一種檢測人基質金屬蛋白酶-12活性的熒光多肽底物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種含有特定序列或基序的檢測基質金屬蛋白酶-12 (MMP-12)的熒 光多肽底物及其活性檢測方法，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 基質金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMPs)是一類依賴媽離子的含 鋅的內肽酶家族，能夠降解細胞外基質及基底膜中的多種成分，具有以下特點：①能降解細 胞外基質及基底膜的成分；②以酶原形式分泌，激活后具有生物學活性；③依賴鈣離子維 持其穩(wěn)定性；④能被內源性組織型金屬蛋白酶組織抑制劑抑制。MMPs來源于多種組織及細 胞，如內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞及腦組織 [h]。MMPs不僅在正常生理情況下參與 組織器官形態(tài)的發(fā)生、細胞迀移和血管生成等，也在病理性的重塑過程中發(fā)揮重要的作用， 如類風濕性關節(jié)炎 [4]腫瘤的侵襲和轉移[5]及慢性阻塞性肺疾病[6]、心血管疾病[7]等。
[0003] 基質金屬蛋白酶-12 (Matrix Metalloproteinases-12，ΜΜΡ-12)又被稱為人巨· 細胞彈性蛋白酶，1975年由Werb等[8]首次在小鼠腹膜巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)，1993年Shapiro等 [9]在吸煙者的肺泡巨噬細胞中成功克隆出MMP-12的cDNA序列。MMP-12以54-kDa的酶原 形式分泌，分泌后自剪切掉氨基末端的序列，生成45-kDa的活性形式，再剪切掉羧基末端 的序列生成成熟的22-kDa活性形式 [9'1(I]，MP-12的底物為彈性蛋白酶、IV型膠原、纖維結合 蛋白、層粘連蛋白、玻璃粘連蛋白、蛋白聚糖、硫酸軟骨素、髓鞘堿性蛋白及α 1-抗胰蛋白 酶。在體內ΜΜΡ-12、ΜΜΡ-3、ΜΜΡ-9、ΜΜΡ-7以血纖維蛋白溶酶原為底物，血纖維蛋白溶酶原被 水解后形成類血管抑制素的片段 [η];ΜΜΡ-12還能夠激活其它的MMPs，如ΜΜΡ-2及和ΜΜΡ-3， 放大并加速蛋白的降解[12]。
[0004] 研宄發(fā)現(xiàn)MMP-12與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關，如慢性阻塞性肺疾病[6]、冠 心病斑塊破裂 [13]、主動脈夾層[14]、腹主動脈瘤[15]、創(chuàng)傷型深靜脈血栓[16]等。但是由于MMPs 間的復雜相互作用機制及研宄方法的限制，其具體作用機制仍未闡明。因此建立一個準確 高效的MMP-12活性檢測方法在了解MMP-12的功能及相關作用機制的研宄中顯得十分重 要。
[0005] 目前檢測蛋白酶活性的主要方法有分光光度法、熒光法、同位素測定法、電化學方 法等。由于熒光發(fā)發(fā)的靈敏度往往比分光光度法要高若干個數(shù)量級，熒光強度也和激發(fā)光 的光源有關；熒光多肽合成、純化方法較簡便以及在實驗過程中可避免離子強度、PH、溫度 等多種因素對實驗結果的影響，在酶學研宄中越來越多地被采用。
[0006] 檢測MMPs活性的熒光底物原理是在合成的蛋白酶底物兩端分別偶聯(lián)熒光發(fā)光基 團和淬滅基團，可通過檢測底物被切割后產(chǎn)生熒光的強度來檢測蛋白酶切割反應的情況 [17' 18]。在無蛋白酶時，由于熒光核和猝滅劑相互彼此靠近，該完整肽鏈不具有內源性的熒 光活性，當?shù)鞍酌笖嗔言撾逆湥环蛛x的熒光核不能再被猝滅劑有效地猝滅而表現(xiàn)熒光活 性，即可測定蛋白酶裂解底物在特定Ex/Em產(chǎn)生的熒光值。
[0007] 目前報道了多種可被MMP-12水解的熒光多肽底物，但是特異性低，在被MMP-12水 解的同時也可以與其它MMPs發(fā)生水解反應，例如美國Anaspec公司所合成的MMP-12熒光 底物可同時被MMP_1、2、3、8和13酶切。臨床血清樣本中含有多種MMPs，MMP-12的功能是 與多種家族成員及組織抑制劑共同調節(jié)完成的，由此以來使用這些熒光多肽底物檢測血清 中的MMP-12的活性便降低了檢測的可靠性。不適合于臨床檢測MMP-12酶活性。

【發(fā)明內容】

[0008] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種特異性高的能檢測MMP-12活性的熒光多 肽底物及檢測方法。
[0009] 為實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下： 使用化學合成的方法合成一種檢測MMP-12酶活性的熒光多肽底物，該底物包括如 Peptide I所示的氨基酸序列，并且其氨基酸序列N端第1位的異亮氨酸的氨基和第12位 的賴氨酸的氨基分別結合有熒光基團和熒光猝滅基團。
[0010] 熒光素染料的應用非常廣泛，包括熒光顯微鏡，流式細胞技術和免疫熒光分析等。 所述的結合在Peptide I所示的氨基酸序列的熒光基團和熒光猝滅基團是：與第1位異亮 氨酸的氨基結合的熒光基團5-羧基熒光素（5-FAM)，與第12位的賴氨酸的氨基結合的熒 光猝滅基團5-羧基四甲基若丹明（5-TAMRA)。本發(fā)明所述熒光多肽底物其氨基酸序列N 端第1位異亮氨酸和第12位賴氨酸結合有熒光基團和熒光猝滅基團，激光照射時熒光多肽 底物中的熒光基團發(fā)射能量，用以熒光檢測。能夠使用的熒光基團和熒光猝滅基團在本行 業(yè)是很多的，包括熒光素1 一氨基萘一8-羧酸（EDANS)，羧基熒光素（FAM)。但作為優(yōu)選， 本發(fā)明所述熒光基團為5 -羧基熒光素（5-FAM)，熒光猝滅基團為5 -羧基四甲基若丹明 (5-TAMRA)〇
[0011] 當一定波長激光照射該熒光多肽底物時，N端第1位異亮氨酸和第12位賴氨酸的 熒光基團同時發(fā)射能量，但此發(fā)射能量又由于彼此位點的接近而被彼此所吸收，無法發(fā)射 能量。而當該熒光多肽底物被MMP-12酶解后，由于異亮氨酸和賴氨酸相互分離，從而使能 量發(fā)射并被檢測出來。
[0012] 本發(fā)明提供的熒光多肽底物可被MMP-12水解，MMP-12催化熒光多肽底物反應的 酶促反應動力學常數(shù)k m:35 μΜ，keatS I. 24s ―1，KS 35428M-1· s-1。其中MMP-9酶切本 發(fā)明所述熒光多肽底物6. 4倍，MMP-1、3與本發(fā)明所述的熒光多肽底物幾乎無反 應。說明本發(fā)明所述的熒光多肽底物在與MMPs反應時有一定的特異性。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種檢測血清中MMP-12酶活性的方法，取APMA激活后的待測血 清與過量的上述熒光多肽底物在反應緩沖液中混合，并在黑色96孔板上建立100 μ 1的 反應體系，37°C下在所述熒光多肽底物所結合熒光集團相應的激發(fā)波長和發(fā)射波長下，檢 測熒光強度，從標準曲線中計算出蛋白酶活性，以單位質量蛋白酶裂解底物的速率ymol/ L. s. mg表示，比較不同血清樣本的MMP-12活性。
[0014] 本發(fā)明所述檢測方法是利用一定波長激光照射含有特定待測血漿樣品和熒光多 肽底物，如果血漿樣品中MMP-12酶活性很低，無法酶解熒光肽鏈底物，連接在N端第1位 異亮氨酸的熒光基團被連接在第12位的賴氨酸位點的猝滅基團猝滅，當?shù)鞍酌笖嗔言撾?鏈，被分離的熒光核不能再被猝滅劑有效地猝滅而表現(xiàn)熒光活性，即可測定蛋白酶裂解底 物在特定Ex/Em產(chǎn)生的熒光值。MMP-12在正常血漿中的濃度未知，因此采用ELISA的方法 先測定血清中MMP-12的濃度，所測樣本中MMP-12濃度大約為4ng/ml。為了保證檢測結果 的準確性，本發(fā)明所述檢測MMP-12活性的方法中加入過量的熒光多肽底物，使血漿樣品中 MMP-12充分反應。在以下的實例1中，所述熒光多肽底物的用量為18 μπιο?，遠遠大于血清 中MMP-12含量。
[0015] 本發(fā)明所述檢測MMP-12活性的方法操作簡便，快速，有一定的特異性。
[0016] 在以下的實例1中，本發(fā)明所述的熒光多肽底物所結合的熒光基團為熒光 素-5-馬來酰胺，所述的發(fā)光波長為485nm，發(fā)射波長為538nm。所述反應緩沖液包括：50mM Tris，PH7.4,20 mM CaCl2,200mM NaCl，0.005%Brij-35。
[0017] 本發(fā)明還提供一種檢測MMP-12酶的試劑盒，包括上述熒光多肽底物。所述的試劑 盒中的反應緩沖液包括 50mM Tris，PH7.4,20 mM CaCl2,200mM NaCl，0.005%Brij-35。
[0018] 本發(fā)明所述的試劑盒穩(wěn)定性好，保存時間長，檢測MMP-12活性方便，可應用于檢 測血清中MMP-12活性。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明所述熒光多肽底物的HPLC分析圖。
[0020] 圖2為本發(fā)明所述熒光多肽底物的質譜分析圖。
[0021] 圖3為本發(fā)明所述熒光多肽底物與MMP-12反應的Lineweaver-Burk(A) 與 Michaelis-Menton(B)散點圖。
[0022] 圖4為本發(fā)明所述檢測MMP-12