專(zhuān)利名稱:與溶基質(zhì)蛋白酶1特異地發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及與溶基質(zhì)蛋白酶(stromelysin) 1特異地發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體以及使用了該抗體的免疫染色法及免疫學(xué)測(cè)定法。
背景技術(shù):
在血管、淋巴管以及關(guān)節(jié)軟骨的基底膜或者結(jié)締組織的構(gòu)成蛋白質(zhì)即所謂的細(xì)胞外基質(zhì)的分解中,統(tǒng)稱為基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的一類(lèi)酶參與其中。MMPs中有亞類(lèi),溶基質(zhì)蛋白酶1、2及3屬于溶基質(zhì)蛋白酶類(lèi)的亞類(lèi)。溶基質(zhì)蛋白酶1也被稱作蛋白多糖酶 (proteoglycanase)或MMP-3,是在受到各種細(xì)胞因子或各種增殖因子等刺激的成纖維細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生的物質(zhì)。在生物體內(nèi),除了在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病患者的關(guān)節(jié)局部產(chǎn)生之外,還存在于血液中或關(guān)節(jié)液中(專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。因而,患者中的溶基質(zhì)蛋白酶1的定量被用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷中。另外,溶基質(zhì)蛋白酶2 (MMP-10)是由Muller等人將基因克隆,從而具有與溶基質(zhì)蛋白酶1相同的底物特異性(非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。溶基質(zhì)蛋白酶3 (MMP-Il)是由Basset等人將基因克隆,被認(rèn)為其與癌的發(fā)展程度有關(guān)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)?,F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1 日本特公平8-5920號(hào)公報(bào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1 =Muller 等,Biochem. J.,253,187-192,1988非專(zhuān)利文獻(xiàn)2 =Basset 等,Nature, 348,699-704,1990
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題溶基質(zhì)蛋白酶1、2及3具有非常近似的氨基酸序列和底物特異性,在制作針對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的抗體時(shí),與溶基質(zhì)蛋白酶2或3發(fā)生交叉反應(yīng)的可能性很高。上述專(zhuān)利文獻(xiàn)1中,雖然得到了很多針對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的單克隆抗體,但這些抗體具有與溶基質(zhì)蛋白酶2或3的交叉反應(yīng)性。為了更加精確地診斷類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,有必要進(jìn)一步精度良好地對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1進(jìn)行定量。因而,本發(fā)明的課題在于以更高的靈敏度更正確地對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1進(jìn)行定量。用于解決課題的手段本發(fā)明提供不與溶基質(zhì)蛋白酶2及溶基質(zhì)蛋白酶3發(fā)生交叉反應(yīng)、而是與溶基質(zhì)蛋白酶1特異地發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體。本發(fā)明的單克隆抗體由于不與溶基質(zhì)蛋白酶2及溶基質(zhì)蛋白酶3發(fā)生交叉反應(yīng),因而即便在試樣中含有溶基質(zhì)蛋白酶2或溶基質(zhì)蛋白酶3, 也可僅與溶基質(zhì)蛋白酶1特異地發(fā)生反應(yīng)。上述單克隆抗體的對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶2及溶基質(zhì)蛋白酶3的交叉反應(yīng)性優(yōu)選為對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的反應(yīng)性的5%以下。這種單克隆抗體對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1更為特異。另外,本發(fā)明提供一種單克隆抗體,其為與由序列號(hào)1的一部分氨基酸序列構(gòu)成的肽特異地反應(yīng)、且與溶基質(zhì)蛋白酶1特異地發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體,其中,該氨基酸序列含有序列號(hào)ι的第425號(hào) 第436號(hào)的序列、該肽的長(zhǎng)度為12 20個(gè)氨基酸殘基。上述單克隆抗體優(yōu)選不與溶基質(zhì)蛋白酶2及溶基質(zhì)蛋白酶3發(fā)生交叉反應(yīng)。序列號(hào)1的氨基酸序列表示溶基質(zhì)蛋白酶1的氨基酸序列,認(rèn)為由序列號(hào)1的第425號(hào) 第436號(hào)序列構(gòu)成的肽與交叉反應(yīng)性有關(guān)。另外,本發(fā)明提供一種單克隆抗體,其為與溶基質(zhì)蛋白酶1特異地發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體,其中,通過(guò)利用賴氨酰內(nèi)肽酶將溶基質(zhì)蛋白酶1分解,使所述抗體對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的反應(yīng)性消失。上述單克隆抗體優(yōu)選與溶基質(zhì)蛋白酶2及溶基質(zhì)蛋白酶3不發(fā)生交叉反應(yīng)。通過(guò)賴氨酰內(nèi)肽酶的分解使反應(yīng)性消失的單克隆抗體具有識(shí)別溶基質(zhì)蛋白酶1蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行反應(yīng)的可能性。本發(fā)明的單克隆抗體可用于免疫染色法。根據(jù)使用了本發(fā)明的與溶基質(zhì)蛋白酶2 及溶基質(zhì)蛋白酶3不發(fā)生交叉反應(yīng)的單克隆抗體的免疫染色法,即便試樣中含有溶基質(zhì)蛋白酶2或溶基質(zhì)蛋白酶3,它們也不會(huì)被染色,可以特異性地將溶基質(zhì)蛋白酶1可視化。本發(fā)明的單克隆抗體可用于對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1進(jìn)行定量的溶基質(zhì)蛋白酶1的免疫學(xué)測(cè)定法。根據(jù)使用了本發(fā)明的不與溶基質(zhì)蛋白酶2及溶基質(zhì)蛋白酶3發(fā)生交叉反應(yīng)的單克隆抗體的免疫學(xué)測(cè)定法,即便溶基質(zhì)蛋白酶2及溶基質(zhì)蛋白酶3含有在試樣中也檢測(cè)不到這些物質(zhì),因而可以準(zhǔn)確度良好地對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1進(jìn)行定量。上述免疫學(xué)測(cè)定法是以使用1種單克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)型免疫測(cè)定、使用2種單克隆抗體的夾心法為代表的免疫測(cè)定以及利用使用2種以上單克隆抗體的凝集法等的免疫測(cè)定法,當(dāng)使用2種以上的單克隆抗體時(shí),優(yōu)選使所用的單克隆抗體中的至少1種為本發(fā)明的單克隆抗體。通過(guò)使用2種以上的單克隆抗體,對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的特異性增高,可以更為正確地對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1進(jìn)行定量。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明,能夠以更高靈敏度更精確地對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1進(jìn)行定量。
圖1為表示將溶基質(zhì)蛋白酶1肽分級(jí)所獲得的各級(jí)分的肽與單克隆抗體的反應(yīng)性的圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中使用的單克隆抗體也可以是由Kohler等,Nature,256,495,1975等公開(kāi)的利用使用骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合技術(shù)所獲得的單克隆抗體。本發(fā)明中使用的單克隆抗體可通過(guò)以下工序制作。1.免疫原性抗原的制備2.利用免疫原性抗原進(jìn)行的動(dòng)物免疫3.骨髓瘤細(xì)胞的制備4.抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合
5.雜交瘤(融合細(xì)胞)的選擇及單克隆化6.單克隆抗體的制造7.不與溶基質(zhì)蛋白酶2及3發(fā)生交叉反應(yīng)的單克隆抗體的挑選1.免疫原性抗原的制備作為抗原,例如可以使用從正常人皮膚成纖維細(xì)胞NB1RGB(RCB222)培養(yǎng)上清中根據(jù)Obata等,Clin. Chim. Acta, 211, 59-72,1992的方法進(jìn)行精制所獲得的溶基質(zhì)蛋白酶 1。如此獲得的溶基質(zhì)蛋白酶1還可進(jìn)一步制成免疫原性綴合物等,但也可直接與適當(dāng)?shù)淖魟┫嗷旌虾笥糜趯?dòng)物免疫。另外,溶基質(zhì)蛋白酶1還可借助適當(dāng)?shù)目s合劑使將其片段化的產(chǎn)物與各種載體蛋白質(zhì)類(lèi)相結(jié)合而制成半抗原-蛋白質(zhì)的免疫原性綴合物。例如,可以由從天然細(xì)胞中利用分子克隆獲得的DNA序列或者已知的基因組序列中使用酶或者通過(guò)化學(xué)合成獲得DNA序列或修飾DNA序列,作為使其在微生物、動(dòng)物、植物或昆蟲(chóng)等中表達(dá)所獲得的重組體抗原使用。另外,還可使用利用這些信息通過(guò)肽化學(xué)合成法獲得的含有對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1特異性的氨基酸序列的肽或變構(gòu)肽。當(dāng)使其與載體蛋白質(zhì)類(lèi)相結(jié)合時(shí),可以首先將載體蛋白質(zhì)類(lèi)活化。這種活化可舉出導(dǎo)入活化鍵合基團(tuán)。作為活化鍵合基團(tuán),可舉出(1)活化酯或活化羧基、例如硝基苯基酯基、五氟苯基酯基、1-苯并三唑酯基、N-琥珀酰亞胺酯基等,(2)活化二硫基、例如2-吡啶基二硫基等。作為載體蛋白質(zhì)類(lèi),可舉出鑰孔戚血藍(lán)蛋白(KLH),牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白、球蛋白、聚賴氨酸等多肽,細(xì)菌菌體成分、例如BCG等。2.利用免疫原性抗原進(jìn)行的動(dòng)物免疫在對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫時(shí),可以按照例如松村繁等編、実験生物學(xué)耩座14、免疫生物學(xué)、丸善株式會(huì)社、昭和60年、日本生化學(xué)會(huì)編、続生化學(xué)実験耩座5、免疫生化學(xué)研究法、 灰京化學(xué)同人、1986年、日本生化學(xué)會(huì)編、新生化學(xué)実験耩座12、分子免疫學(xué)III、抗原·抗體·補(bǔ)體、東京化學(xué)同人、1992年等中所記載的方法進(jìn)行。作為與抗原一同使用的佐劑,例如可舉出弗氏完全佐劑、Ribi佐劑、百日咳疫苗、BCG、脂質(zhì)A、脂質(zhì)體、氫氧化鋁、二氧化硅等。免疫例如使用以BALB/c等小鼠為代表的動(dòng)物來(lái)進(jìn)行??乖耐队枇坷鐚?duì)于小鼠以約1 400 μ g/動(dòng)物的量通常注射于宿主動(dòng)物的腹腔內(nèi)或皮下,之后每隔1 4周、優(yōu)選每隔1 2周反復(fù)進(jìn)行2 10次左右的追加免疫至腹腔內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)。作為免疫用的小鼠,除了 BALB/c系小鼠之外,還可使用BALB/c系小鼠與其他系小鼠的Fl小鼠等。 可以根據(jù)需要制備抗體效價(jià)測(cè)定體系,測(cè)定抗體效價(jià)以確認(rèn)動(dòng)物免疫的程度。3.骨髓瘤細(xì)胞的制備作為細(xì)胞融合中使用的可無(wú)限增殖的細(xì)胞株(腫瘤細(xì)胞株),可以從不產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞株中挑選,例如可使用P3-NS-l-Ag4-l (NS-U Kohler等人,Eur. J. Immunol., 6,511 519,1976)、SP2/0_Agl4 (SP2、Shulman 等人,Nature, 276, 269 270,1978)、小鼠骨髓瘤 M0PC-21 細(xì)胞系來(lái)源的 P3-X63-Ag8-Ul (P3U1、Yelton 等人,Current topics in Microbiol, and Immunol.,81,1 7,1978)、P3_X63_Ag8 (X63、Kohler 等人,Nature, 256, 495 497,1975)、P3-X63_Ag8. 653(653、Kearney 等人,J. Immunol.,123,1548 1550, 1979)等。8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤耐性的小鼠骨髓瘤細(xì)胞株可以是在于Dulbecco' s Modified Eagle Medium培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基)、RPMI_1640培養(yǎng)基等細(xì)胞培養(yǎng)基中添加例如青霉素、 阿米卡星等抗生素、胎牛血清(FCS)等,進(jìn)而添加8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤(例如5 45yg/ml)的培養(yǎng)基中傳代,在細(xì)胞融合的2 5日前用正常培養(yǎng)基傳代,準(zhǔn)備所需數(shù)量的細(xì)胞株。另外,使用細(xì)胞株還可以是在約37°C下將冷凍保存株完全解凍后用RPMI-1640培養(yǎng)基等正常培養(yǎng)基洗滌3次以上后,在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng),準(zhǔn)備所需數(shù)量的細(xì)胞株。4.抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合根據(jù)上述2.的工序進(jìn)行了免疫的動(dòng)物、例如小鼠在末次免疫后的2 5日后將其脾臟摘出,獲得脾細(xì)胞懸浮液。除了脾細(xì)胞之外,還可獲得生物體各部位的淋巴結(jié)細(xì)胞,將其用于細(xì)胞融合。將如此獲得的脾細(xì)胞懸浮液與按照上述3.的工序獲得的骨髓瘤細(xì)胞株放置于例如最小必需培養(yǎng)基(MEM培養(yǎng)基)、DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基等細(xì)胞培養(yǎng)基中,添加細(xì)胞融合劑、例如聚乙二醇。作為細(xì)胞融合劑,可以使用其他各種在該領(lǐng)域中已知的物質(zhì),例如進(jìn)行了滅活的日本血凝病毒(HVJ =Hemagglutinating virus of Japan)等。 優(yōu)選可添加例如30 60%的聚乙二醇0. 5 anl。這種聚乙二醇的分子量?jī)?yōu)選為1000 8000、更優(yōu)選分子量為1000 4000。融合培養(yǎng)基中的聚乙二醇的濃度優(yōu)選為30 60%。 也可以根據(jù)需要添加少量的例如二甲基亞砜等以促進(jìn)融合。融合中使用的脾細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)骨髓瘤細(xì)胞株的比例例如可舉出1 1 20 1、更優(yōu)選為4 1 10 1。融合反應(yīng)進(jìn)行1 10分鐘,接著添加RPMI-1640培養(yǎng)基等細(xì)胞培養(yǎng)基。融合反應(yīng)處理還可進(jìn)行多次。融合反應(yīng)處理后通過(guò)離心等將細(xì)胞分離,之后移至選擇用培養(yǎng)基。5.雜交瘤(融合細(xì)胞)的選擇及單克隆化作為選擇用培養(yǎng)基,例如可舉出含有次黃嘌呤、氨基蝶呤及胸腺嘧啶脫氧核苷的含F(xiàn)CS的MEM培養(yǎng)基或RPMI-1640培養(yǎng)基等培養(yǎng)基、所謂的HAT培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基交換的方法通??梢栽诖稳仗砑优c分注至培養(yǎng)板中的容量相當(dāng)容量的培養(yǎng)基,之后每隔1 3日用HAT培養(yǎng)基每次交換一半量地進(jìn)行,也可適當(dāng)對(duì)此加以變更地進(jìn)行。另外,可以在融合后的第8 16日,利用除去了氨基蝶呤的所謂HT培養(yǎng)基每隔1 4日進(jìn)行培養(yǎng)基交換。作為飼養(yǎng)細(xì)胞,例如可使用小鼠胸腺細(xì)胞,有其優(yōu)選的情況。例如利用放射免疫分析(RIA)、 酶免疫分析(ELISA)、熒光免疫分析(FIA)等測(cè)定體系或者熒光激活細(xì)胞分離裝置(FACS) 等,使用溶基質(zhì)蛋白酶1或其片段肽或標(biāo)記抗小鼠抗體對(duì)雜交瘤的增殖旺盛的培養(yǎng)孔的培養(yǎng)上清檢測(cè)目標(biāo)抗體,進(jìn)行篩選、分離。接著,對(duì)產(chǎn)生目標(biāo)抗體的雜交瘤進(jìn)行克隆??寺】赏ㄟ^(guò)在瓊脂培養(yǎng)基中挑出群落或者通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行。更優(yōu)選利用有限稀釋法進(jìn)行克隆。 克隆優(yōu)選進(jìn)行多次。6.單克隆抗體的制造所得的雜交瘤株可以在含F(xiàn)CS的MEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基等適當(dāng)?shù)脑鲋秤门囵B(yǎng)基中培養(yǎng),由其培養(yǎng)基上清中可獲得所需的單克隆抗體。為了獲得大量的抗體,可舉出將雜交瘤腹水化。此時(shí),可以將各雜交瘤移植至與骨髓瘤細(xì)胞來(lái)源的動(dòng)物同系的組織相容性動(dòng)物的腹腔內(nèi)并使其增殖,或者將各雜交瘤移植至例如裸鼠等中并使其增殖,然后將在該動(dòng)物的腹水中產(chǎn)生的單克隆抗體回收,從而獲得。在雜交瘤移植之前,可以將降植烷(2, 6,10,14-四甲基十五烷)等礦物油投予至腹腔內(nèi)后使雜交瘤增殖,再采集腹水。腹水液可以直接使用,或者利用以往公知的方法、例如硫酸銨沉淀法等的鹽析、利用kphadex等的凝膠過(guò)濾法、離子交換色譜法、電泳法、透析、超濾法、親和層析法、高效液相色譜法等進(jìn)行精制制成單克隆抗體后使用。優(yōu)選含有單克隆抗體的腹水可以在進(jìn)行硫酸銨分級(jí)后,利用 DEAE-瓊脂糖凝膠等陰離子交換凝膠及蛋白A柱等親和層析柱等處理來(lái)進(jìn)行精制分離處理。特別優(yōu)選地可以舉出固定有抗原或抗原片段(例如合成肽、重組抗原蛋白質(zhì)或肽等抗體特異性識(shí)別的部位)的親和層析、固定有蛋白A的親和層析等。7.不與溶基質(zhì)蛋白酶2及3發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體的挑選從6.中獲得的針對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的單克隆抗體中挑選不與溶基質(zhì)蛋白酶2及溶基質(zhì)蛋白酶3發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體。挑選可通過(guò)免疫測(cè)定、例如競(jìng)爭(zhēng)型免疫測(cè)定或非競(jìng)爭(zhēng)型免疫測(cè)定來(lái)進(jìn)行,可使用RIA、ELISA等,也可進(jìn)行或不進(jìn)行B-F分離。優(yōu)選利用直接吸附法或夾心法的ELISA。測(cè)定可以是直接法也可以是間接法。另外還可使用間接法的變法、 例如PAP法(過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶法)、ABC法(親和素生物素復(fù)合法)、蛋白A法等。例如在利用直接吸附法的ELISA中,以一定濃度的溶基質(zhì)蛋白酶1作為抗原使其固相化。固相可優(yōu)選使用后示的載體。在固相化后,優(yōu)選使不參與抗原抗體反應(yīng)及酶反應(yīng)的蛋白質(zhì)吸附于固相上并進(jìn)行封閉。接著,使對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的單克隆抗體與固相相接觸,進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。單克隆抗體可用酶標(biāo)記,也可不用酶標(biāo)記。未反應(yīng)的多余抗體也可通過(guò)對(duì)固相進(jìn)行洗滌而除去。在單克隆抗體上標(biāo)記酶時(shí),添加酶的底物,測(cè)定酶反應(yīng)的產(chǎn)物量。當(dāng)未在單克隆抗體上標(biāo)記酶時(shí),使與單克隆抗體特異地發(fā)生反應(yīng)的用酶進(jìn)行了標(biāo)記的抗體(二抗)作用于單克隆抗體。將未與單克隆抗體結(jié)合的二抗除去,添加酶的底物,測(cè)定酶反應(yīng)的產(chǎn)物量。酶反應(yīng)的產(chǎn)物量與對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的反應(yīng)性成比例。接著,分別以溶基質(zhì)蛋白酶2及溶基質(zhì)蛋白酶3為抗原,實(shí)施利用上述直接吸附法的ELISA。測(cè)定酶反應(yīng)的產(chǎn)物量。由于酶反應(yīng)產(chǎn)物的量與對(duì)各抗原的反應(yīng)性成比例,因而將分別使用溶基質(zhì)蛋白酶2及3時(shí)的酶反應(yīng)產(chǎn)物的量相對(duì)于使用溶基質(zhì)蛋白酶1時(shí)的酶反應(yīng)產(chǎn)物的量分別作為對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶2及3的交叉反應(yīng)性。分別測(cè)定對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶2及3 的交叉反應(yīng)性,挑選出與兩者均不發(fā)生交叉反應(yīng)的單克隆抗體。除了利用上述直接吸附法的ELISA的測(cè)定以外,例如通過(guò)夾心法的ELISA,也可將本發(fā)明的不與溶基質(zhì)蛋白酶2及溶基質(zhì)蛋白酶3發(fā)生交叉反應(yīng)、而與溶基質(zhì)蛋白酶1特異地發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體挑選出。在夾心法中,使用2種針對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的抗體。使其中一者為針對(duì)6.中獲得的溶基質(zhì)蛋白酶1的單克隆抗體、另一者為已知與溶基質(zhì)蛋白酶特異地發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體。作為已知與溶基質(zhì)蛋白酶特異地發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體, 例如可以使用上述專(zhuān)利文獻(xiàn)1中記載的針對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的單克隆抗體。將其中一個(gè)的單克隆抗體固相化。在固相化后,優(yōu)選使不參與抗原抗體反應(yīng)及酶反應(yīng)的蛋白質(zhì)吸附于固相并進(jìn)行封閉。接著,添加作為抗原的一定濃度的溶基質(zhì)蛋白酶1及另一個(gè)單克隆抗體,進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。單克隆抗體可以用酶等進(jìn)行標(biāo)記。未反應(yīng)的多余抗體可以通過(guò)對(duì)固相進(jìn)行洗滌而除去。添加酶的底物,測(cè)定酶反應(yīng)的產(chǎn)物量。酶反應(yīng)產(chǎn)物的量與對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶 1的反應(yīng)性成比例。接著,分別以溶基質(zhì)蛋白酶2及溶基質(zhì)蛋白酶3為抗原,實(shí)施利用上述夾心法的 ELISA。測(cè)定酶反應(yīng)的產(chǎn)物的量。由于酶反應(yīng)產(chǎn)物的量與對(duì)各抗原的反應(yīng)性成比例,因而將分別使用溶基質(zhì)蛋白酶2及3時(shí)的酶反應(yīng)產(chǎn)物的量相對(duì)于使用溶基質(zhì)蛋白酶1時(shí)的酶反應(yīng)產(chǎn)物的量分別作為對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶2及3的交叉反應(yīng)性。分別測(cè)定對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶2及3 的交叉反應(yīng)性,挑選出與兩者均不發(fā)生交叉反應(yīng)的單克隆抗體。此外,本說(shuō)明書(shū)中的與抗原“特異地發(fā)生反應(yīng)”或“顯示反應(yīng)性”是指在進(jìn)行利用直接法或夾心法的任一種的ELISA的抗原抗體反應(yīng)時(shí),例如在室溫下進(jìn)行1小時(shí)以上或者在4°C下進(jìn)行一晚的抗原抗體反應(yīng),將固相洗滌后,使用四甲基聯(lián)苯胺(TMB)等顯色劑進(jìn)行利用酶標(biāo)記的顯色反應(yīng),之后利用硫酸停止顯色反應(yīng),在此測(cè)定條件下,A450(與一抗為Ong/ ml時(shí)之差)為0.05以上。優(yōu)選A450為0.08以上、更優(yōu)選為0. 1以上。另外,本說(shuō)明書(shū)中所說(shuō)的“對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶2的交叉反應(yīng)性”是指在將單克隆抗體對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的反應(yīng)性設(shè)為100%時(shí)單克隆抗體對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶2的反應(yīng)性的大小?!皩?duì)溶基質(zhì)蛋白酶3的交叉反應(yīng)性”也是同樣含義。交叉反應(yīng)性的大小也可通過(guò)上述利用直接吸附法或夾心法的ELISA 的任何一種方法測(cè)定。本說(shuō)明書(shū)中所說(shuō)的“不發(fā)生交叉反應(yīng)”是指通過(guò)直接吸附法或夾心法的任何一種ELISA測(cè)定的交叉反應(yīng)性為5%以下的情況。優(yōu)選通過(guò)夾心法測(cè)定的交叉反應(yīng)性為5%以下。本發(fā)明的單克隆抗體對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶2及3的交叉反應(yīng)性優(yōu)選為2. 4% 以下、更優(yōu)選為1.3%以下。8.溶基質(zhì)蛋白酶1的反應(yīng)部位的特定如上獲得的與溶基質(zhì)蛋白酶1特異地發(fā)生反應(yīng)、但不與溶基質(zhì)蛋白酶2及溶基質(zhì)蛋白酶3發(fā)生交叉反應(yīng)的單克隆抗體與溶基質(zhì)蛋白酶1的特定反應(yīng)部位發(fā)生反應(yīng)。通過(guò)鑒定這種反應(yīng)部位,按照1. 6.中說(shuō)明過(guò)的方法制作與該反應(yīng)部位發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體, 可以調(diào)節(jié)所制作的單克隆抗體的交叉反應(yīng)性。反應(yīng)部位可以如下鑒定。通過(guò)酶將溶基質(zhì)蛋白酶1分解為肽。利用色譜法等以往公知的方法對(duì)所得肽進(jìn)行分級(jí),在使通過(guò)7.獲得的單克隆抗體與各級(jí)分的肽發(fā)生反應(yīng)時(shí),則在反應(yīng)性高的級(jí)分中含有作為溶基質(zhì)蛋白酶1的反應(yīng)部位的肽。該反應(yīng)性高的級(jí)分所含的肽可以利用以往公知的方法進(jìn)一步精制,利用公知的氨基酸序列分析法,可以確定反應(yīng)部位的氨基酸序列。9.顯示與由溶基質(zhì)蛋白酶1的一部分構(gòu)成的肽的反應(yīng)性的單克隆抗體的挑選另外,本發(fā)明提供一種單克隆抗體,其為與由序列號(hào)1的一部分氨基酸序列構(gòu)成的肽特異地發(fā)生反應(yīng)、且與溶基質(zhì)蛋白酶1特異地發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體,其中,該氨基酸序列含有序列號(hào)ι的第425號(hào) 第436號(hào)的序列,且該肽的長(zhǎng)度為12 20個(gè)氨基酸殘基。 序列號(hào)1的氨基酸序列為溶基質(zhì)蛋白酶1蛋白質(zhì)的氨基酸序列。認(rèn)為由序列號(hào)1的第425 號(hào) 第436號(hào)的序列構(gòu)成的肽與交叉反應(yīng)性有關(guān)。上述單克隆抗體可通過(guò)從6.中所得的對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的單克隆抗體中挑選出顯示與由序列號(hào)1的第425號(hào) 第436號(hào)序列構(gòu)成的肽的反應(yīng)性的單克隆抗體而獲得。挑選可通過(guò)7.中所示的測(cè)定法進(jìn)行,例如在7.中所示的利用直接吸附法的ELISA中,使用由序列號(hào)1的第425號(hào) 第436號(hào)序列構(gòu)成的肽代替溶基質(zhì)蛋白酶1作為抗原即可。上述單克隆抗體優(yōu)選不與溶基質(zhì)蛋白酶2及溶基質(zhì)蛋白酶3發(fā)生交叉反應(yīng)。與溶基質(zhì)蛋白酶2及溶基質(zhì)蛋白酶3不發(fā)生交叉反應(yīng)的單克隆抗體可通過(guò)7.所示的方法進(jìn)行挑選。10.通過(guò)溶基質(zhì)蛋白酶1的分解而使反應(yīng)性消失的單克隆抗體的挑選另外,本發(fā)明提供一種單克隆抗體,其為與溶基質(zhì)蛋白酶1特異地發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體,其中,通過(guò)利用賴氨酰內(nèi)肽酶將溶基質(zhì)蛋白酶1分解,使所述抗體對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的反應(yīng)性消失。這種單克隆抗體為識(shí)別溶基質(zhì)蛋白酶1蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)或三級(jí)結(jié)構(gòu)等立體結(jié)構(gòu)的單克隆抗體。“通過(guò)將溶基質(zhì)蛋白酶1分解使所述抗體對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的反應(yīng)性消失”是指溶基質(zhì)蛋白酶1分解后的反應(yīng)性低于分解前的反應(yīng)性。這種單克隆抗體可以通過(guò)從6.中所得的對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的單克隆抗體中如下進(jìn)行挑選而獲得。通過(guò)酶將溶基質(zhì)蛋白酶1分解成肽。在分解前和分解后比較與溶基質(zhì)蛋白酶1特異地發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體的對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的反應(yīng)性,挑選出溶基質(zhì)蛋白酶1分解后的反應(yīng)性低于分解前的反應(yīng)性的單克隆抗體。分解后的反應(yīng)性越低,則越是無(wú)論溶基質(zhì)蛋白酶1的一級(jí)結(jié)構(gòu)如何而能識(shí)別溶基質(zhì)蛋白酶1的立體結(jié)構(gòu)、與溶基質(zhì)蛋白酶1發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體。優(yōu)選在使分解前的對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的反應(yīng)性為100%時(shí),分解后的反應(yīng)性為10%以下。反應(yīng)性可以通過(guò)7.所示方法的直接吸附法或夾心法的任何一種ELISA進(jìn)行測(cè)定,優(yōu)選通過(guò)直接吸附法的ELISA測(cè)定的分解后的反應(yīng)性為分解前的反應(yīng)性的10%以下。更優(yōu)選為8.0% 以下、進(jìn)一步優(yōu)選為7. 3%以下。如此獲得的單克隆抗體可使用市售的同種型特異性的抗小鼠Ig抗體、例如同種型特異性的兔抗小鼠Ig抗體等,對(duì)該抗體構(gòu)成鏈的重鏈和輕鏈的類(lèi)型進(jìn)行研究。還可確定對(duì)所得單克隆抗體進(jìn)行編碼的堿基序列,并利用基因重組技術(shù)制作抗體。還可利用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等酶對(duì)這些抗體進(jìn)行處理,根據(jù)情況進(jìn)行還原制成Fab、Fab’、F(ab’)2等抗體片段后進(jìn)行使用。作為進(jìn)行標(biāo)記的抗體,可以使用IgG 級(jí)分、例如對(duì)抗體含有物進(jìn)行硫酸銨分級(jí)后利用DEAE-瓊脂糖等陰離子交換凝膠進(jìn)行處理所獲得的IgG級(jí)分等,可使用進(jìn)一步進(jìn)行胃蛋白酶消化后實(shí)施還原所獲得的特異性結(jié)合部Fab’等。作為這些情況下的標(biāo)記的例子,例如有下述的酶(過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或 β -D-半乳糖苷酶等)、化學(xué)物質(zhì)、熒光物質(zhì)或放射性同位素等。利用本發(fā)明的不與溶基質(zhì)蛋白酶2及3發(fā)生交叉反應(yīng)、而與溶基質(zhì)蛋白酶1特異地發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體,可以進(jìn)行免疫染色法。本發(fā)明的免疫染色法包含以下工序使本發(fā)明的單克隆抗體與試樣中的抗原反應(yīng)以形成抗原抗體復(fù)合體的工序和使該抗原抗體復(fù)合體可視化的工序。抗原抗體復(fù)合體可以預(yù)先在抗體上加以標(biāo)記,在抗原抗體反應(yīng)后改變標(biāo)記,將其變化作為信號(hào)進(jìn)行檢測(cè),從而進(jìn)行可視化。本發(fā)明的免疫染色法可以是對(duì)與抗原直接反應(yīng)的抗體(一抗)進(jìn)行標(biāo)記的直接法,也可以是對(duì)識(shí)別未進(jìn)行標(biāo)記的一抗的其他抗體(二抗)進(jìn)行標(biāo)記的間接法。另外,還可使用間接法的變法例如PAP法(過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶法)、ABC法(親和素生物素復(fù)合法)、蛋白A法等。另外,還可對(duì)試樣進(jìn)行電泳、將電泳后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至膜上,對(duì)該膜進(jìn)行免疫染色。根據(jù)使用了本發(fā)明的單克隆抗體的免疫染色法,即便在試樣中混有溶基質(zhì)蛋白酶2或溶基質(zhì)蛋白酶3,也可僅由溶基質(zhì)蛋白酶 1將信號(hào)特異地檢測(cè)、可以將溶基質(zhì)蛋白酶1的存在及分布可視化。另外,還可利用本發(fā)明的單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞染色或免疫組織染色。本發(fā)明的單克隆抗體可用于免疫學(xué)測(cè)定法。本發(fā)明的免疫學(xué)測(cè)定法包含以下工序使本發(fā)明的單克隆抗體與試樣中的抗原反應(yīng)以形成抗原抗體復(fù)合體的工序;對(duì)所形成的抗原抗體復(fù)合體進(jìn)行檢測(cè)的工序;以及由所檢測(cè)的抗原抗體復(fù)合體的量測(cè)定試樣中的抗原的量的工序??乖贵w復(fù)合體可以用抗原抗體復(fù)合體的濁度的形式進(jìn)行檢測(cè),另外還可預(yù)先在抗體上加以標(biāo)記,在抗原抗體反應(yīng)后改變標(biāo)記,將其變化作為信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。免疫學(xué)測(cè)定法可通過(guò)免疫測(cè)定、例如競(jìng)爭(zhēng)型免疫測(cè)定或非競(jìng)爭(zhēng)型免疫測(cè)定來(lái)進(jìn)行,還可使用RIA、 ELISA、凝集法、比濁法、免疫層析法、Western blotting法等,也可進(jìn)行或不進(jìn)行B-F分離。 免疫學(xué)測(cè)定法可以是對(duì)直接與抗原發(fā)生反應(yīng)的抗體(一抗)進(jìn)行標(biāo)記的直接法,也可以是對(duì)識(shí)別未進(jìn)行標(biāo)記的一抗的其他抗體(二抗)進(jìn)行標(biāo)記的間接法。另外,還可使用間接法的變法例如PAP法(過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶法)、ABC法(親和素生物素復(fù)合法)、蛋白A 法等。
作為利用上述直接法的競(jìng)爭(zhēng)型免疫測(cè)定中所使用的單克隆抗體,使用本發(fā)明的單克隆抗體。在夾心法中使用2種單克隆抗體時(shí),使至少一者為本發(fā)明的單克隆抗體。另一者只要是識(shí)別溶基質(zhì)蛋白酶1的抗體則無(wú)特別限定。只要種類(lèi)不同,則2種均可使用本發(fā)明的與溶基質(zhì)蛋白酶2及3不發(fā)生交叉反應(yīng)、而與溶基質(zhì)蛋白酶1特異地發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體。另外,也可以使上述2種單克隆抗體中的一者為用標(biāo)記物進(jìn)行了標(biāo)記的可溶性抗體、使另一者為固相化抗體。在利用凝集法等的免疫測(cè)定法中使用的2種以上的單克隆抗體中,使至少1種為本發(fā)明的單克隆抗體。只要種類(lèi)不同,則可全部使用本發(fā)明的單克隆抗體。另外,只要至少1種為本發(fā)明的單克隆抗體,則可使用3種以上的抗體。在上述免疫學(xué)測(cè)定法中,例如使用含有已知濃度的溶基質(zhì)蛋白酶1的標(biāo)準(zhǔn)液來(lái)制作濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線,由該濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定試樣中的溶基質(zhì)蛋白酶1的濃度,可以進(jìn)行溶基質(zhì)蛋白酶1的定量。根據(jù)本發(fā)明的免疫學(xué)測(cè)定法,即便在試樣中混有溶基質(zhì)蛋白酶2或溶基質(zhì)蛋白酶3,也可不對(duì)它們進(jìn)行檢測(cè)而是特異性地對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1進(jìn)行定量。本發(fā)明的免疫染色法及免疫學(xué)測(cè)定法中,可以使用酶等進(jìn)行了標(biāo)記的單克隆抗體與結(jié)合在載體上的抗體依次反應(yīng),也可使其同時(shí)反應(yīng)。另外,還可用酶等對(duì)本發(fā)明的單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記,作為免疫染色用試劑或免疫學(xué)測(cè)定用試劑。在凝集法中,可以使抗原及2種以上的非標(biāo)記單克隆抗體同時(shí)或依次反應(yīng)。添加抗體及試樣的順序根據(jù)所選的載體系的類(lèi)型的不同而不同。載體例如可以從后述物質(zhì)中適當(dāng)選定。在使用致敏了的塑料等珠粒時(shí), 可以將用酶等進(jìn)行了標(biāo)記的單克隆抗體與含有待測(cè)定物質(zhì)的檢體試樣一同放入適當(dāng)?shù)脑嚬苤?,之后添加該致敏了的塑料等珠粒?lái)進(jìn)行反應(yīng)。在反應(yīng)時(shí),可以在保持于適當(dāng)PH、例如 pH約4 9的適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行。特別是作為適當(dāng)?shù)木彌_劑,例如可舉出乙酸酯緩沖劑、 檸檬酸鹽緩沖劑、磷酸鹽緩沖劑、Tris緩沖劑、三乙醇胺緩沖劑、硼酸鹽緩沖劑、甘氨酸緩沖齊U、碳酸鹽緩沖劑、Tris-鹽酸緩沖劑等。緩沖劑可以相互以任意比例混合后使用??乖贵w反應(yīng)優(yōu)選在約0°C 60°C之間的溫度下進(jìn)行。本發(fā)明的免疫染色法及免疫學(xué)測(cè)定法中,與本發(fā)明的單克隆抗體、其他抗體及抗原的孵育處理可進(jìn)行至達(dá)到平衡,也可以在達(dá)到抗原抗體反應(yīng)的平衡之前稍早一點(diǎn)的時(shí)刻終止反應(yīng),可測(cè)定液相或固相的任一者的濁度或酶等標(biāo)記的存在程度。測(cè)定操作還可以使用經(jīng)自動(dòng)化的測(cè)定裝置進(jìn)行,例如使用比色計(jì)、發(fā)光檢測(cè)器、光檢測(cè)器等對(duì)濁度或者底物在酶的作用下發(fā)生變換所產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行檢測(cè),實(shí)施測(cè)定??乖贵w反應(yīng)中,可以使分別使用的試劑、待測(cè)定的物質(zhì)、酶等標(biāo)記穩(wěn)定化,也可尋求適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ箍乖贵w反應(yīng)本身穩(wěn)定化。進(jìn)而,為了將非特異性的反應(yīng)除去、減少阻礙性影響或者將測(cè)定反應(yīng)活化,還可在孵育溶液中添加蛋白質(zhì)、穩(wěn)定化劑、表面活性劑、螯合化劑等。可以實(shí)施在該領(lǐng)域中普遍采用或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于防止非特異性結(jié)合反應(yīng)的封閉處理,例如可以利用哺乳動(dòng)物等的正常血清蛋白質(zhì)、白蛋白、脫脂奶、乳發(fā)酵物質(zhì)、骨膠原、明膠等進(jìn)行處理。只要是為了防止非特異性的結(jié)合反應(yīng),這些方法可以沒(méi)有特別限定地使用。例如,在特定的狀況下可以適當(dāng)采用洗滌、攪拌、振蕩、過(guò)濾或抗原的預(yù)抽提等。特定的試劑、緩沖液等的濃度、溫度或孵育處理時(shí)間等其他的測(cè)定條件可以根據(jù)試樣中的抗原的濃度、試樣的性質(zhì)等要素進(jìn)行改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在使用通常的實(shí)驗(yàn)法的同時(shí),適當(dāng)選擇對(duì)各測(cè)定有效的最佳條件來(lái)進(jìn)行測(cè)定。已知很多能夠?qū)⒖乖蚩贵w固相化的載體,本發(fā)明中可以從其中適當(dāng)選擇使用。作為特別優(yōu)選使用的載體,例如可舉出玻璃例如活化玻璃、多孔質(zhì)玻璃、硅膠、二氧化硅-氧化鋁、氧化鋁、磁鐵、磁合金等無(wú)機(jī)材料,聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚偏氟乙烯、聚醋酸乙烯酯、聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚丙烯酰胺、交聯(lián)聚丙烯酰胺、苯乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、聚甲基丙烯酸縮水甘油酯、丙烯醛-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物等,交聯(lián)化白蛋白、骨膠原、明膠、糊精、瓊脂糖、交聯(lián)瓊脂糖、纖維素、微晶纖維素、羧甲基纖維素、醋酸纖維素等天然或改性纖維素、交聯(lián)糊精、尼龍等聚酰胺、聚氨酯、 聚環(huán)氧樹(shù)脂等有機(jī)高分子物質(zhì),進(jìn)一步將它們?nèi)榛酆纤@得的物質(zhì),細(xì)胞、紅細(xì)胞等,根據(jù)需要利用硅烷偶聯(lián)劑導(dǎo)入有官能團(tuán)的物質(zhì)。而且,可以舉出濾紙、珠粒、試驗(yàn)容器的內(nèi)壁、例如試管、滴定板、滴定孔、玻璃小室、合成樹(shù)脂制小室等合成材料構(gòu)成的小室、玻璃棒、合成材料構(gòu)成的棒、使末端變粗或變細(xì)的棒、末端帶有圓形突起或扁平突起的棒、制成薄板狀的棒等固體物質(zhì)(物體)的表面等??梢允箍贵w結(jié)合在這些載體上,可優(yōu)選使本發(fā)明中所得的對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1特異性結(jié)合的單克隆抗體結(jié)合在這些載體上。載體與這些參與抗原抗體反應(yīng)的物質(zhì)的結(jié)合可以通過(guò)使用吸附等物理手法,或使用縮合劑等、使用經(jīng)活化的物質(zhì)等的化學(xué)方法、以及利用了相互的化學(xué)結(jié)合反應(yīng)的手法等來(lái)進(jìn)行。作為標(biāo)記,可以舉出酶、酶底物、酶抑制劑、輔基類(lèi)、輔酶、酶前體、脫輔基酶、熒光物質(zhì)、色素物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光化合物、發(fā)光物質(zhì)、顯色物質(zhì)、磁性物質(zhì)、金屬粒子、例如金膠體等、放射性物質(zhì)等。作為酶,可舉出脫氫酶,還原酶、氧化酶等氧化還原酶,對(duì)轉(zhuǎn)移例如氨基、 羧基、甲基、?;?、磷酸基等具有催化作用的轉(zhuǎn)移酶,對(duì)例如酯鍵、糖苷鍵、醚鍵、肽鍵等進(jìn)行水解的水解酶,裂解酶,異構(gòu)酶,連接酶等。酶還可以復(fù)合使用多種酶用于檢測(cè)。例如還可利用酶的循環(huán)。作為代表性的酶標(biāo)記,可舉出辣根過(guò)氧化物酶(HRP)等過(guò)氧化物酶、大腸桿菌 β -D-半乳糖苷酶等半乳糖苷酶、馬來(lái)酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、乙酰膽堿酯酶、過(guò)氧化氫酶、牛小腸堿性磷酸酶、大腸桿菌堿性磷酸酶等堿性磷酸酶等。使用堿性磷酸酶時(shí),可以使用4-甲基傘形酮基磷酸鹽等傘形酮衍生物、硝基苯基磷酸鹽等磷酸化苯酚衍生物、利用了 NADP的酶循環(huán)體系、熒光素衍生物、二氧雜環(huán)丁烷衍生物等底物,通過(guò)所產(chǎn)生的熒光、發(fā)光等進(jìn)行測(cè)定。還可利用熒光素、熒光素酶體系。使用過(guò)氧化氫酶時(shí),由于與過(guò)氧化氫反應(yīng)產(chǎn)生氧,因而可以用電極等對(duì)該氧進(jìn)行檢測(cè)。作為電極,還可以為玻璃電極、使用難溶性鹽膜的離子電極、液膜型電極、高分子膜電極等。酶標(biāo)記還可以替換成生物素標(biāo)記體和酶標(biāo)記親和素(鏈霉親和素)。標(biāo)記還可使用多個(gè)不同種類(lèi)的標(biāo)記。在這種情況下,還可以連續(xù)或非連續(xù)地、且同時(shí)或分別地進(jìn)行多個(gè)測(cè)定。在形成用于檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)時(shí),還可利用4-羥基苯基乙酸、1,2_苯二胺、四甲基聯(lián)苯胺等與辣根過(guò)氧化物酶、傘形酮半乳糖苷、硝基苯基半乳糖苷等與β -D-半乳糖苷酶、 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶等酶試劑的組合,還可使用通過(guò)酶的作用可形成氫醌、羥基苯醌、羥基蒽醌等醌化合物、硫辛酸、谷胱甘肽等硫醇化合物、苯酚衍生物、二茂鐵衍生物等的化合物。作為熒光物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光化合物,可舉出異硫氰酸熒光素、例如若丹明B異硫氰酸酯、四甲基若丹明異硫氰酸酯等若丹明衍生物、丹磺酰氯、丹磺酰氟、熒光胺、藻膽蛋白、 丫啶鐺鹽、熒光素、熒光素酶、水母發(fā)光蛋白等魯米諾、咪唑、草酸酯、稀土類(lèi)螯合化合物、香豆素衍生物等。進(jìn)行標(biāo)記時(shí),可以利用硫醇基與馬來(lái)酰亞胺基的反應(yīng)、吡啶基二硫化物基與硫醇基的反應(yīng)、氨基與醛基的反應(yīng)等來(lái)進(jìn)行,可以從公知的方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易操作的方法、以及對(duì)這些方法進(jìn)行了修飾的方法中適當(dāng)選擇后使用。另外,還可使用可用于免疫原性綴合物制作的縮合劑、可用于與載體結(jié)合的縮合劑等。作為縮合劑,例如可舉出戊二醛、六亞甲基二異氰酸酯、六亞甲基二異硫氰酸酯、 N,N’ -聚亞甲基雙碘乙酰胺、N, N’ -亞乙基雙馬來(lái)酰亞胺、乙二醇雙琥珀酰亞胺基琥珀酸酯、雙重氮聯(lián)苯胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺、3-(2-吡啶二硫基)丙酸琥珀酰亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸N-琥珀酰亞胺酯(SMCC)、 4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸N-磺基琥珀酰亞胺酯、(4-碘代乙?;?氨基苯甲酸N-琥珀酰亞胺酯、4-(1-馬來(lái)酰亞胺基苯基)丁酸N-琥珀酰亞胺酯、N-( ε -馬來(lái)酰亞胺基己酰氧基)琥珀酰亞胺(EMCS)、亞氨基四氫噻吩、S-乙?;鶐€基琥珀酸酐、3- ’-二硫吡啶基)丙亞氨酸甲酯、4-巰基丁亞氨酸甲酯、3-巰基丙亞氨酸甲酯、N-琥珀酰亞胺基-S-乙?;鶐€基乙酸酯。作為成為本發(fā)明的免疫學(xué)測(cè)定方法對(duì)象的試樣,可舉出所有形態(tài)的溶液或膠體溶液等,優(yōu)選可舉出生物來(lái)源的流體試樣、例如血液、血漿、血清、關(guān)節(jié)液、腦脊髓液、唾液、羊水、尿、其他體液、細(xì)胞培養(yǎng)液、組織培養(yǎng)液、活檢檢體、例如細(xì)胞、組織、臟器、腫瘤組織等。 上述試樣可用于檢測(cè)患者的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。特別優(yōu)選可舉出血漿、血清、關(guān)節(jié)液等。使用了本發(fā)明的單克隆抗體的免疫染色法中,優(yōu)選使用活檢檢體、例如細(xì)胞、組織、臟器、腫瘤組織。對(duì)于上述試樣,使用本發(fā)明的單克隆抗體作為類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的標(biāo)記物,可進(jìn)行免疫細(xì)胞染色法或免疫組織染色法。上述試樣可在染色前根據(jù)需要進(jìn)行固定化。固定化時(shí),可使用在該領(lǐng)域中廣泛使用的物質(zhì)或者由其衍生的物質(zhì)。例如可以使用高碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛、戊二醛、Bouin固定液、福爾馬林、多聚甲醛、Zamboni固定液、丙烯醛等。另外,還可用石蠟等進(jìn)行固定化。本發(fā)明還提供一種免疫學(xué)測(cè)定用試劑,其特征在于,含有本發(fā)明的單克隆抗體。根據(jù)上述免疫學(xué)測(cè)定用試劑,可以簡(jiǎn)單且靈敏度良好地對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1特異性地進(jìn)行檢測(cè)。另外,上述試劑可用于檢測(cè)患者的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明還涉及一種在藥品或臨床檢查領(lǐng)域或分析測(cè)定領(lǐng)域中允許的包裝及試劑盒,其含有1個(gè)或多個(gè)容器,所述容器填充有1個(gè)或多個(gè)在本發(fā)明的免疫染色法或免疫學(xué)測(cè)定法中所用的上述物質(zhì)。在包裝及試劑盒中,還可以與這種(單一或多個(gè))容器一起附上使用須知,該使用須知是由規(guī)定藥品、檢驗(yàn)試劑或生物學(xué)產(chǎn)物的制造、使用或出售的政府機(jī)關(guān)指示的形態(tài)的使用須知(文件),是表示與和人相關(guān)制品的制造、使用或出售有關(guān)的該政府機(jī)關(guān)認(rèn)可的使用須知(附帶文件)。當(dāng)將測(cè)定試劑或試劑盒用于本發(fā)明的免疫染色法或免疫學(xué)測(cè)定法時(shí),不需要設(shè)定特別的條件、操作等。可以在各方法中的通常條件、操作法中加以本領(lǐng)域技術(shù)人員的通常的技術(shù)考量,構(gòu)建與本發(fā)明的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)或具有與其實(shí)質(zhì)上為相等活性的物質(zhì)有關(guān)的測(cè)定體系。實(shí)施例以下,利用實(shí)施例具體地說(shuō)明本發(fā)明的單克隆抗體及其制造方法以及使用了該單克隆抗體的免疫染色法和使用該單克隆抗體在免疫學(xué)上對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1進(jìn)行定量的方法。但本發(fā)明并不限定于這些示例。
(實(shí)施例1抗原及標(biāo)準(zhǔn)品的制作)如下所述,根據(jù)Obata等人,Clin. Chim. Acta,211,59-72,1992所記載的方法,由正常人皮膚成纖維細(xì)胞NBlRGB(RCB22》培養(yǎng)上清中精制出溶基質(zhì)蛋白酶1。在含10%胎牛血清、14mM HEPESU. 4g/l NaHC03的RITC80-7基礎(chǔ)培養(yǎng)基(pH為7.幻中、在5% C02存在下、37°C下對(duì)NBlRGB細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),直至匯合成片(confluent)。用IOOml的RITC80-7 基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞后,在含有2g/l乳清蛋白水解物及10000U/1白細(xì)胞介素1 α的無(wú)血清RITC80-7基礎(chǔ)培養(yǎng)基300ml中進(jìn)行培養(yǎng),并將其上清回收。將上述上清供至瓊脂糖凝膠4B柱。在該瓊脂糖凝膠4B柱中填充有下述物質(zhì)根據(jù)手冊(cè)記載的操作法預(yù)先在CNBr-活化瓊脂糖凝膠(GE HEALTHCARE公司)上結(jié)合有對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的單克隆抗體55-3G3(國(guó)際保藏號(hào)FERM BP-3744、保藏日平成3年(1991 年)6月12日、保藏機(jī)關(guān)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中心、茨城縣筑波市東1-1-1筑波中心中央第6)的物質(zhì)。利用含0. lMNaCl、5mM CaCl2及5g/l CHAPS的 30mM Tris鹽酸緩沖液(pH為8. 0)對(duì)供有上清的柱進(jìn)行洗滌,利用3M KSCN將結(jié)合于柱的蛋白質(zhì)洗脫。接著,將上述洗脫液供至用含0.4M NaClUOmM CaCl2及0. 5g/l Brij 35的 50mM Tris鹽酸緩沖液(pH為7. 5)進(jìn)行了平衡化的S印hadex G-25柱(GE HEALTHCARE公司)。收集空隙體積級(jí)分,供至用G-25色譜柱進(jìn)行平衡化的緩沖液相同的緩沖液進(jìn)行了平衡化的伴刀豆球蛋白A-瓊脂糖凝膠柱(GE HEALTHCARE公司),收集未結(jié)合于柱的蛋白質(zhì)。最后將未結(jié)合在伴刀豆球蛋白A柱上的蛋白質(zhì)級(jí)分供至Ultrogel AcA44柱 (PALL公司),進(jìn)行色譜分級(jí)。通過(guò)月桂基硫酸聚丙烯酰胺凝膠電泳確認(rèn)了蛋白質(zhì)的純度。精制過(guò)的酶是均一的、顯示分子量為57kDa。將該精制酶作為抗原及標(biāo)準(zhǔn)品。溶基質(zhì)蛋白酶2以R & D Systems 公司制的產(chǎn)品作為標(biāo)準(zhǔn)品使用、溶基質(zhì)蛋白酶3以Abcam公司制的產(chǎn)品作為標(biāo)準(zhǔn)品使用。(實(shí)施例2單克隆抗體的制備)如下所述,根據(jù)Obata等人,Clin. Chim. Acta,211,59-72,1992所記載的方法,以實(shí)施例1所精制的溶基質(zhì)蛋白酶1作為抗原,制備了單克隆抗體。(a)利用溶基質(zhì)蛋白酶1的動(dòng)物免疫將44. 6 μ g通過(guò)實(shí)施例1所記載的方法制備的溶基質(zhì)蛋白酶1與等重量的弗氏完全佐劑一起腹腔內(nèi)投予6周齡BALB/c雌性小鼠2只,進(jìn)行初次免疫。之后,在第19日用溶解于含 0. 4MNaCl、10mM CaCl2 及 0. 5g/l Brij35 的 50m M Tris 鹽酸緩沖液(pH 為 7. 5)中的40. 4μ g溶基質(zhì)蛋白酶1進(jìn)行追加免疫。作為末次免疫,在第55日用43. 2μ g的溶基質(zhì)蛋白酶1進(jìn)行免疫。從末次免疫經(jīng)過(guò)3日后,將小鼠脾臟摘出,制備脾臟細(xì)胞。(b)抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合使用以下的材料及方法。RPMI 1640 培養(yǎng)基在 RPMI 1640 (JRH Biosciences 制)中添加 24mM 碳酸氫鈉、 ImM丙酮酸鈉、50U/ml青霉素G鉀、50 μ g/ml硫酸鏈霉素及100 μ g/ml硫酸阿米卡星,用干冰使PH為7. 2,利用0. 22 μ m微孔過(guò)濾器進(jìn)行除菌過(guò)濾。NS-I培養(yǎng)基在上述RPMI-1640培養(yǎng)基中添加除菌過(guò)濾后的FBS (JRH Biosciences制)直至達(dá)到15% (ν/ν)的濃度。PEG4000 溶液在 RPMI-1640 培養(yǎng)基中制備聚乙二醇 4000 (PEG4000,Merck andCO.,Inc.制)50% (w/w)的無(wú)血清溶液。脾臟細(xì)胞與8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤耐性骨髓瘤細(xì)胞SP2 (SP2/0_Agl4)的融合按照Oi等人,Selected Methods in Cellular Immunology, 351-371, W. H. Freeman & Co. , 1980 的方法進(jìn)行。以5 : 1的比例將(a)中制備的脾臟細(xì)胞(活細(xì)胞率100% )與骨髓瘤細(xì)胞(活細(xì)胞率100%)融合。用上述RPMI-1640培養(yǎng)基分別對(duì)脾臟細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行洗滌。 接著,將分別懸浮于相同培養(yǎng)基中的脾臟細(xì)胞3. 2 X IO8個(gè)和骨髓瘤細(xì)胞6. 4X IO7個(gè)混合。 接著,通過(guò)lOOOr.p.m.下10分鐘的離心分離使細(xì)胞沉淀,將上清完全地抽吸除去。用1分鐘的時(shí)間將加熱至37°C的PEG4000溶液2. Iml滴加到沉淀的細(xì)胞中,同時(shí)緩慢地?cái)嚢瑁瑪嚢?分鐘使細(xì)胞再次懸浮、分散。接著,用2分鐘的時(shí)間滴加加熱至37°C的RPMI-1640培養(yǎng)基4. anl。用2 3分鐘的時(shí)間一邊不停攪拌一邊滴加相同培養(yǎng)基14. 7ml使細(xì)胞分散。在 IOOOr. p. m.下對(duì)其離心分離7分鐘,將上清完全地抽吸除去。接著,在該沉淀細(xì)胞中快速添加加熱至37°C的NS-I培養(yǎng)基21ml,小心地利用移液管將大的細(xì)胞團(tuán)塊分散。然后添加相同培養(yǎng)基42ml進(jìn)行稀釋?zhuān)诰郾揭蚁┲?6孔微孔(巖城硝子制)中添加每孔為6X IO5個(gè) /0. Iml的細(xì)胞。在 % C02/93%空氣中、在溫度37°C、濕度100%下培養(yǎng)該微孔。(c)利用選擇培養(yǎng)基的雜交瘤的選擇性增殖所使用的培養(yǎng)基如下所示。HAT培養(yǎng)基在上述實(shí)施例2(b)中所述的NS-I培養(yǎng)基中進(jìn)一步添加次黃嘌呤 (100 μ Μ)、氨基蝶呤(0. 4μΜ)及胸腺嘧啶脫氧核苷(16 μ Μ)。HT培養(yǎng)基除了除去氨基蝶呤之外,與上述HAT培養(yǎng)基為相同組成。在上述(b)的培養(yǎng)開(kāi)始后次日(第1日)、用移液管在細(xì)胞中添加HAT培養(yǎng)基2滴 (約0. Iml)。在第2、3、5及8日用新的HAT培養(yǎng)基將培養(yǎng)基的一半(約0. Iml)替換。在第11日,對(duì)于觀察到雜交瘤的充分生長(zhǎng)的所有孔,利用以下(d)所記載的ELISA研究陽(yáng)性孔。(d)細(xì)胞融合后的利用ELISA的抗溶基質(zhì)蛋白酶1抗體產(chǎn)生雜交瘤的選擇如下所述,進(jìn)行利用直接吸附法的ELISA。在96孔微孔板(Nunc公司)中按照 IOOng/孔被覆用0. IM磷酸緩沖液(pH為7. 0)進(jìn)行了稀釋的溶基質(zhì)蛋白酶1作為抗原。在 4°C下放置一晚以上后,將包被液吸走,用含0. 05% Tween20的PBS(pH為7. 2)對(duì)微孔板進(jìn)行洗滌。以100 μ 1/孔的量添加欲確認(rèn)的雜交瘤的培養(yǎng)上清(一抗),在室溫下孵育(靜置) 約1小時(shí)。洗滌后,以100μ 1/孔的量添加作為二抗的用封閉液將山羊抗小鼠Ig(G+M+A) 免疫球蛋白-過(guò)氧化物酶(POD) (CAPPEL公司)稀釋至1/10000的液體,在室溫下孵育(靜置)約1小時(shí)。洗滌后,以100 μ 1/孔的量添加作為底物的過(guò)氧化氫和四甲基聯(lián)苯胺(TMB), 在室溫下反應(yīng)約20分鐘,以100 μ 1/孔的量添加IM硫酸使反應(yīng)停止,利用酶標(biāo)儀(T0S0H、 MPRA4)對(duì)測(cè)定波長(zhǎng)450nm下的吸光度進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于與溶基質(zhì)蛋白酶1的反應(yīng)顯示陽(yáng)性的 16孔實(shí)施細(xì)胞的冷凍及復(fù)蘇,實(shí)施利用有限稀釋法的克隆。(e)克隆使用以下的材料及方法。RPMI 1640 培養(yǎng)基- )在 RPMIIMO 培養(yǎng)基(SIGMAR8758)5OOmld 瓶)中添加胎牛血清(FOETAL BOVINE SERUM) (SIGMA F9423) 50ml、青鏈霉素溶液 (Penicillin-Streptomycin Solution)(SIGMAP0781)2. 5ml。
含BriClone 的 RPMI 1640 培養(yǎng)基;在 RPMI 1640 培養(yǎng)基-O)中添加 BriClone (雜交瘤克隆培養(yǎng)基)(NICB公司制)至達(dá)到5%。在RMI 1640培養(yǎng)基-(2)中使冷凍細(xì)胞復(fù)蘇,使用含BriClone的RPMI1640培養(yǎng)基在96孔微孔的36孔、36孔及M孔中每孔分別添加5個(gè)、1個(gè)及0. 5個(gè)的雜交瘤。在第 5日,在所有孔中追加約0. Iml的RPMI 1640培養(yǎng)基42)。克隆開(kāi)始后,從第11日開(kāi)始,在第14日可見(jiàn)雜交瘤的充分生長(zhǎng),對(duì)于它們進(jìn)行下述(f)所記載的ELISA。當(dāng)所測(cè)試的所有孔均非陽(yáng)性時(shí),確認(rèn)抗體陽(yáng)性孔中的群落數(shù),在孔中選擇1 3個(gè)單群落(沒(méi)有時(shí)選擇群落數(shù)盡量少的孔),進(jìn)行再次克隆。結(jié)果,如表1所示,獲得12個(gè)克隆的對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的單克隆抗體產(chǎn)生細(xì)胞。(f)克隆時(shí)的利用ELISA的抗溶基質(zhì)蛋白酶1抗體產(chǎn)生雜交瘤的選擇如下所述,進(jìn)行利用直接吸附法的ELISA。在利用直接吸附法的ELISA中,在96孔微孔板(Nunc公司)中按照50ng/孔包被用0. IM磷酸緩沖液(pH為7. 0)進(jìn)行了稀釋的溶基質(zhì)蛋白酶1作為抗原。在4°C下放置一晚以上后,將包被液吸走,用200μ 1/孔的封閉液 (含BSA及0. IM NaCl的0. OlM磷酸緩沖液、pH為7. 0)在室溫下封閉1小時(shí)以上。用含0. Tween20及0. IM NaCl的0. OlM磷酸緩沖液(pH為7. 0)對(duì)微孔板進(jìn)行洗滌后,以 100 μ 1/孔的量添加欲確認(rèn)的雜交瘤的培養(yǎng)上清(一抗),在室溫下孵育(靜置)約1小時(shí)。洗滌后,以100 μ 1/孔的量添加作為二抗的用封閉液將山羊抗小鼠Ig(G+M+A)免疫球蛋白-過(guò)氧化物酶(POD) (CAPPEL公司)稀釋至1/3000的液體,在室溫下孵育(靜置)約1小時(shí)。洗滌后,以 100 μ 1/孔的量添加 TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX 公司,Products TMBW-1000-01),在室溫下使其反應(yīng)約5 10分鐘。以100 μ 1/孔的量添加IM硫酸使反應(yīng)停止,利用酶標(biāo)儀(TECAN SPECTRA)對(duì)測(cè)定波長(zhǎng)450nm下的吸光度進(jìn)行測(cè)定。(實(shí)施例3單克隆抗體的亞類(lèi)的鑒定)根據(jù)實(shí)施例2(d)所記載的ELISA,如下鑒定單克隆抗體的亞類(lèi)。進(jìn)行實(shí)施例2(d) 所記載的直到包被有溶基質(zhì)蛋白酶1的96孔微孔的封閉之前的操作。用含0. Tween20 及0. IM NaCl的0. OlM磷酸緩沖液(pH為7. 0)進(jìn)行洗滌后,以100 μ 1/孔的量添加各單克隆抗體產(chǎn)生雜交瘤的培養(yǎng)上清,在室溫下孵育(靜置)約1小時(shí)。在洗滌后,以50 μ 1/孔的量添加同種型特異性的兔抗小鼠Ig抗體(Mouse MonoAb-ID Kit、Zymed Laboratories 公司),在室溫下孵育(靜置)約1小時(shí)。進(jìn)一步洗滌后,以50 μ 1/孔的量添加用封閉液將辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)抗體稀釋至1/50的溶液,在室溫下孵育 (靜置)約1小時(shí)。洗滌后,以100 μ 1/孔的量添加TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX 公司、Product#TMBW-1000_01)使其顯色,以 100 μ 1/ 孔的量添加 IM 硫酸使反應(yīng)停止,對(duì)測(cè)定波長(zhǎng)450nm下的吸光度進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如表1所示,所得的單克隆抗體是Y l/κ為4個(gè)、γ 2b/ κ為3個(gè)、μ / κ為4個(gè)、α / Κ為1個(gè)。表1針對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的單克隆抗體
克隆號(hào)亞類(lèi)296-21C4Y 2b/κ
權(quán)利要求
1.一種單克隆抗體,其與溶基質(zhì)蛋白酶2及溶基質(zhì)蛋白酶3不發(fā)生交叉反應(yīng),而與溶基質(zhì)蛋白酶1特異地發(fā)生反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體,其對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶2及溶基質(zhì)蛋白酶3的交叉反應(yīng)性為其對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的反應(yīng)性的5%以下。
3.一種單克隆抗體,其為與序列號(hào)1的一部分氨基酸序列所構(gòu)成的肽特異地發(fā)生反應(yīng)、且與溶基質(zhì)蛋白酶1特異地發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體,其中,該氨基酸序列含有序列號(hào)1 的第425號(hào) 第436號(hào)的序列,且該肽的長(zhǎng)度為12 20個(gè)氨基酸殘基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體,其與序列號(hào)1的一部分氨基酸序列所構(gòu)成的肽特異地發(fā)生反應(yīng),該氨基酸序列含有序列號(hào)1的第425號(hào) 第436號(hào)的序列,且該肽的長(zhǎng)度為12 20個(gè)氨基酸殘基。
5.一種單克隆抗體,其為與溶基質(zhì)蛋白酶1特異地發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體,其中,通過(guò)利用賴氨酰內(nèi)肽酶將溶基質(zhì)蛋白酶1分解,使所述抗體對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的反應(yīng)性消失。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體,其中,通過(guò)利用賴氨酰內(nèi)肽酶將溶基質(zhì)蛋白酶1 分解,使所述抗體對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的反應(yīng)性消失。
7.一種免疫染色法,其特征在于,使用權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的單克隆抗體。
8.溶基質(zhì)蛋白酶1的免疫學(xué)測(cè)定法,其特征在于,使用權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的單克隆抗體對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1進(jìn)行定量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的免疫學(xué)測(cè)定法,其為使用針對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1的2種以上的單克隆抗體的免疫學(xué)測(cè)定法,其中,所述單克隆抗體中的至少1種為權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于以更高的靈敏度更正確地對(duì)溶基質(zhì)蛋白酶1進(jìn)行定量。本發(fā)明提供不與溶基質(zhì)蛋白酶2及溶基質(zhì)蛋白酶3發(fā)生交叉反應(yīng)、而與溶基質(zhì)蛋白酶1特異地發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體。
文檔編號(hào)G01N33/573GK102300878SQ20108000637
公開(kāi)日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2010年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月3日
發(fā)明者中村協(xié)枝, 藤本升 申請(qǐng)人:第一精密化學(xué)株式會(huì)社