1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計算。
[0153] 實施例1
[0154] 人外周血淋己細胞分離試驗
[0155](采用Ficoll液進行淋己細胞分離）
[0156] 1. 1分離血清：把抗凝血收集到50ml離必管中，室溫300g離必5min，收集上層血 清，分裝后-2(TC保存；
[0157] 1. 2抗凝血稀釋；剩余血液，加入等體積鹽平衡溶液稀釋，之后加到Ficoll液上， 稀釋抗凝血與Ficoll液的體積比為4:3, 20°C，400g，離必30min;
[0158] 1. 3淋己細胞分離：用一次性己氏吸頭盡量去掉最上一層細胞液，再用移液管小 必吸取淋己細胞層至50ml離必管；
[0159]I. 4洗淋己細胞；加入鹽平衡溶液至20ml，2(TC，400g，離必IOmin;
[0160] 1. 5去上清，重復上一步驟；
[0161] 1. 6去上清，用IMDM基礎培養(yǎng)基重懸細胞得到人外周血淋己細胞，計數(shù)；
[0162] 1.7分組培養(yǎng)細胞。
[0163] 實施例2
[0164] 淋己細胞培養(yǎng)
[016引 2. 1將實施例1分離得到的淋己細胞進行計數(shù)，調整細胞濃度在IXIO6個/2ml(采 用血球計數(shù)板鏡下計數(shù)，其中含有大量紅細胞）后進行分組，一組為對照組，采用加IL2(40ng/ml)的基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)，另一組為實驗組，采用加IL2(40ng/ml)+CD13化(40ng/ ml)+SCF(4化g/ml)+ConA巧化g/ml)的基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)（3+1因子添加方案）。采用細胞培 養(yǎng)板進行淋己細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)在為37°C，5%C02的細胞培養(yǎng)箱中；
[0166] 2. 2培養(yǎng)第一周時，每H天進行補液，補液時不去除原有的培養(yǎng)液，對照組直 接補入新鮮的含有IL2 (40ng/ml)的培養(yǎng)液，實驗組直接補入新鮮的含有IL2 (40ng/ ml)+CD13化(4化g/ml)+SCF(4化g/ml)的培養(yǎng)液，補液體積根據(jù)培養(yǎng)細胞的現(xiàn)有培養(yǎng)液體 積，等體積補液；
[0167] 2. 3培養(yǎng)第二周時，細胞進入增殖期，每H天進行補液，補液情況同第一周，補液體 積根據(jù)培養(yǎng)細胞的現(xiàn)有培養(yǎng)液體積，1~2倍體積補液；
[016引 2. 4培養(yǎng)第H、四周時，細胞進入快速增殖期，可一周進行一次大體積補液，補液情 況同第一周，補液體積根據(jù)培養(yǎng)細胞的現(xiàn)有培養(yǎng)液體積，2~3倍體積補液。
[0169] 圖1為人外周血淋己細胞體外培養(yǎng)過程中實驗組和對照組的對比圖，分別取第1、 7、14、21、28天的拍照結果，圖2為實驗組和對照組的淋己細胞總數(shù)。
[0170] 由圖1的對比結果可知，與只添加IL-2的培養(yǎng)基相比，采用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng) 淋己細胞，淋己細胞增殖W形成細胞團的方式進行，生長狀況良好的淋己細胞組，細胞團可 W肉眼可見，數(shù)量多，說明淋己細胞增殖狀況好。且由圖2可知，經長時間培養(yǎng)后，采用本發(fā) 明的培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的淋己細胞數(shù)量遠多于對照組。
[0171] 實施例3
[0172] 采用流式細胞術進行淋己細胞分型
[0173] 3. 1淋己細胞培養(yǎng)到第7、14、21和28天，對培養(yǎng)淋己細胞進行流式檢測，培養(yǎng)的淋 己細胞采用300g，離必5min，收集細胞；用培養(yǎng)基重懸后計數(shù)，調整細胞濃度在2XIO3個/ U1 ；
[0174] 3. 2取50ul細胞懸液來染色，每管分別加入1 的CD3 (抗人CD3FITC)和1 的CD56 (抗人CD56APC)抗體，混勻后室溫賠育40min;
[01巧]3. 3加入ImlPBS洗，500g，離必5min，去掉上清；
[0176] 3. 4 重復步驟 3. 3;
[0177] 3. 5加入300UIPBS重懸細胞，把重懸的細胞轉移至流式上樣管，上機進行細胞分 選，其中CD3-CD56+的是NK細胞，CD3+CD56+的是CIK細胞。
[0178] 結果如表1所示。
[0179] 表1人外周血淋己細胞體外培養(yǎng)細胞流式分型結果
[0180] 【CIK細胞】
[0181]
[018引【NK細胞】
[0183]
[0184] 結果顯示，在整個培養(yǎng)過程中，隨著細胞數(shù)量的增殖和淋己細胞的分化，對照組淋 己細胞中的CIK細胞亞群比例基本不變，NK細胞亞群比例降低；而實驗組淋己細胞中的CIK 細胞亞群的比例則明顯增加，幾乎占到整個細胞群的1/3,NK細胞亞群比例也降低，但降低 的幅度比對照組小。表明本發(fā)明的實驗方法對CIK和NK細胞的增殖分化有促進作用，特別 是對CIK細胞。
[0185] 實施例4
[0186] 殺傷實驗
[0187] 采用實施例1的方法，分離新鮮抽取的肝素抗凝血，得到的淋己細胞分成4等分用 于細胞培養(yǎng)；其中的兩份（標記為公司A-I和公司A-2)采用已知的公司A的培養(yǎng)基和培 養(yǎng)方法，另外兩份（標記為實驗組-1和實驗組-2)采用本發(fā)明實施例2的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方 法，每種方法采用兩個重復組。
[018引采用公司A提供的培養(yǎng)方案，具體如下：
[0189]①采用3ml生理鹽水稀釋肥R2單抗（1:2000稀釋比），把稀釋好的抗體加入T25 培養(yǎng)瓶，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，讓溶液在培養(yǎng)瓶培養(yǎng)表面擴散；
[0190] ②室溫下賠育比，移除抗體溶液，用生理鹽水洗培養(yǎng)瓶兩次；
[0191] ⑨采用Ficoll液分離淋己細胞時，收集最上一層稀釋血漿備用；
[0192] ④處理好的培養(yǎng)瓶中加入分離好的淋己細胞，采用7ml培養(yǎng)基A(含lOOOUI/ml的 IL2)培養(yǎng)；
[0193] ⑤培養(yǎng)到第H天，補充13ml培養(yǎng)基A(含lOOOUI/ml的IL2);
[0194] ⑧培養(yǎng)到第5天，轉移細胞到T75培養(yǎng)瓶中，加入47ml培養(yǎng)基A(含lOOOUI/ml的 IL2和5ml稀釋血漿）；
[019引⑦培養(yǎng)到第7天，加入133ml培養(yǎng)基B(含lOOOUI/ml的IL2);
[0196] ⑨培養(yǎng)到第9天，轉移細胞到培養(yǎng)袋中，加入200ml的培養(yǎng)液B(含lOOOUI/ml的 IL2)；
[0197] ⑨培養(yǎng)到第11天，加入200ml的培養(yǎng)液B(含lOOOUI/ml的IL2);
[019引⑩培養(yǎng)到第15天，開始對細胞進行檢測，整個實驗過程中，分別在第15天、22天和 29天對培養(yǎng)的淋己細胞進行檢測。
[0199] 淋己細胞對人肺癌細胞系H1299殺傷性實驗：
[0200] 實驗采用的試劑是CellTitery()聯(lián)A如eous單溶液細胞增殖檢測試劑盒（MT巧， 檢測時，只需將少量的CellTiter9()巧A如eous單溶液直接加入培養(yǎng)板孔的培養(yǎng)基中，賠育 3小時，然后W酶標儀讀取490nm的吸光度值。
[0201] 具體實驗步驟如下；采用96孔細胞培養(yǎng)板進行實驗，提前一天，按照50U1培養(yǎng)基 中4000個/孔的量在96孔板中鋪好H1299細胞，實驗當天，收集淋己細胞計數(shù)，按照淋己 細胞；腫瘤細胞=20:1的比例，在鋪有H1299細胞的孔中，加入50U1培養(yǎng)基中80000個/ 孔的淋己細胞，每組淋己細胞做6個重復孔，設置好單獨腫瘤細胞、單獨淋己細胞和空白培 養(yǎng)基對照組。鋪好細胞的96孔細胞培養(yǎng)板放在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，在顯微鏡下觀察 拍照，拍照結果見圖3 ;之后每孔加入20ul的CellTiter9:6憑Aqueous溶液，在細胞培養(yǎng)箱 中繼續(xù)培養(yǎng)化，之后采用酶標儀，測490波長下溶液的吸光度值，根據(jù)得到的吸光度值，計 算不同淋己細胞組中H1299細胞的存活率，實驗結果見圖4。
[0202] 從圖3結果可W看出，與對照組的H1299相比較，公司A-I和公司A-2組的淋己細 胞偏小，且在經過淋己細胞殺傷之后，共培養(yǎng)組仍存在大量H1299細胞，而實驗組-1和實驗 組-2組的淋己細胞較大，經過淋己細胞殺傷之后，共培養(yǎng)組基本只剩下淋己細胞，可W看 出采用公司A的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，得到淋己細胞對檢測所用的人肺癌細胞系H1299基本 沒有殺傷性，相比采用本發(fā)明的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，得到的淋己細胞對H1299有非常好地 殺傷效果。
[0203] 從圖4結果可W看出，通過與對照組腫瘤細胞的存活率相比，公司A-I和公司A-2 組對腫瘤細胞的殺傷效率基本都在20%W下；而實驗組-1和實驗組-2組對腫瘤細胞的殺 傷效率基本都在80%W上，甚至達到100%。
[0204] 實驗結果均采用SPSS-單因素方差分析（ANOVA)，實驗各組均與對照組進行比較 分析；表示P< 0. 05,結果差異具有統(tǒng)計學意義；"**"表示P< 0. 01，結果差異具有顯 著性的統(tǒng)計學意義。
[0205] 實施例5
[0206] 培養(yǎng)淋己細胞的相關檢測
[0207] 5. 1采用流式細胞術進行淋己細胞分型
[020引表2人外周血淋己細胞體外培養(yǎng)細胞流式分型結果 [020引【第15天】
[0211]【第22天】
[0215] 采用與實施例3相同的方法檢測淋己細胞分型，結果如表2所示，公司A的培養(yǎng) 基和培養(yǎng)方案在2周的時候，NK細胞比例達到最大值，47. 3%，之后繼續(xù)培養(yǎng)，淋己細胞 開始大量死亡，同時NK細胞的比