17培養(yǎng)基、 間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MSCGM)、 DMEM/F12、 RPMI 1640和 CELL-GRO-FREE。培養(yǎng)基中可以補(bǔ)充一種或多種成分，包括例如胎 牛血清(FBS);馬血清(ES);人血清(HS); P-巰基乙醇(BME或2-ME), 優(yōu)選約0.001% (v/v); —種或多種生長(zhǎng)因子，例如血小板衍生生長(zhǎng)因 子(PDGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血管內(nèi) 皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 (IGF-1)、白細(xì)胞抑制因子 (LIF)和紅細(xì)胞生成素；氨基酸，包括L-纈氨酸；和一種或多種控制微 生物污染的抗生素和/或抗真菌藥，例如青霉素G、硫酸鏈霉素、兩性 霉素B、慶大霉素和制霉菌素，可以單用或聯(lián)用。可將細(xì)胞接種在培 養(yǎng)容器中，其密度允許細(xì)胞生長(zhǎng)。
選擇最合適培養(yǎng)基、培養(yǎng)基制品和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的方法是本領(lǐng)域 眾所周知的，可參見(jiàn)各種來(lái)源，包括Doyle等(編著)，1995, CELL & TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley & Sons, Chichester;以及Ho和Wang (編著)，1991, ANIMAL CELL BIOREACTORS, Butterworth-Heinemann， Boston。
間充質(zhì)干細(xì)胞在治療眼科疾病中的用途
在本發(fā)明的一方面，MSC用于治療眼變性性疾病的細(xì)胞療法。 一旦將MSC移植到眼內(nèi)靶部位，MSC可在原位給眼細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)支 持，或者它們本身分化成一種或多種表型，或者它們以這兩種方式發(fā)
17揮有益效果。
給予?？刹捎贸Ｒ?guī)藥學(xué)上可接受的載體，以藥物制劑形式給予MSC。 當(dāng)MSC與其它細(xì)胞一起給予時(shí)，它們可以與其它細(xì)胞同時(shí)或序貫給
予(在給予其它細(xì)胞之前或之后)?？膳cMSC聯(lián)合給予的細(xì)胞包括但不
限于神經(jīng)元、星形細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、
眼祖細(xì)胞、^L網(wǎng)膜或角膜上皮千細(xì)胞和/或其它多能或多潛能干細(xì)胞。 不同類型的細(xì)胞可直接與MSC混合，或在臨用前混合，或者可在給 予之前將它們共同培養(yǎng)一段時(shí)間。
MSC可與至少一種藥物耳關(guān)用，例如生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)因子、條件 培養(yǎng)基或其它活性藥物，例如抗炎藥、抗凋亡藥、抗氧化劑、神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng)因子或本領(lǐng)域已知的神經(jīng)再生藥物或神經(jīng)保護(hù)藥物。當(dāng)MSC與其 它藥物聯(lián)用時(shí)，它們可以單一藥物組合物形式一起給予，或以單獨(dú)的 藥物組合物形式，與其它藥物同時(shí)或序貫給予(在給予其它藥物之前或 之后)。
與間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)用的其它成分的實(shí)例包括但不限于(l)其它神 經(jīng)保護(hù)藥或?qū)ι窠?jīng)有益的藥物；(2)所選胞外基質(zhì)組分，例如本領(lǐng)域已 知的一種或多種類型的膠原蛋白，和/或生長(zhǎng)因子、富含血小板的血漿 和藥物(或者，細(xì)胞可經(jīng)基因工程改造以表達(dá)和產(chǎn)生生長(zhǎng)因子)；(3)抗 凋亡藥(例如紅細(xì)胞生成素(EPO)、 EPO模擬抗體(mimetibody)、血小 板生成素、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-I、 IGF-II、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胱 冬蛋白酶抑制劑)；(4)抗炎化合物(例如p38 MAP激酶抑制劑、TGF-P 抑制劑、抑制素(stating)、 IL-6抑制劑、IL-1抑制劑、吡嘧司特 (PEMIROLAST)、曲尼司特(TRANILAST)、 英夫利昔單抗 (REMICADE)、西羅莫司(SIROLIMUS)和非甾體抗炎藥(NSAIDS)(例 如:36替泊沙林(TEPOXALIN)、托美丁和舒洛芬)；("免疫抑制藥或免 疫調(diào)節(jié)藥，例如神經(jīng)鈣蛋白抑制劑、mTOR抑制劑、抗增殖藥、皮質(zhì) 類固醇和各種抗體；(6)抗氧化劑，例如普羅布考、維生素C、維生素E、輔酶Q-IO、谷胱甘肽、L-半胱氨酸和N-乙酰基半胱氨酸；和(6)
局部麻醉藥等。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以未分化細(xì)胞形式給予MSC,即給予在 生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的MSC?；蛘?，使MSC接觸到能刺激MSC分化 為所需表型的條件培養(yǎng)基，然后再給予。可經(jīng)外科植入、注射或其它 方式將細(xì)胞直接或間接給予眼損傷部位或患處。當(dāng)在半固體或固體裝 置中給予細(xì)胞時(shí)，常規(guī)合適的主合藥方式是經(jīng)外科植入機(jī)體內(nèi)的準(zhǔn)確部 位。然而，液體或流體藥物組合物則可以給予更常M^的眼睛給藥部位 (例如局部或眼內(nèi))。
其它實(shí)施方案涵蓋眼變性性疾病的治療方法，即通過(guò)給予包含 MSC細(xì)胞組分(例如細(xì)胞裂解物或其組分)或產(chǎn)物(例如由MSC天然產(chǎn) 生或經(jīng)遺傳修飾而產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)因子和其它生物因子，來(lái)自MSC培養(yǎng) 物的條件培養(yǎng)基)的藥物組合物。
另外，這些方法還可包括給予其它活性藥物，例如生長(zhǎng)因子、營(yíng) 養(yǎng)因子或者本領(lǐng)域已知的神經(jīng)再生藥或神經(jīng)保護(hù)藥。
按照良好醫(yī)藥管理規(guī)范(good medical practice),考慮到每個(gè)患者 的具體情況(例如眼變性性疾病的特點(diǎn)和程度、年齡、性別、體重和一 般醫(yī)學(xué)狀況以及主治醫(yī)師已知的其它因素)，來(lái)確定MSC或本文所述 的任何其它藥物組合物的劑型和給藥方案。因此，根據(jù)本領(lǐng)域已知的 這些考慮，確定給予患者的藥物組合物的有效量。
在開(kāi)始細(xì)胞治療之前，最好是或適合于對(duì)患者進(jìn)行藥理學(xué)上的免 疫抑制。可以通過(guò)使用全身或局部免疫抑制藥來(lái)達(dá)到該目的，或者通 過(guò)用包膠嚢裝置給予細(xì)胞而達(dá)到該目的。用于減少或消除針對(duì)移植細(xì)
法，可以對(duì)MSC進(jìn)行遺傳修飾以減少其免疫原性。
按照本發(fā)明的另一方面，提供治療眼變性性疾病患者的方法，該 方法包括給予患者治療眼變性性疾病有效量的間充質(zhì)干細(xì)胞的制劑， 其中制劑包含MSC的細(xì)胞裂解物、或MSC在其中生長(zhǎng)的條件培養(yǎng)基、或MSC的胞外基質(zhì)。裂解物可包含MSC的至少一種或所有亞細(xì)胞部
分，例如質(zhì)膜部分。細(xì)胞的裂解方法是本領(lǐng)域眾所周知的，包括機(jī)械 破碎、酶促破碎或化學(xué)破碎或其組合等各種方法?？梢杂缮L(zhǎng)培養(yǎng)基 中的細(xì)胞，直接制備這類細(xì)胞裂解物(因而含有分泌的生長(zhǎng)因子)，或
者可以由經(jīng)PBS或其它溶液等洗滌而不含培養(yǎng)基的細(xì)胞來(lái)制備這類 細(xì)胞裂解物。優(yōu)選以大于原始群體密度的濃度重懸洗滌過(guò)的細(xì)胞。在 一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)破碎細(xì)胞而隨后不分離細(xì)胞部分的方式， 制備全細(xì)胞裂解物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)離心、過(guò)濾等本領(lǐng) 域已知的常規(guī)方法或類似方法，從細(xì)胞可溶性部分中分離出細(xì)胞膜部 分。
可以通過(guò)超濾或凍干、甚至干燥、部分純化等方法進(jìn)一步濃縮由 MSC群體制備而來(lái)的細(xì)胞裂解物或細(xì)胞可溶性部分，并與本領(lǐng)域已知 的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑混合使用，或與其它化合物(例如藥學(xué)
上有用的蛋白質(zhì)組合物等生物制品)混合使用。細(xì)胞裂解物或其部分可 用于體外或體內(nèi)，單用或例如與自體或同種異體活細(xì)胞一起使用。如 果將裂解物導(dǎo)入體內(nèi)的話，可以將裂解物導(dǎo)入局部治療部位或遠(yuǎn)離治 療部位，從而向患者提供例如所需細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
另一方面，本發(fā)明的特征在于包含藥學(xué)上可接受的載體和間充質(zhì) 干細(xì)胞制劑的藥物組合物，所述制劑是MSC的裂解物、MSC的胞外 基質(zhì)或MSC在其中生長(zhǎng)的條件培養(yǎng)基。也提供實(shí)施本發(fā)明該方面的 藥盒。藥盒可包括一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或其它藥物或試 劑、 一種或多種細(xì)胞裂解物或其部分、MSC胞外基質(zhì)或條件培養(yǎng)基、 以及使用藥盒內(nèi)各組分的說(shuō)明書(shū)。
藥物制劑
本發(fā)明的藥物組合物可包括產(chǎn)后細(xì)胞MSC或其組分或產(chǎn)物，及 與其配制在一起的藥學(xué)上可接受的載體或介質(zhì)。合適的藥學(xué)上可接受 的載體包括水、鹽溶液(例如林格液)、醇類、油類、明膠和糖類(例如乳糖、直鏈淀粉或淀粉)、脂肪酸酯、羥曱基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮。 這類制劑可以滅菌，如有必要，可以與輔料混合，例如潤(rùn)滑劑、防腐 劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽類、緩沖劑和著色劑。 通常但不一定，包含細(xì)胞組分或產(chǎn)物、但不含活細(xì)胞的藥物組合物可 配制成液體。包含活MSC的藥物組合物通?？膳渲瞥梢后w、半固體(例 如凝月交劑)或固體(例如基質(zhì)、支持物等，適用于眼組織工程)。
藥物組合物可包含藥物化學(xué)家或生物學(xué)家所熟知的輔料組分，例 如，它們可根據(jù)所用抗氧化劑種類的不同而含有不同范圍的抗氧化 劑。通用抗氧化劑的合理范圍約0.01°/。至約0.15% (重量體積比)的
EDTA、約0.01%至約2.0% (重量體積比)的亞硫酸鈉和約0.01%至約 2.0% (重量體積比)的焦亞碌L酸鈉。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用以上各試劑 的濃度約為0.1%(重量體積比)。其它代表性化合物包括巰基丙酰甘氨 酸、N-乙酰半胱氨酸、(3-巰基乙胺、谷胱甘肽和類似化合物，盡管也 可使用適于眼用的其它抗氧化劑(例如抗壞血酸及其鹽或亞硫酸鈉或 焦亞辟b酸鈉)。
可使用緩沖劑以維持滴眼劑的pH范圍在約4.0至約8.0;以便盡 可能減少對(duì)眼睛的刺激。對(duì)于玻璃體內(nèi)或眼內(nèi)直接注射而言，制劑的 pH應(yīng)為7.2-7.5,或者pH為7.3-7.4。眼科用組合物也可包含適于眼用 的張力劑。其中合適的張力劑是氯化鈉，用0.9%鹽水使制劑大致等張。
在某些實(shí)施方案中，藥物組合物可與增稠劑一起配制。這類試劑 可以是例如羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、曱基纖維素和聚乙烯吡咯 烷酮。如有必要，藥物組合物可具有助溶劑。合適的助溶劑可包括甘 油、聚乙二醇(PEG)、聚山梨酯、丙二醇和聚乙烯醇。也可包含防腐 劑，例如苯扎氯銨、千索氯銨、三氯叔丁醇、醋酸苯汞、硝酸苯汞、 硫柳汞、對(duì)羥基苯曱酸曱酯或?qū)αu基笨曱酸丙酯。
注射用制劑可設(shè)計(jì)成單次給藥用且不含防腐劑。注射用溶液劑可 以與0.9%氯化鈉溶液等張(滲透壓摩爾濃度為290-300 mM (milliosmole))。可通過(guò)添力口氯化鈉或以上列舉的其它助溶劑或賦形劑(例如以上列舉的緩沖劑和抗氧化劑)來(lái)達(dá)到該目的。
眼前房組織浸泡在房水中，而視網(wǎng)膜持續(xù)暴露給玻璃體液。這些 流體/凝膠以高度還原狀態(tài)存在，因?yàn)樗鼈兒锌寡趸衔锖兔?。?此，眼科用組合物中最好包含還原劑。合適的還原劑包括N-乙酰半胱 氨酸、抗壞血酸或鹽形式、以及亞石泉酸鈉或焦亞石充酸鈉，其中抗壞血 酸和/或N-乙酰半胱氨酸或谷胱甘肽特別適于注射用溶液劑。
可按本領(lǐng)域已知的一種或多種不同給藥形式，將包含細(xì)胞、細(xì)胞 組分或細(xì)胞產(chǎn)物的藥物組合物遞送到患者眼內(nèi)。在一個(gè)適用于某些情 況下的實(shí)施方案中，將組合物的滴眼劑或洗眼劑局部遞送到眼內(nèi)。在
另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)周期性眼內(nèi)注射或輸注灌洗液(例如BSS或 BSS PLUS ， Alcon USA， Fort Worth, TX),將組合物遞送到眼內(nèi)不同部 位。或者，組合物可適用于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它眼科用劑型， 例如預(yù)制的或原位形成的凝膠劑或脂質(zhì)體，例如公開(kāi)于美國(guó)專利 5,718,922 (Herrero-Vanrell)的那些。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)隱形 眼鏡(例如Lidofilcon B. Bausch & Lomb CW79或DELTACON (DeltafilconA)或臨時(shí)停留在眼表面的其它物體，將組合物遞送到需要 治療的眼睛晶狀體或通過(guò)晶狀體來(lái)遞送。在其它實(shí)施方案中，可使用 支持物，例如膠原蛋白角膜護(hù)罩(例如BIO-COR溶解角膜護(hù)罩 (dissolvable corneal shields), Summit Technology, Watertown, Mass.)。
也可通過(guò)滲透泵(ALZET， Alza Corp., Palo Alto, Calif.)的插管，或 者植入定時(shí)釋放膠嚢劑(OCCUSENT)或生物可降解盤(pán)(OCULEX， OCUSERT)，將組合物輸注到眼球，來(lái)給予組合物。這些給藥途徑的 優(yōu)勢(shì)是能持續(xù)將藥物組合物供應(yīng)給眼睛。對(duì)例如角膜局部給藥而言， 這可能是優(yōu)勢(shì)。
通常配制包含活細(xì)胞和半固體或固體載體的藥物組合物，用于經(jīng) 外科;f直入眼損傷部位或患處?？梢岳斫?，也可通過(guò)外科手術(shù)給予液體 組合物。在具體實(shí)施方案中，半固體或固體藥物組合物可包括半滲透 性凝膠、網(wǎng)格、細(xì)胞支持物等，它們可以是非生物可降解的或是生物
22可降解的。例如，在某些實(shí)施方案中，最好是或適合于將來(lái)自環(huán)境的 外源細(xì)胞螯合起來(lái)，使細(xì)胞能夠?qū)⑸锓肿臃置诤瓦f送給周圍細(xì)胞。
在這些實(shí)施方案中，可以將細(xì)胞配制成包含活MSC或細(xì)胞群體的自 體植入物，所述活MSC或細(xì)胞群體中包含的MSC由非生物可降解的、 選擇性滲透屏障所包圍，從而將移植細(xì)胞與宿主組織在物理上隔離 開(kāi)。這類植入物有時(shí)稱為"免疫保護(hù)"植入物，因?yàn)樗鼈冊(cè)跊](méi)有藥理學(xué) 引入的免疫抑制劑的情況下，能防止免疫細(xì)胞和大分子殺傷移植細(xì)胞 (有關(guān)這類裝置和方法的綜述參見(jiàn)例如P.A. Tresco等，2000， Adv. Drug Delivery Rev. 42: 3-27》
支持物
一方面，可將本發(fā)明的MSC摻入到支持物材料中，再進(jìn)行移植。 適用于本發(fā)明的目的的支持物材料包括用于組織修復(fù)的組織模板 (tissue template)、 導(dǎo)管(conduit)、屏P章(barrier),口貝i庫(kù)(reservoir)。 具體 地講，已經(jīng)用于在體外和體內(nèi)重建或再生生物組織、以及遞送趨化藥 物以誘導(dǎo)組織生長(zhǎng)的泡沫、海綿、凝膠、水凝膠、紡織物和無(wú)紡結(jié)構(gòu) 等形式的合成和天然材料，都適用于實(shí)施本發(fā)明的方法。參見(jiàn)例如以 下文獻(xiàn)中公開(kāi)的材料美國(guó)專利5,770,417、美國(guó)專利6,022,743、美 國(guó)專利5,567,612、美國(guó)專利5,759,830、美國(guó)專利6,626,950、美國(guó)專 利6,534,084、美國(guó)專利6,306,424、美國(guó)專利6,365,149、美國(guó)專利 6，599，323、美國(guó)專利6,656,488和美國(guó)專利6,333,029。適用于本發(fā)明 的示例性聚合物公開(kāi)于美國(guó)公布申請(qǐng)2004/0062753A1和美國(guó)專利 4,557,264。
為了形成摻有藥用制劑的支持物，可將藥用制劑與聚合物溶液混 合，然后再形成支持物?；蛘?，可將藥用制劑涂覆在制造好的支持物 上，優(yōu)選在藥物載體存在的條件下。藥用制劑可呈液體、細(xì)微固體或 其它任何合適物理狀態(tài)?；蛘?，可將賦形劑加入到支持物中，改變藥 用制劑的釋放速率。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，支持物中摻入至少一種
23藥用化合物，其為抗炎化合物，例如美國(guó)專利6,509,369中公開(kāi)的化 合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，支持物中摻入至少一種藥用化合物，其為抗 凋亡化合物，例如美國(guó)專利6,793，945中公開(kāi)的化合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，支持物中摻入至少一種藥用化合物，其為 纖維化抑制劑，例如美國(guó)專利6,331,298中公開(kāi)的化合物。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，支持物中摻入至少一種能加強(qiáng)血管生成的 藥用化合物，例如美國(guó)公布申請(qǐng)2004/0220393和美國(guó)公布申請(qǐng) 2004/0209901中公開(kāi)的化合物。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，支持物中摻入至少一種藥用化合物，其為 免疫抑制化合物，例如美國(guó)公布申請(qǐng)2004/0171623中公開(kāi)的化合物。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，支持物中摻入至少一種藥用化合物，其為 生長(zhǎng)因子，例如TGF-卩家族成員(包括TGF-(31、 TGF-(32和TGF-卩3)、 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2、 -3、 -4、 -5、 -6、 -7、 -11、 -12和-13)、成纖 維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1和-2、血小板衍生生長(zhǎng)因子-AA和-BB、富含血小 板的血漿、胰島素生長(zhǎng)因子(IGF-I、 11)、生長(zhǎng)分化因子(GDF-5、畫(huà)6、 -8、 -10、 -15)、血管內(nèi)皮細(xì)胞衍生生長(zhǎng)因子(VEGF)、多效營(yíng)養(yǎng)因子、內(nèi)皮 素等。其它藥用化合物可包括例如煙酰胺、低氧誘導(dǎo)因子l-a、高血 糖素樣肽-1 (GLP-1)、 GLP-1和GLP-2模擬抗體和II、毒蜥外泌肽4 (Exendin-4)、視黃酸、甲狀旁腺激素、生腱蛋白-C、原彈性蛋白、凝 血酶衍生肽、殺微生物肽(cathelicidin)、防御素、層粘連蛋白、含有粘 附胞外基質(zhì)蛋白(例如纖連蛋白和玻連蛋白)的細(xì)胞結(jié)合域和肝素結(jié)合 域的生物肽、MAPK抑制劑，例如以下文獻(xiàn)中公開(kāi)的化合物美國(guó)公 布申請(qǐng)2004/0209901和美國(guó)/>布申請(qǐng)2004/0132729。
可通過(guò)將細(xì)胞簡(jiǎn)單沉積在支持物上，將本發(fā)明細(xì)胞摻入到支持物 中。細(xì)胞可通過(guò)簡(jiǎn)單擴(kuò)散進(jìn)入支持物中(J, Pediatr. Surg. 23 (1 Pt 2): 3-9 (1988))。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出其它一些方法以提高細(xì)胞接種的效率。例如，已 經(jīng)使用轉(zhuǎn)瓶將軟骨細(xì)胞接種到聚乙醇酸支持物中(Biotechnol. Prog.14(2): 193-202 (1998))。接種細(xì)胞的另 一方法是采用離心，由此得到對(duì)接種細(xì)胞的最小應(yīng)力并提高接種效率。例如，Yang等開(kāi)發(fā)了一種細(xì)胞接種方法(J. Biomed. Mater. Res. 55(3): 379-86 (2001)),也稱為離心細(xì)胞固定化法(CCI)?？赏ㄟ^(guò)使用各種掃描技術(shù)測(cè)定患者活體內(nèi)移植細(xì)胞的存活，所述技術(shù)例如計(jì)算機(jī)軸向斷層掃描(CAT或CT)、磁共振成像(MRI)或正電子發(fā)射斷層掃描(PET)。
也可通過(guò)尸體解剖，取出組織并目測(cè)或通過(guò)顯微鏡觀察而進(jìn)行移植物存活測(cè)定?；蛘?，可采用對(duì)神經(jīng)細(xì)胞或眼細(xì)胞或其產(chǎn)物(例如神經(jīng)遞質(zhì))具有特異性的染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色處理。也可事先摻入示蹤染料(例如用羅丹明或熒光素標(biāo)記的微球體、堅(jiān)牢藍(lán)、高鐵微粒、雙苯曱酰胺)或用基因工程技術(shù)引入報(bào)道基因產(chǎn)物(P-半乳糖苷酶或P-葡糖醛酸糖香酶)，來(lái)鑒別移植細(xì)胞。
對(duì)受損傷或患病眼功能的恢復(fù)進(jìn)行檢查，可評(píng)價(jià)移植細(xì)胞在患者眼組織的功能整合性。例如，可通過(guò)視敏度的改善和對(duì)異常的評(píng)價(jià)以及立體4充色基才聶影(stereoscopic color fundus photograph)的等纟及，來(lái)石角定黃斑變性或其它視網(wǎng)膜病的療效(Age-Related Eye Disease StudyResearch Group, NEI, NIH, AREDS Report No. 8， 2001, Arch.Ophthalmol. 119: 1417-1436)。
根據(jù)以下實(shí)施例進(jìn)一 步說(shuō)明本發(fā)明，但不得視為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例
間充質(zhì)干細(xì)胞在視網(wǎng)膜色素變性治療中的用途經(jīng)遺傳改造的Royal College of Surgeon (RCS)大鼠易于經(jīng)歷由視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞基本功能異常而引起的顯著視覺(jué)喪失。采用該模型，在RCS大鼠中測(cè)定視網(wǎng)膜下移植間充質(zhì)干細(xì)胞群體保護(hù)光感受器的功效。在該變性性模型中，視桿細(xì)胞功能在出生后30-60天內(nèi)喪失。視錐細(xì)胞功能通常在3個(gè)月內(nèi)喪失。移植用MSC的制備
成人MSC培養(yǎng)物(目錄號(hào)PT-2501, Cambrex)在體外擴(kuò)增共6代。所有細(xì)胞以5,000細(xì)胞/cm2先接種在未包被的T75瓶中，其中裝有按照制造商(Cambrex)使用說(shuō)明而補(bǔ)充的間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基。對(duì)于后續(xù)傳代，所有細(xì)胞處理如下。胰蛋白酶水解后，經(jīng)錐蟲(chóng)藍(lán)染色后進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。簡(jiǎn)而言之，將50ml細(xì)胞懸液與50ml 0.04% w/v錐蟲(chóng)藍(lán)(Sigma, St. Louis MO)混合，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定活細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶水解，用無(wú)補(bǔ)充物的DMEM:低葡萄糖培養(yǎng)基(Invitrogen，Carlsbad, CA)洗滌3次。第6 4戈人MSC細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)胰蛋白酶水解，用Leibovitz L-15培養(yǎng)基(Invitrogen, Carlsbad, CA)洗滌2次，除去血清成分。為了進(jìn)行移植手術(shù)，營(yíng)養(yǎng)不良的RCS大鼠用賽拉口秦-氯胺酮麻醉(lmg/kg i.p.以下混合物2.5ml 20mg/ml賽拉溱，5ml 100mg/ml氯胺酮和0.5ml蒸餾水)，將它們的頭用壓尺(nosebar)固定。將不含血清的細(xì)胞重懸(每次注射2 X 104細(xì)胞)于2ml Leibovitz, L-15培養(yǎng)基(Invitrogen， Carlsbad, CA)中，用精細(xì)玻璃移液管(內(nèi)徑75-150mm)經(jīng)鞏膜(trans-sceraliy)移植。將細(xì)胞遞送到已麻醉的3周齡營(yíng)養(yǎng)不良-色素RCS大鼠(共N二10/細(xì)胞類型)的顳部背側(cè)(dorso-temporal)視網(wǎng)膜下腔。
將細(xì)胞單側(cè)注射到右眼，而左眼僅注射載體培養(yǎng)基(安慰劑對(duì)照；Leibovitz L-15培養(yǎng)基)。在細(xì)胞注射完成后，經(jīng)錐蟲(chóng)藍(lán)排除試驗(yàn)測(cè)定殘余未注射細(xì)胞的活力大于95%。注射細(xì)胞之后，在移植后10天給動(dòng)物注射地塞米松(2mg/kg)。研究期間，從移植前2天直到研究結(jié)束時(shí)，持續(xù)給動(dòng)物口服環(huán)孢菌素A (210mg/L飲用水；使血濃度為250-300mg/L) (Bedford Labs, Bedford, Ohio)。隨意進(jìn)食々欠水。在術(shù)后60天或90天處死動(dòng)物，其余動(dòng)物在更早時(shí)間點(diǎn)被處死，用于對(duì)細(xì)胞移植相關(guān)的短期變化進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。
也測(cè)定了在RCS大鼠中觀察到能治療眼變性的其它細(xì)胞類型的能力。由人臍帶衍生細(xì)胞(在已公布的美國(guó)專利申請(qǐng)US2005/0054098中公開(kāi)的細(xì)胞)、人胎盤(pán)衍生細(xì)胞(在已公布的美國(guó)專利申請(qǐng)US2005/0058631中公開(kāi)的細(xì)胞)和成纖維細(xì)胞制備細(xì)胞組合物。按照上述方法，將細(xì)胞組合物給予平行組動(dòng)物。
功能測(cè)定
視網(wǎng)膜電位圖記錄視網(wǎng)膜電位圖(ERG)是視網(wǎng)膜內(nèi)產(chǎn)生的電位記錄(動(dòng)作電位)(通常響應(yīng)閃光燈)。用兩個(gè)電極來(lái)記錄，其中一個(gè)電極放在眼角膜上或鄰近眼角膜，而另一個(gè)則放在頭皮上。按照Sauve等(2004)所述，進(jìn)行過(guò)夜暗適應(yīng)后，在昏暗紅燈下準(zhǔn)備給動(dòng)物進(jìn)行ERG記錄。簡(jiǎn)而言之，在麻醉下(用150mg/kg i.p氯胺酮和10mg/kg i.p.賽拉。秦的混合物)將頭部固定在立體定位的頭架上，用直腸溫度計(jì)監(jiān)測(cè)體溫，用家用電熱毯維持體溫在3S。C。用等量的局部2.5%去氧腎上腺素和1%托吡卡胺散瞳。用0.75%布比卡因局部麻醉以防任何角膜反射，頻繁將0.9%鹽水滴在角膜上，以防脫水并讓其與記錄電極(金線圈)保持電接觸。在頭皮下介于兩眼之間插入25號(hào)針頭，作為參考電極。用來(lái)自LKC Technologies (Gaithersburg, MD)的UTAS-3000系統(tǒng)，提供放大(在l-1000Hz帶通，沒(méi)有陷波過(guò)濾)、刺激呈現(xiàn)和數(shù)據(jù)獲取。
雙重閃光方案用于測(cè)定分離的視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞反應(yīng)(Nixon等，2001)。使用帶有標(biāo)定的空視野(ganzfeld)的UTAS-3000系統(tǒng)(LKCTechnologies)的指定特征，在調(diào)節(jié)閃光后，讓探頭閃光出現(xiàn)1秒鐘；確保刺激器再次充電完全。在該步驟中調(diào)節(jié)閃光的作用是瞬時(shí)飽和視桿細(xì)胞，使得它們對(duì)探頭閃光無(wú)反應(yīng)。對(duì)探頭閃光的反應(yīng)視為反射視錐細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的活性(a波)。從混合反應(yīng)(在單獨(dú)給予探頭閃光后得到，即不在任何調(diào)節(jié)的閃光之前)中減去視錐細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)，得到視桿細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的b波。
對(duì)于暗適應(yīng)b波的定量測(cè)定，記錄包括單次閃光呈現(xiàn)(10毫微秒(lisec)的持續(xù)時(shí)間)，重復(fù)3-5次，以證實(shí)反應(yīng)的可靠性并改善信噪比，如有必要。在范圍為-3.6至1.41og坎德拉(candila)/m2亮度的一對(duì)數(shù)單位階躍中，提供6次逐漸增加強(qiáng)度的刺激。為了使視桿細(xì)胞的電位漂移(potentialbleaching)減至最低，將刺激間隔增加，使刺激亮度從最低刺激強(qiáng)度10秒增加到最高刺激強(qiáng)度的2分鐘。最大b波振幅定義為得自閃光強(qiáng)度系列的振幅，無(wú)論刺激強(qiáng)度如何(Nusinowitz等，1999)。
在第60天所測(cè)的所有結(jié)果中，接受臍帶細(xì)胞注射的動(dòng)物(11=6)都表現(xiàn)出改善，a波(27土11)對(duì)安慰劑對(duì)照(0)，混合b波(117土67)對(duì)安慰劑對(duì)照(18土13),視錐細(xì)胞b波(55±25)對(duì)安慰劑對(duì)照(28±11),以及視桿細(xì)胞的貢獻(xiàn)(49±16%)對(duì)安慰劑對(duì)照(6±7%)。此外，在2個(gè)所測(cè)動(dòng)物中測(cè)得第90天的改善反應(yīng)為a波(15土7)對(duì)安慰劑對(duì)照(0)，混合b波(37±15)對(duì)安慰劑對(duì)照(0),視錐細(xì)胞b波(16±11)對(duì)安慰劑對(duì)照(7±5),以及視桿細(xì)胞的貢獻(xiàn)(58±39%)對(duì)安慰劑對(duì)照(0%)。(圖1)。在這些動(dòng)物中所觀察到的反應(yīng)都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在未治療或安慰劑治療的動(dòng)物中所觀察到的。在第58天MSC注射0=5)表明a波測(cè)定值(16.4士13.1)對(duì)安慰劑對(duì)照(14.6士12.5)的反應(yīng)性。在混合b波反應(yīng)(81.6土15.3)對(duì)安慰劑(54.4土24.5)和分離的視錐細(xì)胞b波反應(yīng)(134±68)對(duì)安慰劑(72.4±40.8)，以及視桿細(xì)胞貢獻(xiàn)的所有測(cè)定值(41±16.8)對(duì)安慰劑(21±19.34)方面，都證明了視覺(jué)功能上的保留。這些結(jié)果證明在這些動(dòng)物中在第60天仍保留光感受器功能。
與安慰劑對(duì)照相比，在同樣動(dòng)物中在第88天進(jìn)行MSC注射(n-5)證明在所有ERG測(cè)定中都明顯保留。a波反應(yīng)的測(cè)定值(14.3士12.1)對(duì)安慰劑對(duì)照(O)。在混合b波反應(yīng)(64.5土24)對(duì)安慰劑(0)和分離的視錐細(xì)胞b波反應(yīng)(32.6土22.7)對(duì)安慰劑(8±4)，以及^L桿細(xì)胞貢獻(xiàn)的所有測(cè)定值(47.5土29)對(duì)安慰劑(0)方面，都證明了視覺(jué)功能上的保留。與安慰劑對(duì)照相比，這些結(jié)果證明了視覺(jué)反應(yīng)上的改善。因此，數(shù)據(jù)清楚表明，在視覺(jué)喪失90天時(shí)，與接受安慰劑對(duì)照相比，接受MSC注射的RCS動(dòng)物的視覺(jué)功能被保留。
在60天的胎盤(pán)細(xì)胞移植(11=4)表現(xiàn)出在a波(20土20)對(duì)安慰劑對(duì)照(O)方面沒(méi)有改善，但是在混合b波(81±72)對(duì)安慰劑對(duì)照(1.5±2)方面卻表現(xiàn)出微小改善，而在一見(jiàn)錐細(xì)月包b波(50±19)對(duì)安慰劑對(duì)照(7±7)以及在視桿細(xì)胞貢獻(xiàn)(30%)對(duì)安慰劑對(duì)(0)方面都有良好改善。這些結(jié)果表明 當(dāng)與安慰劑對(duì)照相比時(shí)，視覺(jué)反應(yīng)方面有所改善。這表明從某種程度 而言在這些動(dòng)物中觀察到了光感受器拯救(圖1)。
相比之下，接受成纖維細(xì)胞移植的動(dòng)物在所測(cè)的任何參數(shù)方面都 未表現(xiàn)出改善。
功能評(píng)價(jià)進(jìn)行生理視網(wǎng)膜敏感性測(cè)定，以證明視網(wǎng)膜對(duì)弱光的 反應(yīng)。在這些試驗(yàn)中，動(dòng)物用1.25g尿烷/kg i.p麻醉。通過(guò)記錄上丘 對(duì)各自視覺(jué)感受野的照明的多組胞外活性，在移植后90天測(cè)定這些 動(dòng)物的生理評(píng)價(jià)值(Lund等，2001)。在涵蓋視野的20個(gè)獨(dú)立點(diǎn)(間隔 200mm，每步對(duì)應(yīng)于視野的約10-150位移)重復(fù)該步驟。隨著背景上 強(qiáng)度增加并保持在0.02坎德拉/m2 (發(fā)光強(qiáng)度單位)，測(cè)定視閾值，這 是在上丘表面200mm用直徑30的光點(diǎn)活化單位所需的。比較了移植 眼與僅接受溶媒的安慰劑對(duì)照眼之間的反應(yīng)參數(shù)。
視敏度RCS大鼠在3月齡和4月齡后測(cè)定其光柵視敏度(grating acuity)。正常動(dòng)物在3月齡時(shí)的視敏度為0.5循環(huán)/度。眼部注射MSC 后3個(gè)月維持平均視敏度為0.47循環(huán)/度0=14)，相比之下，安慰劑治 療動(dòng)物的平均視敏度保持在0.2循環(huán)/度。因此這些動(dòng)物在移植90天 后仍保留視敏度。移植MSC動(dòng)物在4月齡時(shí)保留平均視敏度為0.36 循環(huán)/度0=7),相比之下，安慰劑治療動(dòng)物的視敏度保持在基線水平(圖 2)。
視閾值通過(guò)評(píng)價(jià)4個(gè)動(dòng)物的電生理反應(yīng)，監(jiān)測(cè)移植物在預(yù)防視 覺(jué)喪失方面的功效。采用對(duì)光的閾值靈敏度反應(yīng)，來(lái)定義注射安慰劑 的對(duì)照眼相對(duì)于移植MSC的眼的視野拯救面積。在非營(yíng)養(yǎng)不良大鼠 中，視閾值決不超過(guò)背景的0.5 1og坎德拉/m"圖3)。在非手術(shù)性營(yíng)養(yǎng) 不良大鼠中，閾值范圍通常為4 log坎德拉/m2單位(Blakema和Drager, 1991)。相比之下，在注射安慰劑的非手術(shù)性營(yíng)養(yǎng)不良大鼠中，閾值約 為2.9-4.91og坎德拉/m2單位，平均閾值為4.0 log坎德拉/m2單位，在 某些情況下沒(méi)有得到記錄(圖3)。因此，注射安慰劑的大鼠在顳部視網(wǎng)膜(temporal retina)上表現(xiàn)出某些高度定位的功能拯救。然而，移植人 MSC的大鼠基本上都表現(xiàn)出較高水平的視覺(jué)保留，閾值范圍為0.8-2.1 1og坎德拉/m2單位，平均閾值為1.3 1og坎德拉/n^單位(圖3)。在注射 MSC的動(dòng)物中平均有60%的閾值反應(yīng)低于2.1 log坎德拉(candela)單 位，而在注射安慰劑對(duì)照中為18%。
組織學(xué)在本項(xiàng)研究結(jié)束時(shí)，用過(guò)量尿烷(12.5g/kg)處死動(dòng)物。在 眼球摘出之前將6.0縫線穿過(guò)上直肌，保持眼球的定位。在切開(kāi)角膜 后，眼球用2.5%低聚甲醛、2.5%戊二醛、0.01%苦味酸的0.1M 二曱 胂酸緩沖液(pH7.4)固定。固定后，沿睫狀體切割取出角膜和晶狀體。 在去除上直肌之前，在視網(wǎng)膜背側(cè)周圍切一個(gè)小切口，以便保持定位。 再將視網(wǎng)膜在1%四氧化鋨中后固定1小時(shí)。通過(guò)一系列乙醇到環(huán)氧 丙烷的脫水之后，將視網(wǎng)膜用TAAB包埋樹(shù)脂(TAAB Laboratories, Aldemarston, UK)包埋起來(lái)。將半薄切片用1%曱苯胺藍(lán)的1%硼酸緩 沖液染色，超薄切片用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛增加反差。
對(duì)于Nissl染色，將切片用0.75。/o曱酚紫(Sigma, St. Louis， MO)染 色，然后通過(guò)在70%、 95%和100%的乙醇中逐步脫水兩次，將其脫 水。再將它們放入二曱苯(Sigma， St. Louis, MO)中，用PBS (pH7.4) (Invitrogen, Carlsbad, CA)漂洗，蓋上蓋玻片并用DPX封固劑(Sigma, St. Louis, MO)封片。
在90-100天時(shí)間點(diǎn)，在MSC治療動(dòng)物中，清楚地表明了宿主光 感受器在組織學(xué)上解剖學(xué)拯救(圖4)。光感受器形成被來(lái)自內(nèi)部核層的 由其它視網(wǎng)膜細(xì)胞組成的間隙隔開(kāi)的厚層。在安慰劑對(duì)照中的外層寬 度至多只不過(guò)是不連續(xù)的單層，相比之下在移植的眼中則厚達(dá)約3-5 個(gè)細(xì)胞。與正常動(dòng)物相比，這或多或少地超過(guò)通常所見(jiàn)到的光感受器 細(xì)胞層厚度的一半。
該文件中引用的出版物全都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。盡管上面已 經(jīng)通過(guò)實(shí)施例和優(yōu)選實(shí)施方案說(shuō)明了本發(fā)明各方面，但是可以理解， 本發(fā)明的范圍并不受上文描述的限定，而是按照專利法規(guī)定由所附權(quán) 利要求書(shū)予以限定。
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權(quán)利要求
1. 一種治療眼變性性疾病患者的方法，所述方法包括給予所述患者治療眼變性性疾病有效量的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞的特征是表達(dá)至少一種以下表面標(biāo)記CD29、CD44、CD105或CD166，而不表達(dá)CD14、CD34或CD45中的至少一種。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞在原位促進(jìn)眼細(xì)胞 的存活，但是所述細(xì)胞并不形成類似于光感受器層的結(jié)構(gòu)，也不表達(dá) 光感受器特異性標(biāo)記。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞在原位促進(jìn)眼細(xì)胞 形成光感受器，但所述干細(xì)胞本身并不分化成光感受器。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中所述眼變性性疾病是急性眼變性性疾病。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中所述急性眼變性性疾病是腦創(chuàng)傷、視 神經(jīng)創(chuàng)傷或眼損傷。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中所述眼變性性疾病是慢性或進(jìn)行性變 性性疾病。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述慢性或進(jìn)行性眼變性性疾病是黃 斑變性、視網(wǎng)膜色素變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病、青光眼、緣上皮細(xì)胞 缺陷。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞與至少一種其它細(xì)胞類型一 起給予。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述至少一種其它細(xì)胞類型是星形細(xì) 胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)祖細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、視網(wǎng)膜上皮 干細(xì)胞、角膜上皮干細(xì)胞、或者其它多能干細(xì)胞或多潛能干細(xì)胞。
10. 權(quán)利要求8的方法，其中所述至少一種其它細(xì)胞類型在給予 間充質(zhì)干細(xì)胞同時(shí)、或之前、或之后給予。
11. 權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞與至少一種其它藥物一起給予。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中所述至少一種其它藥物在給予所述 細(xì)胞同時(shí)、或之前、或之后給予。
13. 權(quán)利要求l的方法，其中將所述細(xì)胞給予眼表面。
14. 權(quán)利要求l的方法，其中將所述細(xì)胞給予眼內(nèi)。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中通過(guò)插管或通過(guò)在眼內(nèi)或眼附近植 入患者體內(nèi)的裝置給予所述細(xì)胞。
16. 權(quán)利要求14的方法，其中通過(guò)植入含有所述細(xì)胞的三維基質(zhì) 或支持物而給予所述細(xì)胞。
17. —種治療眼變性性疾病患者的藥物組合物，所述組合物包含 治療眼變性性疾病有效量的間充質(zhì)干細(xì)胞以及藥學(xué)上可接受的載體。
18. 權(quán)利要求17的藥物組合物，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞的特征是 表達(dá)至少一種以下表面標(biāo)記CD29、 CD44、 CD105或CD166,而不 表達(dá)CD14、 CD34或CD45中的至少一種。
19. 權(quán)利要求17或18的藥物組合物，其中所述眼變性性疾病是 急性眼變性性疾病。
20. 權(quán)利要求19的藥物組合物，其中所述急性眼變性性疾病是腦 創(chuàng)傷、視神經(jīng)創(chuàng)傷或眼損傷。
21. 權(quán)利要求17或18的藥物組合物，其中所述眼變性性疾病是 慢性或進(jìn)行性變性性疾病。
22. 權(quán)利要求21的藥物組合物，其中所述慢性或進(jìn)行性眼變性性 疾病是黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病、青光眼、緣 上皮細(xì)胞缺陷。
23. 權(quán)利要求17或18的藥物組合物，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞在 原位促進(jìn)眼細(xì)胞的存活，但是所述細(xì)胞并不形成類似于光感受器層的 結(jié)構(gòu)，也不表達(dá)光感受器特異性標(biāo)記。
24. 權(quán)利要求17或18的藥物組合物，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞在 原位促進(jìn)眼細(xì)胞形成光感受器，但所述干細(xì)胞本身并不分化成光感受突 存。
25. 權(quán)利要求17或18的藥物組合物，所述組合物含有至少一種 其它細(xì)胞類型。
26. 權(quán)利要求25的藥物組合物，其中所述至少一種其它細(xì)胞類型 是星形細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)祖細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、視 網(wǎng)膜上皮干細(xì)胞、角膜上皮干細(xì)胞、或者其它多能干細(xì)胞或多潛能干 細(xì)胞。
27. 權(quán)利要求25的藥物組合物，所述組合物包含至少一種其它藥物。
28. 權(quán)利要求27的藥物組合物，其中所述至少一種其它藥物是治 療眼變性性障礙的藥物。
29. 權(quán)利要求17或18的藥物組合物，其中所述細(xì)胞給予眼表面。
30. 權(quán)利要求17或18的藥物組合物，其中所述細(xì)胞給予眼內(nèi)。
31. 權(quán)利要求17或18的藥物組合物，其中所述藥物載體配制成 含有所述細(xì)胞的三維基質(zhì)或支持物。
全文摘要
適用于眼科疾病和障礙的基于細(xì)胞的療法或再生療法的組合物和方法，包含間充質(zhì)干細(xì)胞，尤其是具有以下特征的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)至少一種以下表面標(biāo)記CD29、CD44、CD105或CD166，而不表達(dá)CD14、CD34或CD45中的至少一種。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK101484575SQ200680028820
公開(kāi)日2009年7月15日 申請(qǐng)日期2006年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月8日
發(fā)明者S·米斯特里 申請(qǐng)人:森托科爾公司