從漆樹木粉中提取具有抗氧化活性的黃顏木素和3,4’,7-三羥基二氫黃酮醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及從漆樹木粉中提取具有抗氧化活性的黃顏木素和3,4'，7-=徑基二氨 黃酬醇的方法，屬于天然藥物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 漆樹是中國重要的特用經(jīng)濟(jì)林，目前國內(nèi)學(xué)者對漆樹栽培、生漆涂料、漆酪、漆蠟 等方面進(jìn)行了大量的研究。對漆樹枝啞莖材中的主要活性成分，國內(nèi)研究較少。韓國學(xué)者對 漆樹的化學(xué)成分和生物活性進(jìn)行了詳細(xì)地研究，Park等采用多次硅膠柱層析從漆樹木材中 分離得到硫黃菊素、漆黃素、黃顏木素、和3,4,3'，4'，7-五徑基黃燒。Kim等采用XAD-2D、娃 膠柱和ODS反向硅膠柱對漆樹木材的乙酸乙醋萃取部位進(jìn)行分離，得到黃顏木素、沒食子 酸和漆黃素。Kang等從漆樹皮中分離得到具有抗病毒作用的黃顏木素、漆黃素、硫黃菊素和 紫馴花素四種黃酬化合物。黃酬的分離絕大多數(shù)采用硅膠柱層析，由于化合物在溶解性上 存在很大差異，根據(jù)相似相溶原理，采用極性較小的洗脫體系，如不同的石油酸或乙酸與乙 酸乙醋比例洗脫極性由小大到的化合物，再逐漸增加洗脫體系的極性，如氯仿與甲醇的不 同洗脫比例。但是一些極性與分子結(jié)構(gòu)相似的化合物很難通過硅膠柱層析直接獲取，往往 需要與其它的分離手段進(jìn)行協(xié)同，如制備型高效液相色譜(Pre-HPLC)。Pre-HPLC具有準(zhǔn)備 確度高，分離速度快，能夠使用反相C18色譜柱，大大地提高了多酪類化合物的分離度，但是 其處理樣品量較小。中低壓分離色譜(MPLC)，具有上樣量大，高效，快速等優(yōu)點(diǎn)，是新型的分 離純化技術(shù)，廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物、食品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域。 我國是漆樹的原產(chǎn)地，主要集中在陜西、四川、重慶、湖北、貴州、甘肅和云南屯個省，在 鎮(zhèn)雄、大方、畢節(jié)、赫章、北川、恩施等60多個縣建立了漆樹產(chǎn)業(yè)化種植基地，種植面積達(dá) 100萬hm2,栽種漆樹達(dá)150,000萬株。但是目前漆樹的產(chǎn)業(yè)主要集中在天然生漆涂料的生 產(chǎn)及開發(fā)，在漆巧的利用方面也比較薄弱，另外在漆樹生長、利用過程中，大量的枝啞莖材 未得到利用，為了擴(kuò)大漆樹產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；由炱針滟Y源的產(chǎn)業(yè)鏈，因此開展漆樹多酪中具 有抗氧化活性化合物的提取和制備研究，對于漆樹資源的開發(fā)利用具有指導(dǎo)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，發(fā)明了從漆樹木粉中提取具有抗氧化活性的黃顏木素和3,4'， 7-=徑基二氨黃酬醇的方法，其特征在于由W下步驟組成： 第一步 將漆樹木粉，干燥去渣，按質(zhì)量體積比為1:10~1:30(g:mU，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50~95%的 乙醇或甲醇水溶液，減壓回流提取2~3次，每次^化，過濾，濾液合并，于40~60°C下減壓蒸發(fā) 除去溶劑，得到含水粗提液； 第二步 粗提液按質(zhì)量比1:3~l:10(g:mL)加入蒸饋水，攬拌溶解，加入石油酸萃取^5次，分離， 在40~60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到石油酸萃取物；水層繼續(xù)用乙酸乙醋萃取I~5次，分 離，在40~60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥得到乙酸乙醋萃取物； 第=步 將乙酸乙醋萃取物與硅膠填料按質(zhì)量比1:15-50吸附，柱長50-150 cm,柱直徑4-20 cm,采用不同比例石油酸與乙酸乙醋進(jìn)行洗脫，收集抗氧化活性較高的石油酸：乙酸乙醋體 積比為7:3-3:7(巾:巾)的部位，真空濃縮，回收溶劑，得到富含黃顏木素和3,4'，7-^徑基二 氨黃酬醇的提取物； 第四步 將富含黃顏木素和3，4 '，7-=徑基二氨黃酬醇的提取物與中低壓色譜填料按質(zhì)量比1: 15-50吸附，中壓柱柱長20-80 cm,柱直徑2-8 cm,采用不同比例的洗脫劑進(jìn)行洗脫，柱壓為 0.5-10 MPa,檢測波長220-280 nm，流速3-50 mL/min，分別收集黃顏木素和3,4'，7-S徑 基二氨黃酬醇部位，真空濃縮，回收溶劑，得到黃顏木素和3，4 '，7-=徑基二氨黃酬醇樣品， 將黃顏木素和3，4 '，7-=徑基二氨黃酬醇進(jìn)行HPLC分析，含量為95% W上； 第五步 將黃顏木素和3，4 '，7-S徑基二氨黃酬醇進(jìn)行體外抗氧化活性測試，黃顏木素清除 DPPH自由基的ICso值為19.54mg/L，清除ABTS自由基的ICso值為25.45mg/L，清除徑自由基的 ICso值為52.97 mg/L，5~50mg/L黃顏木素的總還原力為0.175~1.108,鐵離子還原力為53~ 260皿ol/L; 3，4'，7-S徑基二氨黃酬醇清除DPPH自由基的IC50值為28.97mg/L，清除ABTS 自由基的ICso值為27.58mg/L，清除徑自由基的IC50值為57.68 mg/L，5~50mg/L3，4'，7-S 徑基二氨黃酬醇的總還原力為0.177~0.875，鐵離子還原力為31~144皿ol/L。 本專利采用的中低壓色譜填料為孔徑為60 A，20-60 ym的ODS C18、C8和S邱hedex LH-20材料中的一種，洗脫劑為甲醇、乙醇和體積比0.5%-2%(v:v)的醋酸水中的一種或幾種的 混合溶液。 本專利采用HPLC分析黃顏木素和3，4 '，7-S徑基二氨黃酬醇的主要含量，其HPLC分析 條件為:4.6 X 250mm, 5皿的C18 Gold AQ反相柱，流動相為體積比為40:60(v:v)的甲 醇:體積比〇.5-l%(v/v)醋酸水溶液，紫外檢測器，檢測波長為280 nm,流速為ImL/min。 本方法中采用醇溶液進(jìn)行提取，經(jīng)過萃取，硅膠柱層析與中低壓柱色譜分離得到黃顏 木素和3,4'，7-S徑基二氨黃酬醇，并經(jīng)過MS、IR、1H-NMR和13C-NMR進(jìn)行證實(shí)，兩者的結(jié)構(gòu) 為。 本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明所提供的從漆樹木粉中提取具有抗氧化活性的黃顏木素和3,4'，7-=徑基二氨 黃酬醇的方法，還具有W下特點(diǎn)： (1) 本發(fā)明采用負(fù)壓提取方法，可W有效地防止具有抗氧化活性的黃酬化合物的分解， 大大地提局提取得率； (2) 本發(fā)明采用硅膠柱和中低壓色譜制備，可W快速有效地得到黃顏木素和3,4'，7-= 徑基二氨黃酬醇； (3) 本發(fā)明工藝操作簡單，易實(shí)施，產(chǎn)品色淺，純度高； (4) 漆樹多酪提取物具有顯著的抗氧化作用，能夠用于多種由于氧化應(yīng)激引起的疾病。
【附圖說明】
[0004] 圖1黃顏木素(a)和3,4'，7-S徑基二氨黃酬醇(b)的HPLC色譜圖； 圖2黃顏木素和3,4'，7-S徑基二氨黃酬醇對DPKl自由基的清除作用； 圖3黃顏木素和3,4'，7-=徑基二氨黃酬醇對ABTS自由基的清除作用； 圖4黃顏木素和3,4'，7-=徑基二氨黃酬醇對徑自由基的清除作用。
【具體實(shí)施方式】
[0005] W下實(shí)施例為本發(fā)明的一些舉例，不應(yīng)被看做是對本發(fā)明的限定。 實(shí)施例1 第一步 將漆樹木粉，干燥去渣，按質(zhì)量體積比為1:10~1:30(g:mU，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50~95%的 乙醇水溶液，減壓回流提取2~3次，每次1~化，過濾，濾液合并，于40~60°C下減壓蒸發(fā)除去溶 劑，得到含水粗提液； 第二步 粗提液按質(zhì)量比1:3~l:10(g:mL)加入蒸饋水，攬拌溶解，加入石油酸萃取^5次，分離， 在40~60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到石油酸萃取物；水層繼續(xù)用乙酸乙醋萃取1~5次，分 離，在40~60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥得到乙酸乙醋萃取物； 第=步 將乙酸乙醋萃取物與硅膠填料按質(zhì)量比1:15-50吸附，柱長50-150 cm,柱直徑4-20 cm,采用不同比例石油酸與乙酸乙醋進(jìn)行洗脫，收集抗氧化活性較高的石油酸：乙酸乙醋體 積比為7:3-3:7(巾:巾)的部位，真空濃縮，回收溶劑，得到富含黃顏木素和3,4'，7-^徑基二 氨黃酬醇的提取物； 第四步 將富含黃顏木素和3,4'，7-=徑基二氨黃酬醇的提取物與中低壓色譜填料60 A,20-60 ym的ODS C18按質(zhì)量比1:15-50吸附，中壓柱柱長20-80 cm,柱直徑2-8 cm,采用體積比為 0.5:9.5~5:5的甲醇和體積比0.5%-2%(V: V)的醋酸水進(jìn)行洗脫，柱壓為0.5-10 MPa，檢測 波長220皿，流速3-50 mL/min，分別收集黃顏木素和3,4'，7-S徑基二氨黃