專利名稱：利用突變和非突變的基質金屬蛋白酶制備藥物組合物及穩(wěn)定性提高的突變的金屬蛋白酶的制作方法
利用突變和非突變的基質金屬蛋白酶制備藥物組合物及穩(wěn)定性提高的突變的金屬蛋白酶發(fā)明領域本發(fā)明涉及蛋白質領域，特別是涉及利用突變和非突變的基質金屬蛋白酶制備藥 物組合物。同時，還涉及下文所定義的突變的基質金屬蛋白酶，該突變的基質金屬蛋白 酶較相應的非突變蛋白質對蛋白自溶的穩(wěn)定性提高?，F有技術基質金屬蛋白酶是一個由20多種不同鋅依賴酶組成的家族，它們負責降解細胞外基 質。在細胞生長、形態(tài)形成及組織修復過程中，細胞外基質組分具有調節(jié)細胞環(huán)境的基 本功能。因此，基質金屬蛋白酶的活性在轉錄及激活水平進行細微調節(jié)，也可以通過如 組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)和a2-巨球蛋白等內源抑制劑進行調節(jié)。調節(jié)基質金 屬蛋白酶活性的微平衡的改變，與如硬皮癥、心硬化、腎硬化、肝纖維化、肺纖維化、 胰囊性纖維化等病癥的發(fā)生和發(fā)展聯系在一起。基質金屬蛋白酶酶活性的抑制因子的許 多活性成分已為人們所知。因此，將它們用于制備治療金屬蛋白酶過表達所引起的病癥 的藥物組合物。相反，直到本申請人才意識到基質金屬蛋白酶不能以所分離純化的形式 作為活性成分，直接用于藥物領域。盡管如此，由于其在生理與病理領域的相關性，不管在學術領域，還是在工業(yè)領域， 對這種蛋白的需求仍很大。實際上，獲得提純的基質金屬蛋白酶是研究這些蛋白所參加 的生物過程和開發(fā)備選抑制劑的重要基礎問題。但是，由于基質金屬蛋白酶有蛋白自溶的趨勢和蛋白自身隨后降解，因此，基質金 屬蛋白酶的利用通常是困難、復雜且昂貴的。這是由于一個或更多的氨基酸序列暴露在 蛋白的表面，并與蛋白的催化位點有很好的親和性，從而水解了自身。為了避免蛋白自溶和降解過程，使用基質金屬蛋白酶需要非?？量痰墓ぷ鳝h(huán)境，這 就使其應用的實驗環(huán)境非常的復雜，有時甚至不可能實現。同時，其運輸和保藏也非常的復雜，事實上，生產企業(yè)推薦將其保存在-80。C。另一個重要的限制是為了避免蛋白自溶，研究者被迫使用低濃度基質金屬蛋白酶。這是許多實驗中利用基質金屬蛋白酶的另 一個限制。直到今天，研究人員利用合成的抑制劑或自我抑制的蛋白即蛋白帶有原結構域來減 少蛋白自溶現象。不過，這兩種策略都有許多的局限性，并且都不是解決這個問題的方 法。為了克服這個困難，已經制備出了基質金屬蛋白酶的突變子，將在酶活性位點參與 催化機制的氨基酸谷氨酸被丙氨酸代替(Morgunova, E. et al.， Science 1999, 284,1667)。事 實上，在水解過程中，谷氨酸側鏈的羧基與水分子一起親核攻擊肽鏈的羰基(Babine， R.E. etal., Chem. Rev. 1197,97,1359-1472)。谷氨酸被取代后，該蛋白失去水分子，從而再也 不能進行催化作用。正如很容易理解的，由于產生的是沒有活性的蛋白，因此在需要保 持催化活性的情況下這種方法是不可行的。因此，深感有必要開發(fā)另一種替代方法，該方法能消除蛋白自溶，并且既不阻礙其 催化活性，也不妨礙其與底物和天然抑制劑的親和性。發(fā)明內容本發(fā)明的申請人驚奇地發(fā)現將基質金屬蛋白酶催化結構域中的一個遠離活性位點的 特定位置的氨基酸突變使蛋白自溶的穩(wěn)定性比野生型、非突變蛋白高。而且本申請的申請人還發(fā)現突變基質金屬蛋白酶和野生型基質金屬蛋白酶都可以用 于制備藥物組合物，特別是治療基質生物多聚物積累和/或TIMPs過量有關病癥的藥物 組合物，如硬皮癥、心硬化、腎硬化、肝纖維化、肺纖維化、胰嚢性纖維化等病癥。因此，本發(fā)明的主題是人類基質金屬蛋白酶的催化結構域，其特征在于將所述催化 結構域突變以使與苯丙氨酸171相應的氨基酸殘基突變?yōu)橛H水的和/或帶電荷的氨基酸 殘基，其中苯丙氨酸171是根據序列登記號為P39900 (SwissProt)的編號。本發(fā)明的另 一個研究主題是含有將上面所述突變催化結構域作為催化結構域的基 質金屬蛋白酶；編碼上述突變基質金屬蛋白酶的DNA序列；含有上述DNA序列的重 組載體；和用上述重組載體轉化或轉染的離體細胞。本發(fā)明進一步的研究主題是利用人基質金屬蛋白酶和其上述任意突變的催化結構域 來制備藥物組合物；以及由此獲得的藥物組合物。本發(fā)明進一 步的研究主題是診斷基質生物多聚物積累和/或組織金屬蛋白酶抑制劑 (TIMPs)過量有關病變的診斷試劑盒，包括人基質金屬蛋白酶及其上述任意突變的催化結構域。本發(fā)明進一步的研究主題是根據基質金屬蛋白酶的藥理學性質，將上述突變的人基 質金屬蛋白酶，或其突變的催化結構域，作為藥學靶標。 本發(fā)明的特點和優(yōu)點將在下面詳細介紹。


圖1:實例3中的野生型和突變MMP3 (3號序列)十二烷基硫酸鈉(SDS ) /聚丙 蜂酰胺凝膠電泳圖。圖2:實例4中的野生型和突變MMPIO ( IO號序列)SDS/聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。 圖3:實例5中的野生型和突變MMP13 (10號序列)SDS/聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。本發(fā)明的詳細介紹本發(fā)明中，"親水和/或帶電氨基酸殘基"的表述意思是，氨基酸殘基選自包括谷氨酰 胺、天冬酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的組。尤其特指天冬氨酸。本發(fā)明中，"根據序列登記號為P39900 (SwissProt)的編號，與苯丙氨酸171相應 的氨基酸殘基"的表述意思是，在多序列比對結果中與上述苯丙氨酸171在相同位置的 氨基酸殘基。下文相同。對各種在上述定義的相應位置沒有親水和/或帶電氨基酸殘基的基質金屬蛋白酶(下 文中縮寫為MMP)而言，例如，通過多序列比對，除MMP-l(l號序列)、MMP-8(5號 序列)、MMP-11(8號序列)外所有的MMPs,突變位于如下位點-根據序列登錄號為P08253(SwissProt)的編號，人MMP-2(2號序列)及其所有通過 選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基酸殘基是甘氨酸181。-根據序列登錄號為P08254(SwissProt)或Q6GRF8 (TrEMBL)的編號，人MMP-3(3 號序列)及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基酸殘基是苯丙氨酸171。-根據序列登錄號為P09237(SwissProt)的編號，人MMP-7(4號序歹'J)及其所有通過 選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基酸殘基是絲氨酸166。-根據序列登錄號為P14780 (SwissProt)的編號，人MMP-9(6號序列)及其所有通過 選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基酸殘基是甘氨酸178。-根據序列登錄號為P09238 (SwissProt)或Q53HH9 (TrEMBL)的編號，人 MMP-10(7號序列)及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基酸殘基是苯丙 氨酸170。-根據序列登錄號為P39900 (SwissProt)的編號，人MMP-12(9號序列)及其所有通 過選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基酸殘基是苯丙氨酸171。-根據序列登錄號為P45452 (SwissProt)或Q7Z5M0、 Q7Z5M1 、Q6NWN6 (TrEMBL) 的編號，人MMP-13(10號序列)及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基 酸殘基是苯丙氨酸175。-根據序列登錄號為P50281 (SwissProt)或Q6GSF3 (TrEMBL)的編號，人 MMP-14(11號序列)及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基酸殘基是絲 氨酸189。-根據序列登錄號為P51511 (SwissProt)或Q7KZY0 (TrEMBL)的編號，人 MMP-15(12號序列)及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基酸殘基是絲 氨酸209。-根據序列登錄號為P51512 (SwissProt)或Q52H48、 Q14824 (TrEMBL)的編號，人 MMP-16(13號序列和14號序列)及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基 酸殘基是絲氨酸196。-才艮據序列登錄號為Q9ULZ9 (SwissProt)或Q5U5M0、 Q81WC3 (TrEMBL)的編號， 人MMP-17(15號序列)及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基酸殘基是 甘氨酸200。-根據序列登錄號為Q99542 (TrEMBL)的編號，人MMP-19(16號序列和17號序列) 及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基酸殘基是酪氨酸165。-根據序列登錄號為060882 (TrEMBL)的編號，人MMP-20(18號序列)及其所有通 過選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基酸殘基是絲氨酸179。-根據序列登錄號為Q5VZP9和Q8N119 (TrEMBL)的編號，人MMP-21(19號序列) 及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基酸殘基是半胱氨酸238。-根據序列登錄號為075卯0 (TrEMBL)的編號，人MMP-23A(20號序歹'j)及其所有 通過選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基酸殘基是半胱氨酸152。-根據序列登錄號為Q9UBR9(TrEMBL)的編號，人MMP-23B(21號序列)及其所有 通過選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基酸殘基是半胱氨酸152。-根據序列登錄號為Q9Y5R2和Q9H440 (TrEMBL)的編號，人MMP-24(22號序列) 及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基酸殘基是絲氨酸232。-根據序列登錄號為Q9NPA2 (TrEMBL)的編號，人MMP-25(23號序列)及其所有通 過選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基酸殘基是絲氨酸182。-根據序列登錄號為Q9NRE1 (TrEMBL)的編號，人MMP-26(24號序列)及其所有通 過選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基酸殘基是甘氨酸161。-根據序列登錄號為Q9H306和Q6UWK6 (TrEMBL)的編號，人MMP-27(25號序列) 及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基酸殘基是半胱氨酸168。-根據序列登錄號為Q9H239和Q9BUG8 (TrEMBL)的編號，人MMP-28(26號序列 和27號序列)及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基酸殘基是甘氨酸 193。-根據序列登錄號為043923 (TrEMBL)的編號，類人MMP - 1(28號序列)及其所 有通過選擇性剪接所決定的異構體，突變的氨基酸殘基是絲氨酸106。比對程序ClustalW(L6)采用下列參數取代矩陣Gonnet250,缺口 IO,缺口關閉-I, 缺口延伸-2，缺口大小4。序列比對方法學的詳細介紹見Andreini C.等，J. of Prot醒e Research, 2004， 3, 21,及其參考文獻。如下面的例子所示，本發(fā)明中的突變蛋白與相應的野生型、未突變的蛋白相比，具 有非常高的穩(wěn)定性。這樣就使得不管是利用本發(fā)明得突變蛋白作為科學研究公具如藥學 工具以檢測以基質金屬蛋白酶作為藥學把標的新藥，還是以其作為藥物的有效成分，都 變的更加有效。通過下面的實例來證明，但不限于本發(fā)明。 實例1根據本發(fā)明，通過定點誘變，使氨基酸殘基進行突變。根據這個目的合成了一組核 苷酸，其中該組核苷酸由35個與野生型的基因互補的堿基組成，其中不包括編碼在蛋 白質中將被突變的氨基酸的三連體密碼子。利用這些寡核苷酸，在含有野生型基因的質 粒上，采用比寡核香酸熔點(tm)低至少15 - 20°C的溫度(tm)退火進行PCR反應，得到含有突變基因的質粒。將PCR反應混合物轉化大腸桿菌(E.coli)細胞,并分離含有 突變質粒的細胞，并通過基因序列測定鑒定質粒上的突變基因。 實例2通過下面的程序，克隆、表達、純化野生型和突變型的MMPs催化結構域。 將每個原MMP (proMMP )蛋白的cDNA克隆在pET21 (Novagen )載體上。所得的載體轉化大腸桿菌BL21細胞。37。C下，在LB ( Luria - Bertani)培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉化細胞。在對數生長期加入0.5mM IPTG (異丙基-卩-D -硫代半乳糖苷)誘導蛋白表達。 誘導4小時后，收獲并裂解細胞。細胞裂解后，收集包涵體，并將其溶解在6M尿素和 20mM pH = 8的Tris-HCl溶液中。然后，用Hiprep 16/10 (20ml) QFF (Ph纖acia)和含有 6M尿素和pH 8.0的20mM Tris-HCI的緩沖液純化蛋白。然后用NaCl線性梯度洗脫到 0.35M。接著用含有50mM Tris-HCl (pH 7.2 ) , 10mM CaC12, 0.1 mM ZnC12, 0.3 M NaCl 和0.2 M AHA (醋羥胺酸)的緩沖液透析，得到復性的純化蛋白。在復性過程中通過切斷 前肽序列使每一蛋白質活化。在最后的復性透析過程中，醋羥胺酸的濃度為0.5M。用 Superdex 75 16/60 (Pharmacia)色譜柱，以最后的透析緩沖液洗脫，來分離單一的催化 結構域。通過上述制備、純化步驟得到的MMPs,其氨基酸序列如下 l號序列MMP-1 P03956 〉gilll6852lsplP03956IMMPL人間質膠原酶前體 (基質金屬蛋白酶-l) ( MMP-1)(纖維原細胞膠原酶)QPIGPQTPKACDSEVRFFKGNKYWA MDPGYPKMIAHDFPGIGHKVDAVFMKDGFFYFFHGTRQYKFDPKTKRILTLQKANSWFNCRKN 2號序列MMP-2 P08253>gi|116856|sp|P08253|MMP2—人72 kDa IV型膠原酶前體 (72 kDa明膠酶)(基質金屬蛋白酶-2 ) ( MMP-2)(明膠酶A) ( TBE-l )YGCPKESCNLFVLRIIGYTPDLDPETVPGTGVGGDSHFDDDKDGKYGFCPHEALFMSTVGGNSEGAPCVHAMGLEHSQDPGALIRGE肝FKDLERGYPKPLTSLGNLDAVVDLqGGGHSY FFKGAYYLKLENQSLKSVKFGSIKSDWLGC3號序列 MMP-3 P08254 〉gilll6857lsplP082541MMP3—人基質分解素-前體 (基質金屬蛋白酶-3) (MMP-3)(轉換素-l) (SL-1)SGPVVKKIREMQKFDAVDSAVEKALKVDDDE，TKDTTGTPETPLVPTEPVDAAYEVTSKDWRFDEKRNSMEP4號序列MMP-7 P09237>gi|l 16861 IsplP09237IMMP7—人基質溶解因子前體(Pump-1蛋白酶) (子宮金屬蛋白酶)(基質金屬蛋白酶-7) (MMP-7)(基質蛋白)AKLKEMQKFFGLPIVSKALNMWGKEIRWTDGSSLGINFLYK5號序列MMP-8 P22894>gi|l 16862|sp|P22894|MMP8_人中性粒細胞膠原酶前體 (基質金屬蛋白酶-8) (MMP-8)(多形核白細胞膠原酶)(PMNL-CL)GYPKSISGAFPGIESKVDAVFQGEHFFHVFSGPRYYAFDLIAQRVTRVARGNKWLNCRYG 6號序列MMP-9 P14780〉gilll6863lsplP14780IMMP9—人基質金屬蛋白酶-9前體(MMP-9) (92 kDa IV型膠原酶)(92 kDa明膠酶)(明膠酶B) (GELB) [包含67kDa基質金屬蛋白酶-9; 82 kDa基質金屬蛋白酶-9〗MSLWQPLVLVLLVLGCCFAAPRQRQSTLVLFPGDLRTNLTDRQLAEEYLYRYGYTR VAEMRGESKSLGPAFGFCPSERLYTRD14MGGNSAGELCVFPLGLDHSSVPEALMYRPTAGPTGPPSRPQGPFLIADKWRSGRGKMLLFSGRSELNQVDQVGYVTYD ILQCPED7號序列MMP-10 P09238>gi|l 16869|sp|P09238|MMP10—人基質分解素-2前體 (基質金屬蛋白酶-lO) (MMP-10)(轉換素-2) (SL-2)NLIVKKIQGMQKFLDAVDSAIEKALKVWDEKWTEDASGTNTEEPLVPTKSVPLDAAYEVNSRDTRFDENSQSMEQG8號序列MMP-11 P24347>gi|l 16871 |sp|P24347|MMPl 1_人基質分解素-3前體 (基質金屬蛋白酶-11) (MMP-11) (ST3) (SL-3)SSPAPAPA，APRQTMAEALKVWSDVTWTIGDDQGTDIXRTPALGPQAGIDTNGLPSPVDAAFEDADYWRFHPSTRRVDSFFGCAEPANTFL 9號序列MMP-12 P39900>gi|729179|sp|P39900|MMP 12—人巨噬細胞金屬彈性蛋白酶前體(HME)(基質金屬彈性蛋白酶-12) (MMP-12)(巨噬細胞彈性蛋白酶)(ME)LMKEKIQEMQHFNREDVDYAIRKAFQVDEDEFWTTHSGGTQRLPNPDNSEPA ARNQVFLFKDD MMDPGYPKLITKNFGGIGPKIDAVFYSKNKYYYFFQGSN,YDFLL,TKTLKSNSWFGC IO號序列MMP-13 P45452>gi|1168998|sp|P45452|MMP13—人膠原蛋白酶-3前體 (基質金屬蛋白酶-13) (MMP-13))TNLAGILKENAASSMTERLRETPDMTHSEVEKAFKKAHFDDDETWTSSPGDEDPNPKHPKTEHPSHDLIFIFRTNHIMDKDYPRLIll號序列MMP-14 P50281〉gil60392771lsplP50281IMMPl七人基質金屬蛋白酶-14前體(MMP-14)(細胞膜型基質金屬蛋白酶1) (MT-MMP 1) (MTMMP1) (1型細胞膜基質金屬 蛋白酶)(MT1-MMP) (MTIMMP) (MMP-X1)QSLSAAIAAMQKFCIQNYTPKVGEYATIAHAYFPGPNIGENFVLPDDDRRGIQERWFWRVRNNQVMRGLPTDKIDAALFYKGNKYWKFNNQKLIXLVLAVGLAVF FFRRHGTPRRLLYCQRSLLDKV 12號序列MMP-15 P51511:^ill705988lsplP51511IMMP15—人基質金屬蛋白酶-15前體(MMP-15)(細胞膜型基質金屬蛋白酶2) (MT - MMP2) (MTMMP2) (2型細胞膜基質金屬 蛋白酶)(MT2-MMP) (MT2MMP) (SMCP-2)LRLYGYLPQPSRHMRRRKRYALTGRKWNMVLFASGFHGDSSLEHSSNPNAIMAPF PPGGKPERPPKP MPIGHFWRGLPGDIS TFFFQEDRYWRFN GYPKSILRDFMGCQ ,EEVARTVNVVMVLVPLLLLLCVLGLTYALVQMQRKGAPRVLLYCKRSLQEWV13號序列MMP-16 P51512異構體l>gi|3041669|splP51512|MMP16—人基質金屬蛋白酶-16前體 (MMP-16)(細胞膜型基質金屬蛋白酶3) (MT-MMP 3)(MTMMP3) (3型細胞膜基質金屬蛋白酶)(MT3-MMP) (MT3MMP) (MMP-X2) PRMSVLRSAETMQ WQHKHITYS腦VT DGEGGFLAHAY YQYMETDNFKLPN NICDGNFNTLKGNKYWVFKDTTLQDVDIVIKLDNTASTVKAIAIVIPCILALCLLVLVYTVFQFKRKGTPRHILYCKRSMQEWV14號序列異構體2>gi|13027800|ref]NP_072086.1|基質金屬蛋白酶-16異構體2 [人]KVKGDTLSVIQDGWLYKYHWKWILEQRqSVPVLSRGTEKHKTYEELSSITY 15號序列MMP-17 Q9ULZ9〉gil21264469lsplQ9ULZ9IMMP17—人基質金屬蛋白酶-17前體 (MMP-17)(細胞膜型基質金屬蛋白酶4) (MT-MMP 4) (4型細胞膜基質金屬蛋白酶)(MT4-MMP)LSRFGYLPPADP GAPAPTK職KRN NDGYPFDGPGGTV HSIMRPYYQGPVGDP FDAVAQIRGEAF RYWVFKDNNVEEGY GVPSTLDDAMRWSD RAPPGQHDQSRSEDGYEVCSCTSGASSPPGAPGPUVAATMIXIXPPLSPGALWTAAQALTX 16號序列MMP-19 Q99542 異構體類風濕關節(jié)炎滑膜炎癥因子-1 (rasi-l) 〉gill2643345lsplQ99542IMMP19—人基質金屬蛋白酶-19前體 (MMP-19)(基質金屬蛋白酶類風濕關節(jié)炎滑膜炎癥因子)(MMP-18)LRAFQEASELPVSGALRQAFQDWSNVAGTYRGVNLRIIAEEETELPTVPPVPTLDAAVYSPRTQWIHLARTDFSSYPKPIKGTIDTTPSGGNTTPSGTGITLDTTLSATETTFEY17號序列異構體類風濕關節(jié)炎滑膜炎癥因子-6 (msi-6)>gi|13027792|reflNP—073628.11基質金屬蛋白酶-19異構體類風濕關節(jié)炎滑膜炎癥因子 一 6[人]SNVAPLTFQEVQARIIAAHEVGHALGVPTEPSPMPDPCSSELDAMMLGEAPPLQAVGRRWGQPADPEAWTNGSDMGLQHEQWRAPWEDLCFQGGLCVDCIRFRTGPLVPSVCPLGGAPRKPGCCCLLASNTMDSLL18號序列 MMP-20 060882〉gil564053031splO60882IMMP20一人基質金屬蛋白酶-20前體 (MMP-20)(釉質金屬蛋白酶)(釉質溶解素)IGEMVARGSNSMIRKYTPSMSSVEVDKGLGGDTHFDNAEKWTMGTNGFNLFTVAAHEFGHALGLAHSTDPSALMYPTYKY認PYGFHLPKDDVKGI QALYGPRKVFLGKPPQLMSNVDAA FFVGDEYYSYDER SSWIGC19號序列MMP-21 Q8N119〉gil50401068lsplQ8N119IMMP2L人基質金屬蛋白酶-21前體(MMP-21) RYGWSGVWAAWG SAPPSPPGPPPRA VALAFRMWSEVTP PPTSDTGISLLKV WIRKE認QYGEV RYFFQGNQYWRYDRVLNSYPKRITPKKHSEKWFDVC DVHISTLNM20號序列MMP-23 A 075900>gi|4758730|reflNP—004650.11基質金屬蛋白酶23A [人]EPLEFSYPGYLALGEAHLSIIANAVNEGTYTCVVRR②RVLTTYSWRVRVRG 21號序列MMP-23B Q9UBR9 >gi|4468604|emb|CAB38176.1| MMP-23 [人]EPLEFSYPGYLALGEAHLSIIANAVNEGTYTCVVRRQQRVLTTYSWRVRVRG 22號序列 MMP-24 Q9Y5R2>gi|12585280|splQ9Y5R2|MMP24—人基質金屬蛋白酶-24前體 (MMP-24)(細胞膜型基質金屬蛋白酶5) (MT-MMP 5) (5型細胞膜基質金屬蛋白酶)(MT5-MMP)DQTTIEWMKKPRCGNRVQEGYPMQ正QVYTIFQFKNKTG PQPVTYYKRPVQEWV 23號序列 MMP-25 Q9NPA2〉gill2585274jsplQ9NPA2IMMP25—人基質金屬蛋白酶-25前體 (MMP-25)(細胞膜型基質金屬蛋白酶6) (MT-MMP 6) (6型細胞膜基質金屬蛋白酶)(MT6-MMP)(白細胞溶素)LRDAIKVMQRFAGSFPQSSQLSQETVRVPGEHPISGDTHFDLSQDDRDGLQQLYGRLQPSGQLVSELGLPPGEEVDAVFYFFKGAHYWRFPKNSL1XLPLXVGGVA SR24號序列 MMP-26 Q9NREI>gi| 136294931splQ9NREllMMP26—人基質金屬蛋白酶-26前體 (MMP-26)(基質溶解因子-2)(子宮內膜基質金屬蛋白酶Endometase)LQQFHRNGTDLLDVSIWSNVTPLIFQSDTGYNLFLVATHEI25號序列 MMP-27 Q9H306>gi|11066090|gb|AAG28453.1|AF 195192—1基質金屬蛋白酶MMP-27 [人] IDDKIREMQAFF VDEAIQEGLEVWSK ENWTKDGAGFNL KPKEPTIPHACD KILVFKDENFWM KGFPQRWKHFPG EKAHSGGIKILYHKSLSLFIFGIVHLLKNTSIYQ 26號序列 MMP-28 Q9H239 異構體1>gi|37538314|sp|Q9H2391MMP28—人基質金屬蛋白酶-28前體 (MMP-28) (Epilysin) (UNQ1893/PR04339)TRFSDAIRAFQWVSQLPVSGVLDRATLRQMTRPRCGVTDTNSYAAWAERISDLFARHRTKMRRKKRFAKQ GNKWYKQHLSYRLVAFDGPGGALAHAFLDALLSWDDVLAVG QLYIFKGSHFWEV QLCRAGGLPRHPDA FRDDRYWRLDQAKLQATTSGRWATELPWMGCWHANSGSALF27號序列異構體2>gi|14589912|reflNP—116568.11基質金屬蛋白酶28前蛋白原異構體2 [人] TRFSDAIRAFQWVS GNKWYKQHLSYRLV AFDGPGGALAHAFL DAIXSWDDVLAVQ GLYIFKGSHFWEVAADGNVSEPRPLQE證VGLPPN正AAAVSLNDGDFYFFKVQSV 28號序列類MMP-l 043923>gi|4758728|reflNP—004133.11類基質金屬蛋白酶1 [人] LSQETVRVLMSYALGDTHFDDEETWTFGSKASQGLE卿AGGSPVDEELGFSRG豐VNPLGPGSPERLS 實例3突變的MMP-3穩(wěn)定性評估(3號序列)對野生型人金屬蛋白酶3(MMP-3) (3號序列)催化結構域和苯丙氨酸突變?yōu)樘於彼?的突變的人金屬蛋白酶3(MMP-3) (3號序列)催化結構域進行了穩(wěn)定性評估研究。在相同 條件下，針對蛋白自溶對這兩種蛋白的穩(wěn)定性進行了比較分析。利用實例1中的方法，制備了這兩種蛋白質。并采用SDS/聚丙烯酰胺凝膠電泳，按 下述方法分析了其穩(wěn)定性。所用的蛋白樣品溶解在含有50mM羥基曱基氨基乙烷(hydroxymethylaminoethane ) (Tris ) (pH = 7.2), 5mM CaC12, 0.1 mM ZnC12, 0.3 M NaCI和0,5 M醋羥胺酸(AHA)的 緩沖溶液中，蛋白濃度0.45mM。樣品維持在室溫。在間隔相當于O, 4， 7, 11, 14天的時候，分別取保存在室溫下的樣品5|_iL,迅速 在-80°C凍存。所收集的蛋白樣品具有上述所述的濃度，并進行SDS/聚丙烯酰胺凝膠 電泳(17% )分析，所得結果如圖1所示并在下面進行說明。分析顯示突變蛋白與野生型相比具有更高的穩(wěn)定性。事實上，野生型和突變蛋白 從O時開始都有降解條帶。但是，在接下來的14天中沒有降解的野生型蛋白條帶的濃 度顯著下降。相反，沒有降解的突變蛋白的相應條帶在這14天中基本上不變。而且， 野生型蛋白的斷裂在氨基酸殘基171位點，突變蛋白在相應位點產生的斷裂，兩者相比 野生型蛋白斷裂產生的片段比突變蛋白產生的片段的分子量小。這說明野生型和突變蛋 白具有不同的切割位點，因此突變蛋白的突變位點與野生型蛋白的相應位點相比不易作 為切割位點，這說明沒有降解的突變蛋白更穩(wěn)定。最后，如圖l所示，來自突變蛋白降解片段的條帶的強度基本維持不變。這說明突 變蛋白不易于斷裂，而且斷裂產生的片段也比野生型斷裂的片段更穩(wěn)定。 實例4突變的MMP-10 ( 7號序列)穩(wěn)定性評估對野生型人金屬蛋白酶10(MMP-10) (7號序列)催化結構域和苯丙氨酸突變?yōu)樘於彼岬娜私饘俚鞍酌窱O(MMP-IO) (7號序列)催化結構域進行了穩(wěn)定性評估研究。在相同條 件下，針對蛋白自溶對這兩種蛋白的穩(wěn)定性進行了比較分析。利用實例1中的步驟制備了這兩種蛋白質。并采用SDS/聚丙烯酰胺凝膠電泳，按下述方法分析了其穩(wěn)定性。所用的蛋白樣品溶解在含有10mM Tris(pH = 7.2) , 10mM CaC12, 0.1 mM ZnC12, 0.3 MNaCl和0.5 M醋羥胺酸(AHA)的緩沖溶液中，野生型蛋白濃度為0.3mM,突變蛋白 的濃度為0.26mM。樣品維持在室溫4。C。4'C條件下，野生型蛋白在O, 1, 2和3天取樣5uL,突變蛋白在O， 6和30天取樣 5uL,所取的樣品立即在-80。C凍存。樣品的濃度如上所述，通過SDS/聚丙烯酰胺凝膠 (17% )電泳分析，所得結果如圖2所示。而且，上面MMP3 ( 3號序列)得到的結果 與MMP-10所得到的結果基本一樣，值得注意的是突變蛋白甚至在30天后仍有高穩(wěn)定 性。實例5突變MMP-13 ( 10號序列)的穩(wěn)定性評估對野生型人金屬蛋白酶13(MMP-13) (10號序列)催化結構域和苯丙氨酸突變?yōu)樘於彼?的人金屬蛋白酶13(MMP-13) (10號序列)催化結構域進行了穩(wěn)定性評估研究。在相同條 件下，針對蛋白自溶對這兩種蛋白的穩(wěn)定性進行了比較分析。利用實例1中的步驟制備了這兩種蛋白質。并采用SDS/聚丙烯酰胺凝膠電泳按下述 方法分析了其穩(wěn)定性。所用的蛋白樣品溶解在含有50mM Tris(pH = 7.2) ， 5mM CaC12, 0.1 mM ZnC12, 0.3 M NaCl，但不含醋羥胺酸(AHA)的緩沖溶液中，蛋白濃度80uM。樣品維持在室溫。室溫下，這兩種蛋白樣品分別在O、 2、 7、 14和21天取樣5uL,迅速在-80。C凍 存。所收集蛋白樣品的濃度如上所述，進行SDS/聚丙歸酰胺凝膠電泳分析(17% ), 所得結果如圖3所示并在下面進行說明。分析顯示與野生型蛋白相比突變蛋白具有更高的穩(wěn)定性。事實上，從圖3可以看 到非降解野生型蛋白相對應的條帶強度降低的很明顯，21天后檢測條帶幾乎消失，相反， 本發(fā)明中的突變蛋白相對應的條帶的強度21天后幾乎沒有變化。而且，圖3可以看到野生型有小分子量的蛋白片段，而本發(fā)明中的突變蛋白沒有這樣的條帶出現。 實例6 活性評估通過下述的方法測定酶的活性用于比色法的底物是硫肽(乙酰-脯-亮_甘-[2 -疏基-4 -甲基-戊酰]-亮-甘乙酯，該實際來自Biomol catalogue。在基質金屬蛋白酶作用下，硫肽水解產生sulphydrilic基，產生的sulphydrilic基再與DTOB (5, 5'-二硫代雙硝基苯曱酸)即Ellman試劑反應，)，產生2 -硝基-硫代笨甲酸，在412nm波長檢測其吸光度。反應條件如下反應體積=500ul硫肽濃度* = lOOuM蛋白濃度* == 50nM帶"*"為最終體系中的濃度?；钚詼y定緩沖液50mM HEPES pH 75 mM CaC120.1 mMZnC120.05% Brj-351 mM DTNB ( 5, 5' - 二好u代雙硝基苯甲酸) 25'C下，測定結果為25。C下，MMP3 (3號序列)(F171)的比活性為43 U/ g. An U = 100 pmol/分 25。C下,MMP7 (4號序列)(S166D)的比活性為66 U/ g. An U = 100 pmol/分 25。C下，MMP10(7號序列)(F171)的比活性為41 U/ g. AnU = 100pmol/分 25。C下，MMP12(9號序列)(F171)的比活性為:91 U/ g. AnU = 100 pmol/分 37。C下，我們采用相同的底物測定了 Biomol MMP的活性值，結果如下 37。C下，MMP3 (3號序列)的比活性為50 U/ g. AnU = 100 pmol/分 37。C下，MMP7 (4號序列)的比活性為34.5 U/ g. AnU = 100 pmoI/分 37'C下,MMP10 (7號序列)的比活性為42.5 U/ g. An U = 100 pmol/分37。C下，MMP12 (SEQIDNo. 9號序列)的比活性為86 U/ g. An U = 100 pmol/分 實例7將每個MMP的催化結構域的cDNA克隆到pET21 (Novagen )載體內(Novagen)。 然后，將所得栽體用于轉化大腸桿菌BL21-DE3細胞中。在37。C下，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng) 轉化的細胞。在對數期加入0.5mMIPTG誘導蛋白表達。誘導5小時后，收集并裂解誘 導細胞。包涵體溶解在含有20mM pH8.0 Tris和6M尿素的緩沖液中。通過陰離子交換柱(H汀rap QHP - Pharmacia)純化蛋白，緩沖液含有20mM pH8.0 Tris和6M尿素，再用NaCl進行線性洗脫知道濃度為0.5M。純化后的蛋白用在含有50mMpH7.2Tris, 10mMCaC12, 0.1 M ZnC12, NaCl 0.3 M和0.2M醋羥胺酸(AHA)的緩沖液中復性，隨后透析。醋羥胺酸復性透析的終濃 度為0.5M。用色譜柱Superdex 75 16/60 (Pharmacia)分離催化結構域，洗脫液用最后 的透析液。用上面的方法，制備并純化了 MMP-l(l號序列)、MMP-3(3號序列)、MMP-7(4號 序列)、MMP-8(8號序列)、MMP-10(7號序列)和MMP-12(9號序列)的催化結構域。
權利要求
1. 人基質金屬蛋白酶的催化結構域，其特征在于，使所述的催化結構域發(fā)生突變以使與苯丙氨酸171相應的氨基酸殘基是親水的和/或帶電荷的氨基酸殘基，其中苯丙氨酸171是根據序列登錄號為P39900(SwissProt)的編號。
2. 根據權利要求1所述的催化結構域，其特征在于，所述的與苯丙氨酸171相對應的氨 基酸殘基從下面進行選擇-根據序列登錄號為P08253(SwissProt)的編號，人MMP-2即2號序列及其所有通過 選擇性剪接所決定的異構體，被突變的氨基酸殘基是甘氨酸181;-根據序列登錄號為P08254(SwissProt)或Q6GRF8 (TrEMBL)的編號，人MMP-3即3 號序列及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，被突變的氨基酸殘基是苯丙氨酸 171;-根據序列登錄號為P09237(SwissProt)的編號，人MMP-7即4號序列及其所有通過選 擇性剪接所決定的異構體，被突變的氨基酸殘基是絲氨酸166;-根據序列登錄號為P14780 (SwissProt)的編號，人MMP-9即6號序列及其所有通過 選擇性剪接所決定的異構體，被突變的氨基酸殘基是甘氨酸178; -根據序列登錄號為P09238 (SwissProt)或Q53HH9 (TrEMBL)的編號，人MMP-10 即7號序列及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，被突變的氨基酸殘基是苯丙氨 酸170;-根據序列登錄號為P39卯0 (SwissProt)的編號，人MMP-12即9號序列及其所有通過 選擇性剪接所決定的異構體，被突變的氨基酸殘基是苯丙氨酸171; -根據序列登錄號為P45452 (SwissProt)或Q7Z5M0、 Q7Z5M1 、 Q6NWN6 (TrEMBL) 的編號，人MMP-13即10號序列及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，被突變 的氨基酸殘基是苯丙氨酸175;-根據序列登錄號為P50281 (SwissProt)或Q6GSF3 (TrEMBL)的編號，人MMP-14即 11號序列及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，被突變的氨基酸殘基是絲氨酸 189;-根據序列登錄號為P51511 (SwissProt)或Q7KZY0 (TrEMBL)的編號，人MMP-15即 12號序列及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，被突變的氨基酸殘基是絲氨酸 209;-根據序列登錄號為P51512 (SwissProt)或Q52H48和Q14824 (TrEMBL)的編號，人 MMP-16即13號序列和14號序列及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，被突變 的氨基酸殘基是絲氨酸196;-根據序列登錄號為Q9ULZ9 (SwissProt)或Q5U5M0和Q81WC3 (TrEMBL)的編號， 人MMP-17即15號序列及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，被突變的氨基酸 殘基是甘氨酸200;-根據序列登錄號為Q99542 (TrEMBL)的編號，人MMP-19即16號序列和17號序列 及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，被突變的氨基酸殘基是酪氨酸165; -根據序列登錄號為060882 (TrEMBL)的編號，人MMP-20即18號序列及其所有通過 選擇性剪接所決定的異構體，被突變的氨基酸殘基是絲氨酸179; -根據序列登錄號為Q5VZP9和Q8N119 (TrEMBL)的編號，人MMP-21即19號序列 及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，被突變的氨基酸殘基是半胱氨酸238; -根據序列登錄號為075卯0 (TrEMBL)的編號，人MMP-23A即20號序列及其所有通 過選擇性剪接所決定的異構體，被突變的氨基酸殘基是半胱氨酸152; -根據序列登錄號為Q9UBR9 (TrEMBL)的編號，人MMP-23B即21號序列及其所有 通過選擇性剪接所決定的異構體，被突變的氨基酸殘基是半胱氨酸152; -根據序列登錄號為Q9Y5R2和Q9H440 (TrEMBL)的編號，人MMP-24即22號序列 及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，被突變的氨基酸殘基是絲氨酸232; -根據序列登錄號為Q9NPA2 (TrEMBL)的編號，人MMP-25即23號序列及其所有通 過選擇性剪接所決定的異構體，被突變的氨基酸殘基是絲氨酸182; -根據序列登錄號為Q9NRE1 (TrEMBL)的編號，人MMP-26即24號序列及其所有通 過選擇性剪接所決定的異構體，被突變的氨基酸殘基是甘氨酸161; -根據序列登錄號為Q9H306和Q6UWK6 (TrEMBL)的編號，人MMP-27即25號序列 及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，被突變的氨基酸殘基是半胱氨酸168; -根據序列登錄號為Q9H239和Q9BUG8 (TrEMBL)的編號，人MMP-28即26號序列 和27號序列及其所有通過選擇性剪接所決定的異構體，被突變的氨基酸殘基是甘氨 酸193;-根據序列登錄號為043923 (TrEMBL)的編號，類人MMP - 1即28號序列及其所有 通過選擇性剪接所決定的異構體，被突變的氨基酸殘基是絲氨酸106。
3. 根據權利要求1所述的催化結構域，其特征在于，所述的親水的和/或帶電荷的氨基 酸殘基是選自包括谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸組中的一個氨基酸殘基。
4. 根據權利要求3所迷的催化結構域，其特征在于，所述的親水的和/或帶電荷的氨基 酸殘基是天冬氨酸殘基。
5. —種突變的人基質金屬蛋白酶，所述的突變的人基質金屬蛋白酶的催化結構域含有權 利要求1 - 4中任一權利要求所定義的催化結構域。
6. 人基質金屬蛋白酶和其催化結構域用于制備藥物組合物的用途，所述人基質金屬蛋白 酶和其催化結構域可以是非突變的或為權利要求1 - 5中任一權利要求所述的突變的 人基質金屬蛋白酶和其催化結構域。
7. 根據權利要求6所述的用途，用于制備用于治療基質生物多聚物積累和/或組織抑制 金屬蛋白酶TIMPs過量有關病變的藥物組合物。
8. 根據權利要求7所述的用途，其特征在于，所述的病癥選自硬皮癥、心硬化、腎硬化、 肝纖維化、肺纖維化、胰嚢性纖維化。
9. 一種藥物組合物，所述的藥物組合物的活性成分含有人基質金屬蛋白酶或其催化結構 域，所述人基質金屬蛋白酶或其催化結構域可以是非突變的或權利要求1-5中任一 權利要求所述的突變的人基質金屬蛋白酶和其催化結構域。
10. —種診斷基質生物多聚物積累和/或組織金屬蛋白酶抑制劑TIMPs過量有關病變的 診斷試劑盒，所述的診斷試劑盒含有人基質金屬蛋白酶或其催化結構域，所述人基質 金屬蛋白酶或其催化結構域可以是非突變的或權利要求1-5中任一權利要求所述的 突變的人基質金屬蛋白酶和其催化結構域。
11. 根據權利要求10所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述的病癥選自硬皮癥、心硬化、 腎硬化、肝纖維化、肺纖維化、胰嚢性纖維化。
12. 權利要求5所定義的突變的基質金屬蛋白酶或權利要求1 - 4中任一權利要求所定義 的基質金屬蛋白酶的突變催化結構域的用途，將其作為以基質金屬蛋白酶為藥學靶標 的藥理性質鑒定的試劑。
13. 編碼權利要求5所定義的突變基質金屬蛋白酶的DNA序列。
14. 含有權利要求13所定義的DNA序列的重組載體。
15. 用權利要求14所定義的重組載體轉染或轉化的離體細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用突變和非突變基質金屬蛋白酶制備藥物組合物以治療與基質生物多聚物積累和/或組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)過量所引起的病變。本發(fā)明還公開了所述的突變基質蛋白酶蛋白中至少一個特定位置的氨基酸殘基突變成親水的和/或帶電的氨基酸殘基，從而使其對蛋白自溶具有高穩(wěn)定性。
文檔編號C12N9/50GK101238211SQ200680028904
公開日2008年8月6日 申請日期2006年8月10日 優(yōu)先權日2005年8月12日
發(fā)明者麗貝卡·德爾·康提, 伊萬諾·貝爾蒂尼, 克勞迪奧·魯奇耐特, 露西婭·班西, 馬可·弗萊吉 申請人:普羅泰拉有限公司