專利名稱：粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶蛋白編碼序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及檢測樣品中是否存在粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶基因核苷酸序列 的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結合。較佳地，該 樣品是PCR擴增后的產物，其中PCR擴增引物對應于粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶基因核 苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
本發(fā)明的粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶基因核苷酸全長序列或其片段通?？梢?用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發(fā)明所公開的有 關核苷酸序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制 備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR 擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。 —旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可通過化學合成將突變弓|入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術，通過直接合成肽而加以生產(Stewart等人，(1969) Solid-Phase P印tide Synthesis, WH Freeman Co.，SanFrancisco ;Merrifield J. (1963) J. Am Chem. Soc 85:2149-2154)。在體外合成蛋白質可以用手工或自動進行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(FosterCity，CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學方法加以連接以產生全長的分子。 利用本發(fā)明的粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶相關發(fā)生相互作用的物質，或者受體、抑制劑或拮劑等。
本發(fā)明在提高粘毛黃芩黃酮類化合物含量上具有明顯的作用。提高該化合物的產量，以滿足全世界對黃芩苷等藥物的巨大需求。因此，本發(fā)明具有很大的應用價值。
具體實施例方式
下面結合實驗室具體的試驗數據和結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等《分子克隆實驗室手冊》(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。 實施例1 粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶的克隆
1.組織分離(isolation) 粘毛黃吝從山西大學購買，將種子播種于溫室中，待粘毛黃吝苗長至10cm高時，
準備抽取DNA或RNA。 2. RNA的分離(RNA isolation) 取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1. 5mL EP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻槳器內。勻槳后移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(TRIzol Reagents,GIBC0 BRL，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量，然后在分光光度計上測定RNA含量。
3.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA) 根據各種植物的二氫黃酮醇4-還原酶基因的核苷酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(Clontech試劑盒)進行cDNA全長克隆，分三個階段進行
(1)核心片斷的克隆 PCR[BPOOl [5， _GA (T/C) CC (T/C) GAGAATGA (G/A) GT (G/A) AT (T/A/C)AA-3 ， ] +BP002 [5 ，-TC(C/T)A(G/A/C)ATG(T/C/G)ACA(T/A)A(C/T)TG(C/A/T)CCTTG-3 ，]]得到416bp的核心片斷，回收后連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye， Perkin-Elmer， USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結果用GCG軟件包(Wisconsin group, USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數據庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知黃芩的DFR基因的同源性很高，故初步認為它是一個二氫黃酮醇4-還原酶基因。
(2)3， -RACE第一輪PCR[AP+BP003 (5， -AATCTTGGCTGAGAAAGCAGCA-3')]連同第二輪PCR[AP+BP004(5' -CCCACCTAGCTTGATCACTGCA-3')]得到757bp 3，端序列，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye， Perkin-Elmer， USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer， USA)上進行測序。測序結果用GCG軟件包(Wisconsin group, USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數據庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與黃芩的DFR基因的同源性很高，故初步認為它是一個二氫黃酮醇4-還原酶基因。
(3)5， -RACE 第 一 輪PCR[UMP+BP005 (5， -TCCAGGTCACTCCAACTGGTTTC-3 ，)]連同第二輪PCR[(NUP+BP006(5' -CATCCCCTCAACCGTTGGCTTG-3')]得到201457bp 5，端序列，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye ，Perkin-Elmer， USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer， USA)上進行測序。測序結果用GCG軟件包(Wisconsin group, USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數據庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與白蘇的DFR基因的同源性很高，故初步認為它是一個二氫黃酮醇4-還原酶基因。 將測序結果的重疊區(qū)拼接，得到全長片段序列信息，并設計一對特異引物進行PCR擴增DFR編碼區(qū)(BP007F1 (5，-ATGCCTTTGGTAACCACCATGG_3，) +BP007R1 (5 ，-TCTGAGAAGTCGATCGAGGTGT-3'))得到DFR的編碼區(qū)(777bp)。 BLAST的結果證明從粘毛黃芩中新得到的基因確為一個二氫黃酮醇4_還原酶基因。由于已知的同源二氫黃酮醇4-還原酶基因具有將二氫黃酮醇還原生成無色花色素的功能，故推測此基因具有相同的功能。 通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶的全長編碼序列。在拼接得到全長(包含完整的開放讀框)的基礎上，進一步設計引物BP008F1 :5， -ACGCGGGGACAATCCTTGGCAT-3' (SEQ ID NO. 1)為正向引物，BP009 Rl :5， -AATCCCAACGCAGCACTTACAT-3' (SEQ ID NO. 2)為反向引物，以總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，F(xiàn)1/R2的PCR條件為94。C預變性2min ;然后94變性45s、55退火45s、72延伸2min ;30個循環(huán)；最后72延伸lOmin ;電泳檢測PCR產物，獲得擴增片斷長度為1283bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴增產物進行克隆，測序，獲得SEQ IDNO. 3所示的序列。
實施例2 粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶基因序列信息與同源性分析 本發(fā)明新的二氫黃酮醇4-還原酶基因序列全長cDNA的長度為1283bp，詳細序列見SEQ ID NO. 3，其中開放讀框位于90-866位核苷酸(777個核苷酸)。根據全長cDNA推導出粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶氨基酸序列，共259個氨基酸殘基，分子量為28. 59kDa，等電點(PI)為6. 18。詳細序列見SEQ ID NO. 4。 將粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶基因基因相關的全長cDNA序列及其編碼蛋白質用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數據庫中進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發(fā)現(xiàn)它與白蘇二氫黃酮醇4-還原酶基因基因序列在核苷酸水平上具有84%的相同性(附表2);在氨基酸水平上，它與白蘇二氫黃酮醇4-還原酶基因DFR在蛋白水平上具有81 %的相同性，(附表3)。由此可見，粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶基因與白蘇二氫黃酮醇4-還原酶基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，故可以認為粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶在黃酮類化合物生物合成途徑上也具有相似的作用。
實施例3 粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶蛋白或多肽在粘毛黃芩中進行真核細胞表達及轉基因植株中黃芩苷含量的檢測。 含目的基因的表達載體的構建，根據粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶基因編碼序列(SEQ ID N0.3)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增后，將粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶基因cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進一步克隆到雙元表達載體(如pBI121和改進的pCAMBIA1304)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達載體，再將其轉入農桿菌中，利用葉盤法技術轉化粘毛黃芩。 1.發(fā)苗采取粘毛黃芩成熟的種子，用0. 1 % (M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡5分鐘，用無菌水沖洗6次；將粘毛黃芩種子接種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基盛于150ml的三角瓶中，于12rC滅菌20分鐘)，該培養(yǎng)基配方為MS基本培養(yǎng)基，添加30g *L—1蔗糖，調節(jié)培養(yǎng)基pH值為5.8，再添加5X瓊脂粉。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)粘毛黃芩的幼芽，培養(yǎng)條件為25t:，黑暗條件下培養(yǎng)。待種子萌動后，改變培養(yǎng)條件為25t:，12小時光照，光照強度為25 ii mol m—2 s—、等到植株片長到3cm高時可用于遺傳轉化。 2.轉化共培養(yǎng)將粘毛黃芩無菌苗的幼嫩葉片用小刀片削成約lcm2放入事先培養(yǎng)好的菌液中(OD值0. 4-0. 6)侵染3-5分鐘。接著取出放入共培養(yǎng)基暗培養(yǎng)2天。
3.除菌培養(yǎng)共培養(yǎng)結束后，將外植體放入除菌培養(yǎng)基培養(yǎng)。4周繼代一次。待除菌培養(yǎng)結束后，轉入抗性篩選培養(yǎng)基進行轉基因毛狀根初步篩選。
除菌培養(yǎng)基MS+cb (250mg L—0
篩選培養(yǎng)基MS+hygr (30mg L—" 4.毛狀根的離體培養(yǎng)當毛狀根長至大約4cm長時切下，在不含任何植物激素的MS培養(yǎng)基上于25±1. (TC無光照的恒溫培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。每三周繼代一次，經過幾次繼代培養(yǎng)后可進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，以進一步進行分子檢測。
5.轉基因粘毛黃芩的分子檢測 毛狀根DNA的提取和純化均參照《分子克隆實驗指南》(Sambrook，J. et al 1993)
根據Fumer等的Ri質?；蛐蛄蟹治鲈O計rolB、rolC基因的特異性引物。rolB基因的一
對引物為5' -GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3'和5' -GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3' 。 rolC基因的
一對引物為5' -CTCCTGACATCAAACTCGTC-3'和5' -TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3， 。 rolB、rolC
基因的片段大小分別423bp和626bp。同時對基因進行PCR檢測。 6. 二氫黃酮醇4-還原酶在粘毛黃吝毛狀根中的northern blot分析 l)RNA的提取利用TRIzol試劑盒(GIBC0 BRL， USA)提取并參考《分子克隆實驗
指南》有關RNA的制備章節(jié)(Sambrook等，1989)提取粘毛黃芩轉基因毛狀根各個單克隆的
RNA。 2)RNA的定量參考《分子克隆實驗指南》(Sambrook等，1989)，分光光度計測0D26。 ；RNA含量計算1 0D26。 = 40 ii g m1—1。
3)總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離①取6ml 25 X (倍)電泳緩沖液，加入117ml無菌水，混勻。②稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉入55t:水浴中。③于通風櫥中取26. 8ml甲醛，加入到55t:的凝膠溶液中，混勻。④迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。⑤將提取的RNA (20 ii g)溶解于RNA變性溶液中，在65 °C下加熱IO分鐘，然后立即放在冰上。⑥在樣品中加入2ul IOX上樣緩沖液，混勻。⑦在電泳液未蓋過膠的條件下點樣，5V/cm電壓電泳5小時左右。 4) RNA尼龍膜上轉移①轉移之前，將尼龍膜用10 X SSC浸泡。②將濕潤的膜準確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2XSSC溶液中濕潤，蓋在膜上，排除氣泡。③濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉移12-20小時。④轉移后，將膜于8(TC烘烤2小時。 5)膜上雜交信號的檢出①將膜浸在5XDendart， s，O. 1% SDS，O. lmg m1—1鮭
魚精DNA，65。C下預雜交2小時。②將用Gene Images Contents CDP-Star labelling
module標記的探針在沸水中變性5分鐘，直接加入①的雜交液中，于65。C雜交16-24小時。
③取出膜，置于洗膜液I(1XSSC，1XSDS)中，于65t:漂洗3次，每次15分鐘。轉入洗膜液
11(0. 1XSSC，1% SDS)中于65t:漂洗3次，每次15分鐘。 用X光片壓片60-90分鐘，然
后顯影、定影(方法參照Roche DIG labeled試劑盒說明書)。 7.轉二氫黃酮醇4-還原酶的粘毛黃芩毛狀根黃芩苷的HPLC分析 黃芩苷的提取將培養(yǎng)30d的單克隆毛狀根洗凈，用吸水紙吸干水分，稱鮮重后冷
凍干燥30h至恒重，研磨成粉，稱取100mg干粉加入10mL甲醇超聲破碎20min，過濾，再提取
一次，合并濾液，將甲醇提取液濃縮蒸干，用甲醇定容至lOrnl， _20°〇保存，作為供試樣品溶
液，可用于HPLC分析。 高壓液相檢測標準品的制備精密稱取2mg黃芩苷標準對照品，用色譜純甲醇溶解過濾，配成濃度為1000 ii g mL—、分別梯度稀釋成280、140、70、35、17. 5ii g mL—、在相
應的色譜條件下進樣，且每一濃度進樣三次，記錄圖譜及色譜參數，分別以峰面積對進樣量回歸分析，得對照品的線性回歸方程和標準曲線。 高壓液相檢測條件色譜柱為Symmetry-C18柱(4. 6mmX 150mm， 5 y m)，流動相甲
醇0. 2mo1 L—1磷酸二氫鈉溶液(45 : 55)，流速0. 8mL min—、柱溫25°C 。檢測波長
280nm。黃吝苷大約在7. 7min處出峰。 序列表 〈110>西南大學 〈120〉粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶蛋白編碼序列
〈140〉
〈141〉
〈160>4 〈170>PatentIn version 3. 1
〈210>1
〈211>22bp
〈212>DNA 〈213>粘毛黃吝(Scutellaria viscidula B皿ge)
〈400>1ACGCGGGGACAATCCTTGGCAT 〈210>2 〈211>22bp 〈212>DNA 〈213>粘毛黃吝(Scutellaria viscidula B皿ge) 〈400>2 AATCCCAACGCAGCACTTACAT 〈210>3 〈211>1283 〈212>DNA 〈213>粘毛黃吝(Scutellaria viscidula B皿ge) 〈220>1 〈221>CDS 〈222>(90). (866) 〈223〉 〈400>3
AC 2 GCG GGG ACA ATC CTT GGC ATT GGT TCA AAC TTG TCT TAA MT TTA ATA TAT AGTTCC AAT 62 CCA ACC CM ATA TCT CAC TTC CTA AAC ATG CCT TTG GTA ACC ACC ATG GCC ATGCCA CCT 122 Met Pro Leu Val Thr Thr Met Ala Met
Pro Pro 1 5
10 CCA GCC ACG ACA GTA TGT GTC ACC GGA GCA TCT GGC TTC ATC GGC TCA TGG CTCGTC ATG 182 Pro Ala Thr Thr Val Cys Val Thr Gly Ala Ser Gly Phe lie Gly Ser Trp LeuVal Met 15 20 25
30 AGA CTC CTC CAG CAT GGT TAT ATT GTT CGT GCA ACT GTT CGT GAT CCT GGG MCATG GAG 242 Arg Leu Leu Gin His Gly Tyr lie Val Arg Ala Thr Val Arg Asp Pro Gly AsnMet Glu 35 40 45
50
MG GTGAMCACCTA ACGGAA CTG CCA CMGCA GACACA MG TTG ACACTG TGG
AAG GCA302Lys ValLysHisLeu ThrGlu Leu Pro GinAla AspThr Lys Leu ThrLeu Trp
Lys Ala556065
70GAT ATGAGCATACM GGAAGC TAC GAC AMGCA GTACAA GGT TGT GMGGG GTG
TTT CAC362Asp MetSerlieGin GlySer Tyr Asp LysAla ValGin Gly Cys GluGly Val
Phe His758085
90ATG GCCACACCTATG GATTTC GM TCC AATGAT CCTGAG MT GM GTGATC MG
CCA ACG422Met AlaThrProMet AspPhe Glu Ser AsnAsp ProGlu Asn Glu Vallie Lys
Pro Thr95100105
110GTT GAGGGGATGTTG MCATC ATA AGA TCATGT GCCMA GCC AM ACTGTG MG
AAA TTG482Val GluGlyMetLeu Asnlie lie Arg SerCys AlaLys Ala Lys ThrVal Lys
Lys Leu115120125
130ATA TTCACAACCTCA GCAGGG ACA CTG AATGTT GAAGAA CAC CAG AMCCA GTT
TAT GAT542lie PheThrThrSer AlaGly Thr Leu AsnVal GluGlu His Gin LysPro Val
Tyr Asp135140145
150GAA ACCAGTTGGAGT GACCTG GAT TTC ATTTAC TCCMG AM ATG ACTGGA TGG
ATA TAT602Glu ThrSerTrpSer AspLeu Asp Phe lieTyr SerLys Lys Met ThrGly Trp
lie Tyr155160165
170TTT TTGTCTAMATC TTGGCT GAG AM GCAGCA ATGGAA GCA ACT AMGAG MT
AAT ATC662Phe LeuSerLyslie LeuAla Glu Lys AlaAla MetGlu Ala Thr LysGlu AsnAsn lie175180185
190MC TTAATTACTGTC ATACCA CCTCTA GTGGTT GGTCCATTC ATC ATGCCC ACC
CTC CCA722Asn LeulieThrValliePro ProLeu ValVal GlyProPhe lie MetPro Thr
Leu Pro195200205
210CCT AGCTTGATCACTGCACTT TCCCCC ATTACT GGGMTGAA GCC CACTAT TTA
CTA TCA782Pro SerLeulieThr AlaLeu SerPro lieThr GlyAsnGlu Ala HisTyr Leu
Leu Ser215220225
230GGA TTCAGTGACAGTCACTCT CMGGG ACAAGA ACTGGAGCT GM AMGAT TCT
TAC AAT842Gly PheSerAspSerHisSer Gin Gly ThrArg ThrGlyAla Glu LysAsp Ser
Tyr Asn235240245
250CTA CACCTCGATCGACTTCTC AGATM CCATCT CGTTGGMC AAT TCCTCA MC
AGT TGG902Leu HisLeuAspArgLeuLeu Arg:氺265TGA GCTGMATCCCTGTATTT TCTCM CCTCTC CCACAATGC TCT CTCTGG CCA
CAT CCC962ATC ATCGATAGGAMTCTACA GMGCT CGAGTC ATTGGATCT CTC ACTCM CAG
TCT CGA1022CGG AGAAATCCCGAGGCAGCT TGCAAG CCTCAC GTTCCTCTC ATT CTTGAA CGT
GTC TTA1082CAA CCATCTTGTTGGGAGGAT CCCAGA AGGGAG CCAMTCCA GAC ATTTCC AGA
GAG TTC1142CTT CATCGGAMCGAGGGGCT TTGTGG GTTTCC TTTGAACM AAC CTGCAA TGG
CAC TGG1202MC ATCATCATCATCGTCATC GCCGGA GTTTCC ACGGGGGM GTT GGAGGG AGA
GAT ATA1262TGTA AGTG CTGCG TTGGGATT
1283
〈210>4〈211>259〈212>PRT〈213>粘毛黃吝(Scutellaria viscidula B皿ge)
〈400>4Met Pro Leu ValThr Thr Met Ala Met Pro Pro Pro Ala Thr Thr Val Cys Val
Thr GlyAla15 10 15
20Ser Gly Phe lieGly Ser Trp Leu Val Met Arg Leu Leu Gin His Gly Tyr lie
Val ArgAla25 30 35
40Thr Val Arg AspPro Gly Asn Met Glu Lys Val Lys His Leu Thr Glu Leu Pro
Gin AlaAsp4550 55
60Thr Lys Leu ThrLeu Trp Lys Ala Asp Met Ser lie Gin Gly Ser Tyr Asp Lys
Ala ValGin657075 80Gly Cys Glu GlyVal Phe His Met Ala Thr Pro Met Asp Phe Glu Ser Asn Asp
Pro GluAsn8590 95 100
105Glu Val lie LysPro Thr Val Glu Gly Met Leu Asn lie lie Arg Ser Cys Ala
Lys AlaLys110115 120
125Thr Val Lys LysLeu lie Phe Thr Thr Ser Ala Gly Thr Leu Asn Val Glu Glu
His GinLys130 135 140
145Pro Val Tyr AspGlu Thr Ser Trp Ser Asp Leu Asp Phe lie Tyr Ser Lys Lys
Met ThrGly150155 160
165Trp lie Tyr PheLeu Ser Lys lie Leu Ala Glu Lys Ala Ala Met Glu Ala Thr
Lys GluAsn170175 180 185
15
Asn lie Asn Leu lie Thr Val lie Pro Pro Leu Val Val Gly Pro Phe lie Met Pro Thr Leu 190 195 200 205
210 Pro Pro Ser Leu lie Thr Ala Leu Ser Pro lie Thr Gly Asn Glu Ala His Tyr Leu Leu Ser 215 220 225
230 Gly Phe Ser Asp Ser His Ser Gin Gly Thr Arg Thr Gly Ala Glu Lys Asp Ser Tyr Asn Leu 235 240 245
250 His Leu Asp Arg Leu Leu Arg *
25權利要求
一種粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶蛋白編碼序列，編碼具有二氫黃酮醇4-還原酶活性的多肽的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列由SEQ ID NO.3中從核苷酸第54-752位的核苷酸序列或其簡并序列構成。
2. 根據權利要求1所述的粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶蛋白編碼序列，其特征是，所 述簡并序列是指位于SEQ ID N0.3序列的編碼框第54-752位核苷酸中，有一個或多個密碼 子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。
3. 根據權利要求1或2所述的粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶蛋白編碼序列，其特征 是，具有SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列的多肽。
4. 根據權利要求3所述的粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶蛋白編碼序列轉化的宿主細 胞，其特征是，所述宿主細胞是真核細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種粘毛黃芩二氫黃酮醇4-還原酶蛋白編碼序列，屬于基因工程領域。其核苷酸序列由SEQ ID NO.3中從核苷酸第54-752位的核苷酸序列或其簡并序列構成，具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明對提高粘毛黃芩植物體中黃芩苷等黃酮類化合物含量具有明顯的作用，本發(fā)明具有很大的應用價值。
文檔編號C12N5/10GK101712962SQ20091010363
公開日2010年5月26日 申請日期2009年4月17日 優(yōu)先權日2009年4月17日
發(fā)明者孫敏, 雷桅 申請人:西南大學