專(zhuān)利名稱(chēng)：：輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶及編碼該酶的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新型的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶(以下有時(shí)記為"GLD")、編碼該酶的多核苦酸、其獲耳又方法、該GLD的制備方法、及此GLD的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：血中葡萄糖量是糖尿病的重要標(biāo)志。糖尿病的檢查，除在醫(yī)院檢查室等中進(jìn)行的臨床檢查之外，還可以進(jìn)行由診斷人員等進(jìn)行的簡(jiǎn)易一企查或由患者自己進(jìn)行的自4全查等簡(jiǎn)易測(cè)定(Point-of-CareTesting:POCT)。此簡(jiǎn)易測(cè)定可以通過(guò)葡萄糖診斷試劑盒或生物傳感器等測(cè)定裝置(POCT裝置)進(jìn)行，目前，上述POCT裝置中開(kāi)始使用葡萄糖氧化酶。但是，葡萄糖氧化酶受溶存氧濃度的影響，使測(cè)量值產(chǎn)生誤差，因此，推薦使用不受氧影響的葡萄糖脫氫酶。葡萄糖脫氫酶包括以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)為輔酶的NAD輔酶非結(jié)合型葡萄糖脫氬酶、和以吡咯喹啉醌(PQQ)、黃素腺噤呤二核苷酸(FAD)等為輔酶的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶，輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氬酶與NAD輔酶非結(jié)合型葡萄糖脫氳酶相比，不易受雜質(zhì)的影響，測(cè)定感度高，并且從原理上看具有可以廉價(jià)地制備POCT裝置的優(yōu)點(diǎn)。但是，現(xiàn)有的吡咯喹啉醌(PQQ)型葡萄糖脫氫酶具有穩(wěn)定性低、并且也與麥芽糖或半乳糖反應(yīng)的缺點(diǎn)。麥芽糖是用于輸液的糖，如果PQQ葡萄糖脫氬酶與麥芽糖反應(yīng)，則血糖POCT裝置顯示比實(shí)際高的血糖值。因此，導(dǎo)致患者進(jìn)行了不必要的胰島素注射，結(jié)果發(fā)生陷入意識(shí)障礙或昏睡狀態(tài)等低血糖事故，造成嚴(yán)重問(wèn)題。特別指出的是，現(xiàn)在的血糖POCT裝置的應(yīng)用主要是簡(jiǎn)單地測(cè)定血糖，進(jìn)而由于作為患者自我管理及治療的一種方法的重要性提高，因此使用的自我監(jiān)測(cè)血糖裝置(Self-MonitoringofBloodGlucose:SMBG)向家庭中的普及迅速擴(kuò)大，所以對(duì)測(cè)定精度的要求非常高。目前，2005年2月日本衛(wèi)生勞動(dòng)部發(fā)出通知，要求對(duì)正注射麥芽糖輸液的患者^(guò)f吏用利用了以PQQ作為輔酶的酶的血糖測(cè)定器時(shí)，加以注意(2005年2月7日；藥食安發(fā)第0207005號(hào)等)。另一方面，作為催化葡萄糖脫氫反應(yīng)、以FAD為輔酶的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶，已報(bào)道有來(lái)自根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)(J.Biol.Chem.(1967)242:3665-3672)、來(lái)自海黃謹(jǐn)纖維菌(Cytophagamarinoflava)(Appl.Biochem.Biotechnol.(1996)56:301-310)、來(lái)自鹽單胞菌a畫(huà)15(Halomonassp.)(EnzymeMicrob.Technol.(1998)22:269-274)、來(lái)自雙孢蘑菇(Agaricusbispoms)(Arch.Microbiol.(1997)167:119-125、Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)51:58-64)及來(lái)自大環(huán)柄菇(Macrolepiotarhacodes)(Arch.Microbiol.(2001)176:178-186)的酶，但是，上述酶氧化葡萄糖的2位及/或3位的羥基，對(duì)麥芽糖的活性都很高，對(duì)葡萄糖的選擇性低。另外，也已知同樣對(duì)麥芽糖活性高、來(lái)自洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkhorderiacepacia)的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶，該酶的天然型酶是由a、p、y3種亞基構(gòu)成的雜寡聚物酶，為膜結(jié)合性酶。所以存在以下問(wèn)題為了得到酶，必須進(jìn)行可溶化處理，或者為了在克隆中呈現(xiàn)充分的活性必須同時(shí)克隆必要的亞基等。并且，根據(jù)日本生物工學(xué)會(huì)大會(huì)(2002年10月28日-30日)的報(bào)告，基質(zhì)特異性(對(duì)葡萄糖活性為100%時(shí)，對(duì)麥芽糖的活性、對(duì)半乳糖的活性)為SM4抹40%、105%、JCM5506抹43%、132%、JCM550抹57%、123%、JCM2800抹83%、108%、JCM2801抹74%、117%、IF014595抹38。/。、104%、IF015124抹74%、148%,據(jù)報(bào)告者所述，由于對(duì)麥芽糖的活性高，用于自我血糖監(jiān)測(cè)器時(shí)存在問(wèn)題，期望今后能改變序列，改良基質(zhì)特異性。針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明人等發(fā)明了一種以FAD為輔酶的、非膜結(jié)合型的新型可溶性輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶，并申請(qǐng)了專(zhuān)利(專(zhuān)利文獻(xiàn)l)。此專(zhuān)利文獻(xiàn)l的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶具有迄今為止沒(méi)有的優(yōu)異特性，即氧化葡萄糖的l位羥基，對(duì)葡萄糖的基質(zhì)識(shí)別性?xún)?yōu)異，不受溶存酶的影響，并且對(duì)麥芽糖的活性低(對(duì)葡萄糖活性為100%時(shí)，對(duì)麥芽糖活性為5%以下、對(duì)半乳糖活性也為5%以下)。但是，此專(zhuān)利文獻(xiàn)l的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶從野生的微生物(例如曲霉屬微生物等)的液體培養(yǎng)物中分離、萃取而獲得，其生產(chǎn)量有限。另外，酶生產(chǎn)量為極微量，且糖大量地與酶結(jié)合，被與通常的與酶結(jié)合的N型或O型糖鏈種類(lèi)不同的糖被覆，形成稱(chēng)為"糖包埋型酶"的狀態(tài)，由此難于檢出其活性(酶活性低)，不能通過(guò)酶或化學(xué)方法除去糖鏈，結(jié)果在電泳中，常用的蛋白質(zhì)染色方法(使用考馬斯亮蘭(CoomassieBrilliantBlue)G-250等)幾乎不能將其染色，也難以由常用的精制酶解讀為基因獲取所必要的信息的酶的氨基末端或內(nèi)部的氨基酸序列，目前為止尚無(wú)成功進(jìn)行酶基因克隆、確認(rèn)該酶活性表達(dá)的事例。關(guān)于來(lái)自米曲霉的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶，在1967年已提示過(guò)該酶的存在(非專(zhuān)利文獻(xiàn)l),但只闡明了其部分酶學(xué)性質(zhì)，雖然提示該酶具有不作用于麥芽糖的特性，但之后關(guān)于來(lái)自米曲霉的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的詳細(xì)報(bào)告，當(dāng)然也包括關(guān)于來(lái)自其他微生物的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的報(bào)告，未見(jiàn)對(duì)于氧化葡萄糖l位羥基的酶的繼續(xù)報(bào)道，關(guān)于輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列或基因也完全沒(méi)有報(bào)道。另夕卜，已知在葡萄糖測(cè)定中使用葡萄糖脫氫酶EC1.1.99.10的設(shè)想(參見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)15),但輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶不能按照實(shí)用的水平生產(chǎn)，實(shí)際上尚未達(dá)到用于傳感器而實(shí)用化的水平。推測(cè)其原因在于，該酶在菌體內(nèi)的活性微弱，即使分泌到菌體外其量也極其微小，并且被大量的糖所被覆，活性弱，連檢測(cè)都很困難，所以未能克隆出基因。另外，在使用葡萄糖氧化酶的傳感器中，葡萄糖測(cè)定時(shí)受到酶的糖鏈的影響，難以將來(lái)自霉菌的多糖鏈酶應(yīng)用于葡萄糖傳感器(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2),但通常已知與液體培養(yǎng)相比固體培養(yǎng)時(shí)糖鏈較多，在曲霉屬微生物的固體培養(yǎng)中產(chǎn)生的酶的糖含量與液體培養(yǎng)時(shí)相比增加(非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)等。因此，即使探討培養(yǎng)條件等，減少來(lái)自霉菌的葡萄糖脫氫酶的糖鏈，也難以用于葡萄糖傳感器，推測(cè)上述情況也是迄今為止輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶不能實(shí)用化的原因。目前，本申請(qǐng)人等也精制了來(lái)自土曲霉菌的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶，但該酶被大量的糖被覆，成為"阿拉伯半乳糖膠包埋型酶"的形態(tài)，由此在將其涂布在電極上、使其干燥制成固定化酶電極時(shí)，除產(chǎn)生干燥性差的問(wèn)題之外，還存在糖導(dǎo)致作為葡萄糖傳感器的反應(yīng)性降低的問(wèn)題。為了大量地生產(chǎn)酶等蛋白質(zhì)，已知有使用編碼蛋白質(zhì)的基因材料的基因工程學(xué)方法，已知有關(guān)于葡萄糖脫氫酶的基因工程學(xué)制備的專(zhuān)利文獻(xiàn)2~14的現(xiàn)有技術(shù)。上述現(xiàn)有技術(shù)，主要涉及PQQ葡萄糖脫氫酶的改變，提供了用于改良基質(zhì)特異性低或穩(wěn)定性低的現(xiàn)有PQQ葡萄糖脫氫酶缺點(diǎn)的修飾型PQQ葡萄糖脫氫酶和用于采用基因工程學(xué)方法制備該酶的修飾型基因材料。專(zhuān)利文獻(xiàn)l:WO2004/058958號(hào)說(shuō)明書(shū)專(zhuān)利文獻(xiàn)2:特開(kāi)2000-312588號(hào)/>才艮專(zhuān)利文獻(xiàn)3:特開(kāi)2000-350588號(hào)公才艮專(zhuān)利文獻(xiàn)4:特開(kāi)2000-354495號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)5:特開(kāi)2001-197888號(hào)7>才艮專(zhuān)利文獻(xiàn)6:特開(kāi)2001-346587號(hào)公才艮專(zhuān)利文獻(xiàn)7:特開(kāi)2001-37483號(hào)公才艮專(zhuān)利文獻(xiàn)8:特開(kāi)2004-173538號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)9:特開(kāi)2004-313172號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)10:特開(kāi)2004-313180號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)ll:特開(kāi)2004-344145號(hào)^H艮專(zhuān)利文獻(xiàn)12:特開(kāi)平10-243786號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)13:特表2004-512047號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)14:WO2002/072839號(hào)說(shuō)明書(shū)專(zhuān)利文獻(xiàn)15:特開(kāi)昭59-25700號(hào)公才艮非專(zhuān)利文獻(xiàn)l:Biochem.Biophys.Acta.，139,277-293,1967非專(zhuān)利文獻(xiàn)2:ApplEnvironMicrobiol.,64(4),1405—1411,1998非專(zhuān)利文獻(xiàn)3:Biosci.Biotechnol.Biochem.，62(10)，1938-1946，1998
發(fā)明內(nèi)容但是，目前的實(shí)際情況是使用修飾型基因材料制作的修飾型PQQ葡萄糖脫氫酶對(duì)葡萄糖的活性為100%時(shí)，對(duì)麥芽糖的活性依然較高，大約為10%以上，或使對(duì)麥芽糖的反應(yīng)性降低，結(jié)果導(dǎo)致原來(lái)的對(duì)葡萄糖的反應(yīng)性(比活性)也降低，如果在基質(zhì)為充分量的條件下采用電化學(xué)測(cè)定方法觀察活性，則作為葡萄糖傳感器的功能不充分，不能達(dá)到用于POCT裝置等的程度。另外，也存在下述問(wèn)題，即PQQ葡萄糖脫氫酶的活性表達(dá)所必需的輔酶PQQ,不能用通常廣泛用作重組宿主的大腸桿菌制作，必須限定于生產(chǎn)PQQ的宿主微生物(假單胞菌(Pseudomonas)等)制作重組體。本發(fā)明是鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題而完成的，其目的在于提供一種可解決附加在酶上的大量糖的問(wèn)題，并且具有對(duì)葡萄糖的反應(yīng)性、熱穩(wěn)定性、基質(zhì)識(shí)別性?xún)?yōu)異且對(duì)麥芽糖的活性低的優(yōu)異特性的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶及大量且簡(jiǎn)單地制備該酶的方法、編碼該酶的多核苷酸及其獲取方法、使用該酶的葡萄糖測(cè)定方法、葡萄糖測(cè)定試劑組合物、葡萄糖測(cè)定用生物傳感器。本發(fā)明人等認(rèn)為，為了產(chǎn)業(yè)上廣泛地利用輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶，除將附加在酶上的大量糖鏈減少至能夠用于葡萄糖測(cè)定的水平之外，還必須可按實(shí)用成本通過(guò)基因克隆大量生產(chǎn)不作用于麥芽糖的葡萄糖脫氫酶。另外，本發(fā)明人認(rèn)為，為了進(jìn)行基因克隆，解讀酶的氨基末端及內(nèi)部的氨基酸序列、獲得基因獲取所必須的信息是必不可少的，因此，將目前為止妨礙基因克隆獲得成功的、與通常N型、O型糖鏈不同的、包埋酶的大量糖除去，改善蛋白質(zhì)染色性，同時(shí)可以通過(guò)HPLC進(jìn)行分析是十分必要的，本發(fā)明人等全力以赴地研究一種精制酶的獲取，從該精制酶上除去了導(dǎo)致難以進(jìn)行蛋白質(zhì)染色及HPLC分析的、包埋酶的糖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)進(jìn)行固體培養(yǎng)，減少包埋目標(biāo)酶的糖，使其氨基酸序列明確，獲取基因。作為解決上述問(wèn)題的方法，本發(fā)明提供了一種編碼可溶性輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶(GLD)的多核香酸(以下，有時(shí)記為"GLD多核苷酸")，該輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的特征在于，在電子受體存在下催化葡萄糖脫氫反應(yīng)，相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下，優(yōu)選為3%以下，較優(yōu)選為2%以下。更具體而言，此多核苷酸為(A)—種GLD多核苷酸，其特征在于，所述GLD具有下述1)至4)的性質(zhì)。1)以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作為輔酶，2)亞基結(jié)構(gòu)為同二聚體(homodimer)，3)不以氧為電子受體，及4)相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下，優(yōu)選為3%以下，更優(yōu)選為2%以下。(B)—種GLD多核苷酸，其特征在于，所述GLD具有下述1)至3)的性質(zhì)。1)以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作為輔酶，2)不以氧為電子受體，及3)相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下，優(yōu)選為3%以下，更優(yōu)選為2%以下。(C)一種GLD多核苷酸，其特征在于，所述GLD具有下述1)至4)的性質(zhì)。1)以黃素腺噤呤二核苷酸(FAD)作為輔酶，2)不以氧為電子受體，3)相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下，優(yōu)選為3%以下，更優(yōu)選為2%以下，4)相對(duì)于每l昭蛋白質(zhì)，所含糖(半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖)的含量總和為80i!g以下，(D)—種GLD多核苷酸，其特征在于，所述GLD具有下述1)至4)的性質(zhì)。1)以黃素腺噪呤二核苷酸(FAD)作為輔酶，2)不以氧為電子受體，3)相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下，優(yōu)選為3%以下，更優(yōu)選為2%以下，4)每1單位(unit)酶活性，所含糖(半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖)的含量總和為40|ig以下。(E)—種多核苷酸，所述多核苷酸具有選自序列號(hào)5~7記載的、編碼輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的堿基序列的共有序列中的1種或2種以上的部分堿基序列，且編碼具有下述a~d性質(zhì)的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氬酶，a亞基分子量約63kDa,b輔酶FAD，c催化將葡萄糖的1位羥基氧化、將葡萄糖變?yōu)槠咸撬?5-內(nèi)酯的反應(yīng)，d相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下。其中，性質(zhì)a的亞基分子量是指，將來(lái)自原核細(xì)胞的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶用于聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)時(shí)測(cè)得的亞基分子量，為58kDa63kDa，其中，所述原核細(xì)胞插入了含有或不含信號(hào)肽的GLD多核苷酸。另外，與上述相同，用來(lái)自真核細(xì)胞的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶測(cè)定時(shí)，亞基分子量為58kDa150kDa。(F)—種編碼輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的多核苷酸，所述輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶具有選自序列號(hào)8~12記載的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶共有序列中的1種或2種以上的部分氨基酸序列，且具有下述a~d性質(zhì)，a亞基分子量約63kDa，b輔酶FAD,c催化將葡萄糖的1位羥基氧化，將葡萄糖變?yōu)槠咸撬?S-內(nèi)酯的反應(yīng)，d相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下，其中，性質(zhì)a的亞基分子量，是指將來(lái)自原核細(xì)胞的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶用于聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)時(shí)測(cè)得的亞基分子量，為58kDa63kDa，其中，所述原核細(xì)胞插入了含有或不含信號(hào)肽的GLD多核苷酸。另外，與上述相同，在用來(lái)自真核細(xì)胞的酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶測(cè)定時(shí)，亞基分子量為58kDa150kDa。由該GLD多核苷酸編碼的GLD，是具有下述物理化學(xué)性質(zhì)的酶，即以黃素化合物(黃素腺嘌呤二核苷酸)為輔酶，在電子受體存在下催化葡萄糖1位羥基氧化反應(yīng)。另外，此GLD對(duì)麥芽糖的活性為5%以下，優(yōu)選為3%以下，更優(yōu)選為2%以下，用纟冬濃度5mM的l，10-菲咯啉可阻斷50%以上，優(yōu)選用2mM的l，10-菲咯啉阻斷50%以上，更優(yōu)選用lmM的1,10-菲咯啉阻斷50%以上。亞基結(jié)構(gòu)為同二聚體，有時(shí)單聚體也為活性型。另外，由該GLD多核苷酸編碼的GLD所含的半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖的總含量，與野生型不同，相對(duì)于每lpg蛋白質(zhì)總計(jì)為80(xg以下，優(yōu)選為10pg以下，專(zhuān)交優(yōu)選為2jig以下，更優(yōu)選為0.5(xg以下。并且，由該GLD多核苷酸編碼的GLD所含的半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖的總含量，與野生型不同，相對(duì)于每l單位酶活性總計(jì)為40fig以下，優(yōu)選為10jig以下，4交優(yōu)選為2pg以下，更優(yōu)選為0.5(ig以下。另夕卜，由該GLD多核苷酸編碼的GLD的亞基分子量約為63kDa,輔酶為黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD),催化葡萄糖l位羥基氧化、使葡萄糖變?yōu)槠咸撬?s-內(nèi)酯的反應(yīng)，相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下。具體而言，該GLD多核苷酸是從絲狀菌、或擔(dān)子菌，例如曲霉菌屬(Aspergillus)、青霉菌屬(Penicillium)、或靈芝屬(Ganoderma)微生物中，特別是從土曲霉菌(A.terreus)中分離獲得的多核苷酸。本發(fā)明的GLD多核苷酸的具體方案是提供一種多核苷酸，所述多核苷酸由序列號(hào)l的堿基序列構(gòu)成、或由序列號(hào)l所示堿基序列中缺失、取代或附加l個(gè)或數(shù)個(gè)堿基形成的堿基序列構(gòu)成，且編碼與輔酶、特別是與FAD結(jié)合具有使葡萄糖脫氫的作用的GLD。另外，本發(fā)明提供一種多核苷酸，所述多核苷酸由與由序列號(hào)l所示堿基序列構(gòu)成的多核香酸具有60%以上同源性的堿基序列構(gòu)成，并且編碼與輔酶、特別是與FAD結(jié)合具有使葡萄糖脫氬的作用的GLD。需要說(shuō)明的是，"與由序列號(hào)l所示堿基序列構(gòu)成的多核苷酸具有60%以上同源性的堿基序列"，是指在序列號(hào)l的堿基序列全長(zhǎng)內(nèi)，相對(duì)于序列號(hào)1的堿基序列顯示至少60%的同一性、優(yōu)選為70%以上、較優(yōu)選為80%以上、更優(yōu)選為90%以上、特別優(yōu)選為95%以上的同一性的堿基序列。上述石威基序列的同一性百分率，可以使用公開(kāi)或市售的軟件進(jìn)行計(jì)算，所述軟件中具有以基準(zhǔn)序列(本發(fā)明中的序列號(hào)l)為對(duì)照序列進(jìn)行比較的計(jì)算法。作為例子，可以使用BLAST、FASTA、或GENETYX(軟件開(kāi)發(fā)抹式會(huì)社制)等，可以按默認(rèn)參數(shù)(defaultparameter)使用上述軟件。本發(fā)明還提供一種多核苷酸，所述多核苷酸和由下述堿基序列構(gòu)成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼與輔酶、特別是與FAD結(jié)合具有使葡萄糖脫氫的作用的GLD,上述堿基序列與由序列號(hào)l所示堿基序列構(gòu)成的多核苷酸互補(bǔ)。此核苷酸序列編碼的GLD中，從開(kāi)始的Met到第19個(gè)氨基酸Leu為止是信號(hào)肽，編碼此部分的多核苷酸可以根據(jù)生物體或所用宿主載體系統(tǒng)分別取代為適當(dāng)?shù)男蛄谢虮粍h除。另外，本發(fā)明提供一種編碼GLD的多核苷酸的獲取方法，該多核苷酸的獲取方法將具有GLD生產(chǎn)能力的微生物進(jìn)行固體培養(yǎng)，以所得酶的信息作為基礎(chǔ)克隆基因。所用微生物為屬于曲霉菌屬的一個(gè)以上菌^^，特別優(yōu)選為土曲霉菌(A.terreus)。并且，本發(fā)明提供由上述任一種多核苷酸堿基序列編碼的GLD。本發(fā)明的GLD的更具體方案為提供一種可溶性GLD，所述可溶性GLD在電子受體存在下能催化葡萄糖脫氫反應(yīng)，相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下。另外，具有下述l)至4)的性質(zhì)。1)以黃素腺嘌呤二核苷酸作為輔酶，2)亞基結(jié)構(gòu)為同二聚體，3)不以氧為電子受體，4)相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下，優(yōu)選為3%以下，更優(yōu)選為2%以下。或者，具有下述l)至3)的性質(zhì)。1)以黃素腺嘌呤二核苷酸作為輔酶，2)不以氧為電子受體，3)相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下，優(yōu)選為3%以下，更優(yōu)選為2%以下或者，具有下述l)至4)的性質(zhì)。1)以黃素腺。票呤二核苷酸(FAD)作為輔酶，2)不以氧為電子受體，3)相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下，及4)相對(duì)于每l嗎蛋白質(zhì)，所含半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖的含量總和為80fig以下?；蛘?，具有下述l)至4)的性質(zhì)。1)以黃素腺噤呤二核苷酸(FAD)作為輔酶，2)不以氧為電子受體，3)相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下，及4)相對(duì)于每l單位酶活性，所含半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖的含量總和為40(ig以下?；蛘?，具有下述性質(zhì)。a亞基分子量約63kDa，b輔酶FAD,c催化氧化葡萄糖1位羥基、將葡萄糖變?yōu)槠咸撬?5-內(nèi)酯的反應(yīng)，d相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下。上述GLD是從絲狀菌，優(yōu)選從屬于曲霉菌屬的l個(gè)以上菌抹，特別優(yōu)選從土曲霉菌中分離得到的酶。本發(fā)明的GLD的更具體的方案是一種GLD,該GLD由序列號(hào)2所示氨基酸序列構(gòu)成，且與輔酶、特別是與FAD結(jié)合使葡萄糖脫氫。另外，提供一種GLD，該GLD由序列號(hào)2所示氨基酸序列中缺失、取代或附加l個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸形成的氨基酸序列構(gòu)成，且與輔酶、特別是與FAD結(jié)合顯示使葡萄糖脫氫的作用。另外，本發(fā)明提供一種GLD,該GLD由相對(duì)于序列號(hào)2所示氨基酸序列具有至少60%以上序列同源性的氨基酸序列構(gòu)成，且與輔酶、特別是與FAD結(jié)合顯示使葡萄糖脫氫的作用。目前，果蠅的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶是7^知的(Proc.Na仏Acad.Sci.1983October;80:6286-6288."BiphasicexpressionandfunctionofglucosedehydrogenaseinDrosophilamelanogaster."),與序歹ll號(hào)2所示氛基酸序列具有45~47%的同源性。另外，來(lái)自該昆蟲(chóng)的酶在昆蟲(chóng)細(xì)胞之外難于表達(dá)，生產(chǎn)率極差，因此，難于在產(chǎn)業(yè)上應(yīng)用。由相對(duì)于序列號(hào)2所示氨基酸序列具有至少60%序列同源性的氨基酸序列構(gòu)成的本發(fā)明的酶，可以在大腸桿菌等中表達(dá)，因此能夠容易地作為產(chǎn)業(yè)用酶使用。另外，本發(fā)明提供一種編碼由序列號(hào)2所示氨基酸序列構(gòu)成的GLD的多核苦酸。需要說(shuō)明的是，"相對(duì)于序列號(hào)2所示氨基酸序列具有至少60%序列同源性的氨基酸序列"是指在序列號(hào)2的氨基酸序列全長(zhǎng)內(nèi)，相對(duì)于序列號(hào)2的氨基酸序列具有至少60%的同一性，優(yōu)選為70%以上、4交優(yōu)選為80%以上、更優(yōu)選為90%以上、特別優(yōu)選為95%以上的同一性的氨基酸序列。上述氨基酸序列的同一性百分率可以使用公開(kāi)或市售的軟件進(jìn)行計(jì)算，所述軟件中具有以基準(zhǔn)序列(本發(fā)明中的序列號(hào)2)為對(duì)照序列進(jìn)行比較的計(jì)算法。作為例子，可以使用BLAST、FASTA、或GENETYX(軟件開(kāi)發(fā)抹式會(huì)社制)等軟件，可以按默認(rèn)參數(shù)使用。另外，本發(fā)明提供上述GLD的制備方法及通過(guò)該方法制備的GLD，所述制備方法的特征在于，使產(chǎn)生上述任一種GLD的微生物存在于使用小麥麩或麥片等為培養(yǎng)基成分的固體培養(yǎng)物中，由此可以使該培養(yǎng)物中產(chǎn)生GLD，進(jìn)而得到GLD。本發(fā)明還提供一種具有如上所述由本發(fā)明提供的多核苷酸中的任一種多核苷酸的重組載體以及使用重組載體制成的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，特征為培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，從培養(yǎng)物中提取具有葡萄糖脫氫作用的GLD的該GLD的制備方法，及通過(guò)該方法得到的GLD。通過(guò)該方法得到的GLD不結(jié)合糖鏈，或即使結(jié)合，也為常用的N型、O型糖鏈，其結(jié)合量與野生型的糖結(jié)合量相比少，糖鏈也容易除去，且顯示較高活性。另夕卜，本發(fā)明提供一種GLD,該GLD具有序列號(hào)2的第20-592氨基酸序列、或與此氨基酸序列具有60%以上同源性的氨基酸序列，具有與上述GLD同等的功能，且可通過(guò)肽合成法或基因重組法獲得。本發(fā)明還分別提供了特征在于使用由本發(fā)明如上所述地提供的GLD的葡萄糖測(cè)定方法；特征在于含有由本發(fā)明提供的GLD的葡萄糖測(cè)定試劑組合物；及特征在于使用由本發(fā)明提供的GLD的葡萄糖測(cè)定用生物傳感器。上述發(fā)明使用時(shí)優(yōu)選以終濃度為2mM-500mM使用電子受體，特別是鐵氰化物。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中，"多核苷酸"是指鍵合100個(gè)以上噤呤或嘧啶與糖以P-N-糖苷鍵連接的核苷的磷酸酯(ATP(三磷酸腺普)、GTP(三磷酸鳥(niǎo)苷)、CTP(三磷酸胞苷)、UTP(三磷酸尿苷)、或dATP(三磷酸脫氧腺苷)、dGTP(三磷酸脫氧鳥(niǎo)苷)、dCTP(三磷酸脫氧胞苦)、dTTP(三磷酸脫氧胸苷))形成的分子，具體而言，包括由編碼GLD的基因組DNA、由基因組DNA轉(zhuǎn)錄所得的mRNA、由mRNA合成的cDNA及以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的多核苷酸。"寡核苷酸"是指299個(gè)核苷酸連接形成的分子。另外，"多肽"是指由通過(guò)酰胺鍵(肽鍵)或非天然殘基的連接相互鍵合得到的30個(gè)以上的氨基酸殘基構(gòu)成的分子，并且，也包括其上附加有糖鏈的分子、或進(jìn)行人工化學(xué)修飾所得的分子等。本申請(qǐng)的各項(xiàng)發(fā)明中其它的用語(yǔ)或概念，在發(fā)明的實(shí)施方案的說(shuō)明或?qū)嵤├性敿?xì)地解釋。另夕卜，為了實(shí)施此發(fā)明而使用的各種技術(shù)，除了特別標(biāo)注其出處的技術(shù)之外，只要為本
技術(shù)領(lǐng)域：
人員，即可基于公知的文獻(xiàn)等容易且確實(shí)地實(shí)施。例如，基因工程學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)可以才艮據(jù)以下方法實(shí)施，即SambrookandManiatis,inMolecularCloning-ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,1989;Ausubel,F.M.etal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y，1995等記載的方法、或其中引用的文獻(xiàn)記載的方法、或與其實(shí)質(zhì)上相同的方法或變形。并且，此發(fā)明中的用語(yǔ)基本上依據(jù)IUPAC-IUBCommissiononBiochemicalNomenclature,或依據(jù)該領(lǐng)域中慣用的用語(yǔ)的含義。本發(fā)明的酶是輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氬酶(GLD),該酶能夠?qū)⑻烊恍兔钢械拇罅康奶菧p少至可用于葡萄糖傳感器的水平，對(duì)葡萄糖的基質(zhì)識(shí)別性?xún)?yōu)異，并且具有對(duì)麥芽糖的活性低的優(yōu)異特性。另外，如果使用本發(fā)明的酶的制備方法，則能夠均質(zhì)且大量地生產(chǎn)該酶。使葡萄糖脫氫的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶中產(chǎn)生問(wèn)題的糖的量，因此，通過(guò)調(diào)制減少了糖含量的酶，也可以在血糖測(cè)定等中改變對(duì)試樣中糖(葡萄糖等)的活性。本發(fā)明的GLD在血糖測(cè)定中實(shí)質(zhì)上不作用于麥芽糖，因此能夠用于精度更高的SMBG裝置中，十分有助于糖尿病患者的自我管理-治療。表示將酶的糖鏈切斷，用于SDS-PAGE,進(jìn)行糖鏈染色。[圖2]表示將酶的糖鏈切斷，用于SDS-PAGE，進(jìn)行CBB染色。[圖3]表示將酶的糖鏈切斷，進(jìn)行Native-PAGE電泳、活性染色。[圖4]表示使用鋨配位化合物作為電子受體，測(cè)定酶的傳感特性(雙分子反應(yīng)速度常數(shù))的結(jié)果。表示使用醌化合物作為電子受體，測(cè)定酶的傳感特性(雙分子反應(yīng)速度常數(shù))的結(jié)果。表示使用酶固定化電極，定量D-葡萄糖的結(jié)果。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的GLD多核苷酸(基因)是編碼可溶性GLD的多核苷酸，所述GLD的特征在于，在電子受體存在下，可催化葡萄糖氧化反應(yīng)，相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下，優(yōu)選為3%以下，更優(yōu)選為2%以下。更具體而言，此多核苷酸是GLD多核苷酸，其中GLD的特征在于具有上述(A)~(F)中的任一種性質(zhì)。本發(fā)明的GLD多核苷酸的最具體的方案為含有序列號(hào)1的核普酸序列的多核苷酸。此多核苷酸是來(lái)自絲狀菌，例如曲霉屬，特別是土曲霉(FERMBP-08578)的GLD多核苷酸，編碼具有序列號(hào)2的氨基酸序列的GLD。此GLD多核苷酸可以如下獲取，即制備來(lái)自例如土曲霉(FERMBP-08578)的cDNA文庫(kù)，通過(guò)Edman法等確定該GLD的N末端及內(nèi)部序列的氨基酸，使用基于此氨基酸序列制作的多個(gè)寡核苷酸探針篩選cDNA文庫(kù)，獲取該GLD多核香酸。需要說(shuō)明的是，在含有小麥麩、麥片等的固體培養(yǎng)物中，添加可以產(chǎn)生本發(fā)明GLD的微生物，例如屬于曲霉屬的土曲霉、日本曲霉(A.japonicus)、米曲霉(A.oryzae)等l個(gè)以上的菌抹，從該培養(yǎng)物中提取GLD的方法，由于與GLD結(jié)合的糖鏈的量少，易于除去糖鏈，精制GLD，因此，在確定GLD的N末端及內(nèi)部序列時(shí)，優(yōu)選使用固體培養(yǎng)得到的GLD。使用小麥麩時(shí)，例如將含有4070質(zhì)量％小麥麩的液體進(jìn)行滅菌后，添加0.5~2質(zhì)量％種培養(yǎng)液，在約室溫下進(jìn)行培養(yǎng)，從所得的培養(yǎng)菌體中萃取GLD粗酶即可。另外，使用麥片時(shí)，例如將含有40~70質(zhì)量％麥片的液體進(jìn)行滅菌后，添加0.5~2質(zhì)量％種培養(yǎng)液，在約室溫下進(jìn)行培養(yǎng)，從所得的培養(yǎng)菌體中萃取GLD粗酶即可。另外，探針標(biāo)記可以采用放射性同位素(RI)法或非RI法進(jìn)行，但優(yōu)選使用非RI法。作為非RI法，可以舉出熒光標(biāo)記法、生物素標(biāo)記法、化學(xué)發(fā)光法等，優(yōu)選使用熒光識(shí)別法。作為熒光物質(zhì)，可以適當(dāng)?shù)剡x擇使用能夠與寡核苷酸的堿基部分結(jié)合的熒光物，可以使用花青苷色素(例如CyDye頂系列的Cy3、Cy5等)、若丹明6G試劑、N-乙酰氧基-N2-乙酰氨基芴(AAF)、AAIF(AAF的碘衍生物)等?；蛘?，可以通過(guò)以下方法獲得目的GLD基因，即將土曲霉(FERMBP-08578)的cDNA文庫(kù)作為模板，使用上述制成的寡核苷酸引物(探針)組的PCR方法，或者以從土曲霉(FERMBP-08578)中萃取的全部RNA或mRNA為模板的RT-PCR方法。另外，也可以通過(guò)使用序列號(hào)1的5'端1引物的5'RACE法對(duì)cDNA的上游進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)使用序列號(hào)1的3'端1引物的3'RACE法對(duì)cDNA的下游部分進(jìn)4亍PCR擴(kuò)增。需要說(shuō)明的是，設(shè)計(jì)探針時(shí)，要考慮到使引物的大小(堿基數(shù))滿(mǎn)足與模板DNA之間的特異性退火，為15-40個(gè)堿基，優(yōu)選為15-30個(gè)堿基。但是，進(jìn)行LA(longandaccurate)PCR時(shí)，至少30個(gè)i咸基是有效率的。避免兩引物間的互補(bǔ)序列，使由有意義鏈(5'末端側(cè))和反義鏈(3'末端側(cè))構(gòu)成的一組或一對(duì)(2條)引物相互間不發(fā)生退火。并且，為了確保與模板DNA之間的穩(wěn)定的鍵合，使GC含量約為50。/。，防止富含GC或富含AT在引物內(nèi)不均衡分布。由于退火溫度依賴(lài)于Tm(解鏈溫度，meltingtemperature)，所以為了獲得特異性高的PCR產(chǎn)物，選擇Tm值在55-65。C相互近似的引物。另外，必須注意的是，需調(diào)整PCR中所用引物的最終濃度，使其約為0.1至lpM等。另外，也可以使用4笨針i殳計(jì)用的市售專(zhuān)欠件，例如01igoTM[NationalBioscienceInc.(美國(guó))制]、GENETYX(軟件開(kāi)發(fā)抹式會(huì)社制)等。此外，上述寡核苷酸4笨針或寡核苷酸引物組(primerset),例如也可以通過(guò)用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗌鲜鯣LDcDNA而制成，或者按照文獻(xiàn)(例如Carruthers(1982)ColdSpringHarborSymp.Q薩t.Biol.47:411-418;Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105:661;Belo勵(lì)v(1997)NucleicAcidRes.25:3440-3444;Frenkel(1995)FreeRadic.Biol.Med.19:373—380;Blommers(1994)Biochemistry33:7886-7896;Narang(1979)Meth.Enzymol.68:90;Brown(1979)Meth.Enzymol.68:109;Beaucage(1981)Tetra.Lett.22:1859;美國(guó)專(zhuān)利第4，458,066號(hào))記載的周知的化學(xué)合成技術(shù)，在體外合成。本發(fā)明的多核苷酸由與序列號(hào)1具有60%以上同源性的堿基序列構(gòu)成，可以編碼與上述輔酶特別是與FAD結(jié)合具有使葡萄糖脫氫的作用GLD。本發(fā)明的多核苷酸由缺失、取代或附加序列號(hào)l中的l個(gè)或多個(gè)堿基得到的堿基序列構(gòu)成，可以編碼與上述輔酶特別是與FAD結(jié)合具有使葡萄糖脫氫的作用的GLD。本發(fā)明的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交與序列號(hào)l所示堿基序列互補(bǔ)的DNA、具有與序列號(hào)1所示堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的DNA,且可以編碼與上述輔酶特別是與FAD結(jié)合具有使葡萄糖脫氬的作用的GLD。本發(fā)明的多核苷酸具有選自序列號(hào)5~7所示的、編碼輔酶結(jié)合型序列。另外，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼具有選自序列號(hào)8~12所示的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶共有序列中的1種或2種以上的部分氨基酸序列的酶。所述具有共有序列(氨基酸序列)的酶，多具有本發(fā)明GLD的活性，推斷所述部分構(gòu)成本發(fā)明酶的活性中心。需要說(shuō)明的是，序列號(hào)8的3個(gè)Xaa中，最左端的Xaa表示Ala或Gly，左側(cè)第2個(gè)Xaa表示Ala或Val，最右端的Xaa表示Ile或Val。另外，序列號(hào)9的4個(gè)Xaa中，最左端的Xaa表示Ala或Val，左側(cè)第2個(gè)Xaa表示Ile或Leu，左側(cè)第3個(gè)Xaa表示Ala或Ser，最右端的Xaa表示Glu或Gln。另外，序列號(hào)10的3個(gè)Xaa中，最左端的Xaa表示Ala或Leu，左側(cè)第2個(gè)Xaa表示Ile或Leu,最右端的Xaa表示Ile或Val。另外，序列號(hào)12的3個(gè)Xaa中，最左端的Xaa表示Ala或Ser,左側(cè)第2個(gè)Xaa表示Asn或Ser，最右端的Xaa表示Ile或Val。編碼上述GLD類(lèi)似酶的多核苷酸，例如可以通過(guò)知的突變導(dǎo)入法或變異導(dǎo)入PCR法等改變上述來(lái)自土曲霉的GLDcDNA進(jìn)行制備?；蛘咄ㄟ^(guò)使用多核苷酸的探針雜交法獲取，所述多核苷酸基于序列號(hào)1的核苷酸序列信息，由土曲霉之外的微生物等的基因組DNA或其cDNA文庫(kù)制備得到。進(jìn)行雜交時(shí)，通過(guò)多種方式改變嚴(yán)格條件，可以獲if又如上所述的編碼GLD類(lèi)似酶的多核苷酸。通過(guò)雜交及清洗工序中的鹽濃度、有機(jī)溶劑(甲醛等)的濃度、溫度條件等限定嚴(yán)格條件，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的各種條件，例如美國(guó)專(zhuān)利No.6，100,037等公開(kāi)的條件等。作為更具體的雜交條件，例如可以列舉在50%曱酰胺，5xSSC(150mM氯化鈉、15mM檸檬酸三鈉、10mM磷酸鈉、lmM乙二胺四乙酸、pH7.2)、5xDenhardt(Denhardt，s)溶液、0.1%SDS、10%石克酸葡聚糖及100pg/mL的變性鮭魚(yú)精子DNA中于42。C下孵育后，在0.2xSSC中于42。C下清洗過(guò)濾器等。作為用于獲取編碼GLD類(lèi)似酶的多核普酸的微生物等，對(duì)微生物的種或?qū)贈(zèng)]有限定，可以為野生抹或變異抹的任意微生物。例如，可以列舉專(zhuān)利文獻(xiàn)1公開(kāi)的微生物等。本發(fā)明的重組載體是克隆載體或表達(dá)載體，可以根據(jù)作為插入片斷的多核苷酸的種類(lèi)或其使用目的等使用適當(dāng)?shù)妮d體。例如，使用cDNA或其ORF區(qū)域作為插入片斷生產(chǎn)GLD或其類(lèi)似酶時(shí)，可以使用體外轉(zhuǎn)錄用的表達(dá)載體、或分別適于大腸桿菌、枯草菌等原核細(xì)胞、酵母、霉菌等絲狀菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等真核細(xì)胞的表達(dá)載體。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，例如在大量制備GLD或其類(lèi)似酶時(shí)，可以使用大腸桿菌、枯草菌等原核細(xì)胞、或酵母、霉菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等真核細(xì)胞等。上述轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以通過(guò)采用電穿孔法、磷酸鈣法、核糖體法、DEAE葡聚糖法等公知的方法將重組載體導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行制備。作為重組載體及轉(zhuǎn)化細(xì)胞的具體例，可以舉出下述實(shí)施例中給出的重組載體pCGLD和由此載體得到的轉(zhuǎn)化大腸桿菌EscherichiacoliJM109/pCGLD(FERMABP-10243)。本發(fā)明的GLD是具有由上述GLD多核苷酸的堿基序列編碼的氨基酸序列的多肽。具體而言，是在電子受體存在下催化葡萄糖脫氫反應(yīng)，相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下的可溶性輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氬酶，并且，優(yōu)選具有上述(A)~(F)中的任一種性質(zhì)。本發(fā)明的GLD的更具體方案為，相對(duì)于每lpg蛋白質(zhì)，所含的糖(半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖)的含量總和為80ng以下，或者相對(duì)于每l單位酶活性，所含的糖(半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖)的含量總和為40pg以下。上述糖通過(guò)縮聚形成多糖類(lèi)，被覆酶的周?chē)?。所以，只要上述糖?lèi)的含量為相對(duì)于每l嗎蛋白質(zhì)總計(jì)為80jig以下，或相對(duì)于每1單位酶活性總計(jì)為40嗎以下，即可獲得高活性的酶，故而優(yōu)選。另外，本發(fā)明的GLD的更具體方案為由序列號(hào)2所示的氨基酸序列構(gòu)成。并且，本發(fā)明的GLD可以是由與序列號(hào)2具有60。/。以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的、且與輔酶特別是與FAD結(jié)合具有葡萄糖脫氫作用的GLD類(lèi)似酶。進(jìn)而，本發(fā)明的GLD可以是由序列號(hào)2中缺失、取代或附加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列構(gòu)成的、且與輔酶特別是與FAD結(jié)合具有葡萄糖脫氫作用的GLD類(lèi)似酶。并且，本發(fā)明的GLD是具有序列號(hào)2的第20-592個(gè)氨基酸序列，或與此氨基酸序列具有60%以上同源性，具有與上述多肽同等的功能，并且可通過(guò)肽合成法或基因重組法合成的多肽。上述GLD例如可以基于序列號(hào)2的氨基酸序列或其類(lèi)似序列，通過(guò)公^口的月太合成法(Merrifield，R.B.J.SolidphasepeptidesynthesisI.Thesynthesisoftetrapeptide.J.Amer.Chem.Soc.85,2149-2154,1963;FmocSolidPhasePeptideSynthesis.APracticalApproach.Chan,W.C.andWhite,P.D.,OxfordUniversityPress,2000)進(jìn)行制備。另外，上述肽可以由天然的酰胺鍵之外的殘基連接構(gòu)成。天然的酰胺4定之外的殘基連接，例如可以列舉戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯、2官能團(tuán)馬來(lái)酰亞胺、N,N，-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、或N,N，-二異丙基碳二亞胺(DIC)等化學(xué)鍵或偶聯(lián)方法。另外，可以代替肽鍵的連接基團(tuán)例如包含酮亞甲基(ketomethylene)(例嘖口，用-C(=O)-CH2—-C(=O)-NH-)、氨基亞曱基(CH2-NH)、亞乙基、烯烴(CH=CH)、醚(CH2-O)、石克醚(CH2-S)、四唑(CN4-)、？塞唑、逆酰胺(retroamide)、石危卄<耽胺、或酉旨(參見(jiàn)侈寸^口Spatola(1983)inChemistryandBiochemistryofAminoAcids,PeptidesandProteins,Vol.7,pp267-357，"PeptideBackboneModifications,"MarcellDekker，NY)。另外，GLD可以通過(guò)使用上述GLD多核普酸(cDNA或其翻譯區(qū)域)的重組DNA技術(shù)獲得。例如，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄，由具有上述多核苦酸的載體制備RNA,將其作為模板進(jìn)行體外翻譯，由此可以在體外制備GLD。另外，只要通過(guò)公知的方法將多核苷酸重組到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體上，即可使多核苷酸編碼的GLD在大腸桿菌、枯草菌等原核細(xì)胞或酵母、霉菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等真核細(xì)胞中大量地表達(dá)?？梢愿鶕?jù)是否需要糖鏈、其他肽修飾的必要性，選擇適當(dāng)?shù)乃拗鳌Ｊ笹LD在體外表達(dá)進(jìn)行生產(chǎn)時(shí)，將上述多核苷酸插入到具有能夠鍵合RNA聚合酶的啟動(dòng)子的載體中，制成重組載體，只要將此載體添加到體外翻譯體系，即含有與啟動(dòng)子相對(duì)應(yīng)的RNA聚合酶的兔網(wǎng)狀紅細(xì)胞溶解物或小麥胚芽萃取物等，即可在體外生產(chǎn)GLD。作為RNA聚合酶能夠4建合的啟動(dòng)子，可以列舉T3、T7、SP6等。作為含有上述啟動(dòng)子的載體，可以舉出pKAl、pCDM8、pT3/T718、pT7/319、pBluescriptII等。在大腸桿菌等微生物中使DNA表達(dá)生產(chǎn)GLD時(shí)，在具有可以在微生物中復(fù)制的起始點(diǎn)、啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合部位、DNA克隆部位、終止子序列等的表達(dá)載體中重組上述多核苷酸，制作表達(dá)載體，培養(yǎng)用此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞得到的轉(zhuǎn)化體，即可在微生物內(nèi)大量生產(chǎn)GLD。此時(shí)，如果在任意的翻譯區(qū)域前后插入起始密碼子和終止密碼子使其表達(dá)，也可得到含有任意區(qū)域的GLD片斷?；蛘?，也可以作為與其他蛋白質(zhì)的融合蛋白表達(dá)。通過(guò)用適當(dāng)?shù)牡鞍酌盖袛啻巳诤系鞍踪|(zhì)，可以得到目的GLD。作為大腸桿菌用表達(dá)載體，可以舉出pUC類(lèi)、pBluescriptII、pET表達(dá)體系、pGEX表達(dá)體系、pCold表達(dá)體系等。在真核細(xì)胞中表達(dá)生產(chǎn)GLD時(shí)，只要將上述多核苷酸插入具有啟動(dòng)子、剪接區(qū)域、多(A)附加部位等的真核細(xì)胞用表達(dá)載體中，制作重組載體，導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi)，即可在真核細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)GLD。在細(xì)胞內(nèi)能夠以質(zhì)粒之類(lèi)的狀態(tài)保持，也能夠使其整合到染色體中保持。作為表達(dá)載體，可以列舉出pKAl、pCDM8、pSVK3、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV載體、pRS、pYE82等。另夕卜，使用pIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-Nl、pEGFP-Cl等作為表達(dá)載體時(shí)，也可以使FAD-GLD多肽表達(dá)為附加了His標(biāo)記、FLAG標(biāo)記、GFP等各種標(biāo)記的融合蛋白。作為真核細(xì)胞，通?？梢允褂煤锬I臟細(xì)胞COS-7、中國(guó)蒼鼠(Chinesehamster)卵巢細(xì)胞CHO等哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞、芽殖酵母、分裂酵母、霉菌、蠶細(xì)胞、非洲爪蟾卵細(xì)胞等，只要為能夠表達(dá)GLD的細(xì)胞即可，可以為任意真核細(xì)胞。為了將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi)，可以使用電穿孔法、磷酸鈣法、核糖體法、DEAE葡聚糖法等公知的方法。使GLD在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中表達(dá)后，為了從培養(yǎng)物(含有菌體或分泌到菌體外的酶的培養(yǎng)液、培養(yǎng)基組合物等)中分離精制目的蛋白質(zhì)，可以組合公知的分離操作進(jìn)行分離。例如可以舉出用尿素等變性劑或表面活性劑進(jìn)行的處理、熱處理、pH處理、超聲波處理、酶消化、鹽析或溶劑沉淀法、透析、離心、超濾、凝月交過(guò)濾、SDS-PAGE、等電點(diǎn)電泳、離子交換色譜法、疏水性色譜法、反相色譜法、親和色譜法(包括利用標(biāo)記序列的方法及使用UKC1特異性多克隆抗體、單克隆抗體的方法)等。(1)作用按照國(guó)際生化學(xué)聯(lián)合(IUB)的分類(lèi)，本發(fā)明的GLD是分屬于EC1丄99.10的酶，在電子受體存在下可以催化葡萄糖l位羥基氧化、生成葡糖酸-S-內(nèi)酯的反應(yīng)(葡萄糖+電子受體—葡糖酸內(nèi)酯+還原型電子受體)。需要說(shuō)明的是，作為電子受體，例如可以舉出利用吩。秦硫酸曱酯(phenazinemethosulfate)、1-曱氧基-5-曱基吩。秦鐵硫酸曱酯鹽(l畫(huà)mGthoxy畫(huà)5-methyl誦phenaziniummethylsulfate)、2,6-二^S^"t^酚、鐵氰化物、鋨化合物、醌化合物等。(2)基質(zhì)特異性對(duì)D-葡萄糖作用強(qiáng)，對(duì)D-甘露糖、1,5-脫水-D-葡萄糖醇、D-纖維二糖、D-海藻糖、麥芽糖、D-半乳糖、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖作用弱。另外，對(duì)L-阿拉伯糖、乳糖、D-山梨糖醇、葡糖酸、蔗糖、D-甘露醇、L-山梨糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖-1-磷酸、D-棉子糖、乙醇、甘油幾乎無(wú)作用。(3)阻斷劑#11，10-菲咯啉阻斷60%以上。(4)輔酶黃素腺嘌呤二核苷酸(5)最適pH:7.0~9.0(6)穩(wěn)定pH:4.5~8.5(7)最適溫度55。C左右(8)溫度穩(wěn)定性在約50。C以下穩(wěn)定需要說(shuō)明的是，關(guān)于上述分子量，由于原來(lái)糖鏈附加在該酶上，所以如果糖鏈的附加方法根據(jù)培養(yǎng)條件或精制條件而改變，則分子量變化，在重組體中，糖鏈或附加的氨基酸也根據(jù)其宿主、載體系的種類(lèi)等而變化，分子量變化。確認(rèn)等電點(diǎn)也以與上述相同的方式發(fā)生變化。如上所述的本發(fā)明的GLD是在電子受體存在下催化葡萄糖脫氫反應(yīng)的酶，因此，只要是可以利用由此反應(yīng)導(dǎo)致的變化的應(yīng)用即可，沒(méi)有特殊的限制。例如，可以用于含有活體物質(zhì)的試樣中的葡萄糖的測(cè)定及測(cè)定用試劑、清除用試劑等醫(yī)療領(lǐng)域、臨床領(lǐng)域，也可以在使用輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氳酶的物質(zhì)生產(chǎn)中使用。本發(fā)明的生物傳感器用于含有本發(fā)明GLD作為酶的反應(yīng)層中，是測(cè)定試樣液中葡萄糖濃度的生物傳感器。例如，可以通過(guò)如下方法制作，即利用絲網(wǎng)印刷等方法在絕緣性基板上形成由工作電極、其對(duì)電極及參比電極構(gòu)成的電極體系，與此電子體系相連接形成含有親水性高分子和氧化還原酶和電子受體的酶反應(yīng)層，由此制得生物傳感器。在此生物傳感器的酶反應(yīng)層上滴下含有基質(zhì)的試樣液時(shí)，酶反應(yīng)層溶解，酶和基質(zhì)反應(yīng)，隨之電子受體被還原。酶反應(yīng)結(jié)束后，使被還原的電子受體以電化學(xué)方式被氧化，此時(shí)，此生物傳感器可以根據(jù)所得氧化電流值測(cè)定試樣液中的基質(zhì)濃度。除此之外，也可以構(gòu)筑具有枱，測(cè)發(fā)色強(qiáng)度或pH變化等方式的生物傳感器。作為生物傳感器的電子受體，可以使用電子授受能力優(yōu)異的化學(xué)物質(zhì)。所謂電子授受能力優(yōu)異的化學(xué)物質(zhì)，是指通常稱(chēng)為"電子轉(zhuǎn)運(yùn)體"、"中介體"或"氧化還原介質(zhì)"的化學(xué)物質(zhì)，作為與其相當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)物質(zhì)，例如可以利用特表2002-526759中舉出的電子轉(zhuǎn)運(yùn)體、氧化還原介質(zhì)等。具體而言可以舉出鋨化合物、醌化合物、鐵氰化合物等。生物傳感器通常使用廉價(jià)的鐵氰化鉀(六氰合鐵(IU)酸鉀)作為電子受體，一般在終濃度為lmM以下使用。但是本發(fā)明的GLD在以高濃度2-500mM、較優(yōu)選30-100mM使用鐵氰化鉀時(shí)，能夠感度更好地測(cè)定D-葡萄糖。本發(fā)明的測(cè)定方法、測(cè)定試劑、測(cè)定化合物、生物傳感器等的優(yōu)選方案為在其涉及的測(cè)定反應(yīng)體系中以終濃度2-500mM使用鐵氰化鉀。在該酶的活性測(cè)定中，適當(dāng)?shù)叵♂屖褂迷撁?，?yōu)選終濃度為0.11.0unit/ml。需要說(shuō)明的是，該酶的酶活性單位(unit)是l分鐘內(nèi)氧化lpmol的葡萄糖的酶活性。本發(fā)明的輔酶結(jié)合型葡萄脫氫酶的酶活性可以采用以下方法進(jìn)行測(cè)定。(i)酶活性測(cè)定方法-1在3ml石英槽(光路長(zhǎng)lcm)中添加0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)l.Oml、1.0MD-葡萄糖1.0ml、3mM2,6-二氯酚錠酚(以下稱(chēng)為DCIP)0.1ml、3mMl-甲氧基-5-曱基吩。秦鐵硫酸曱酯鹽0.2ml、水0.65ml，安放在帶有恒溫槽支架的分光光度計(jì)上，在37。C下培育5分鐘后，添加0.05ml酶溶液，之后測(cè)定DCIP在600nm處的吸光度變化(AABS/min)。DCIP在pH7.0下的摩爾吸光系數(shù)為16.3xl()3cm—_1，1分鐘內(nèi)還原1pmol的DCIP的酶活性實(shí)質(zhì)上與1單位該酶活性等價(jià)，因此可以根據(jù)下式由吸光度變化求出該酶活性。酶活性(unit/ml)=-，SXx酶的稀釋率16,30.05(ii)酶活性測(cè)定方法-2將1.0M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)3.4^1、l.OMD-葡萄糖0.1ml、20mMDCIP86.6]il在37。C下培育5分鐘后，加入0.01ml酶溶液攪拌，反應(yīng)5分鐘后在100。C下培育3分鐘，停止反應(yīng)。再加入100mM甘氨酸.鈉緩沖液(pH13.0)0.19ml、2.0N氫氧化鉀0.01ml，在37。C下培育IO分鐘，溶液中的D-葡糖酸變?yōu)镈-葡糖酸-S-內(nèi)酯后，加入100mMTris[]鹽酸緩沖液(pH7.5)0.39ml、l.ON鹽酸O.Olml,使pH為中性。用D-葡糖酸/D-葡糖酸-5-內(nèi)酯定量試劑盒(Roche'Diagnostics社制)定量溶液中的D-葡糖酸。由于l分鐘內(nèi)生成l)iimolD-葡糖酸-S-內(nèi)酯的酶活性實(shí)質(zhì)上與l單位該酶活性等價(jià)，所以由D-葡糖酸-5-內(nèi)酯的生成量鑒定該酶活性。該酶的蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定中，適當(dāng)?shù)叵♂屖褂迷撁福瑑?yōu)選終濃度為0.20.9mg/ml。本發(fā)明的蛋白質(zhì)濃度可以使用從日本BioDRad(抹)購(gòu)入的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒Bio-RadProteinAssay,按照操作說(shuō)明書(shū)，根據(jù)以牛血清白蛋白(BSA，和光純藥工業(yè)(林)制，生化學(xué)用)作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算而求出。以下給出實(shí)施例，更加詳細(xì)且具體地說(shuō)明本發(fā)明，^旦本發(fā)明并不限定于以下例子。實(shí)施例l1_1(種培養(yǎng))將由1%(W/V)葡萄糖(和光純藥工業(yè)社制)、2%(W/V)脫脂大豆(日本食販社制)、0.5%(W/V)玉米浸漬液(SAN-EI糖化社制)、0.1%(W/V)碌u酸鎂七水合物(NACALAITESQUE社制)及水構(gòu)成的液體培養(yǎng)基調(diào)至pH6.0,將100mL裝入500mL容量的坂口燒瓶(sakaguchiflask)中，加上棉塞，在121。C下高壓滅菌20分鐘。在冷卻后的液體培養(yǎng)基中接種土曲霉(Aspergillusterreus)FERMBP-08578抹，在28X:下振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，將所得培養(yǎng)液作為種培養(yǎng)液。1-2(通過(guò)液體培養(yǎng)獲取粗酶溶液)將4L由1。/。(W/V)葡萄糖(和光純藥工業(yè)社制)、2%(W/V)脫脂大豆(日本食販社制)、0.5%(W/V)玉米浸漬液(SAN-EI糖化社制)、0.1%(W/V)石克酸4美七水合物(NACALAITESQUE社制)、消泡劑、水構(gòu)成的液體培養(yǎng)基調(diào)整至pH6.0,加入5L容量的發(fā)酵缸(jarfermenter)中，在121°C下高壓滅菌20分鐘。在冷卻后的該液體培養(yǎng)基中接種40mL上述l-1(種培養(yǎng))所述的培養(yǎng)液，在通氣攪拌的條件下培養(yǎng)菌體41小時(shí)。過(guò)濾培養(yǎng)液，將所得培養(yǎng)液上清液作為粗酶溶液l。1-3(通過(guò)固體培養(yǎng)(麥麩培養(yǎng))獲取粗酶溶液)將300g小麥麩(陽(yáng)和制粉抹式會(huì)社制)和240g自來(lái)水放入5L容量的三角燒瓶中，充分?jǐn)嚢杌旌虾?，加上棉塞，?21。C下滅菌25分鐘。接種5mL上述1-1(種培養(yǎng))所述的種培養(yǎng)液，在26。C下靜置培養(yǎng)。邊不時(shí)地?cái)嚢枨沂蛊渫?，邊培養(yǎng)2周，用5L的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)萃取麥麩中生長(zhǎng)的培養(yǎng)菌體，過(guò)濾，將所得的上清液作為凈且酶溶液2。1-4(通過(guò)固體培養(yǎng)(麥片培養(yǎng))獲取粗酶溶液)將300g麥片(雪印乳業(yè)制)和240g自來(lái)水加入5L容量的三角燒瓶中，充分?jǐn)嚢杌旌虾螅由厦奕?，?21。C下滅菌25分鐘。接種5mL上述l-l(種培養(yǎng))中制備的種培養(yǎng)液，在25。C下邊不時(shí)地?cái)嚢枋蛊渫?，邊靜置培養(yǎng)4天，用5L的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)萃取麥片中生長(zhǎng)的培養(yǎng)菌體，過(guò)濾，將所得上清液作為粗酶溶液3。1-5(酶的精制)通過(guò)以下步驟U)~(5)對(duì)上述粗酶溶液1至3進(jìn)行酶精制，分離精制輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶。(1)濃縮'脫鹽用截留分子量為10000的超濾膜"Pellicon2Modules"(MILLIPORE社制)濃縮粗酶溶液，換為20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5),得到粗酶濃縮液。(2)通過(guò)Butyl-TOYOPEARL650M(東曹社制)進(jìn)行精制(第l次)將上述粗酶濃縮液配制成65%石克酸銨飽和液(pH7.5)后，離心，得到上清液。使此粗酶液通過(guò)預(yù)先用含有65%飽和硫酸銨的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)平衡化的Buty卜TOYOPEARL650M柱，使酶吸附。用相同的緩沖液清洗此柱后，用含有30。/。飽和硫酸銨的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)使酶溶出，收集活性成分。進(jìn)而，采用從該緩沖液至20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)的梯度洗脫法洗脫酶，與上述活性成分合并。(3)通過(guò)DEAE-CellulofineA-500(生化學(xué)工業(yè)社制)進(jìn)行精制用截留分子量為10000的超濾膜"Pellicon2Modules"濃縮上述活性成分，脫鹽后用15mMTris.鹽酸緩沖液(pH8.5)平衡化。使該成分通過(guò)用該緩沖液平衡化的DEAE-CellulofineA-500柱，收集活性成分。(4)通過(guò)Butyl-TOYOPEARL650M(東曹社制)進(jìn)行精制(第2次)將上述活性成分配制成65%硫酸銨飽和液(pH7.5)后，離心，得到上清液。使該上清液通過(guò)用含有65%飽和碌u酸銨的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)預(yù)先平衡化的Butyl-TOYOPEARL650M柱，使酶吸附。該柱用相同緩沖液清洗后，用含有30%飽和硫酸銨的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)使酶洗脫，收集活性成分。(5)通過(guò)TSKgelG3000SW(東曹社制)精制用截留分子量13000的筆型膜濃縮組件(pencil-typemembraneconcentrationmodule)"ACP-0013"(旭化成工業(yè)社制)濃縮上述活性成分，脫鹽后使其與含有0.2M氯化鈉的50mM磷酸鉀緩沖液(pH5.5)平衡。將此成分通過(guò)用上述緩沖液平衡化的TSKgelG3000SW(直徑2.15cmx高60cm),用相同緩沖液使酶洗脫，分取活性成分。用Centriplus10(Amicoi^土制)濃縮活性成分，脫鹽后4奐為50mM檸檬酸'磷酸鈉緩沖液(pH5.5)。從粗酶溶液l得到的精制酶(以下稱(chēng)為精制酶l)的比活性為約1,800units/mg，從粗酶溶液2得到的精制酶(以下稱(chēng)為精制酶2)的比活性為約1,010units/mg。從粗酶溶液3得到的酶(以下稱(chēng)為精制酶3)的比活性與上述精制酶等同，所有酶的精制倍率相對(duì)于粗酶溶液均為100倍以上。實(shí)施例2(制備含有插入DNA的載體)(1)分離全RNA將2g根據(jù)實(shí)施例l的l-1(種培養(yǎng))所述方法培養(yǎng)的濕菌體用液體氮凍結(jié)后，使用EASYPrepRNA(TaKaRaBio社制)萃取得到1.5mg全RNA。(2)制備cDNA文庫(kù)通過(guò)使用逆轉(zhuǎn)錄酶及附有銜接序列的寡dT引物的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，由全RNA制備cDNA文庫(kù)。反應(yīng)試劑使用"3，-FullRACECoreSet"(TaKaRaBio抹式會(huì)社制)，反應(yīng)條件依據(jù)說(shuō)明書(shū)中記載的方案。(3)GLD基因的克隆以cDNA文庫(kù)為模板，對(duì)GLD基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物可以根據(jù)實(shí)施例l的l-5(酶的精制)記載的方法，精制上述實(shí)施例l的l-3(通過(guò)固體培養(yǎng)(麥麩培養(yǎng))獲取粗酶溶液)所述的來(lái)自麥麩培養(yǎng)的粗酶溶液2而獲得，通過(guò)Edman法確定不含有包埋糖的精制酶2的N末端及內(nèi)部序列的氨基酸，以此氨基酸序列為基礎(chǔ)合成多個(gè)寡核苷酸。最后使用KpnF(序列號(hào)3)、PstR(序列號(hào)4)以下的引物組，獲取目的GLD基因。需要說(shuō)明的是，PCR使用DNA聚合酶、Pyrobest(TaKaRaBio抹式會(huì)社)，反應(yīng)條件為[94。C/30秒—55°C/1分—72°C/2分]x25循環(huán)。然后，使用限制酶PstI和KpnI使pColdIII載體(TaKaRaBio抹式會(huì)社)裂開(kāi)，將該限制酶處理后的PCR擴(kuò)增斷片與載體連接，導(dǎo)入大腸桿菌DH5a抹中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。所得轉(zhuǎn)化體中用6個(gè)克隆制備質(zhì)粒DNA，在用PstI和KpnI處理時(shí)在全部克隆中可確認(rèn)目的大小的片斷。制備4個(gè)克隆的質(zhì)粒，確定其插入片段的序列，此時(shí)可確認(rèn)在所有質(zhì)粒中有目的基因。實(shí)施例3(宿主的轉(zhuǎn)化和酶的精制)使用實(shí)施例2制作的重組載體(pCGLD)轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌JM109抹，在含有氨節(jié)青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。然后將轉(zhuǎn)化體植菌到含有5(Hig/ml氨千青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°。下振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)液的OD600為約0.40.5時(shí)將培養(yǎng)液冷卻至15。C,放置30分鐘后，添加lmMIPTG,再于15。C下振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)離心收集菌體，懸濁在10mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)中。使用超聲波破碎裝置破碎菌體后，離心，制備無(wú)細(xì)胞萃取液。在SDS-PAGE及活性測(cè)定中確認(rèn)目的表達(dá)時(shí)，可以確認(rèn)有予測(cè)的分子量的酶表達(dá)。另外，確認(rèn)每培養(yǎng)液中酶活性為0.09U/mL。并且，通過(guò)以下步驟(l)~(5),分離精制輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氬酶。(1)濃縮用截留分子量10000的超濾膜"Pellicon2Modules"(MILLIPORE社制)濃縮上述無(wú)細(xì)胞萃耳又液，置換成20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)，得到粗酶液。(2)采用Butyl-TOYOPEARL650M(東曹社制)進(jìn)行精制(第l次)調(diào)整上述粗酶液成為65%飽和硫酸銨液(pH7.5)后，離心得到上清液。將此粗酶液通過(guò)預(yù)先用含有65%硫酸銨的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)平衡化的Buty卜TOYOPEARL650M柱，使酶吸附。用相同緩沖液清洗此柱后，用含有30M硫酸銨的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)使酶洗脫，收集活性成分。進(jìn)而，采用從該緩沖液至20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)的梯度洗脫法洗脫酶，與上述活性成分合并。(3)通過(guò)DEAE-CellulofineA-500(生化學(xué)工業(yè)社制)進(jìn)行精制用截留分子量10000的超濾膜"Pellicon2Modules"濃縮上述活性成分，脫鹽后使其與15mMTris.鹽酸緩沖液(pH8.5)平衡。使該成分通過(guò)用相同緩沖液平衡化的DEAE-CellulofineA-500柱，收集洗脫液。(4)采用Butyl-TOYOPEARL650M(東曹社制)進(jìn)行精制(第2次)調(diào)整上述洗脫液成為65%飽和硫酸銨液(pH7.5)后，離心，得到上清。將此上清液通過(guò)預(yù)先用含有65%石克酸銨的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)平衡化的Buty卜TOYOPEARL650M柱，使酶吸附。用相同緩沖液清洗該柱后，用含有30%硫酸銨的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)使酶洗脫，收集活性成分。(5)通過(guò)TSKgelG3000SW(東曹社制)進(jìn)行精制用截留分子量13000的筆型膜濃縮組件"ACP-0013"(旭化成工業(yè)社制)濃縮上述活性成分，脫鹽后用含有0.2M氯化鈉的50mM磷酸鉀緩沖液(pH5.5)使其平衡化。使此成分通過(guò)用上述緩沖液平衡化的TSKgelG3000SW(直徑2.15cmx高60cm)，用相同緩沖液4吏酶洗脫，分取活性成分。用CentripluslO(Amicon社制)濃縮活性成分，脫鹽后置換成50mM種檬酸.磷酸鈉緩沖液(pH5.5)。所得酶(以下，稱(chēng)為精制酶4)的比活性為約2,450units/mg,其精制度約為粗酶液的50倍。實(shí)施例4(霉菌的轉(zhuǎn)化和酶的精制)作為所用的宿主，使用米曲霉(A.oryzae)NS4抹。如7>知文獻(xiàn)l(Biosci.Biotech.Biochem.,61(8),1367-1369,1997)所述，該菌抹于1997年(平成9年)在釀造試驗(yàn)所育種，用于轉(zhuǎn)錄因子的解析、各種酶的高生產(chǎn)抹的育種等，可以購(gòu)入被分成小塊的菌抹。在該菌抹中，使用公知文獻(xiàn)2(曲霉屬的異種基因表達(dá)體系，峰時(shí)俊貴，化學(xué)和生物，38、12、P831-838、2000)所述的來(lái)自米曲霉(A.oryzae)的淀粉酶類(lèi)的改良啟動(dòng)子，制備可以表達(dá)GLD基因的載體?；旧习凑展墨I(xiàn)2及公知文獻(xiàn)3(清酒用麹菌的基因操作技術(shù)，五p未勝也，釀協(xié)，P494-502,2000)中記載的方法實(shí)施轉(zhuǎn)化。通過(guò)反復(fù)實(shí)施轉(zhuǎn)化活性株的選擇，可以獲取具有GLD生產(chǎn)能力的米曲霉(Aspergillusoryzae)。將該菌抹在含有蛋白胨1%、蔗糖2%、磷酸氫二鉀0.5%、硫酸鎂0.05%的培養(yǎng)液中于30。C下振蕩培養(yǎng)5天，由此可以獲取具有GLD活性的培養(yǎng)液。精制方法按照實(shí)施例3中記載的方法實(shí)施，采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳得到幾乎單一的酶標(biāo)準(zhǔn)品。將其作為精制酶5。實(shí)施例5(酵母的轉(zhuǎn)化和酶的精制)作為所用宿主，使用采用7>知文獻(xiàn)4(LaboratoryManualforGeneExpression,Productionofusefulproteininhighexpressionsystem,石田功.安東民衛(wèi)編，KodansyaScientificLtd、P100-129、1994)的方法，將作為高蛋白質(zhì)生產(chǎn)酵母已知的CandidaboidiniiS2AOU-l抹改良成異種基因?qū)胗枚玫降木?。需要說(shuō)明的是，S2AOU-l林被命名為博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)SAM1958，于1992年2月25日保藏于工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)技術(shù)研究所，保藏號(hào)為FERMBP-3766。對(duì)于改良的菌抹，使用公知文獻(xiàn)5(采用甲醇同化性(assimilating)酵母的異種基因表達(dá)體系，由里本博也.阪井康能，化學(xué)和生物，38、8、P533-540、2000)中記載的來(lái)自S2AOU-l抹的甲醇衍生性啟動(dòng)子，制備可以表達(dá)GLD基因的載體，按照公知文獻(xiàn)4、5的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化.菌抹的選定，由此得到具有GLD生產(chǎn)能力的博伊丁假絲酵母。將該菌林在含有蛋白胨2%、酵母提取物1%、甘油2%、曱醇1%的培養(yǎng)液中于28。C下振蕩培養(yǎng)2天，由此得到具有GLD活性的培養(yǎng)液。精制方法按照實(shí)施例3中記載的方法實(shí)施，采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳得到幾乎單一的酶標(biāo)準(zhǔn)品。將其作為精制酶6。實(shí)施例6(酶分解)從上述實(shí)施例l的l-2(通過(guò)液體培養(yǎng)獲耳又粗酶溶液)中制備的粗酶溶液l中取出一部分，添力口0.1%(v/v)SUMIZYMEPX、SUMIZYMEARS，在40。C下使其反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用于SDS-PAGE,使用糖鏈染色試劑盒(GelcodeGlycoproteinStainingKit(PIERCE社制))，按照規(guī)定的方法進(jìn)行糖鏈染色，可確認(rèn)無(wú)糖鏈分解。(使用高碘酸進(jìn)行氧化、還原、酸水解)在用鋁箔被覆的15mL容量的Eppendorf管中，加入以蛋白質(zhì)量計(jì)為20)ig的粗酶溶液1,加入8分之1量的0.8N偏高碘酸鈉(NaI04)水溶液(最終濃度0.1N)，在25。C下進(jìn)行24小時(shí)的氧化反應(yīng)。然后，加入為此溶液的10分之1量的0.4NNaBH4水溶液，在室溫下使其還原反應(yīng)10小時(shí)。進(jìn)而，加入為此溶液的10分之1量的1N硫酸水溶液，在25。C下水解24小時(shí)。與上述(酶分解)試驗(yàn)的確認(rèn)試驗(yàn)相同，將該試樣供于SDS-PAGE,使用糖鏈染色試劑盒進(jìn)行糖鏈染色，經(jīng)確認(rèn)無(wú)糖鏈分解。(電泳(糖鏈染色、考馬斯亮藍(lán)(CBB)染色、活性染色))向?qū)嵤├?至5所得的各酶溶液(精制酶l、2、4、5及6)中以每O.lmg蛋白質(zhì)l單位糖肽酶(glycopeptidase)F(和光純藥社制)的量加入糖肽酶F，在37。C下^f吏其反應(yīng)15小時(shí)，進(jìn)行糖鏈切斷處理后，用于SDS-PAGE,通過(guò)將此凝膠進(jìn)行糖鏈染色，可以確認(rèn)糖鏈的量及糖鏈?zhǔn)欠癖磺袛唷Ｌ擎溔旧褂锰擎溔旧噭┖?GelcodeGlycoproteinStainingKit(PIERCE社制))按照頭見(jiàn)定的方法實(shí)施(圖1)。結(jié)果確認(rèn)作為從液體培養(yǎng)上清液中精制得到的酶的精制酶l中有大量的糖，糖鏈切斷處理前后無(wú)差別，推斷糖肽酶F無(wú)作用。另一方面，作為由固體培養(yǎng)精制得到的酶的精制酶2、5及6在糖鏈切斷處理后分子量變小，通過(guò)斗唐肽酶F,—部分斗唐鏈纟皮切斷。另外，相同地進(jìn)行SDS-PAGE、考馬斯亮藍(lán)(CBB)染色時(shí)，精制酶1難于被CBB染色，精制酶2、4、5及6被CBB良好地染色(圖2)。從以上結(jié)果可知，與通過(guò)液體培養(yǎng)得到的精制酶相比，通過(guò)固體培養(yǎng)或基因重組法得到的精制酶鍵合的糖含量減少，也易被CBB染色。另外，使用Native-PAGE用的電泳凝膠NPU-7.5L(ATTO林式會(huì)社制)，通過(guò)Native-PAGE進(jìn)行電泳分析，進(jìn)行活性染色。結(jié)果如圖3所示。需要說(shuō)明的是，帶7是進(jìn)行液體培養(yǎng)、將酶活性調(diào)整為20mU時(shí)得到的。另外，帶8是進(jìn)行麥麩培養(yǎng)、將酶活性調(diào)整為20mU時(shí)得到的，帶9是進(jìn)行麥片培養(yǎng)、將酶活性調(diào)整為20mU得到的。帶7表示精制酶l,帶8表示精制酶2，帶9表示精制酶3。與從液體培養(yǎng)上清液中精制得到的精制酶1相比，作為由固體培養(yǎng)精制得到的酶的精制酶2及精制酶3的泳動(dòng)位置均出現(xiàn)在較下方的3位置。從以上結(jié)果可知，通過(guò)從液體培養(yǎng)變?yōu)楣腆w培養(yǎng)，所得的酶的糖含量減少，易被CBB染色。根據(jù)上述實(shí)施例的結(jié)果，可以推斷精制酶1和其他精制酶是糖含量及組成不同的酶，進(jìn)行酶的糖分析。實(shí)施例7(通過(guò)ABME標(biāo)記-HPLC分析進(jìn)行糖組成的分析)首先，在試驗(yàn)管中稱(chēng)取35mg對(duì)氨基苯曱酸曱酯(ABME)和3.5mg氰基硼氫化鈉，加入350nl曱醇和41pl乙酸，攪拌，進(jìn)行調(diào)制。將上述實(shí)施例1至5所得的各精制酶溶液調(diào)至蛋白質(zhì)濃度為1.0mg/mL濃度后，稱(chēng)取100nL放入螺口試驗(yàn)管，在氮?dú)夥諊懈晒毯?，加?.2mL的4NTFA(三氟乙酸)溶液，在100°C下使其反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)后，將在管式蒸發(fā)器(tubeevaporator)中減壓干固、再加入200^L離子交換水、減壓干固的操作重復(fù)3次，完全除去TFA。在通風(fēng)櫥內(nèi)，加入200iiL曱醇和20nL吡啶及20nL乙酸酐，在室溫下放置2小時(shí)以上，進(jìn)行N-乙?；磻?yīng)。在氮?dú)饬髦懈晒谭磻?yīng)溶液，溶解于lmL離子交換水中，裝入預(yù)先已清洗的PRE-SEPC18卡套柱(cartridgecolumn)(日本W(wǎng)aters抹式會(huì)社制)中，用15mL離子交換水洗脫。將洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(rotaryevaporator)中減壓濃縮，再移至螺口試驗(yàn)管，于管式蒸發(fā)器中減壓干固。使殘?jiān)芙庥?0iaL離子交換水中，加入80pLABME試劑，在80。C下使其反應(yīng)45分鐘。將反應(yīng)結(jié)束后的溶液在氮?dú)饬髦懈晒毯?，加?mL離子交換水和2mL二乙基醚，攪拌。將其離心，除去含有未反應(yīng)ABME的醚層。將此醚萃取重復(fù)5次，所得的水層在管式蒸發(fā)器中減壓干固，得到ABME衍生化糖。將其溶解于2mL的高純水中，進(jìn)行HPLC分析。作為HPLC的分析柱，-使用Wakosil5C18-200(4.0x250mm;和光純藥工業(yè)抹式會(huì)社制)，柱溫度40。C，流速0.5mL/min，溶劑使用5%乙腈/0.1M乙酸溶液(溶劑A)、15%乙腈/0.1M乙酸溶液(溶劑B)。以線性濃度梯度進(jìn)行洗脫，具體為從樣品注入后開(kāi)始以A:B=100:0洗脫20分鐘，之后經(jīng)80分鐘變化至A:B-0:100。在UV304nm下進(jìn)行^r測(cè)。結(jié)果在來(lái)自液體培養(yǎng)的精制酶l中檢測(cè)到半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、N-乙酰葡糖胺，未檢測(cè)到葡萄糖。另一方面，在來(lái)自麥麩培養(yǎng)的精制酶2中檢測(cè)到甘露糖和N-乙酰葡糖胺，未檢測(cè)到葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖。除此之外，各精制酶的糖含量如表1所示。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>實(shí)施例8(輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的性質(zhì)試驗(yàn))調(diào)查通過(guò)上述實(shí)施例1至5分離得到的精制酶1至6的活性、基質(zhì)特異性、阻斷劑及輔酶。需要說(shuō)明的是，根據(jù)WO2004/058958說(shuō)明書(shū)36頁(yè)及37頁(yè)的酶活性測(cè)定法-1、酶活性測(cè)定法-2的記載，測(cè)定酶活性。1)活性在8.66mMDCIP存在下，使各精制酶與500mMD-葡萄糖反應(yīng)，用D-葡糖酸/D-葡糖酸-S-內(nèi)酯定量試劑盒(Roche.Diagnostics社制)定量反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果確認(rèn)所有精制酶均生成D-葡糖酸，由此可知，本發(fā)明的精制酶2至6是與精制酶1相同地催化D-葡萄糖l位羥基氧化反應(yīng)的酶。2)最適pH:將酶活性測(cè)定法-2的緩沖液分別適當(dāng)?shù)刂脫Q成磷酸鉀緩沖液(pH6.0~7.0)、Tris'鹽酸緩沖液(pH7.4~8.0)或甘氨酸'氫氧化鈉緩沖液(pH8.6~9.1)(各緩沖液的終濃度均為17mM)，采用與酶活性測(cè)定法-2相同的方法，測(cè)定在各pH區(qū)域中該-晴制酶的酶活性。結(jié)果，精制酶4、5及6的最適pH為7.0-9.0。3)穩(wěn)定pH將該精制酶分別溶解于50mM濃度的緩沖液、即乙酸'乙酸鈉緩沖液(pH3.6~5.3)、磷酸鉀緩沖液(pH6.0~6.8)、Tris'鹽酸緩沖液(pH7.7)及甘氨酸'氫氧化鈉緩沖液(pH8.610.0),在40。C下保持60分鐘后，采用活性測(cè)定方法-l測(cè)定酶活性，分析酶活性的殘存率。精制酶5的穩(wěn)定pH為4.5~8.5。4)最適溫度將輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶溶解于50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中，根據(jù)上述活性測(cè)定方法-1在30。C~62。C的范圍內(nèi)測(cè)定酶活性。結(jié)果，精制酶5的最適溫度為55。C左右。5)溫度穩(wěn)定性將輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶溶解于50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中，在從0。C至55。C的幾個(gè)溫度下保持15分鐘后，采用活性測(cè)定方法l測(cè)定酶活性，分析酶活性的殘存率。此處，以在0。C下保持15分鐘時(shí)的酶活性值為100%，計(jì)算酶活性的殘存率。結(jié)果，精制酶5即使在50。C下仍保持89%的酶活性，在約50。C以下穩(wěn)定。6)亞基分子量使用12.5%聚丙烯酰胺凝膠，根據(jù)Laemmli等的方法(Nature(1970)227:680-685)，將該精制酶用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)(CBB)染色，將移動(dòng)度與分子量才示i己(LMWMarker;AmershamPharmaciabiotech公司制)的移動(dòng)度相比較，結(jié)果各酶的亞基分子量為精制酶2約71kDa、精制酶4約58kDa、精制酶5約81kDa、精制酶6約128kDa。7)基質(zhì)特異性活性測(cè)定方法-l中的活性測(cè)定用反應(yīng)液的基質(zhì)，使用D-葡萄糖及其他各基質(zhì)(終濃度均為333mM,D-纖維二糖為193mM、D-海藻糖及D-棉子糖為121mM),按照酶活性測(cè)定法-l測(cè)定精制酶l至6的酶活性。以對(duì)D-葡萄糖的活性值為100%，以相對(duì)于該#_的相對(duì)值作為對(duì)各基質(zhì)的活性值。另外，與上述相同，將D-葡萄糖及麥芽糖的終濃度分別設(shè)定為550mM及100mM2種，測(cè)定相對(duì)反應(yīng)性(酶活性)。結(jié)果是以D-葡萄糖的值為基準(zhǔn)換算成相對(duì)值。由此可知，本發(fā)明的精制酶2至6與精制酶1相同，對(duì)D-葡萄糖作用強(qiáng)，對(duì)D-甘露糖、1，5-脫水-D-葡萄糖醇、D-纖維二糖、D-海藻糖、麥芽糖、D-半乳糖、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖作用微弱。另外，對(duì)L-阿拉伯糖、乳糖、D-山梨糖醇、葡糖酸、蔗糖、D-甘露糖醇、L-山梨糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖-l-磷酸、D-棉子糖、乙醇、甘油幾乎無(wú)作用。8)阻斷劑在活性測(cè)定方法-l的反應(yīng)體系中，分別加入溶解于甲醇的l，10-菲咯啉，且使其終濃度分別為lmM、5mM、10mM、25mM及50mM，按照活性測(cè)定方法-1測(cè)定精制酶1至6的活性。需要說(shuō)明的是，相對(duì)于反應(yīng)體系的曱醇終濃度均為10%(v/v)。按照活性測(cè)定方法-1,對(duì)照區(qū)添加甲醇，使終濃度為10%(v/v)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，添加l，10-菲咯啉的最終濃度為lmM以上時(shí)，阻斷率均較高，為60%以上。9)輔酶向精制酶1至6中添加D-葡萄糖，進(jìn)行吸光分析時(shí)，所有在385nm及46511!11可確^人的極大吸收均通過(guò)添加0-葡萄糖而消失，由此表明輔酶為FAD。需要說(shuō)明的是，上述極大吸收為FAD特有，構(gòu)筑唯獨(dú)未加FAD的對(duì)照反應(yīng)體系時(shí)，不能，見(jiàn)測(cè)到。實(shí)施例9(傳感器特性的比較)使用實(shí)施例1的1-2所得的精制酶1、及實(shí)施例3至5所得的精制酶4至6,用電化學(xué)分析器CHI611A(BAS社制)求出各雙分子反應(yīng)速度常數(shù)。需要說(shuō)明的是，輔助電極使用鉑，工作電極使用碳、參比電極使用銀/氯化銀。在pH7.0的Mops緩沖液中加入終濃度為142mM的葡萄糖及0.45(iM精制酶4、0.76pM精制酶5、1.9fiM精制酶6、或l.lnM精制酶l，順次添加鋨配^立體[Os(4-Methyl-imidazole)2(4—dimethyl-bipyridine)2](PF6)2,使終濃度為0mM至0.57mM,在各濃度(參見(jiàn)圖4)下測(cè)定循環(huán)伏安(cyclicvoltammogram)，結(jié)果，纟晴制酶4的雙分子反應(yīng)速度常數(shù)為8.15x10、—i]VT、精制酶5的雙分子反應(yīng)速度常數(shù)為7.36xl0、—]M—、精制酶6的雙分子反應(yīng)速度常數(shù)為9.38xl(yV_1。精制酶l電流較低，未見(jiàn)穩(wěn)定電流值，不能計(jì)算雙分子反應(yīng)速度常數(shù)(圖4)。另外，與上述相同，在pH7.0的Mops緩沖液中加入終濃度為142mM葡萄糖及0.45fiM精制酶4、0.76jiM精制酶5、0.55(iM精制酶6、或l.ljiM精制酶l,順次添加醌化合物2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌，使終濃度為0mM至0.22mM,測(cè)定各濃度(參見(jiàn)圖5)下的循環(huán)伏安，結(jié)果，精制酶4的雙分子反應(yīng)速度常數(shù)為1.14xl()8s—i]VT、精制酶5的雙分子反應(yīng)速度常數(shù)為5.29x10^—、精制酶6的雙分子反應(yīng)速度常數(shù)為2.49x10、—i]VT、精制酶l的雙分子反應(yīng)速度常數(shù)較低，為5.69xl04s—丄M—、從上述結(jié)果可知，從重組基因的細(xì)胞中得到的酶，與從野生林獲得的酶相比反應(yīng)性提高(圖5)。使用實(shí)施例l的l-2及1-3所得的精制酶1及2，用電化學(xué)分析器CHI611A(BAS社制)求出各雙分子反應(yīng)速度常數(shù)。需要說(shuō)明的是，輔助電極使用柏，工作電極使用碳，參比電極使用銀/氯化銀。在pH7.0的Mops緩沖液中添加終濃度142mM的葡萄糖及0.94(iM精制酶l或3.3[iM精制酶2，順次添加鐵氰化鉀，使終濃度為0mM至0.671mM,在各鐵氰化鉀濃度(O、0.019、0.048、0,095、0.142、0.188、0.234、0.280、0.325、0.370、0.414、0.458、0.501、0.544、0.587、0.629、0.671mM)下測(cè)定循環(huán)伏安，結(jié)果，精制酶2的雙分子反應(yīng)速度常數(shù)為2.84xlO、^M—、精制酶l的電流較低，未見(jiàn)穩(wěn)定電流值，不能計(jì)算雙分子反應(yīng)速度常數(shù)。精制酶l由于為糖包埋型酶所以反應(yīng)性弱，精制酶2無(wú)包埋的糖，是具有通常的糖鏈的酶，因此，反應(yīng)性得到改善。實(shí)施例IO(使用酶固定化電極測(cè)定葡萄糖)使用精制酶l、2、4、5及6,使用酶固定化電極測(cè)定D-葡萄4唐。使用固定1.0U各酶的玻璃碳(GC)電極，測(cè)定相對(duì)于葡萄糖濃度的應(yīng)答電流值。向電解槽中加入50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)1.8ml及1M六氰合鐵(III)酸鉀(鐵氰化鉀)水溶液0.2ml。將GC電極與恒電位儀BAS100B/W(BAS制)連接，在40。C下攪拌溶液，對(duì)4艮/氯化4艮參比電極施加+500mV。在上述體系中添加1MD-葡萄糖溶液20pl，測(cè)定穩(wěn)定狀態(tài)的電流值。進(jìn)而，將添加同量1MD-葡萄^唐溶液、測(cè)定電流值的操作各重復(fù)3次。相對(duì)于已知的葡萄糖濃度(約IO、20、30、40mM)測(cè)繪此電流值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)。由此，通過(guò)使用本發(fā)明GLD的酶固定化電極，可以定量葡萄糖。實(shí)施例ll由序列號(hào)l合成多個(gè)寡核苷酸，最后使用序列號(hào)13及序列號(hào)14的引物組，將作為以FAD為輔酶的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氬酶生產(chǎn)抹的日本曲霉菌(Aspergillusjaponicus)IFO4408、藍(lán)青霉菌(Penicilliumcya麵m)IF05337及靈芝(Ganode函applanatum)IF06498的DNA作為模板，進(jìn)行PCR。此外，在實(shí)施例1記載的條件下培養(yǎng)各林，用液體氮冷凍所得濕菌體后，粉碎，用苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)(NIPPONGENE社制)萃取DNA。使用TaKaRaLATaq(TaKaRaBio社制)，用熱循環(huán)儀(thermalcycler)(Stratagene社制)，在[94。C/30秒—42t:/30秒—72°C/1.5分]x35循環(huán)的反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR。解析約1.6kbp的各擴(kuò)增產(chǎn)物的序列，將除去了內(nèi)含子的cDNA序列和序列號(hào)1、或公知的葡萄糖氧化酶及山梨糖脫氫酶的序列進(jìn)行比較時(shí)，可明確以FAD為輔酶的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶所特有的堿基序列(序列號(hào)5-7)及、氨基酸序列(序列號(hào)8-12)。特別指出的是，序列號(hào)8的氨基酸序列是FAD的結(jié)合位點(diǎn)，是活性中心的一部分。產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明可以用于糖尿病檢查領(lǐng)域。權(quán)利要求1、一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼可溶性的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶，所述輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶在電子受體存在下催化葡萄糖脫氫反應(yīng)，相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5％以下。2、如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有下述1)至4)性質(zhì)的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氬酶，1)以黃素腺。票呤二核苷酸(FAD)作為輔酶，2)亞基結(jié)構(gòu)為同二聚體，3)不以氧為電子受體，及4)相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下。3、如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有下述1)至3)性質(zhì)的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶，1)以黃素腺。票呤二核苷酸(FAD)作為輔酶，2)不以氧為電子受體，及3)相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下。4、如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，所述多核香酸編碼具有下述1)至4)性質(zhì)的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶，1)以黃素腺噪呤二核苷酸(FAD)作為輔酶，2)不以氧為電子受體，3)相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下，及4)相對(duì)于每l昭蛋白質(zhì)，所含糖的含量總和為80ng以下。5、如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有下述1)至4)性質(zhì)的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶，1)以黃素腺。票呤二核苷酸(FAD)作為輔酶，2)不以氧為電子受體，3)相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下，及4)相對(duì)于每1單位酶活性，所含糖的含量總和為40|ig以下。6、一種多核苷酸，所述多核苷酸具有選自序列號(hào)5~7記載的、編碼輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的堿基序列的共有序列中的1種或2種以上的部分堿基序列，且編碼具有下述a~d性質(zhì)的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氬酶，a亞基分子量約63kDa，b輔酶FAD,c催化將葡萄糖的1位羥基氧化、將葡萄糖變?yōu)槠咸撬?S-內(nèi)酯的反應(yīng)，d相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下。7、一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶，所述輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶具有選自序列號(hào)8~12記載的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶共有序列中的1種或2種以上的部分氨基酸序列，且具有下述ad性質(zhì)，a亞基分子量約63kDa,b輔酶FAD,c催化將葡萄糖的1位羥基氧化、將葡萄糖變?yōu)槠咸撬?5-內(nèi)酯的反應(yīng)，d相對(duì)于對(duì)葡萄糖的活性，對(duì)麥芽糖的活性為5%以下。8、如權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，所述多核苷酸是從絲狀菌或擔(dān)子菌分離獲得的。9、如權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的多核普酸，所述多核苷酸是從曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、或靈芝屬(Ganoderma)微生物中分離獲得的。10、如權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，所述多核苷酸是從土曲霉菌(A.terreus)中分離獲得的。11、如權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，所述多核香酸是由序列號(hào)1所示的堿基序列構(gòu)成的。12、一種多核苷酸，所述多核苷酸由在序列號(hào)1所示堿基序列中缺失、取代或附加1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基得到的堿基序列構(gòu)成，且編碼具有葡萄糖脫氫作用的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氬酶。13、一種多核苷酸，所述多核苷酸由與由序列號(hào)1所示》威基序列構(gòu)成的多核香酸的同源性為60%以上的堿基序列構(gòu)成，且編碼具有葡萄糖脫氬作用的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶。14、一種多核苷酸，所述多核苷酸和由與由序列號(hào)1所示石咸基序列構(gòu)成的多核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有葡萄糖脫氫作用的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶。15、一種編碼輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氬酶的多核苷酸的獲取方法，其特征在于，固體培養(yǎng)具有輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶生產(chǎn)能力的微生物，以所得酶的信息為基礎(chǔ)克隆基因。16、如權(quán)利要求15所述的編碼輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的多核苷酸的獲取方法，其中，所述微生物為屬于曲霉屬(Aspergillus)的1個(gè)以上菌才朱。17、如權(quán)利要求15或16所述的編碼輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的基因的獲取方法，其中，所述微生物為選自土曲霉(A.terreus)、日本曲霉(A.japonicus)、米曲霉(A.oryzae)中的1個(gè)以上菌才朱。18、一種輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶，所述輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氬酶具有由權(quán)利要求1~14中任一項(xiàng)所述的多核苷酸的堿基序列編碼的氨基酸序列。19、如權(quán)利要求18所述的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶，所述輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶由序列號(hào)2所示的氨基酸序列構(gòu)成。20、一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼由序列號(hào)2所示氨基酸序列構(gòu)成的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶。21、一種輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氬酶，所述輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶由在序列號(hào)2所示氨基酸序列中缺失、取代或附加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸形成的氨基酸序列構(gòu)成，且具有葡萄糖脫氬作用。22、一種輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶，所述輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氬酶由與序列號(hào)2所示氨基酸序列具有至少60%序列同源性的氨基酸序列構(gòu)成，且具有葡萄糖脫氫作用。23、一種重組載體，所述重組載體載有權(quán)利要求1~14或20中任一項(xiàng)所述的多核普酸。24、一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞通過(guò)使用權(quán)利要求23所述的重組載體而制成。25、一種輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)權(quán)利要求24所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，從所得培養(yǎng)物中收集具有葡萄糖脫氫作用的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶。26、一種輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的制備方法，其特征在于，使產(chǎn)生權(quán)利要求18、19、21、22中任一項(xiàng)所述的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的微生物存在于固體培養(yǎng)物中，由此使該培養(yǎng)物中生成該輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶，進(jìn)行收集。27、一種輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶，由權(quán)利要求25或26所述的方法制備。28、一種輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶，具有序列號(hào)2的第20-592氨基酸序列，或與此氨基酸序列有60%以上同源性的氨基酸序列，具有與權(quán)利要求18、19、21、22或27中任一項(xiàng)所述的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶相同的功能，且可以通過(guò)肽合成法或基因重組法合成。29、一種葡萄糖的測(cè)定方法，其特征在于，使用4又利要求18、19、21、22或27、28中任一項(xiàng)所述的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶。30、如權(quán)利要求29所述的葡萄糖的測(cè)定方法，其特征在于，使用時(shí)在終濃度2mM至500mM的范圍內(nèi)使用4失氰化物。31、一種葡萄糖測(cè)定試劑組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求18、19、21、22或27、28中任一項(xiàng)所述的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶。32、如權(quán)利要求31所述的葡萄糖測(cè)定試劑組合物，其特征在于，使用時(shí)在終濃度2mM至500mM的范圍內(nèi)4吏用鐵氰化物。33、一種葡萄糖測(cè)定用生物傳感器，其特征在于，使用權(quán)利要求18、19、21、22或27、28中任一項(xiàng)所述的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶。34、如權(quán)利要求33所述的生物傳感器，其特征在于，使用時(shí)在終濃度2mM至500mM的范圍內(nèi)使用鐵氰化物。全文摘要[課題]提供一種用于大量生產(chǎn)對(duì)葡萄糖的基質(zhì)識(shí)別性?xún)?yōu)異、且對(duì)麥芽糖的活性低的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的方法。[解決方法]一種編碼可溶性的輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶的多核苷酸，所述輔酶結(jié)合型葡萄糖脫氫酶在電子受體存在下催化葡萄糖氧化反應(yīng)，對(duì)麥芽糖的活性為5％以下；一種由所述多核苷酸的堿基序列編碼的多肽；具有所述多核苷酸的重組載體；使用所述重組載體形成的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；一種多肽的制備方法，其特征在于培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞，從所得培養(yǎng)物中收集與FAD結(jié)合具有葡萄糖脫氫作用的多肽；一種使用所述多肽的葡萄糖測(cè)定方法；葡萄糖測(cè)定試劑組合物；生物傳感器。文檔編號(hào)C12N15/09GK101160397SQ200680009520公開(kāi)日2008年4月9日申請(qǐng)日期2006年3月27日優(yōu)先權(quán)日2005年3月25日發(fā)明者小村啟悟,森田哲成,渥美禮香,真田浩一,矢田貴子,石丸惠美申請(qǐng)人:池田食研株式會(huì)社