包括金屬蛋白酶的洗滌劑組合物的制作方法
【專利說明】包括金屬蛋白酶的洗滌劑組合物
[0001 ] 對序列表的引用
[0002] 本申請包括一個計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，將其通過引用結(jié)合在此。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及包括金屬蛋白酶（E. C 3. 4. 24)的清潔和/或洗滌劑組合物。本發(fā)明 進(jìn)一步涉及金屬蛋白酶在清潔過程（例如餐具洗滌和衣物洗滌）中的用途。另外，本發(fā)明 涉及進(jìn)行清潔（例如餐具洗滌和衣物洗滌）的方法。
[0004] 相關(guān)技術(shù)說明
[0005] 超過30年以來，洗滌劑工業(yè)已經(jīng)在洗滌劑配制品中應(yīng)用了不同酶，最常用的酶包 括蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶，每種酶適于除去不同類型的污物。除這些酶之外，洗滌劑組合 物典型地包括成分的復(fù)合物組合。例如，大多數(shù)清潔產(chǎn)品包括表面活性劑體系、漂白劑或助 洗劑。不管當(dāng)前洗滌劑的復(fù)雜度如何，但是對于研發(fā)包括新的酶和/或酶共混物的新的洗 滌劑組合物仍存在需要。
[0006] 金屬蛋白酶是對于其活性而言絕對需要金屬離子的蛋白水解酶。大多數(shù)金屬蛋 白酶都是鋅依賴性的，盡管一些金屬蛋白酶使用其他過渡金屬。金屬蛋白酶已經(jīng)被廣泛 地用于不同工業(yè)中，像食品和釀造工業(yè)。被最充分表征的金屬蛋白酶組之一是嗜熱菌蛋 白酶。嗜熱菌蛋白酶屬于M4家族金屬蛋白酶并且已經(jīng)用于例如肽合成過程中。對于此 類應(yīng)用，嗜熱菌蛋白酶需要在高溫下具有活性并且已經(jīng)聚焦于在高溫下增加其性能。在 TO 2004/011619(斯特拉塔基因公司（Stratagene))中描述了具有改變的切割特異性的 嗜熱菌蛋白酶樣蛋白酶的耐熱變體。另一種M4金屬蛋白酶是解淀粉芽孢桿菌金屬蛋白 酶,又稱Neutrase?,其多年以來已經(jīng)被用作不同食品和飼料產(chǎn)品中的添加劑,例如在釀 造中。此金屬蛋白酶還已經(jīng)被描述用于在洗滌劑和清潔組合物和過程中使用，如描述于例 如TO 2007/044993,儲存穩(wěn)定的金屬蛋白酶在洗滌劑中的用途或WO 2009/058518,以及EP 1 288 282(聯(lián)合利華（Unilever))中，其描述了一種用于在餐具洗滌中使用的金屬蛋白酶 和絲氨酸蛋白酶的共混物。嗜熱菌蛋白酶樣金屬蛋白酶在洗滌劑中的用途還被描述于WO 20099058303(丹尼斯克美國公司（Danisco US INC·))中。
[0007] 然而，金屬蛋白酶在洗滌劑工業(yè)中的使用已經(jīng)非常受限并且焦點(diǎn)已經(jīng)聚于金屬蛋 白酶Neutrase?:和/或"NprE"的使用，如TO 2007/044993中所闡述。通常，金屬蛋白酶 在常規(guī)洗滌條件下以及在常規(guī)洗滌劑組合物中是非常不穩(wěn)定的。因此，金屬蛋白酶在洗滌 和清潔過程中以及在洗滌劑中的使用受限。
[0008] 對改進(jìn)洗滌過程以便使得它們更環(huán)保的增加的聚焦導(dǎo)致如下全球趨勢：降低洗滌 時間、pH和溫度，減少可能負(fù)面地影響環(huán)境的洗滌劑組分的量。本發(fā)明針對這些以及其他 重要目的。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明的一個方面涉及一種包括具有蛋白酶活性的多肽的組合物，其中具有蛋白 酶活性的該多肽選自：
[0011] a) -種多肽，該多肽與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO 4的成熟多肽具有至少70%序 列一致性，例如至少75%-致性，例如至少80%-致性，例如至少85%序列一致性，例如至 少90%-致性，例如至少95%-致性，例如至少97%-致性，例如至少98%-致性，例如至 少99 % -致性；
[0012] (b) -種多肽，該多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO 3的成熟多肽編碼序列具有至少70%序列一致性，例如至少75%-致性，例如至少80% 一致性，例如至少85%序列一致性，例如至少90%-致性，例如至少95%-致性，例如至少 97%-致性，例如至少98%-致性以及例如至少99% -致性；
[0013] (c) 一種變體，該變體包括SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO 3的成熟多肽的一個或多個 (若干個）氨基酸的取代、缺失、和/或插入；以及
[0014] (d) (a)、（b)或（C)的多肽的片段，該片段具有蛋白酶活性。
[0015] 在本發(fā)明的一個具體方面中，該組合物是一種清潔組合物，例如洗滌劑組合物或 洗滌劑添加劑。此外，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的組合物在清潔過程，例如衣物洗滌、硬表面 清潔、餐具洗滌或自動化餐具洗滌中的用途。
[0016] 本發(fā)明的另一個方面涉及具有蛋白酶活性的多肽在清潔過程中的用途，其中具有 蛋白酶活性的該多肽選自：
[0017] a) -種多肽，該多肽與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO 4的成熟多肽具有至少70%序 列一致性，例如至少75%-致性，例如至少80%-致性，例如至少85%序列一致性，例如至 少90%-致性，例如至少95%-致性，例如至少97%-致性，例如至少98%-致性以及例 如至少99 % -致性；
[0018] (b) -種多肽，該多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO 3的成熟多肽編碼序列具有至少70%序列一致性，例如至少75%-致性，例如至少80% 一致性，例如至少85%序列一致性，例如至少90%-致性，例如至少95%-致性，例如至少 97%-致性，例如至少98% -致性并且最優(yōu)選至少99% -致性；
[0019] (c) 一種變體，該變體包括SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO 4的成熟多肽的一個或多個 (若干個）氨基酸的取代、缺失、和/或插入；以及
[0020] (d) (a)、（b)或（C)的多肽的片段，該片段具有蛋白酶活性。
[0021] 本發(fā)明的分離的多肽是一種屬于M4金屬蛋白酶組的金屬蛋白酶。優(yōu)選地，該分離 的多肽來源于微小桿菌屬。
[0022] 本發(fā)明涉及金屬蛋白酶，特別是M4類型的金屬蛋白酶，例如與SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4具有至少70%-致性的金屬蛋白酶，在清潔過程，例如衣物洗滌和餐具洗滌中的用 途，并且特別地涉及在低溫中的用途。本發(fā)明還涉及包括金屬蛋白酶的洗滌劑組合物和清 潔組合物。
[0023] 本發(fā)明的一個具體方面涉及一種清潔方法，所述方法包括以下步驟：使表面與根 據(jù)本發(fā)明的金屬蛋白酶接觸。
[0024] 本發(fā)明的另一個具體方面涉及包括一種金屬蛋白酶和一種表面活性劑的組合物， 例如洗滌劑組合物。
[0025] 本發(fā)明的又另一個具體方面涉及一種用于從表面除去污物的方法，該方法包括使 該表面與根據(jù)本發(fā)明的組合物接觸。
[0026] 序列表綜述
[0027] SEQ ID NO 1 :是西伯利亞微小桿菌（Exiguobacterium sibiricum)的 DNA 序列。
[0028] SEQ ID NO 2 :是如從 SEQ ID N0:1(SWISSPR0T :B1YFR1)推導(dǎo)的氨基酸序列。
[0029] SEQ ID NO 3 :是微小桿菌屬ATlb的DNA序列。
[0030] SEQ ID NO 4 :是如從 SEQ ID N0:3(SWISSPR0T :C4L1B3)推導(dǎo)的氨基酸序列。
[0031] SEQ ID NO 5:編碼具有被優(yōu)化以用于在芽孢桿菌屬菌株中進(jìn)行表達(dá)的密碼子使 用的西伯利亞微小桿菌金屬蛋白酶的DNA。
[0032] SEQ ID NO 6:編碼具有被優(yōu)化以用于在芽孢桿菌屬菌株中進(jìn)行表達(dá)的密碼子使 用的微小桿菌屬ATlb金屬蛋白酶的DNA。
[0033] SEQ ID NO 7 :正向引物序列
[0034] SEQ ID NO 8 :反向引物序列
[0035] SEQ ID NO 9 :西伯利亞微小桿菌的成熟多肽
[0036] SEQ ID NO 10 :微小桿菌屬ATlb的成熟多肽
[0037] SEQ ID NO 11 :西伯利亞微小桿菌的N-末端序列
[0038] SEQ ID NO 12 :微小桿菌屬ATlb的N-末端序列
[0039] SEQ ID NO Π :解淀粉芽孢桿菌蛋白酶 Uniprot :P〇6832 ( Neutrase? )
[0040] SEQ ID NO 14:克勞氏芽孢桿菌蛋白酶（Savinase? )
[0041] 定義
[0042] "具有蛋白酶活性的多肽"具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有時還被指定為肽酶、 朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是在其任一端開始水解肽的外切型蛋白酶或在 多肽鏈內(nèi)部發(fā)揮作用的內(nèi)切型蛋白酶（內(nèi)肽酶）。內(nèi)肽酶對N-和C-末端被封閉的肽底物 顯示出活性，這些底物與所討論的蛋白酶的特異性有關(guān)。
[0043] 術(shù)語"蛋白酶"在此被定義為水解肽鍵的酶。本發(fā)明提供了具有蛋白酶活性的多肽 在洗滌劑組合物中的用途。本發(fā)明還提供了編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明的蛋白酶是 MEOPS家族M4的金屬蛋白酶。本發(fā)明的這些多肽具有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的成熟 多肽的至少20 %，例如至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至 少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %以及至少100 %的蛋白酶活性。
[0044] 可以使用任何測定來測量"蛋白酶活性"，其中采用一種底物，該底物包括與所討 論的蛋白酶的特異性相關(guān)的肽鍵。PH測定和溫度測定同樣適用于所討論的蛋白酶。pH值 測定的實(shí)例是pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12。溫度測定的實(shí)例是151：、201：、251：、 30°〇、351：、371：、401：、451：、501：、551：、601：、651：、701：、801：、901：、或951：。普通蛋白酶 底物的實(shí)例是膠原、酪蛋白、牛血清白蛋白以及血紅蛋白。在經(jīng)典的安森（Anson)和米爾斯 基（Mirsky)方法中，將變性的血紅蛋白用作底物并且在用所討論的蛋白酶孵育測定后，確 定三氯乙酸可溶的血紅蛋白的量用作蛋白酶活性的量度（安森（Anson)，M.L.和米爾斯基 (Mirsky), A. E.，1932,普通生理學(xué)雜志（J. Gen. Physiol.) 16:59 以及安森（Anson), M. L., 1938,普通生理學(xué)雜志（J. Gen. Physiol.) 22:79)。
[0045] 出于本發(fā)明的目的，使用描述于"材料與方法"中的測定確定蛋白酶活性，如 Protazyme OL 測定。
[0046] 如在此使用的術(shù)語"金屬蛋白酶"是指在結(jié)合/活性位點(diǎn)中具有一種或多種金屬 離子的蛋白酶。
[0047] 如在此使用的術(shù)語"M4金屬蛋白酶家族"或"M4金屬蛋白酶"或"M4"意指根據(jù)羅 林斯（Rawlings)等人，生物化學(xué)雜志（Biochem.J.)，290, 205-218 (1993)并且如進(jìn)一步描 述于 MER0PS_(羅林斯等人，MEROPS :膚酶數(shù)據(jù)庫（MER0PS:the peptidase database)，核酸 研究（Nucl Acids Res)，第34期數(shù)據(jù)庫，D270-272,2006)中，落入M4金屬蛋白酶家族的多 肽。M4金屬蛋白酶是主要包含內(nèi)肽酶的中性金屬蛋白酶。該家族中的所有肽酶都結(jié)合單個 的催化鋅離子。M4金屬蛋白酶家族成員包括常見的HEXXH基序，其中組氨酸殘基充當(dāng)鋅配 體并且谷氨酸是活性位點(diǎn)殘基。M4金屬蛋白酶具有主要位于中性pH處的最優(yōu)pH J4金屬蛋 白酶家族包括例如Neutrase? (被分類為MEROPS亞類M04. 014)、嗜熱菌蛋白酶、桿菌溶素 (Bacillolysin)、弧菌溶血素、假溶素（pseudolysin)、Msp 肽酶、球菌溶素（coccolysin)、 短梗霉溶素（aureolysin)、比梅溶素（vimelysin)、X毒素中性肽酶B、PA肽酶（氣單胞菌 屬類型）、格里塞溶素（griselysin)、硬脂溶素（stearolysin)、MprIII (交替單胞菌屬菌株 0-7)、pap6肽酶、中性肽酶（熱放線菌屬類型）、ZmpA肽酶（伯克霍爾德菌屬）、zpx肽酶、 PrtS肽酶（發(fā)光桿菌）、多變?nèi)芩兀╬rotealysin)、ZmpB肽酶（伯克氏菌屬）。多肽的M4金 屬蛋白酶家庭已經(jīng)被進(jìn)一步表征并且根據(jù)MER0PS，目前包括至少二十二個已經(jīng)為其指定獨(dú) 特MEROPS ID (即，具有式M04. XXX的標(biāo)識符）的亞類以及非肽酶同系物和未指定的肽酶。
[0048] 如在此使用的術(shù)語"分離的多肽"是指從來源分離的多肽。在一個方面中，該變 體或多肽是至少20%純的，更優(yōu)選至少40%純的，更優(yōu)選至少60%純的，甚至更優(yōu)選至少 80%純的，最優(yōu)選至少90%純的并且甚至最優(yōu)選至少95%純的，如通過SDS-PAGE所確定。
[0049] 術(shù)語"基本上純的多肽"在此指一種包含按重量計(jì)至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu) 選至多6 %，更優(yōu)選至多5 %，更優(yōu)選至多4 %，更優(yōu)選至多3 %，甚至更優(yōu)選至多2 %，最優(yōu)選 至多1 %，并且甚至最優(yōu)選至多0. 5 %的該多肽和與其天然地或重組地相關(guān)的其他多肽材 料的多肽制劑。因此，優(yōu)選的是該基本上純的多肽按存在于該制劑中的所有多肽材料的重 量計(jì)是至少92%純的，優(yōu)選至少94%純的，更優(yōu)選至少95%純的，更優(yōu)選至少96%純的，更 優(yōu)選至少97%純的，更優(yōu)選至少98%純的，甚至更優(yōu)選至少99%純的，最優(yōu)選至少99. 5% 純的，并且甚至最優(yōu)選100%純的。本發(fā)明的多肽優(yōu)選處于基本上純的形式。其可通過，例 如，以公知的重組方法或以經(jīng)典的純化方法制備該變體或多肽而達(dá)成。
[0050] 術(shù)語"成熟多肽編碼序列"意指編碼具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
[0051] 兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)"序列一致性"描 述。出于本發(fā)明的目的，使用尼德曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（尼德曼和翁施， 1970,分子生物學(xué)雜志（J. Mol. Biol. )48:443-453)來確定兩個氨基酸序列之間的一致性 程度，該算法如EMBOSS軟件包（EMBOSS :歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件（The European Molecular Biology Open Software Suite)，賴斯（Rice)等人，2000,遺傳學(xué)趨勢（Trends in Genetics) 16:276-277 ;http://emboss, org)(優(yōu)選 3· 0· 0 版或更新版本）的尼德爾 (Needle)程序所實(shí)施的。所使用的這些任選參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5， 及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩陣。尼德爾標(biāo)注的"最長的一致性"的輸 出（使用-非簡化選項(xiàng)獲得）被用作百分比一致性，并且如下計(jì)算：
[0052] (一致的殘基X 100V (比對長度-比對中的空位總數(shù)）
[0053] 出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件， 賴斯等人，2000,見上文；http://emboss, org)(優(yōu)選3. 0. O版或更新版本）的尼德爾程序 中所實(shí)施的尼德爾曼-翁施算法（尼德爾曼和翁施，1970,見上文）來確定兩個脫氧核糖 核苷酸序列之間的一致性程度。所使用的這些任選參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分 0. 5,及EDNAFULL (NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩陣。尼德爾標(biāo)注的"最長的一致性" 的輸出（使用-非簡化選項(xiàng)獲得）被用作百分比一致性，并且如下計(jì)算：
[0054] (一致的脫氧核糖核苷酸X 100V (比對長度-比對中的空位總數(shù)）
[0055] 術(shù)語"片段"意指使一個或多個（若干個）氨基酸從成熟多肽的氨基和/或羧基 末端缺失的多肽；其中該片段具有蛋白酶活性。
[0056] 術(shù)語"多肽的功能片段"或"其功能片段"用來描述衍生自更長的多肽（例如，成 熟多肽）的多肽，以及已經(jīng)在N-末端區(qū)或C-末端區(qū)或兩個區(qū)域中截短以產(chǎn)生親本多肽的 片段的多肽。為了成為功能多肽，該片段必須保持全長/成熟多肽的至少20%，優(yōu)選至少 40%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選 至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，并且甚至最優(yōu)選至少100 %的蛋白酶活性。M4金屬蛋白酶可以 被截短，這樣使得某個結(jié)構(gòu)域被除去以產(chǎn)生一個功能片段，該功能片段可以是其中少于200 個氨基酸已經(jīng)從成熟M4金屬蛋白酶中除去，優(yōu)選少于150個氨基酸，更優(yōu)選少于120、100、 80、60、40、30個氨基酸，甚至更優(yōu)選少于20個氨基酸并且最優(yōu)選少于10個氨基酸已經(jīng)從成 熟多肽中除去的多肽。
[0057] 術(shù)語"子序列"意指使一個或多個（若干個）核苷酸從成熟多肽編碼序列的5'端 和/或3'端缺失的多核苷酸，其中該子序列編碼具有蛋白酶活性的一個片段。
[0058] 術(shù)語"等位基因變體"意指占用同一染色體位點(diǎn)的一種基因的兩個或更多個替代 形式中的任一者。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，并且可以導(dǎo)致群體內(nèi)的多態(tài)性?；蛲?變可以是沉默的（在所編碼的多肽中沒有改變）或可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。 多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
[0059] 術(shù)語"變體"意指在一個或多個（若干個）位置包含改變（即，一個或多個（若干 個）氨基酸殘基取代、插入和/或缺失）的具有蛋白酶活性的多肽。取代意指將占據(jù)某個 位置的氨基酸替換為不同的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)某個位置的氨基酸；并且插入意指 鄰近占據(jù)某個位置的氨基酸添加1-3個氨基酸。
[0060] 術(shù)語"清潔組合物"和"清潔配制品"是指用于從有待清潔的物品上除去不希望的 化合物的組合物，這些物品是例如織物、地毯、餐具（包括玻璃器皿）、接觸鏡、硬表面（例如 瓷磚、鋅（zincs)、地板和桌面）、頭發(fā)（香波）、皮膚（肥皂和面霜）、牙齒（漱口劑、牙膏） 等。這些術(shù)語涵蓋針對具體類型的所希望的清潔組合物和產(chǎn)品的形式（例如，液體、凝膠、 顆?；驀婌F組合物）所選的任何材料/化合物，只要該組合物與用于該組合物中的金屬蛋 白酶以及其他一種或多種酶可相容即可。通過考慮有待清潔的表面、物品或織物，以及針對 使用過程中的清潔條件的組合物的所希望的形式而容易地具體選擇清潔組合物材料。這些 術(shù)語進(jìn)一步是指適于清潔、漂白、消毒、和/或滅菌任何物品和/或表面的任何組合物。其 意圖是，這些術(shù)語包括但不限于洗滌劑組合物（例如，液體和/或固體衣物洗滌劑和精細(xì)織 物洗滌劑；硬表面清潔配制品，如用于玻璃、木材、陶瓷和金屬臺面以及窗戶；地毯清潔劑； 爐灶清潔劑；織物清新劑；織物柔軟劑；和紡織品和衣物預(yù)去污劑，以及餐具洗滌劑）。
[0061] 除非另有說明，術(shù)語"洗滌劑組合物"包括顆粒狀或粉狀的全效或重垢清洗劑，尤 其是清潔洗滌劑；液體、凝膠或糊狀的全效清洗劑，尤其是所謂的重垢液（HDL)類型；液體 細(xì)薄織物洗滌劑；手洗餐具清洗劑或輕垢