一種高殺傷活性的免疫細胞群的培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞生物學及臨床醫(yī)學領域，尤其涉及腫瘤免疫細胞治療方面，具體 涉及人外周血淋己細胞在體外進行高效培養(yǎng)的方法。
【背景技術】
[0002] 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與宿主的免疫狀態(tài)有著密切的關系，傳統(tǒng)的腫瘤治療手段包括 手術、化療與放療，不但存在腫瘤遷移與復發(fā)的危險，而且具有嚴重的損傷正常組織和免疫 功能的副作用。腫瘤細胞免疫治療通過恢復和增強腫瘤患者的免疫監(jiān)視能力和免疫殺傷功 能，可W清除手術和放化療后患者體內殘存的腫瘤細胞，達到預防腫瘤復發(fā)、轉移及根治腫 瘤的目的，并且具有特異性強、毒副作用小等特點。腫瘤細胞免疫治療主要是W免疫活性細 胞為載體，通過體內或體外激活免疫細胞分泌細胞因子調節(jié)其他免疫細胞的功能或直接殺 傷腫瘤細胞進而達到抗腫瘤的目的。
[0003] 根據免疫細胞治療的特點及抗腫瘤的機制，細胞免疫治療可分為主動性免疫治療 和過繼性細胞免疫治療，或特異性免疫治療和非特異性免疫治療。目前腫瘤細胞免疫治療 研究主要集中在過繼性免疫治療，利用體外擴增的免疫細胞，如淋己因子激活的殺傷細胞 (LAK細胞）、腫瘤浸潤的淋己細胞燈IL細胞）、細胞因子誘導的殺傷細胞（CIK細胞）、樹突 狀細胞（den化iticcells，DC細胞）、自然殺傷細胞（naturalkillercell，NK細胞）、基因 修飾的T細胞等進行腫瘤的治療。
[0004] 近年來，國內外開展比較多的應用于臨床上的外周血淋己細胞體外培養(yǎng)的方法主 要有送幾類：
[0005] (1)經典的DC-CIK培養(yǎng)方法，結合市面上現(xiàn)有的商品化的淋己細胞培養(yǎng)基，采用 已經常規(guī)化的DC-CIK淋己細胞培養(yǎng)方法，應用抗人CD3抗體、IL2、GM-CSF、INF-Y等主要 刺激因子，分別刺激培養(yǎng)DC細胞和CIK細胞，在DC細胞經過腫瘤抗原激活后與CIK細胞共 培養(yǎng)。
[0006] 似自體TIL細胞（腫瘤浸潤淋己細胞），TIL細胞是一群存在于腫瘤間質中的異 質性淋己細胞，在體內聚集到腫瘤部位的能力強于CIK和NK，僅殺傷其抗原特異性的腫瘤 細胞，而對其他組織來源的腫瘤細胞無殺傷作用。主要操作是從新鮮的腫瘤組織中分離TIL 細胞并用白細胞介素-2體外刺激，TIL細胞激活、擴增后成為細胞毒性T淋己細胞，并經體 外篩選和大量擴增，可W對表達特異性抗原的腫瘤細胞行使殺傷功能。
[0007] 做自體NK細胞（自然殺傷細胞）培養(yǎng)，NK細胞用于腫瘤的細胞免疫治療已有 二十多年的歷史，LAK細胞的主要抗瘤成分為NK細胞。主要采用建立NK細胞系和采用與 構建的工程細胞共培養(yǎng)來定向刺激自體淋己細胞中的NK細胞大量增殖。而關于用于共培 養(yǎng)的工程細胞的研究已開展很多，也得到了多種細胞因子的組合表達方案。
[0008] 但是，現(xiàn)有的培養(yǎng)方法仍存在較多的問題，主要表現(xiàn)在W下方面：培養(yǎng)方法比較復 雜，步驟較繁瑣。DC-CIK需要把DC細胞和CIK細胞分離開進行培養(yǎng)，需要?？谥苽淠[瘤抗 原去激活；TIL細胞培養(yǎng)需要配合臨床手術，并且對得到的腫瘤組織需要進行TIL的分離和 進一步的培養(yǎng)，操作比較繁瑣；NK細胞建系成功后，操作簡單，但風險較高，大部分建系細 胞不能用于臨床，而另外采用工程細胞共培養(yǎng)，存在工程細胞構建較難，即使構建成功，用 于共培養(yǎng)的話，還需要對工程細胞進行特殊的滅火處理。因此，現(xiàn)有的淋己細胞培養(yǎng)方法， 普遍存在操作復雜，培養(yǎng)時間較短的問題。并且，國內送幾年在臨床上開展免疫細胞治療的 比較多，但普遍反映的是效果不佳或沒有效果。因此針對送些問題，本領域尚需研發(fā)新型的 淋己細胞培養(yǎng)方法。
【發(fā)明內容】
[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種人外周血淋己細胞體外培養(yǎng)方法，可W對人外周血淋 己細胞進行長時間（至少4周）的體外培養(yǎng)，得到可W高效殺傷腫瘤細胞的特定細胞群。
[0010] 本發(fā)明的第一方面，提供一種淋己細胞培養(yǎng)基，包含基礎培養(yǎng)基、比-2(人白介素 2)、人CD13化(4-1BBL)、人SCF和任選的ConA(刀豆蛋白A)，其中，
[0011] 所述比-2(人白介素。的濃度為lO-lOOng/ml;
[001引 所述人CD13化(4-1BBL)的濃度為lO-lOOng/ml;
[001引所述人SCF的濃度為lO-lOOng/ml;
[0014] 所述ConA(刀豆蛋白A)的濃度為lO-lOOng/ml。
[0015] 在另一有優(yōu)選例中，所述基礎培養(yǎng)基選自下組；RPMI-1640,DMEM，IMDM。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述IL-2(人白介素2)的濃度為20-8化g/ml;
[0017]所述人CD13化(4-1BBL)的濃度為 20-80ng/ml;
[0018] 所述人SCF的濃度為20-80ng/ml;
[0019] 所述ConA(刀豆蛋白A)的濃度為20-80ng/ml。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述IL-2(人白介素2)的濃度為30-5化g/ml;
[0021] 所述人CD13化(4-1BBL)的濃度為 30-50ng/ml;
[0022] 所述人SCF的濃度為30-50ng/ml;
[0023] 所述ConA(刀豆蛋白A)的濃度為40-60ng/ml。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述比-2(人白介素2)的濃度為40ng/ml;所述人 CD13化(4-1BBL)的濃度為40ng/ml;所述人SCF的濃度為40ng/ml;所述ConA(刀豆蛋白A) 的濃度為50ng/ml。
[00巧]在另一優(yōu)選例中，所述細胞為人外周血單核細胞。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述細胞為人外周血淋己細胞。
[0027] 本發(fā)明的第二方面，提供一種細胞體外培養(yǎng)方法，包含采用第一方面所述的淋己 細胞培養(yǎng)基對細胞進行培養(yǎng)的步驟。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述細胞為人外周血單核細胞。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述細胞為人外周血淋己細胞。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述方法包括W下步驟：
[00引](a)提供細胞；
[0032]化）將第一淋己細胞培養(yǎng)基加入到所述細胞開始進行培養(yǎng)，所述第一淋己細胞培 養(yǎng)基包含基礎培養(yǎng)基、比-2、人CD13化、人SCF和ConA,其中，
[00對所述比-2的濃度為lO-lOOng/ml;
[0034] 所述人CD13化的濃度為lO-lOOng/ml;
[0035] 所述人SCF的濃度為lO-lOOng/ml;
[0036]所述ConA的濃度為 10-100ng/ml;
[0037] (C)在培養(yǎng)過程中加入第二淋己細胞培養(yǎng)基進行補液，所述第二淋己細胞培養(yǎng)基 包含基礎培養(yǎng)基、比-2、人CD13化和人SCF，其中，
[00測 所述比-2的濃度為lO-lOOng/ml;
[0039] 所述人CD13化的濃度為lO-lOOng/ml;
[0040] 所述人SCF的濃度為lO-lOOng/ml。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（a)中提供外周血單核細胞。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（a)中提供外周血淋己細胞。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（C)中采用W下方式進行補液；培養(yǎng)第一周時，每2-4天 進行等體積（根據培養(yǎng)細胞的現(xiàn)有培養(yǎng)液體積）補液一次；培養(yǎng)第二周時，每2-4天進行補 液一次，補液體積根據培養(yǎng)細胞的現(xiàn)有培養(yǎng)液體積，進行1-2倍體積補液；培養(yǎng)第H-四周 時，一周進行一次補液，根據培養(yǎng)細胞的現(xiàn)有培養(yǎng)液體積，進行2-3倍體積補液。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述方法獲得細胞群，W所述細胞群的細胞總數量計，包含 5%~40%CIK細胞、5%~20%NK細胞、30%~70%DC細胞。
[0045] 本發(fā)明的第H方面，提供一種細胞群，由第一方面所述的淋己細胞培養(yǎng)基或第二 方面所述的方法對細胞進行培養(yǎng)后獲得。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述細胞為人外周血單核細胞。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，所述細胞為人外周血淋己細胞。
[0048] 在另一優(yōu)選例中，W所述細胞群的細胞總數量計，包含5 %~40 %CIK細胞、5 %~ 20%NK細胞、30%~70%DC細胞。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，W所述細胞群的細胞總數量計，包含5% -10%、10% -15%、 30-40%、5% -15%、或 20% -25%的CIK細胞。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，W所述細胞群的細胞總數量計，包含5%~10%或10% -15%的 NK細胞。
[0051] 在另一優(yōu)選例中，W所述細胞群的細胞總數量計，包含50%~60%、30% -45%、 或40% -55%的DC細胞。
[0052] 本發(fā)明的第四方面，提供一種藥物組合物，其特征在于，包含第H方面所述的細胞 群和醫(yī)藥學可接受的載體。
[0053] 本發(fā)明的淋己細胞培養(yǎng)方法，簡單易于操作，采用細胞因子組合添加方案，淋己細 胞分離后，直接在不同時期采用不同因子添加方案的培養(yǎng)基即可，且中間不用去除現(xiàn)有培 養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)時間至少可W培養(yǎng)一個月，并且通過對比現(xiàn)有商品化的培養(yǎng)基及方法，在體 外殺傷實驗中，本發(fā)明方法具有更優(yōu)異的殺傷活性。