專利名稱：基于免疫反應(yīng)的生物檢測(cè)微流控芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速生物檢測(cè)分析的 的微流控芯片，并提供該芯片的制備方法。
背景技術(shù)：
上世紀(jì)70年代末和80年代初，基于抗原.抗體特異性反應(yīng)與高靈敏度的標(biāo)記免 疫分析方法得到迅速發(fā)展，應(yīng)用放射免疫分析原理，以酶、熒光染料、發(fā)光劑等非放射性示 蹤物替代放射性元素標(biāo)記抗原或抗體，出現(xiàn)了一些新的標(biāo)記免疫分析技術(shù)。根據(jù)所標(biāo)記探 針與相應(yīng)檢測(cè)方式的不同，可分為酶聯(lián)免疫吸收分析、熒光免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、 電化學(xué)免疫分析、膠體金標(biāo)記免疫分析等。這些新的標(biāo)記免疫技術(shù)克服了放射免疫分析對(duì) 操作人員的健康危害，因此逐漸取代了傳統(tǒng)的放射免疫分析，成為免疫分析的主流。近年 來(lái)，隨著生物傳感器技術(shù)的發(fā)展，免疫分析在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全、藥物分析與微 生物檢驗(yàn)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。酶聯(lián)免疫分析(ELISA)的原理是把抗原或抗體的固相化的同時(shí)，也將抗原或抗體 用酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體 既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)與 固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與 液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此 時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催 化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定 性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很 高的敏感度。但是ELISA常規(guī)免疫分析通常需要數(shù)小時(shí)甚至一天以上，操作過(guò)程復(fù)雜，需消耗 大量昂貴的免疫試劑。而且檢測(cè)設(shè)備較大，并且經(jīng)常伴隨著非特異性吸附等諸多缺點(diǎn)，難以 滿足現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)要求。20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的微流體學(xué)科是指操作微小網(wǎng)絡(luò)通道(5-500 微米)中流體的科學(xué)技術(shù)。是分子生物學(xué)技術(shù)、微加工技術(shù)、機(jī)械制造技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)等 多種現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展與融合。是基于大規(guī)模平行處理生物信息分子原理的微型裝置，具有 信息通量大、自動(dòng)化、系統(tǒng)化的特點(diǎn)。微流體芯片用于操作，傳輸微升(10_6L)至毫微微升 (IO-15L)量級(jí)的流體。可將生化反應(yīng)的若干步驟包括分析、洗滌、檢測(cè)等集成在一塊或幾塊 微流體芯片上，其微通道孔徑只有微米級(jí)大小，具有濃縮和富集的作用，可以加速反應(yīng)縮短 測(cè)試時(shí)間，從而大大降低了測(cè)試成本。和常規(guī)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)相比，該技術(shù)極大降低了試劑的消 耗量(至少3個(gè)數(shù)量級(jí))、同時(shí)分析產(chǎn)生的廢液極少。在微小范圍內(nèi)的能量傳遞、物質(zhì)分散 更快更均勻，熱能傳導(dǎo)快，也更易實(shí)現(xiàn)各種操控，因此反應(yīng)快、收率高，污染少、成本低。微流 控芯片已從分離檢測(cè)發(fā)展為包括復(fù)雜試樣前處理的高功能全分析系統(tǒng)；從分析工具發(fā)展到 包括在線檢測(cè)的微型化學(xué)反應(yīng)與合成手段。在微流控芯片上進(jìn)行免疫分析，將微流控芯片 的分析能力和抗原-抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合，能有效的克服常規(guī)免疫分析的缺點(diǎn)，使得
3反應(yīng)效率提高，操作步驟簡(jiǎn)化，檢驗(yàn)時(shí)間縮短，樣品、試劑和能量消耗大大降低。用于免疫分 析的微流控芯片是運(yùn)用微加工技術(shù)建立微米級(jí)的免疫反應(yīng)空間，由于尺寸上的減小，加快 了反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過(guò)程，使得基于生物大分子擴(kuò)散控制的免疫反應(yīng)速度提高幾個(gè)數(shù)量級(jí)。微流 控芯片多種功能結(jié)合與集成化的特點(diǎn)也使微流控芯片上的免疫分析與常規(guī)免疫分析相比 有很多潛在的優(yōu)勢(shì)，因此受到越來(lái)越多的關(guān)注。新一代的微流體芯片由高分子材料，例如硅酮polydimethylsiloxane (PDMS)，制 成(見附圖1)，材料造價(jià)低廉(少于10美金/片)，制造周期短(少于24小時(shí))，所需設(shè)備 為少數(shù)常規(guī)設(shè)備，不需要大型機(jī)密儀器，適合于大規(guī)模生產(chǎn)，可用于生產(chǎn)一次性使用產(chǎn)品。 同常規(guī)方式相比，它的主要特點(diǎn)是1)低價(jià)，因?yàn)槭褂玫脑噭┑牧繕O其微量，完成測(cè)試需要的費(fèi)用極低；2)高效，在微流體芯片中反應(yīng)速度快，傳熱傳質(zhì)效率高，測(cè)試速度快；3)應(yīng)用模版技術(shù)制造，適用于大規(guī)模生產(chǎn)；4)容易集成，不同目標(biāo)的測(cè)試模塊可很方便的集成到一塊芯片中，完成多目標(biāo)并 行分析；5)自動(dòng)化程度高，它可以很方便和現(xiàn)代電子技術(shù)結(jié)合，不僅使芯片分析測(cè)試自動(dòng)， 而且信號(hào)傳輸以及信號(hào)分析也可以自動(dòng)完成。6)兼容性好，其他的微分析技術(shù)，例如微電極技術(shù)，生物傳感器技術(shù)也可以整合到 微流體芯片技術(shù)中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于免疫反應(yīng)原理的專門用于現(xiàn)場(chǎng)快速生物檢測(cè)分 析的的微流控芯片。該芯片同現(xiàn)行的檢測(cè)技術(shù)相比具有高效、低價(jià)、便攜和自動(dòng)化的特點(diǎn)。本發(fā)明提供的基于免疫反應(yīng)原理的專門用于現(xiàn)場(chǎng)快速生物檢測(cè)分析的的微流控 芯片，以光學(xué)透明材料為基材，由樣品通道層，閥門控制層及基片層構(gòu)成，其中，樣品通道層 內(nèi)含樣品富集及免疫分析模塊，該樣品富集及免疫分析模塊由一個(gè)，或幾個(gè)并聯(lián)或串聯(lián)的 納升體積的免疫色譜柱微分析室所組成。每個(gè)分析室連接有多個(gè)進(jìn)樣口和出樣口由控制層 的氣閥，每個(gè)分析室通過(guò)聚合填料鍵合固定有抗體蛋白或抗原，能夠和樣品混合物中的抗 原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，免疫分析信號(hào)由標(biāo)記的反應(yīng)物(抗體或抗原)實(shí)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)多次洗滌 之后，免疫標(biāo)記信號(hào)的產(chǎn)生的變化如熒光強(qiáng)度的變化可以被信號(hào)采集模塊采集分析；信號(hào) 采集模塊由紫外LED和熒光光敏器件陣列組成，抗體/藻類毒素間的特異性結(jié)合導(dǎo)致的光 學(xué)信號(hào)都可被光敏器件陣列采集并傳至到微處理器(計(jì)算機(jī))中和數(shù)據(jù)庫(kù)相比較，來(lái)分析 樣品所含毒素的濃度。本發(fā)明用于現(xiàn)場(chǎng)生物檢測(cè)分析的免疫微流控芯片的光學(xué)透明材料選自無(wú)機(jī)材料: 石英、玻璃，硬質(zhì)高分子聚合物聚碳酸脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚對(duì)本二甲酸乙二醇脂、聚 苯乙烯、聚丙烯，彈性聚合物聚二甲基硅氧烷；模具材料為硅片。本發(fā)明中樣品通道層中有免疫色譜柱微分析室。閥門控制層含有氣壓控制閥門， 控制樣品通道層相關(guān)孔道的開關(guān)。閥門控制層的閥門通過(guò)氣壓或電子元件控制，閥門通道 的直徑為1 3 μ m。本發(fā)明微流控芯片的免疫色譜柱微分析室為整體柱或聚合填料灌柱，聚合填料為硅膠填料或其它有機(jī)聚合物。本發(fā)明微流控芯片的微分析室中可根據(jù)檢測(cè)目的的不同，灌注已鍵合不同抗原或 抗體的填料。本發(fā)明的免疫色譜柱微分析室的個(gè)數(shù)可由實(shí)際情況確定，如樣品數(shù)及其中各成分 的性質(zhì)差別，在本發(fā)明的具體實(shí)施中制備了一個(gè)單樣品的微流控芯片，可根據(jù)實(shí)際情況將 該單通道以不同方式并聯(lián)、串聯(lián)。本發(fā)明提供的上述微流控芯片的制備方法，具體步驟如下(1)基片準(zhǔn)備將硅片放入Piranha溶液去氧化后用氮?dú)獯蹈?，用SU-82050系列 經(jīng)旋涂機(jī)甩涂，在恒溫加熱板上軟烘；(2)曝光和烘焙將設(shè)計(jì)好的不同硅片模板放置在甩涂好的基片上，應(yīng)用紫外曝 光機(jī)曝光，之后在加熱板上烘焙；(3)顯影將硅片放入顯影液中顯影，之后分別用異丙醇和去離子水清洗干凈，并 用氮?dú)獯蹈桑?4)硬烘在熱板上緩慢加熱固定。(5)澆注PDMS (聚二甲基硅氧烷)單體及固化劑按質(zhì)量配比5 1至20 1混 合均勻，倒在硅片模具上，在烘箱內(nèi)固化，剝離(6)鍵合將兩層PDMS芯片校準(zhǔn)鍵合形成微通道腔。本發(fā)明中，先將已鍵合抗原或抗體的填料灌注到上述免疫微分析室中后，再進(jìn)行 檢測(cè)。整個(gè)測(cè)試系統(tǒng)控制硬件部分主要由控制部分(計(jì)算機(jī))，操作系統(tǒng)(集成化微流體 芯片，數(shù)控界面)和數(shù)據(jù)采集，數(shù)據(jù)分析部分(計(jì)算機(jī))。軟件系統(tǒng)主要包括LABVIEW程序 (控制)和ImagePr0程序(數(shù)據(jù)分析)。


圖1基于免疫反應(yīng)原理的現(xiàn)場(chǎng)快速生物檢測(cè)分析微流控芯片設(shè)計(jì)2基于免疫反應(yīng)原理的現(xiàn)場(chǎng)快速生物檢測(cè)分析微流控芯片具體實(shí)施示意中標(biāo)號(hào)1氣閥氣體入口，2樣品入口，3氣閥氣體通道，4樣品通道，5填料進(jìn)/出 口，6微分析室，7樣品出口。
具體實(shí)施例方式1.基片準(zhǔn)備。將硅片放入Piranha溶液(98%濃硫酸30%雙氧水=7 3)煮 沸清洗15min。用去離子水沖洗5遍后用氮?dú)獯蹈桑⒃?00°C烘焙30min.2.甩涂。將Microchem公司的SU-8膠(下同)倒在硅片中央，用手握住硅片邊緣 使之傾斜并緩慢旋轉(zhuǎn)，使SU-8覆蓋住硅片大部分區(qū)域。靜置15min，使SU-8初步平坦化， 同時(shí)消除掉傾倒過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡。用旋涂機(jī)(Spin-Coater KW-4A，Chemat Technology, Inc.)進(jìn)行兩次遞進(jìn)式甩涂500轉(zhuǎn)/min旋涂15s，3000轉(zhuǎn)/min旋涂30s，使膠分布較為均 勻，靜置IOmin緩解邊緣突起效應(yīng)。3.軟烘。軟烘的目的是使SU-8光刻膠中的溶劑揮發(fā)，工藝控制的關(guān)鍵是使溶劑揮 發(fā)以可控的速率進(jìn)行。在熱板上以5°C /min的速率逐步升到95°C，期間在65°C和95°C分別保持3min和6min。之后以0. 5°C /min的速率緩慢降至室溫。4.曝光。采用接觸式曝光機(jī)(波長(zhǎng)365nm)，這是因?yàn)镾U-8膠在365nm的紫外光 波段吸收少，可以獲得很好的曝光一致。5.曝光后烘焙(Pm，post exposure bake)。再熱板上以5°C /min的速率由室溫 逐步升到95°C，期間在65°C和95°C分別保持Imin和5min。之后以0. 5°C /min的速率緩慢 降至室溫。6.顯影在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，顯影液的主要成分是丙二醇甲醚醋酸酯(PGMEA)。在 SU-8模具與顯影液分別靜置達(dá)到室溫后，將模具放入顯影液中顯影6min，之后分別用異丙 醇和去離子水清洗干凈，并用氮?dú)獯蹈伞?.硬烘。在熱板上緩慢加熱到200°C，保持30min，再緩慢降至室溫。8.澆注聚二甲基硅氧烷(PDMS)聚合物成型。將把采用光刻法制作的微通道PDMS 印章分別用丙酮、無(wú)水乙醇分別超聲5min，清除通道印章上的水分，把清洗好的印章60°C 烘箱烘烤4h。PDMS單體與固化劑按照5 1的質(zhì)量配比混合均勻，除凈氣泡。倒在經(jīng)三甲 基氯硅烷處理過(guò)的SU-8模具上，在調(diào)整好的水平熱板上65°C保持2h固化。形成上層具有 反應(yīng)微通道層的基片。9.具有控制通道的PDMS層制作。在硅片上甩涂光刻膠，經(jīng)紫外曝光、顯影，制成硅 基光陽(yáng)模，并于120°C退火30min，使光刻膠軟化，陽(yáng)模突起部分銳利的邊角變得光滑。硅基 光膠陽(yáng)模用三甲基氯硅烷在氣相中處理7min，使其表面硅烷化，以防止在注塑過(guò)程中PDMS 的粘附。并且具有控制通道的PDMS層單體與固化劑的比例為20 1，相對(duì)較軟。在甩膠機(jī) 上2000轉(zhuǎn)/min甩涂35s。形成下層具有控制閥門通道的基片。10.鍵合及接口制作。將上層基片打孔，在接縫附近用環(huán)氧膠密封。下層基片打孔 用于控制通道。上下兩片仔細(xì)對(duì)合，80°C過(guò)夜固化。再最后將具有控制通道的一面用乙醇 淋洗后，與玻璃蓋片熱鍵和。即制成了 PDMS芯片。11.若免疫微分析室色譜柱為聚合材料填充柱，可經(jīng)圖1三個(gè)進(jìn)樣通道中任一個(gè) 將聚合材料填料灌注裝柱，閉合柱底閥門，控制閥門氣壓不超過(guò)20psi，同時(shí)控制裝柱速度， 待填料裝滿后進(jìn)緩沖液平衡色譜柱，包被二抗或抗原，實(shí)際樣品溶液、特異性抗體及標(biāo)記競(jìng) 爭(zhēng)物經(jīng)圖一中任一進(jìn)樣孔進(jìn)入色譜柱，溫育10-20分鐘，進(jìn)洗滌緩沖液洗去過(guò)量的抗體及 標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)物，加入顯色緩沖液顯色，抗體/抗原間的特異性結(jié)合導(dǎo)致的光學(xué)信號(hào)都可被信 號(hào)采集模塊的光敏器件陣列采集并傳至到微處理器(計(jì)算機(jī))中和數(shù)據(jù)庫(kù)相比較，來(lái)分析 樣品所含抗原的濃度。整個(gè)測(cè)試系統(tǒng)控制硬件部分主要由控制部分(計(jì)算機(jī))，操作系統(tǒng) (集成化微流體芯片，數(shù)控界面)和數(shù)據(jù)采集，數(shù)據(jù)分析部分(計(jì)算機(jī))。軟件系統(tǒng)主要包 括LABVIEW程序(控制)和ImagePr0程序(數(shù)據(jù)分析)如圖2所示。
權(quán)利要求
一種基于免疫反應(yīng)的生物檢測(cè)微流控芯片，其特征在于該芯片以光學(xué)透明材料為基材，由樣品通道層，閥門控制層及基片層構(gòu)成，其中，樣品通道層內(nèi)含樣品富集及免疫分析模塊，該樣品富集免疫分析模塊由一個(gè)，或幾個(gè)并聯(lián)或串聯(lián)的納升體積的免疫色譜柱微分析室組成，每個(gè)微分析室通過(guò)聚合填料鍵合固定有抗體蛋白或抗原，以便發(fā)生雙抗夾心、直接或間接競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)；閥門控制層含有氣壓控制閥門，控制樣品通道層相關(guān)孔道的開關(guān)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于所述的光學(xué)透明材料選自無(wú)機(jī)材 料石英、玻璃，硬質(zhì)高分子聚合物聚碳酸脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚對(duì)本二甲酸乙二醇 脂、聚苯乙烯、聚丙烯，彈性聚合物聚二甲基硅氧烷；模具材料為硅片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于閥門控制層的閥門通過(guò)氣壓或電子 元件控制，其通道直徑為1-30 μ m。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于免疫色譜柱為整體柱或聚合填料灌 柱，聚合填料為硅膠填料或其它有機(jī)聚合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于免疫分析模塊的鍵合物為二抗或抗 原，免疫分析信號(hào)由標(biāo)記的反應(yīng)物實(shí)現(xiàn)，標(biāo)記物為各種染料或熒光。
6.如權(quán)利要求1所述的微流控芯片的制備方法，其特征在于采用模塑法，具體步驟如下(1)基片準(zhǔn)備將硅片放入Piranha溶液去氧化后用氮?dú)獯蹈桑肧U-82050系列經(jīng)旋 涂機(jī)甩涂，在恒溫加熱板上軟烘；(2)曝光和烘焙將設(shè)計(jì)好的樣品通道層，閥門控制層的硅片模板分別放置在甩涂好 的基片上，應(yīng)用紫外曝光機(jī)曝光，之后在加熱板上烘焙；(3)顯影將硅片放入顯影液中顯影，之后分別用異丙醇和去離子水清洗干凈，并用氮 氣吹干；(4)硬烘在熱板上緩慢加熱固定；(5)澆注聚二甲基硅氧烷單體及固化劑按質(zhì)量配比5 1至20 1混合均勻，分別 倒在相應(yīng)的硅片模具上，在烘箱內(nèi)固化，剝離；(6)鍵合將兩層聚二甲基硅氧烷芯片校準(zhǔn)鍵合形成微通道腔，再與基片層鍵合。
7.如權(quán)利要求1所述的微流控芯片的在基于免疫反應(yīng)的生物檢測(cè)分析中的應(yīng)用，其特 征在于，樣品溶液由所述微流控芯片的進(jìn)樣口進(jìn)入芯片，芯片微分析室中的抗體蛋白或抗 原與樣品中的抗原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，免疫分析信號(hào)由標(biāo)記的反應(yīng)物實(shí)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)多次洗 滌之后，免疫標(biāo)記信號(hào)的產(chǎn)生的變化如熒光強(qiáng)度的變化可以被信號(hào)采集模塊采集分析；信 號(hào)采集模塊由紫外LED和熒光光敏器件陣列組成，抗體/藻類毒素間的特異性結(jié)合導(dǎo)致的 光學(xué)信號(hào)都可被光敏器件陣列采集并傳至到微處理器中和數(shù)據(jù)庫(kù)相比較，來(lái)分析樣品所含 毒素的濃度。
全文摘要
本發(fā)明屬生物分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于免疫反應(yīng)的生物檢測(cè)微流控芯片及其備做方法。該芯片以光學(xué)透明的聚二甲基硅氧烷為材料，由樣品通道層，閥門控制層及基片層構(gòu)成。芯片內(nèi)含樣品富集及免疫分析模塊，該模塊由一個(gè)或幾個(gè)納升體積的免疫色譜柱微分析室組成，每個(gè)分析室固定有抗體蛋白或抗原，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種抗原樣品如細(xì)菌、病毒、各種毒素的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。本發(fā)明具有快速、高效、便攜、低價(jià)和易自動(dòng)化控制的特點(diǎn)，可完成自動(dòng)信號(hào)采集、遠(yuǎn)程傳輸和信號(hào)分析，適合于存在商業(yè)化抗體的多種抗原的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及大范圍內(nèi)遙控檢測(cè)。
文檔編號(hào)B01L3/00GK101884941SQ20091024755
公開日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者劉思秀, 劉超, 張金玲, 趙望, 隋國(guó)棟 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)