專利名稱：用于生產(chǎn)白藜蘆醇或者其寡聚或糖苷結(jié)合衍生物的代謝改造細胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及使用微生物細胞生產(chǎn)多酚白藜蘆醇或者其寡聚或糖苷 結(jié)合衍生物，如其P-葡糖苷云杉新苷。此外，還涉及產(chǎn)生白藜蘆醇或其衍 生物的天然存在或者重組微生物用于生產(chǎn)食品、伺料和飲料的用途。
背景技術(shù)：
由微生物生產(chǎn)化學(xué)品已經(jīng)是生物技術(shù)的一種重要應(yīng)用。開發(fā)這樣的生物制造方法的步驟一般可包括1)選擇合適的微生物宿主，2)消除 引起副產(chǎn)物的代謝途徑，3)在酶活性水平和轉(zhuǎn)錄水平上同時使所需途 徑失調(diào)，和4)過表達所需途徑中的適當酶。在優(yōu)選方面中，本發(fā)明已 采用上述步驟的組合通過植物苯丙素(phenylpropanoid )途徑的酶來 重新定向來自苯丙氨酸或酪氨酸的碳流，所述途徑提供所需白藜蘆醇生 物合成的必需前體。白藜，醇(或3，4,5-三羥基芪)是一種屬于芪類植物抗毒素的植物 酚，是低分子量的次級代謝產(chǎn)物，該次級代謝產(chǎn)物構(gòu)成植物應(yīng)答于感染 或其它脅迫相關(guān)事件的主動防御機制。芪類植物抗毒素含有芪骨架(反 式-l，2-二苯乙烯)作為其共有的基本結(jié)構(gòu)在該骨架上還可以加成其他 基團(Hart and Shrimpton， 1979, Hart, 1981 )。芙類不僅可見于某些樹 木(被子植物，棵子植物)中，而且可見于一些草本植物(桃金娘科 (Myrtaceae)、葡萄科(Vitaceae)和豆科(Leguminosae中的物種)中。所 述化合物對有害生物尤其是真菌、細菌和昆蟲具有毒性。只有少數(shù)植物 具有以提供對有害生物的充分抗性的量合成芪或產(chǎn)生芪的能力。通過茂合酶實施基本芙骨架的合成。迄今為止，有兩種酶已被劃分 為芪合酶赤松素合酶和白藜^醇合酶。目前，已經(jīng)很詳細地表征了落 花生(^mc/i/s/^; M"^ )白藜，醇合酶，其多數(shù)特性已知(Schoppner and Kindl, 1984 )。芙合酶使用的底物為丙二酰CoA、肉桂酰CoA或香 豆酰CoA。這些物質(zhì)存在于每種植物中，因為它們還用于其它重要植物 組分如類黃酮、花色素和脂類的生物合成。
白藜蘆醇(圖1，反式)由兩個緊密連接的苯環(huán)組成，因此屬于多 酚。盡管也存在于其它植物如桉樹、云杉和百合以及其它食品如桑葚和 落花生中，但是白藜,醇最豐富的天然來源是用于釀酒的葡萄Ww(/"ca、 美國葡萄(Wrfs1 /"6nwcfl )和W"、 Araws^df/zie ( rC /i^/iyi //")。 所述化合物存在于藤(vine)、根、種子和莖中，但是在皮中其濃度最 高(Celotti et al., 1996 )，其中含有50-100 fig/g。 ( Jang et al. 1997 )。與 白葡萄酒的釀造相反，在紅葡萄酒釀造期間，葡萄皮包含在葡萄汁中， 因此白藜蘆醇僅在紅葡萄酒中有少量發(fā)現(xiàn)。除了其抗真菌特性以外，還 公認白藜蘆醇具有保護心臟和化學(xué)防癌的活性；它發(fā)揮植物雌激素、血 小板聚集抑制劑(Kopp et al， 1998; Gehm et al 1997; Lobo et al 1995 ) 和抗氧化劑(Jang et al.， 1997; Huang 1997 )的作用。這些特性解釋了 所謂的法國悖論，即盡管缺乏鍛煉并食用高脂肪膳食，但是飲用葡萄酒 的法國人的冠心病發(fā)病率卻很低。最近，已經(jīng)顯示白藜,醇還可以活化 酵母的SIR2基因以及類似的人基因SIRT1，它們在延長壽命方面都起 到關(guān)鍵的作用。從那時起，人們的注意力就主要集中在白藜，醇延長壽 命的特性上(Hall, 2003, Couzin， 2004 )。美國健康協(xié)會(如生命延長基金會)正在推廣此種藥物巨大的有益 效果，并由此推動可成功商品化的理想條件。當前的生產(chǎn)方法主要依賴 于從葡萄漿果的皮中或者從紫菀科植物(knotweed)中提取白藜，醇。 這是一個勞動密集型方法，而且產(chǎn)量很低，因此這激勵著人們?nèi)ラ_發(fā)更 高效、產(chǎn)量更高的新生產(chǎn)方法。在植物中，苯丙素途徑負責合成各種次級代謝化合物，包括木質(zhì)素、 水楊酸鹽、香豆素、羥基肉桂酰氨(hydroxycinnamic amide )、色素、 類黃酮和植物抗毒素。實際上，植物中白藜蘆醇的形成通過苯丙素途徑 進行。L-苯丙氨酸解氨酶(PAL)通過非氧化脫氨基作用將氨基酸L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成反式肉桂酸(圖2)。接著，通過細胞色素P450單加氧 酶肉桂酸-4-羥化酶(C4H)與NADPH:細胞色素P450還原酶(CPR) 結(jié)合使反式肉桂酸在對位羥基化，成為4-香豆酸(4-羥基肉桂酸)。隨 后通過4-香豆酸CoA連接酶(4CL )的作用將4-香豆酸活化成4-香豆 酰CoA。最后，白藜蘆醇合酶(VST)催化4-香豆酰CoA的苯丙烷單 位與丙二酰CoA縮合，由此形成白藜,醇。最近，公開了可以由在葡萄汁中少量可見的4-香豆酸產(chǎn)生白藜蘆醇
的酵母(Becker et al. 2003)。通過共表達來自雜交楊樹的異源輔酶A 連接酶基因和葡萄白藜聲醇合酶基因(vW7)，實現(xiàn)了在釀酒酵母的實驗 室菌林中產(chǎn)生4-香豆酰CoA以及伴隨的白藜,醇。白藜,醇合酶的另 一底物丙二酰CoA已在酵母中內(nèi)源性產(chǎn)生，其參與從頭的脂肪酸生物 合成。該研究表明，當在補充了 4-香豆酸的合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，釀酒 酵母的細胞可以產(chǎn)生游離形式或葡糖苷結(jié)合形式的微量白藜，醇。然而，所述酵母不適合商業(yè)化應(yīng)用，因為其白藜蘆醇產(chǎn)量很低，并 且需要添加只存在于少數(shù)工業(yè)培養(yǎng)基中的4-香豆酸。因此，為了促進和 拓寬白藜蘆醇作為藥物和營養(yǎng)物(neutraceutical)的應(yīng)用，非常期望獲 得可以直接由葡萄糖產(chǎn)生白藜聲醇而無需添加4-香豆酸的酵母。最近的研究(Ro and Douglas, 2004)描述了通過引入來自楊樹的 PAL、 C4H和CPR來重建釀酒酵母中苯丙素途徑的進入點(entry point )。其目的是評估包含PAL和C4H的多酶復(fù)合物(MEC )是否在 進入苯丙素代謝的該進入點具有功能上的重要性。通過在所述重組酵母 中添加[3H-苯丙氨酸發(fā)現(xiàn)，多數(shù)經(jīng)代謝的[3H-苯丙氨酸摻入到4-[3H]-香豆酸中，并且通過抑制C4H活性而極大地降低了苯丙氨酸代謝。此 外，僅表達PAL的系統(tǒng)極少將苯丙氨酸代謝成肉桂酸。當在三重表達 系統(tǒng)中同時加入3H-苯丙氨酸和14C-反式肉桂酸時，沒有證據(jù)顯示將 內(nèi)源性合成的3H-反式肉桂酸輸送到4-香豆酸。因此，在酵母中通過 PAL和C4H催化的反應(yīng)的從苯丙氨酸至4-香豆酸的高效碳流看來不需 要通過MEC，并且PAL和C4H的完全生化偶聯(lián)看來足以驅(qū)動碳流進 入苯丙素途徑。在另一研究中(Hwang et al.， 2003 )，通過表達含有各 種異源苯丙素途徑的三個基因(來自酵母深紅酵母(及/^^Mr"/fl ) 的PAL、來自放線菌天藍色鏈霉菌(&r印似附j(luò);cM 的4CL以及來自甘草類植物刺甘草(G(kow/ ^ ec/ii7iflto)的查耳酮合酶 (CHS))的人工基因簇實現(xiàn)了通過大腸桿菌產(chǎn)生植物特異性的黃烷酮。 這些途徑繞過了 C4H，因為細菌4CL酶將輔酶A連接在反式肉桂酸以 及4-香豆酸上。此外，來自深紅酵母的PAL可利用苯丙氨酸和酪氨酸 二者作為底物。因此，包含所述基因簇并在葡萄糖上生長的大腸桿菌細 胞產(chǎn)生少量的兩種黃烷酮來自苯丙氨酸的生松素(0.29g/l)和來自酪 氨酸的柚皮素(0.17g/l)。另外，它們的前體(4-香豆酸和反式肉桂酸) 也有大量累積(分別為0.47和1.23 mg/1)。此外，可以通過添加苯丙氨 酸和酪氨酸來提高這些化合物的產(chǎn)量。
盡管來自雙子葉植物的酶只能有效利用苯丙氨酸，但是一些研究表明，來自單子葉植物和一些微生物的PAL也利用酪氨酸(Riisler " "/., 1997)。在這些反應(yīng)中，所迷酶活性命名為酪氨酸解氨酶(TAL，圖3)。 用TAL轉(zhuǎn)化酪氨酸導(dǎo)致直接形成4-香豆酸，而沒有C4H和CPR中間 過程。盡管Km和轉(zhuǎn)換數(shù)有很大差異，但這兩種活性主要存在于同一多 肽上，并且具有非常相似的催化效率。然而，來自植物的多數(shù)PAL/TAL 酶偏好苯丙氨酸而不是酪氨酸。多數(shù)TAL的活性水平低于PAL的活性 水平，但是這種差異的量級變化范圍很廣。例如，歐芹(parsley)的酶 的Km對于苯丙氨酸為15-25 nM，對于酪氨酸為2.0-8.0 mM，轉(zhuǎn)換數(shù) 分別為22 S"和0.3 S'1。相反，玉米的酶對于苯丙氨酸的Km比對于酪 氨酸的Km只高15倍，轉(zhuǎn)換數(shù)高約10倍。此外，在紅酵母(redyeast) 如粘紅酵母(及/^dCorM/" g/wrtVi/s )(紅冬孢酵母(和深紅酵母中，TAL的催化活性接近PAL的催化活性， TAL/PAL的比值約為0.58。相信這些酵母的PAL酶發(fā)揮降解代謝功能 降解苯丙氨酸，并且所形成的反式肉桂酸被轉(zhuǎn)化成苯甲酸鹽和其它細胞 材料，而在植物中認為其僅是木質(zhì)素、異黃酮類和其它的苯丙素類生物 合成的調(diào)節(jié)酶。最近，在細菌莢膜紅細菌(及/^^6fl"w copsM/a^is)中發(fā)現(xiàn)了一種光活黃蛋白生i團的生^合成(Kyndteta1.,2002)。這是第一次在細^ 中發(fā)現(xiàn)PAL同源基因。分離了所述TAL基因并在大腸桿菌中過量產(chǎn)生。 對于酪氨酸至4-香豆酸的轉(zhuǎn)化的Km和A:cat值分別是15.6 nM和27.7 s-1，針對L-苯丙氨酸至反式肉桂酸的轉(zhuǎn)化的Km和A:cat值分別是1277 fiM和15.1 s"。由于其Km較小而A:cat稍大，相對于L-苯丙氨酸，該 酶顯示出對酪氨酸的強偏好性，其對于酪氨酸的催化效率(Km/A:cat) 高于苯丙氨酸約150倍。動力學(xué)研究已確定，在生理條件下，酪氨酸是 該酶的天然底物，而L-苯丙氨酸不是。最近的研究描述了在大腸桿菌中 異源共表達苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羥化酶、4-香豆酸CoA連接酶 和查耳酮合成酶(Watts etal., 2004)，以用于產(chǎn)生類黃酮。然而，由于 肉桂酸-4-羥化酶無功能，因此同時表達全部四種基因并不成功。然而， 通過用克隆自球形紅細菌(及/^^7^i"w ^7A"e/wV/M)的新酪氨酸解氨 酶替代苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸-4-羥化酶可以解決該問題，并引起二氫 黃酮柚皮素的高水平產(chǎn)生。此外，還利用來自球形紅細菌的酪氨酸解氨
酶在大腸桿菌中異源產(chǎn)生4-香豆酸(即對羥基肉桂酸) (US-A-2004059103 )。甚至，還描述了開發(fā)生物催化劑用于將葡萄糖轉(zhuǎn) 化成4-香豆酸的其他方法。US-A-2004023357公開了用來自酵母皮狀絲 孢酵母(7Wc/^y/70fwi )的酪氨酸解氨酶在大腸桿菌和釀酒酵母中產(chǎn)生香豆酸。US-A-2001053847描述了將來自酵母粘紅酵母的野生 型PAL整合進大腸桿菌，強化了野生型PAL將酪氨酸直接轉(zhuǎn)化成4-香 豆酸的能力。此外，還有示例將來自酵母粘紅酵母的野生型PAL加植 物C4H和CPR整合進大腸桿菌和釀酒酵母。還描述了通過誘變野生型 酵母粘紅酵母的PAL開發(fā)TAL活性提高的生物催化劑 (US-A-6521748 )。前述專利均未指明摻入4CL和VST用于產(chǎn)生白藜 蘆醇。最近，有證據(jù)顯示絲狀真菌米曲霉(A oo^ie)含有查耳酮合成酶 (CHS)，該酶在植物中通常參與類黃酮比如柚皮素的生物合成 (Seshime et al.， 2005 )。實際上，還顯示米曲霉含有負責苯丙素-類黃酮代謝的一組主要基因，即PAL、 C4H和4CL。然而，沒有證據(jù)表明米曲霉包含芪合成酶，如白藜蘆醇合酶。本發(fā)明現(xiàn)提供具有包含至少 一種酶活性的有效代謝途徑的微生物， 所述途徑產(chǎn)生4-香豆酸，并由其產(chǎn)生白藜,醇，或其寡聚體或糖苷結(jié)合 衍生物。這樣的微生物可以是天然存在的并且可以通過合適的篩選方法 來分離，但是更優(yōu)選是經(jīng)遺傳改造的。優(yōu)選地，在以內(nèi)源性丙二酰CoA為底物的酶所催化的反應(yīng)中產(chǎn)生所 述白藜，醇或衍生物，優(yōu)選由4-香豆酰CoA產(chǎn)生所述白藜蘆醇。優(yōu)選用白藜聲醇合酶由4-香豆酰CoA產(chǎn)生所述白藜蘆醇或者衍生 物，所述白藜,醇合酶優(yōu)選在所述微生物中由編碼所述酶的核酸表達， 所述核酸對于該微生物而言是非天然的。一般在本文中，除非上下文中另外指出，提及白藜聲醇時也包括其 寡聚或糖普結(jié)合衍生物，尤其包括云杉新苷。因此，在某些優(yōu)選實施方案中，所述白藜,醇合酶是來自以下植物的 白藜蘆醇合酶(EC 2.3.1.95):屬于落花生屬(Arachis)的植物(如A. glabatra、落花生(A. hypogaea))、屬于大黃屬(Rheum)的植物(如圓
葉大黃)、屬于葡萄屬的植物(例如，美國葡萄、V.riparaia、葡萄)或者 木>屬、云杉屬(i>/c^i)、百合屬(Zj7/"w)、桉屬(五"cfl(v/)似s )、爬山虎屬(戶flW/re"鎖'sms1 )、白粉膝屬(C7sms)、 CVi/oc/rr Wi/s1、霧屬(/V/^gwiw附)、 買麻藤屬(( /iCww )、 波蘿蜜屬(Jrtocw;w/s )、 A^/^/iig"s、刺葵屬()、羊茅屬(i^W"Cfl)、甚草屬(CVimx:)、藜蘆屬(^ wm )、 羊蹄甲屬(5flw/w7i/fl)或老虎刺屬(iVw/W/w附)屬中任一屬的植物。優(yōu)選地，適當?shù)赝ㄟ^酶在該酶催化的反應(yīng)中由反式肉桂酸產(chǎn)生所述 4-香豆酸，其中氧為底物，NADH或者NADPH為輔因子，NAD+或者 NADP+為產(chǎn)物。因此，可以通過肉桂酸4-羥化酶由反式肉桂酸產(chǎn)生所述4-香豆酸， 所述酶優(yōu)選在所述微生物中由編碼所述酶的核酸表達，所述核酸對于該 微生物而言是非天然的。在某些優(yōu)選實施方案中，包括上面段落中所述的，所述肉桂酸4-羥 化酶是來自植物或微生物的肉桂酸-4-羥化酶(EC 1.14.13.11)。所述植 物可以屬于擬南芥屬(Jm6Wo/w/s)，例如擬南芥；屬于4甘橘屬(C^ms) 的植物，例如甜橙(C. s/"e"s/s)、葡萄柚(C. jci7iinirfZse);屬于菜豆屬 (iV^s /ws)的植物，例如菜豆(P vM/g"n's);屬于爭>屬的植物，例如 火炬松(A似eflffl);屬于楊屬(i^/7m/wsO的植物，例如E flfe/^wVfe、 i ^^附iz/c ,V/es、 P "/cA0cfl/77fl; 屬于癡屬(5Wtf聰附)的植物，例如馬鈴 薯(51.似6mwi/w );屬于i萄屬的植物，例如葡萄；屬于玉蜀黍?qū)?Zea) 屬的植物，例如玉蜀黍(Z附flj^);或者其它屬的植物，例如阿米屬 (Jww/ )、 海棍雄屬 (Jv/cew/i/a )、 山茶屬(Cfl/we///fl )、 喜樹屬 (CVrnipto,/rec )、 長春花屬((7fl幼flmw幼MS1 )、 大豆屬(G7戸'"e )、 向曰 葵屬(//^//flw幼ws )、百脈才艮屬()、日中花屬(M^em6o^w幼e附w附)、 'J、立宛薛屬(^P^vsa 附&re/Z")、 蕓香屬(i i^a)、甘蔑屬(5Vicc/iflrww )、 豇豆屬(Wgwfl)。所述微生物可以是屬于曲霉屬的真菌，例如米曲霉。優(yōu)選地，在產(chǎn)生氨的酶催化反應(yīng)中由酪氨酸產(chǎn)生所述4-香豆酸，并菌的酪氨酸解氨酶(EC 4.3.1.5)由酪氨酸產(chǎn)生所述4-香豆酸。適當?shù)兀?所述酪氨酸解氨酶來自酵母深紅酵母或者來自細菌莢膜紅細菌。任選地，在所述微生物中由編碼所述酶的核酸表達所述酪氨酸解氨
酶，所述核酸對于所述該微生物而言是非天然的?；蛘?，可以在產(chǎn)生氨的酶催化反應(yīng)中由L-苯丙氨酸產(chǎn)生所述反式肉 桂酸，并且適當?shù)赝ㄟ^苯丙氨酸解氨酶由L-苯丙氨酸形成所述反式肉桂在某些優(yōu)選實施方案中，所述L-苯丙氨酸解氨酶是來自植物或者微 生物的L-苯丙氨酸解氨酶(EC 4.3.1.5 )。所述的植物可以屬于擬南芥屬，例如擬南芥；屬于蕓苔屬(5rflSS/Cfl)的植物，例如歐洲油菜(必.Mfl/7WS)、蕪青(仗 ra戸)；屬于甜禍屬的植物，例如甜摘(C )、 Cc/e附e",/""s、軒樣(C//附0W ); 屬于菜豆屬的植物，例如E cocc/"ews1、 菜豆(EvM/gflf/s);屬于爭>屬的植物，例如北美短葉爭》(P 6fl/iA:s/flAi")、 加州山*> (P附^mdc^/fl )、海岸*》(E /w7i"W^")、歐洲赤*》(i w/veWWs )、 火炬松；屬于楊屬的植物，例如小葉楊(P Zw/sfl/my^Yi )、 E ^/",Vfc、 加楊(i*. Ca聽flfews/s )、 i*. AitoA:fl附/e/fs/s、 ^"簡w/o/rfes; 屬于癡屬的植 物，例如馬鈴薯；屬于李屬(iVfiwws)的植物，例如i flv/"w、杉匕；屬 于葡萄屬的植物，例如葡萄；屬于玉蜀黍?qū)俚闹参铮缬袷袷蚧蛘咂?它屬植物例如藿香屬(Jgfl^ic/ie )、鳳梨屬(Jw"w"s)、天門冬屬 (Jspanigws )、丑/Y /wAeflWfl、竹屬(5fl附6Msw)、甜菜屬(丑eto)、樺木屬 (丑W"/")、 C"mcw柳/s、 山茶屬、辣椒屬(CVi/7s/ai附)、決日月屬(CViss/fl )、 長春花屬、鷹嘴豆屬(C7cw)、西瓜屬(C%n///i )、咖啡屬(CV j^")、南瓜屬(C"CMf^,'似)、狗牙根屬(0w rf0W)、胡蘿卜屬(Dfll/CWS)、石斛屬(Dewrfn 6/f//w )、 石竹屬(D/fl/f幼附)、毛地黃屬(D/g/,fl/Zs )、 薯蕷屬 (D/仍cwefl )、桉屬、(7"http://ws、銀杏屬(G7"紐o )、大豆屬、大麥屬(/T(OrrfeMm )、 向日葵屬、番薯屬(//w附oe")、萵苣屬(Zfldiai )、紫菜屬(丄iY/i( spef附ii附)、 百糾艮屬、番癡屬(Z^考emVwi )、苜蓿屬(M^Z/cflgo)、蘋果屬(她/ws)、 木薯屬(Mfl"http://iW )、苜蓿屬(Af(^fiVfl^ )、日中花屬(臉se附—flw幼柳w附)、 煙草屬(7V/cW/flw")、木犀欖屬(0/e")、稻屬(Oryzfl)、豌豆屬(iVswOT)、 聘梨屬(iVrw")、歐芽屬(/V^Ywe/i'"Mw)、蝴蝶蘭屬(iVifl/"em /w/s)、剛 竹屬(iV 〃M似c/y;s )、小立碗蘚屬(J^jwwm/^t//")、云杉屬(戶/cefl)、 梨屬()、櫟屬(QwercWS )、蘿卜屬(J fl/ AflWWS )、地黃屬(及eA附flfm/fl )、 懸鉤子屬(及m6ws)、高粱屬(Swg/iM附)、iS/;/ie朋跨fc、繁縷屬(5"te/Zfl"fl )、 筆花豆屬(5^/仍fl/j幼^ )、小麥屬(7Wft'CM附)、車軸草屬(7>7>//"附)、小 麥屬、越桔屬(Hic"7i/謂)、&豆屬(^g"fl)、百日菊屬(Z/簡/")。所述 微生物可以是屬于蘑菇屬(y^fin ws)的真菌，例如雙孢蘑菇(A 6/印on/s),
屬于曲霉屬屬的真菌，例如米曲霉、構(gòu)巢曲霉(A mV/"/fl朋)、煙曲霉(A /w附/g"似s)，屬于黑粉菌屬(t/幼7tt^)的真菌，例如玉蜀黍黑粉菌(C/. m"3^'s)，屬于紅細菌屬(及/w^6flcter)的細菌，例如莢膜紅細菌(及. c"/^w/"似s),屬于紅酵母屬(W/i￡^^n//fl)的酵母，例如深紅酵母(及. ra&a)。適當?shù)?，在所述微生物中由編碼所述酶的核酸表達所述L-苯丙 氨酸解氨酶，所述核酸對于該微生物而言是非天然的。優(yōu)選地，在酶催化的反應(yīng)中形成4-香豆酰CoA,其中ATP和CoA 為底物，ADP為產(chǎn)物，并且適當?shù)卦谟?-香豆酸CoA連接酶催化的反 應(yīng)中形成4-香豆酰CoA。所述4-香豆酸CoA連接酶可以是來自植物、微生物或者線蟲的4-香豆酸CoA連接酶(EC 6.2.1.12)。所迷植物可以屬于冷杉屬(爿6/es)， 例如百山祖冷杉(A. beshanzuensis )、日本冷杉(B. firma )、杉爭> (B. holophylla);屬于擬南芥屬的植物，例如擬南芥；屬于蕓苔屬的植物，例 如歐洲油菜、蕪青、甘藍；屬于柑橘屬的植物，例如，;屬于落葉松(丄fl^) 屬的植物，例如歐洲落葉爭> (丄.^"Wwfl)、丄.g附^Vi,7、西藏紅杉(丄. gnjQ^/i/"wfl )、喜馬拉雅紅杉(L. himalaica )、日本落葉*》(L. kaempferi )、 北i落葉松(L. laricina)、四川紅杉(L. mastersiana )、美國西部落葉柏"(L. occidentals )、紅杉(L. potaninii )、新疆落葉爭> (L. sibirica )、怒江 紅杉(L speciosa); 屬于菜豆屬的植物，例如/ flo/ftyi // s、荷包豆(E cocc/"e"s);屬于木>屬的植物，例如華山木> <i#7mwirf//)、北美短葉木》(P 6flwh,Vmfl)、海岸爭> (i /;,ViflWw》屬于楊屬的植物，例如小葉楊、毛白 楊(i )、 i^re附M/wVfes;屬于茄屬的植物，例如馬鈴薯；屬于葡萄屬的植物，例如葡萄；屬于玉蜀黍?qū)俚闹参?，例如玉蜀黍；或者其它?的植物例如藿香屬、矮紫穗槐(J附w/;/ifl)、銀杉屬(C7fl幼"戸)、雪松屬(C^/r"s),番紅花屬(Crocus )、羊茅屬、大豆屬、胡桃屬(/wg/fl附)、 油杉屬(J^te/^Wfl)、紫菜屬、黑麥草屬(Z^/,'"w)、百樂M艮屬、番茄屬、 蘋果屬、苜蓿屬、日中花屬、煙草屬、A^幼W仰^1、稻屬、天竺葵屬(Pe/fl^owZMW )、歐斧屬、小立碗蘚屬、云杉屬、李屬、金錢松屬(i^ewflfe/flriv)、黃杉屬(Pseudotsuga )、薔薇屬(及仍tf)、懸鉤子屬、及jzfl、 甘蔗屬、堿蓬屬()、鹽芥屬(77^//w/ig/e//")、小麥屬、鐵杉屬(2i"g")。 所述微生物可以是屬于曲霉屬的絲狀真菌，例如黃曲霉(A/7flv"s)、構(gòu)巢 曲霉(A. nidulans)、米曲霉、煙曲霉(A/w附/g"^s)，屬于脈孢菌屬(A^i/nw/wf")的絲狀真菌，例如WI脈孢菌(TV. 屬的真菌，例如K 屬于球腔菌屬(A0;cwp/iflew//fl)的真菌，例如禾生球腔菌(A/; ^YWl/"/"/fl )，屬于分支桿菌屬(柳cc^"c/w/"附)的 細菌，例如牛分支桿菌(AT. 6ov/s)、麻風分支桿菌(M/印rae)、結(jié)核分支 桿菌(AT.似&n^i/仍/s)，屬于奈瑟菌屬(iV^s^nVi)的細菌，例如腦膜炎 奈瑟菌(/we/i/rtg他Vfc )，屬于鏈霉菌屬(5^r/;to附j(luò)Y^)的細菌，例如天 藍色鏈霉菌(51. a^/,Vo/w)，屬于紅細菌屬的細菌，例如莢膜紅細菌，屬 于鉤口線蟲屬(J"o;/Mto/fifl)的線蟲，例如錫蘭鉤口線蟲(j. c0，/"附Vt/附)， 屬于小桿線蟲屬(C"e"0W^1Z^/他)的線蟲，例如秀麗小桿線蟲(C. e/gfl"s), 屬于血矛線蟲屬(Haemonchus)的線蟲，如掄轉(zhuǎn)血矛線蟲(」H1 cwi似/"似s); 屬于板封l屬(Lumbricus)的線蟲，例如丄.屬于Meilodogyne 屬的線蟲，例如A"/;/"，屬于5^m^yAwV/wx屬的線蟲，例如5. m故Y、 5. s^mwfl//51 ， 屬于7V/幼Vmc/rws屬的線蟲，例如i /7fl"y cws。任選地，已在所述微生物中重組引入了 NADPH:細胞色素P450還 原酶(CPR)。這可以是引入非植物微生物的植物CPR?；蛘?，在所述 微生物中過表達天然NADPH:細胞色素P450還原酶(CPR)。在某些優(yōu)選實施方案中，包括在上面段落中所述的，所述NADPH: 細胞色素P450還原酶是來自以下植物的NADPH:細胞色素P450還原 酶(EC 1.6.2.4 ):屬于擬南芥屬的植物，例如擬南芥，屬于柑橘屬的植 物，例如甜橙、葡萄柚，屬于菜豆屬的植物，例如菜豆，屬于松屬的植 物，例如火炬水》，屬于楊屬的植物，例如i rfWwV/es、 E "e附M/wV/M、Wc觔cm/7fl，屬于茄屬的植物，例如馬鈴薯，屬于葡萄屬的植物，例如葡萄，屬于玉蜀黍?qū)俚闹参?，例如玉蜀黍，或者其它屬的植物例如?米屬、海欖雌屬、山茶屬、喜樹屬、長春花屬、大豆屬、向日葵屬、百 糾艮屬、日中花屬、小立碗蘚屬、蕓香屬、甘蔗屬、豇豆屬。盡管所述微生物可以是天然存在的，但優(yōu)選將編碼所述代謝途徑中 相應(yīng)酶的至少一種遺傳序列的至少一個拷貝重組引入所述微生物。作為引入編碼所述酶的編碼序列的補充或替代，可以提供在所述生 物中不與所述編碼序列天然相關(guān)聯(lián)的一種或多種表達信號，例如啟動子序列。因此，任選地，將編碼酪氨酸解氨酶的遺傳序列的至少一個拷貝 與表達信號有效連接，所述表達信號在所述生物中不與所述遺傳序列天然相關(guān)聯(lián)，和/或?qū)⒕幋aL-苯丙氨酸解氨酶的遺傳序列的至少一個拷貝 與表達信號有效連接，所述表達信號在所述生物中不與所述遺傳序列天
然相關(guān)聯(lián)。任選地，可將編碼肉桂酸4-羥化酶的遺傳序列的至少一個拷貝(無 論其是否是天然的)與表達信號有效連接，所述表達信號在所述生物中 不與所述遺傳序列天然相關(guān)聯(lián)。任選地，可將編碼4-香豆酸-CoA連接酶的遺傳序列的至少一個拷 貝(無論其是否是天然的)與表達信號有效連接，所述表達信號在所述 生物中不與所述遺傳序列天然相關(guān)聯(lián)。任選地，可將編碼白藜，醇合酶的遺傳序列的至少一個拷貝(無論 其是否是天然的)與表達信號有效連接，所述表達信號在所述生物中不 與所述遺傳序列天然相關(guān)聯(lián)。表達信號包括位于編碼序列上游(5，非編碼序列)、內(nèi)部或者下游(3， 非編碼序列)的核苷酸序列，并且其影響相關(guān)聯(lián)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA 加工或穩(wěn)定性、或者翻譯。這樣的序列可以包括啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、 內(nèi)含子和多聚腺苷酸化識別序列。在某些方面中，本發(fā)明提供代謝改造微生物，其具有有效的代謝途 徑，其中第 一種代謝物在由第一種酶催化的反應(yīng)中轉(zhuǎn)化成第二種代謝 物，所述反應(yīng)步驟產(chǎn)生氨，并且其中所述第二種代謝物在由第二種酶催 化的反應(yīng)中轉(zhuǎn)化成第三種代謝物，其中氧為底物，NADPH或NADH為 輔因子，NADP+或NAD+為產(chǎn)物，并且其中所述第三種代謝物在由第三 種酶催化的反應(yīng)中轉(zhuǎn)化成第四種代謝物，其中ATP和CoA為底物，ADP 為產(chǎn)物，并且所述第四種代謝物在由第四種酶催化的反應(yīng)中轉(zhuǎn)化成第五 種代謝物，其中內(nèi)源性丙二酰CoA為底物。本發(fā)明還提供代謝改造的微生物，其具有有效的代謝途徑，其中通 過第 一種酶催化將第 一種代謝物轉(zhuǎn)化成所述第三種代謝物，該反應(yīng)步驟 產(chǎn)生氨，而不涉及所述第二種酶，并且其中所述第三種代謝物在由所述 第三種酶催化的反應(yīng)中轉(zhuǎn)化成所述第四種代謝物，其中ATP和CoA為 底物，ADP為產(chǎn)物，并且其中所述第四種代謝物在由所述第四種酶催 化的反應(yīng)中轉(zhuǎn)化成所述第五種代謝物，其中內(nèi)源性丙二酰CoA為底物。上述微生物包括這樣的微生物含有編碼苯丙氨酸解氨酶并與表達 信號有效連接的異源DNA序列的一個或多個拷貝，并且含有編碼肉桂
酸-4-羥化酶并與表達信號有效連接的異源DNA序列的一個或多個拷 貝，并且含有編碼4-香豆酸CoA連接酶并與表達信號有效連接的異源 DNA序列的一個或多個拷貝，并且含有編碼白藜，醇合酶并與表達信 號有效連接的異源DNA序列的一個或多個拷貝。它們還包括這樣的微生物其中缺乏肉桂酸-4-羥化酶活性，并且含 有編碼酪氨酸解氨酶并與表達信號有效連接的異源DNA序列的一個或 多個拷貝，并且含有編碼4-香豆酸-CoA-連接酶并與表達信號有效連接 的異源DNA序列的一個或多個拷貝，并且含有編碼白藜聲醇合酶并與 表達信號有效連接的異源DNA序列的一個或多個拷貝。在本文中，術(shù)語"微生物"涉及顯微鏡可見的生物體，包括細菌， 顯微鏡可見的真菌，包括酵母。更具體地，所述微生物可以是真菌，更具體地為屬于曲霉屬的絲狀 真菌，例如黑曲霉、泡盛曲霉(A. awamori)、米曲霉、構(gòu)巢曲霉(A. nidulans);屬于酵母屬的酵母，例如釀酒酵母、克魯弗酵母(S. kluyveri )、 貝酵母(S. bay anus )、 少抱酵母(S. exiguus )、 S. sevazzi、 葡請汁酵母(S. uvarum);屬于克魯維酵母屬(Kluyveromyces )的酵 母，例如乳酸克魯維酵母(K. lactis )、馬克斯克魯維酵母馬克斯變種(K. marxianus var. marxianus )、 K. thermotolerans; 屬于假絲酵母屬的酵 母，例如產(chǎn)朊假絲酵母(C， utilis)、熱帶假絲酵母(C. tropicalis)、白 假絲酵母(C. albicans),解脂假絲酵母(C. lipolytica )、 C. versatilis; 屬于畢赤酵母屬(Pichia)的酵母，例如樹干畢赤酵母(P. stipidis)、 巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)、 P. sorbitophila;或者其它的酵母屬，例 如隱球酵母屬(Cryptococcus )、德巴利酵母屬(Debaromyces )、漢遜 酵母屬(Hansenula )、畢赤酵母屬(Pichia )、 Yarrowia、接合酵母屬(Zygosaccharomyce )或者裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces )。 就其 它的微生物而言，合適的絲狀真菌的非窮舉名單提供如下屬于青霉屬(Penicilli腿)、根霉屬(Rhizopus )、鐮孢霉屬(Fusarium)、梭鏈孢 屬(Fusidium)、赤霉屬(Gibberella )、毛霉屬(Mucor )、被孢霉屬(Mortierella )、木霉屬(Trichoderma )的物種。就細菌而言，合適的細菌的非窮舉名單給出如下屬于芽孢桿菌屬 的物種，屬于埃希氏菌屬的物種，屬于乳桿菌屬的物種，屬于乳球菌屬 的物種，屬于棒狀桿菌屬屬的物種，屬于醋酸桿菌屬的物種，屬于不動
桿菌屬的物種，屬于假單胞菌屬的物種等。本發(fā)明優(yōu)選的微生物可以是釀酒酵母、黑曲霉、米曲霉、大腸桿菌、 乳酸乳球菌或枯草芽孢桿菌?？梢圆捎闷毡楣姆椒▉砼囵B(yǎng)所構(gòu)建和改造的微生物，包括恒化 器培養(yǎng)、分批培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)等。因此，本發(fā)明包括用于產(chǎn)生白藜，醇或者其寡聚或糖苷結(jié)合衍生物的方法，所述方法包括在基本沒有外源4-香豆酸的情況下，使非植物細 胞與碳底物接觸，所述細胞具有在該條件下產(chǎn)生白藜，醇或者其寡聚或 糖苷結(jié)合衍生物的能力，其中所述微生物可選自真菌或細菌，尤其是酵 母。任選地，所述碳底物選自由單糖、寡糖和多糖組成的可發(fā)酵碳底物， 例如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、 赤蘚糖、蘇糖和/或核糖。作為補充或替代，所述碳底物可以選自不可 發(fā)酵的碳底物，包括乙醇、乙酸鹽、甘油和/或乳酸鹽。作為補充或替 代，所述不可發(fā)酵的碳底物可以選自氨基酸，可以是苯丙氨酸和/或酪 氨酸。在另一方面中，本發(fā)明包括通過異源表達編碼苯丙氨酸解氨酶、肉 桂酸4-羥化酶、4-肉桂酸CoA連接酶和白藜,醇合酶的核苷酸序列來生產(chǎn)白藜蘆醇或者其寡聚或糖苷結(jié)合衍生物的方法，還包括通過異源表 達編碼酪氨酸解氨酶、4-香豆酸CoA連接酶和白藜蘆醇合酶的核苷酸序 列來產(chǎn)生白藜蘆醇的方法。這樣產(chǎn)生的白藜蘆醇或者其寡聚或糖苷結(jié)合衍生物可以在乳制品或 者飲料(如啤酒)中作為營養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的白藜蘆醇可以是順式白藜蘆醇或者反式白藜蘆 醇，但是預(yù)計通常主要為反式形式。


為了幫助理解本發(fā)明的上述內(nèi)容，可參考附帶的附圖，其中 圖l顯示反式白藜,醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)；
圖2顯示利用作用于L-苯丙氨酸的苯丙氨酸解氨酶的苯丙素途徑；和圖3顯示利用作用于L-酪氨酸的苯丙氨酸解氨酶的另一途徑。圖4顯示在100 g/1半乳糖上培養(yǎng)的釀酒酵母菌林 FSSC-PALC4H4CLVST、 FSSC陽TAL4CLVST的提取物的HPLC層析 圖。其中包括60ng純白藜蘆醇的層析圖。圖5顯示關(guān)于純反式白藜,醇以及在100 g/l半乳糖上培養(yǎng)的釀酒酵 母菌抹FSSC-PALC4H4CLVST產(chǎn)生的反式白藜？"醇的UV吸收光譜。圖6顯示來自在50 g/1葡萄糖上培養(yǎng)的大腸桿菌菌株 FSEC-TAL4CLVST和FSEC-對照的提取物的HPLC層析圖。圖7顯示來自在添加了 20 mg/l香豆酸的50 g/l葡萄糖上培養(yǎng)的大腸 桿菌菌林FSEC-TAL4CLVST和FSEC-對照的提取物的HPLC層析圖。 其中包括在菌林FSEC-TAL4CLVST中產(chǎn)生的反式白藜蘆醇的UV吸收 光謙。本發(fā)明將通過以下的非限制性實施例來進一 步描述和說明。 實施例 實施例1分離編碼PAL、 TAL、 C4H、 CPR、 4CL和VST的基因使用表1中的引物通過PCR從擬南芥的cDNA( BioCat,Heidelberg, Germany)中分離苯丙氨酸解氨酶(PAL2 ) ( Cochrane Wfl/.， 2004; SEQ ID NO: 1 、 2 )、肉桂酸4畫羥化酶(C4H) ( Mizutani " a/" 1997; SEQ ID NO: 3、 4 )和4-香豆酸:輔酶A連接酶(4CL1 X Hamberger and Hahlbrock 2004;Ehlting^fl/.，1999;SEQIDNO:5、 6)。由于動力學(xué)參數(shù)分別有利 于肉桂酸和香豆酰CoA (Cochrane et al.， 2004; Hamberger and Hahlbrock 2004; Ehlting et al.， 1999 )，因此PAL2和4CL1選自幾種擬南 芥同源物。使用www.entelechon.com的在線4良務(wù)回譯工具，對來自圓葉大黃 (i /i^/附)的白藜蘆醇合酶(VST )的編石馬序列(Samappito etal., 2003; SEQ ID NO: 7， 8 )和來自莢膜紅細菌的酪氨酸解氨酶(TAL ) 的編碼序列(Kyndt et al., 2002; SEQ ID NO: 11、 12 )進行密碼子優(yōu)化， 以用于在釀酒酵母中表達，分別得到序列SEQ ID NO: 9、 10和SEQ ID NO: 13、 14。在MWG Biotech構(gòu)建用于裝配合成基因的寡聚物，并使表l.用于基因擴增的引物和限制性位點用于基因擴增的引物' (限制性位點用下劃線標示)基因限制性位點 引物限制性位點 載體5' -CGGAATTCTCATGGATCAAATCGAAGCAATGTTPAL2EcoRlEcoRl5' -CGACTAGTTTAGCAAATCGGAATCGGAGCPAL2SpelSpel5'-CGCTCGAGAT ATGGACCTCCTCTTGCTGGAC4HXholXhol5'-CGGGTACCTTAACAGTTCCTTGGTTTCATAACC4HKpnlKpnl5' -GCTCTAGACCT ATGGCGCCACAAGAACAAGCAGTTT4CL1XbalSpel5'-GCGGATCCCCT TCACAATCCATTTGCTAGTTT TGCC4CIilB柳HlBglII5'-CC GGATCCAAATGGCCCCAGAAGAGAGCAGGVSTBamHlBamHl5' -CG CTCGAGTTAAGTGATCAATGGAACCGAAGACAGVSTXholXhol5' -CCGAATTCCCATGACCCTGCAATCTCAAACAGCTAAAGTALEcoRlECORI5' -CCACTAGTTTAAGCAGGTGGATCGGCAGCTTALSpelSpel5' -CCCTCGAGATCATGCCGTTTGGAATAGACAACACCGACPR1XholXhol5' -CCAAGCTTATCGGGCTGATTACCAGACATCTTCTTGCPR1HindIIIHindI工I5'-CCGGATCCCCATGTCCTCTTCTTCTTCTTCGTCAACAR2BamhlBamhl5'-CCCTCGAGGTGAGTGTGTGGCTTCAATAGTTT CGAR2XholXhol* SEQ工D Nos 19-32用對下文Martin et al. ( 2003 )稍加改良的方法通過PCR裝配所述合成 基因。將來自MWG的用于裝配合成基因的引物溶于milliQ水中，濃度為 100pmole/jil。將每種引物5 jil的等分試樣組合在總混合物中，隨后用 milliQ水稀釋10倍。每50 nl使用5 jil經(jīng)稀釋的總混合物作為融合DNA 聚合^ (Finnzymes)的模板，通過PCR裝配所述基因。PCR程序如 下首先為98"C30秒；隨后為98t:i0秒、1分鐘和72*C 1分鐘/ 千堿基對的30個循環(huán)；最后為721C 5分鐘。在1%瓊脂糖凝膠上純化 20 nl所得的PCR反應(yīng)物。結(jié)果為PCR彌散條帶，從瓊脂糖凝膠上切 下所需大小條帶周圍的區(qū)域，并應(yīng)用QiaQuick凝膠提取試劑盒 (Qiagen)對其進行純化。使用表1中的外部引物(針對TAL和VST 的)的最后一次PCR產(chǎn)生所需的TAL和VST基因。采用Quickchange
定點誘變II試劑盒(Stratagene， La JoUa， CA)或者對來自幾種不同 大腸桿菌亞克隆的重疊的無差錯DNA節(jié)段應(yīng)用PCR來修正點突變。 使用表l中的引物，分別從擬南芥cDNA (BioCat， Heidelberg)和釀 酒酵母基因組DNA中分離來自擬南芥(AR2) (Mizutani and Ohta, 1998; SEQ ID NO: 17,18)和來自釀酒酵母(CPR1)( Aoyama et al.， 1978; SEQ ID NO: 15， 16)的NADPH:細胞色素P450還原^ (CPR)。實施例2構(gòu)建用于表達PAL的酵母栽體應(yīng)用在5'突出端中含有EcoRl和Spel限制性位點的正向和反向引 物(表l)，通過PCR再擴增如實施例l所述分離的編碼PAL的基因。 用EcoRl/Spel消化擴增的PAL PCR產(chǎn)物并將其連接進經(jīng)EcoRl/Spel 消化的pESC-URA載體(Stratagene),得到載體pESC-URA-PAL。通 過對兩個不同克隆進行測序來確認該基因的序列。實施例3構(gòu)建用于表達PAL和C4H的酵母栽體應(yīng)用在5，突出端中含有Xhol和Kpnl限制性位點的正向和反向引 物，通過PCR擴增如實施例1所述分離的編碼C4H的基因。用 Xhol/Kpnl消化擴增的C4H PCR產(chǎn)物并將其連接進同樣消化的 pESC-URA-PAL載體。得到的質(zhì)粒pESC-URA-PAL-C4H中含有反向 (divergent) GAL1/GAL10啟動子控制下的編碼PAL和C4H的基因。 通過對兩個不同克隆進行測序來確認編碼C4H的基因的序列。實施例4構(gòu)建用于表達4CL的酵母栽體如實施例1所述分離編碼4CL的基因。用Xbal/BamHl消化擴增 的4CL PCR產(chǎn)物并將其連接進經(jīng)Spel/Bglll消化的pESC-TRP載體 (Stratagene )， 得到載體pESC-TRP-4CL 。
對兩個不同的 pESC-TRP-4CL克隆進行測序以確認所克隆基因的序列。實施例5
構(gòu)建用于表達4CL和VST的酵母載體
如實施例1所述分離編碼VST的基因。用BamHl/Xhol消化擴增 的合成VST基因并將其連接進經(jīng)BamHl/Xhol消化的pESC-TRP-4CL (實施例4 )。得到的質(zhì)粒pESC-TRP-4CL-VST中含有反向 GAL1/GAL10啟動子控制下的編碼4CL和VST的基因。通過對兩個不 同的pESC-TRP-4CL-VST克隆進行測序來確i^編碼VST的基因的序 列。
實施例6構(gòu)建用于表達TAL的酵母載體如實施例1所述分離編碼TAL的基因。用EcoRl/Spel消化擴增的 合成TAL基因并將其連接進經(jīng)EcoRl/Spel消化的pESC-URA栽體。 得到的質(zhì)粒pESC-URA-TAL含有反向GAL1/GAL10啟動子控制下的 編碼TAL的基因。通過對兩個不同的pESC-URA-TAL克隆進行測序來 確認序列。
實施例7構(gòu)建用于過表達釀酒酵母內(nèi)源性CPR的酵母載體如實施例1所述分離來自釀酒酵母的編碼CPR的基因(CPR1)。 用Xhol/Hindlll消4匕擴增的CPR1基因并將其連接進經(jīng)Xhol/Hind111 消化的pESC-LEU載體(Stratagene)，得到載體pESC-LEU-CPRl。 通過對兩個不同的pESC-LEU-CPRl克隆進行測序來確認序列。
實施例8構(gòu)建用于過表達擬南芥CPR (AR2)的酵母栽體如實施例1所述分離來自擬南芥的編碼CPR的基因(AR2)。用 BamHl/Xhol消化擴增的AR2基因并將其連接進經(jīng)BamHl/Xhol消化 的pESC-LEU載體(Stratagene )，得到載體pESC-LEU-AR2。通過對 兩個不同的pESC-LEU-AR2克隆進行測序來確認序列。實施例9
使用PAL、 C4H、 4CL和VST在釀酒酵母中表達通向白藜,醇的途徑分別地或組合地應(yīng)用如實施例2、 3、 4、 5、 6、 7和8所述的載體來 轉(zhuǎn)化含有適當遺傳標記的酵母菌林。根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法來實施所述 酵母細胞的轉(zhuǎn)化，例如通過利用感受態(tài)細胞或者通過電穿孔(參閱如 Sambrook et al.， 1989 )。在無尿嘧咬和/或色氨酸的培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體 并且在相同的培養(yǎng)基上進行劃線純化。分別用栽體pESC-URA-PAL (實施例2 )和pESC-URA-PAL-C4H (實施例3 )轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌林CEN.PK 113-5D ( MATa ura3 )，分別 得到菌林FSSC-PAL和菌林FSSC-PALC4H。用pESC-URA-PAL-C4H 和pESC-TRP-4CL(實施例4 )共轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌^FS01267( MATa trpl ura3 )， 將轉(zhuǎn)化的菌林命名為 FSSC-PALC4H4CL 。 還用 pESC畫URA-PAL國C4H和pESC-TRP畫4CL-VST (實施例5 )共轉(zhuǎn)化相同 的菌林，得到菌林FSSC-PALC4H4CLVST。實施例10使用TAL、 4CL和VST在釀酒酵母中表達通向白藜,醇的途徑分別用栽體pESC-URA-TAL(實施例6 )轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌林CEN.PK 113-5D ( MATa ura3 )，得到菌林FSSC-TAL。用pESC-URA-TAL (實 施例6)和pESC-TRP-4CL (實施例4)共轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌林FS01267 (MATa trpl ura3 )，將轉(zhuǎn)化的菌林命名為FSSC-TAL4CL。還用 pESC-URA-TAL和pESC-TRP-4CL-VST (實施例5)共轉(zhuǎn)4匕相同的菌 林，得到菌林FSSC-TAL4CLVST。在無尿嘧啶和/或色氨酸的培養(yǎng)基上 選擇轉(zhuǎn)化體并在同樣的培養(yǎng)基上劃線純化。實施例11使用過表達的內(nèi)源性CPR在釀酒酵母中表達通向白藜蘆醇的途徑用載體pESC-URA-PAL-C4H (實施例3 )、 pESC-TRP-4CL (實施 例4)和pESC-LEU-CPRl (實施例7)共轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌抹FS01277 (MATa ura3leu2trpl )。 轉(zhuǎn)化的菌林命名為 FSSC-PALC4H4CLVSTCPR。在無尿嘧咬和/或色氨酸的培養(yǎng)基上選擇 轉(zhuǎn)化體并在同樣的培養(yǎng)基上劃線純化。
實施例12使用過表達的擬南芥CPR ( AR2 )在釀酒酵母中表達通向白藜，醇的途 徑用載體pESC-URA-PAL-C4H (實施例3 )、 pESC-TRP-4CL (實施 例4)和pESC-LEU-AR2 (實施例8)共轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌林FS01277 (MATaura3leu2trpl )。 轉(zhuǎn)化的菌林命名為 FSSC-PALC4H4CLVSTAR2。在無尿嘧咬和/或色氨酸的培養(yǎng)基上選擇 轉(zhuǎn)化體并在同樣的培養(yǎng)基上劃線純化。實施例13在搖瓶中用重組酵母菌林進行發(fā)酵用無菌接種環(huán)從瓊脂平板中接種重組酵母菌林并在200 ml確定成 分的礦物培養(yǎng)基(Verduynetal， 1992)中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有維生 素、微量元素、5 g/1葡油糖和40 g/1或100 g/1半乳糖。將500 ml塞好 的搖瓶在30"C以160 rpm孵育3天。實施例14 白藜蘆醇的提取通過5000 g離心5分鐘來收集細胞。將50 ml上清液等分試樣用20 ml乙酸乙酯萃取一次。將乙酸乙酯凍干并將千產(chǎn)物重新溶于0.7 ml甲 醇并過濾至HPLC管中。將來自200 ml培養(yǎng)基的細胞沉淀溶解在1-2 ml 水中，并分裝在3個fastpr印管中，用玻璃珠破碎。將來自三個管的粗 提物合并在50 ml sartorius管中的10 ml 100%甲醇中，在暗冷室內(nèi)于4 "C在旋轉(zhuǎn)室(rotary chamber)上提取48小時。48小時后，以5000 g 離心5分鐘除去細胞碎片，并通過凍干過夜而除去曱醇。將干燥的殘余 物重新溶于1 ml pH 5.4的磷酸-檸檬酸緩沖液中，并加入10單位來自 杏仁的P-葡糖苷酶(Sigma),以從推定的葡糖苷結(jié)合形式中釋放白藜， 醇。在37C下孵育該混合物3小時，隨后用lml的乙酸乙酯萃取2次。 將合并的乙酸乙酯凍干，將干燥的殘余物重新溶于0.7ml曱醇中，并過 濾至HPLC管中。實施例15白藜，醇的分析 薄層層析開發(fā)了基于薄層層析的方法用于快速篩選分析，所述方法能夠在同一 TLC-板上快速分開肉桂酸、香豆酸和白藜蘆醇。用500微升乙酸乙 酯提取l ml含有細胞和上清液的培養(yǎng)物等分試樣，并且用微型離心機 以13000 rpm離心30秒。干燥乙酸乙酯并重新溶于甲醇。在含有熒光 指示劑的Silica G板(0.2 mm AIugram SIL G/UV254， Macherey-Nagel) 上分析該提取物。流動相為氯仿、乙酸乙酯和甲酸(25:10:1)的混合物。HPLC為了定量分析肉桂酸、香豆酸和白藜蘆醇，通過高效液相層析 (HPLC) Agilent Series 1100系統(tǒng)(Hewlett Packard)分離樣品，然 后在X-306 nm處用uv-二極管陣列進行檢效'J。以40"C應(yīng)用Phenomenex (Torrance, CA， USA) Luna 3微米C18 ( 100 x 2.00 mm )柱。使用梯 度乙腈和milliq水(兩者都含有50 ppm三氟乙酸)作為流動相，流量 為0.4 ml/min。在20分鐘中，梯度譜從15%乙睛至100%乙睛呈線性分 布。洗脫時間對于香豆酸約為3.4分鐘，對于游離的反式白藜蘆醇約為 5.5分鐘，對于肉桂酸約為6.8分鐘。純白藜蘆醇標準品購自Cayman chemical company, 而純香豆酸和肉桂酸才示準品購自Sigma。結(jié)果如實施例13中所述，在100 g/1半乳糖上培養(yǎng)菌抹 FSSC-PALC4H4CLVST和FSSC-TAL4CLVST，并根據(jù)實施例14和15 分析它們的胞內(nèi)白藜蘆醇含量。此外，把僅含有空載體pESC-URA和 pESC-TRP的對照菌林FSSC-對照包括在內(nèi)。HPLC分析顯示菌林 FSSC-PALC4H4CLVST和FSSC-TAL4CLVST含有保留時間為5.5分鐘 的組分，這與反式白藜，醇一致(圖4)。還通過UV吸收光譜證實了該結(jié)果，所述光鐠與純反式白藜，醇的吸收光譜(圖5)相似，其^ax約為306nm。因此，所述結(jié)果證明在釀酒酵母中存在活躍的笨丙素途徑， 所述途徑引起在體內(nèi)產(chǎn)生反式白藜，醇。通過在分批和連續(xù)培養(yǎng)中在明 確規(guī)定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)菌株和/或優(yōu)化各個酶的表達/活性，很有可能 改善白藜蘆醇的產(chǎn)生。
實施例16構(gòu)建用于在大腸桿菌中表達TAL的細菌載體通過PCR從質(zhì)粒pESC-URA-TAL (實施例6 )上再擴增如實施例1 所述分離的編碼TAL的基因，其中使用正向引物5，-CCG CTCGAG CGG ATG ACC CTG CAA TCT CAA ACA GCT AAA G-3' SEQ ID NO 33和反 向引物5'國GC GGATCC TTA AGC AGG TGG ATC GGC AGC T畫3' SEQ ID NO 34，它們的5，突出端中分別含有限制性位點XhoI和BamHI。在基 因的5，和3，末端引入限制性位點允許將限制性PCR產(chǎn)物連接進經(jīng)Xhol 和BamHI消化的pET16b栽體(Novagen)，從而產(chǎn)生pET16b-TAL。 pET16b載體含有氨爺青霉素抗性基因和T7啟動子。因此，以上方案產(chǎn)生 具有抗生素選擇標記的載體，其含有在T7啟動子控制下的編碼TAL的基 因。通過對一個pET16b-TAL克隆進行測序來確認編碼TAL的基因的序 列。實施例17構(gòu)建用于在大腸桿菌中表達4CL和VST的細菌栽體用限制性酶BamHI和Xhol從經(jīng)消化的質(zhì)粒pESC-TRP-4CL-VST(實 施例5)中切下如實施例1所述分離的編碼VST的基因，所述質(zhì)粒含有編 碼4CL和VST的基因。將VST基因連接進含有卡那霉素抗性基因的 pET26b載體(Novagen )，用BamHI和Sail消化得到pET26b-VST。限 制性酶Xhol和Sail具有相容性末端，這使得可以實現(xiàn)正確的連接。pET26b 載體含有卡那霉素抗性基因和T7啟動子。因此，上述方案產(chǎn)生具有抗生 素選擇標記的載體，其含有在T7啟動子控制下的編碼VST的基因。通過 PCRv^f粒pESC-URA-4CL-VST (實施例5 )上再擴增如實施例1所述 分離的編碼4CL的基因，其中使用正向引物5'-TG CCATGG CA ATGGCGCCAC AAGAACAAGC AGTTT-3' SEQ ID NO 35和反向引物 5'-GC GGATCC CCT TCA CAA TCC ATT TGC TAG TTT TGCC-3， SEQ ID NO 36，它們的5，突出端中分別含有限制性位點Ncol和BamHI。在基 因的5，和3，末端引入限制性位點允許將限制性PCR產(chǎn)物連接進經(jīng)Ncol和 BamHI消化的pET16b載體(Novagen )。得到的質(zhì)粒pET16b-4CL含有 在T7啟動子控制下的編碼4CL的基因。通過PCR從^粒pET16b-4CL 上以一個片段擴增T7啟動子和編碼4CL的基因，其中使用正向引物5'-TT
GCGGCCGC AAA TCT CGA TCC CGC GAA ATT AAT ACG-3' SE() ID NO 37和反向引物5'-CG CTCGAG CCT TCA CAA TCC ATT TGC TAG TTT TGCC-3' SEQ ID NO 38，它們的5，突出端中分別含有限制性位點 Notl和Xhol。在所述DNA片段的5，和3'末端引入限制性位點允許將限制 性PCR產(chǎn)物連接i^"粒pET26b-VST，所M粒在連接前用Notl和Xhol 消化。得到的質(zhì)粒pET26b-VST-4CL含有兩個基因4CL和VST，每一個 均在單獨的T7啟動子控制之下。實施例18使用TAL、 4CL和VST在大腸桿菌中表達通向白藜蘆醇的途徑根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法進行細菌細胞的轉(zhuǎn)化，例如通過^f吏用感受態(tài)細 胞或者通過電穿孔(參閱如Sambrook et al.， 1989 )。用兩種載體 pET16b-TAL (實施例16)和pET26b-VST-4CL (實施例17 )共轉(zhuǎn)化;U^ 桿菌菌林BL21 (DE3)(Novagen)，得到菌林FSEC-TAL4CLVST。另夕卜， 用兩種空栽體pET16b (Novagen)和pET26b (Novagen)共轉(zhuǎn)4匕大腸桿 菌菌林BL21 (DE3)，得到作為對照菌林的菌林FSEC-對照。在含有100 Hg/ml的氨千青霉素和60叫/ml的卡那霉素的Luria-Bertani (LB )培養(yǎng)基 上選擇轉(zhuǎn)化體。實施例19在搖瓶中用重組;U^桿菌菌林進行發(fā)酵在玻璃管中，以160 rpm 和37C在含有100 ng/ml氨千青霉素和60 Hg/ml卡那霉素的7 ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌BL21 (DE3 )的預(yù)培養(yǎng) 物。以指數(shù)生長的預(yù)培養(yǎng)物接種含有200 ml LB培養(yǎng)基的500 ml帶擋板的 搖瓶，并以160 rpm和37X:孵育，所述培養(yǎng)基中補充了 50 g/1葡萄糖、5 g/1 K2HP04、 80ng/ml氨節(jié)青霉素和50ng/ml卡那霉素。5小時后，加入終濃 度1 mM的異丙基p-D硫代半乳糖苷(IPTG )，作為三種基因TAL、 4CL 和VST中每種基因之前的T7啟動子的誘導(dǎo)物。在37匸下孵育48小時后， 收集細胞、進行分離方案并分析所產(chǎn)生的白藜，醇的存在情況。實施例20提取和分析大腸桿菌中的白藜聲醇 利用如實施例14和15所述的方法進行提取和分析。 結(jié)果如實施例19所述在50 g/1葡萄糖上培養(yǎng)菌林FSEC-TAL4CLVST和 FSEC-對照，并按照實施例14和15分析其胞內(nèi)白藜,醇含量。HPLC 分析顯示菌林FSEC-TAL4CLVST的確含有一種數(shù)量可觀的組分，其保 留時間為3.4分鐘，與香豆酸一致(圖6)。然而，該提取物中不含有與 反式白藜蘆醇在相同時間洗脫的組分。因此，該結(jié)果表明酪氨酸解氨酶 (TAL )實際上是有活性的，但是并沒有引起產(chǎn)生可檢測量的白藜蘆醇。 然而，未形成白藜聲醇可能是由于i)香豆酸CoA連接酶(4CL)無 功能；ii)白藜聲醇合酶(VST)無功能；iii)香豆酸水平過低，而這 些是由非最佳培養(yǎng)條件、非最佳TAL表達/活性或由香豆酸向其他產(chǎn)物 的支化導(dǎo)致的。為評估所述假說，在與實施例19所述相似但含有20 mg/1 香豆酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌林。其后對FSEC-TAL4CLVST提取物的 HPLC分析確實顯示在與反式白藜，醇相同的保留時間附近有一 串峰， 而這在FS-對照的提取物中卻沒有觀察到(圖6)。實際上，保留時間為 5.5分鐘的峰的UV吸收光鐠與純反式白藜蘆醇的光鐠相似(圖7)，而 對照菌林中的峰卻沒有獲得這樣的光語。因此，所述結(jié)果強烈提示在大 腸桿菌中存在活躍的苯丙素途徑，所述途徑可引起產(chǎn)生白藜蘆醇。通過 在分批和連續(xù)培養(yǎng)中在明確規(guī)定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)菌林和/或優(yōu)化各個 酶的表達/活性，很有可能無需添加香豆酸而實現(xiàn)白藜，醇生產(chǎn)。實施例21構(gòu)建用于在乳酸乳球菌中表達PAL和C4H的細菌載體以下實施例中使用的質(zhì)粒pSH71和其衍生物為雙功能性穿梭載體，具 有來自大腸桿菌和乳酸乳球菌的多個復(fù)制起點。由此，宿主范圍特異性涵 蓋了大腸桿菌和其它的乳酸菌物種。雖然在乳酸乳球菌中實施轉(zhuǎn)化通常不 會遇到問題，但是可以通過使用大腸桿菌作為構(gòu)建重組質(zhì)粒的中間宿主來 克服推測在其它乳酸菌物種中存在的轉(zhuǎn)化困難。所述質(zhì)粒含有一種或多種 標記基因，以允許從不帶有它們的微生物中糸遞出帶有它們的微生物。用 于乳酸乳球菌的選擇系統(tǒng)基于顯性標記，例如對紅霉素和氯霉素的抗性， 但是也已描述了基于涉及碳水化合物代謝的基因、肽酶和食品分級標記的 系統(tǒng)。另外，所述質(zhì)粒含有允許重組基因表達的啟動子和終止子序列。合
適的啟動子取自乳酸乳球菌的基因，例如lacA。此外，所述質(zhì)粒含有合適 的獨特限制性位點，以便于克隆DNA片段和隨后對重組體進行鑒定。在 以下實施例中，所述質(zhì)粒含有或紅霉素抗性基因(稱為pSH71-ERYr)或 氯霉素抗性基因(稱為pSH71-CMr )。使用5，突出端中含有適當限制性位點的正向和反向引物，通過PCR從 質(zhì)粒pESC-URA-PAL-C4H (實施例3)上再擴增如實施例1所述分離的 編碼PAL的基因。在基因的5，和3，末端引入所述限制性位點允許將限制 性PCR產(chǎn)物連接進經(jīng)消化的pSH71-ERYr栽體，所述栽體^^有來自乳酸 乳球菌的lacA啟動子。得到的質(zhì)粒pSH71-ERY匕PAL含有在來自乳酸乳 球菌的lacA啟動子控制下的編碼PAL的基因。使用5，突出端中含有適當 限制性位點的正向和反向引物，通過PCR從質(zhì)粒pESC-URA-PAL-C4H(實 施例3)上再擴增如實施例1所述分離的編碼C4H的基因。在基因的5， 和3'末端引入所述限制性位點允許將限制性PCR產(chǎn)物連接進經(jīng)消化的 pSH71-C]VT栽體，得到pSH71-C]Vr-C4H。使用5，突出端中含有適當限制 性位點的正向和反向引物，通過PCR從質(zhì)粒pSH71-CM^C4H上以一個 片段再擴增lacA啟動子和編碼C4H的基因。在所述DNA片段的5，和3， 末端引入所述限制性位點允許將限制性PCR產(chǎn)物連接進經(jīng)消化的質(zhì)粒 pSH71-ERYr-PAL。得到的質(zhì)粒pSH71-ERYr-PAL-C4H含有編碼PAL和 C4H的基因，每個基因均在各自lacA啟動子的控制下。通過對兩個不同 的pSH71-ERY""-PAL-C4H克隆進行測序來確認編碼PAL和C4H的基因 的序列。實施例22構(gòu)建用于在乳酸乳球菌中表達TAL的細菌載體使用5，突出端中含有適當限制性位點的正向和反向引物，通過PCR從 質(zhì)粒pESC-URA-TAL (實施例6)上再擴增如實施例1所述分離的編碼 TAL的基因。在基因的5，和3'末端引入所述限制性位點允許將限制性PCR 產(chǎn)物連接進經(jīng)消化的pSH71-ERYf載體。得到的質(zhì)粒pSH71-ERY""-TAL含 有在來自乳酸乳球菌的lacA啟動子控制下的編碼TAL的基因。通過對兩 個不同的pSH71-ERY""-TAL克隆進行測序來確認編碼TAL的基因的序列。實施例23 構(gòu)建用于在乳酸乳球菌中表達4CL和VST的細菌載體使用5，突出端中含有適當限制性位點的正向和反向引物，通過PCR從 質(zhì)粒pESC-TRP-4CL-VST (實施例5 )上再擴增如實施例1所述分離的編 碼4CL的基因。在基因的5，和3'末端引入所述的限制性位點允許將限制 性PCR產(chǎn)物連接進經(jīng)消化的PSH71-CM1"載體。得到的質(zhì)粒 pSH71-CJVT-4CL含有在來自乳酸乳球菌的lacA啟動子控制下的編碼4CL 的基因。使用5，突出端中含有適當限制性位點的正向和反向引物，通過 PCR從質(zhì)粒pESC-TRP-4CL-VST (實施例5)上再擴增如實施例1所述 分離的編碼VST的基因。在基因的5，和3'末端引入所述限制性位點允許 將限制性PCR產(chǎn)物連接進經(jīng)消化的PSH71-ERY1"載體。得到的質(zhì)粒 pSH71-ERY""-VST含有在來自乳酸乳球菌的lacA啟動子控制下的編碼 VST的基因。使用5，突出端中含有適當限制性位點的正向和反向引物，通 過PCR從質(zhì)粒pSH71-ERY^VST上以一個片段再擴增lacA啟動子和編碼 VST的基因。在所述DNA片段的5，和3'末端引入所述限制性位點允許將 限制性PCR產(chǎn)物連接進經(jīng)消化的質(zhì)粒pSH71-CIVr-4CL。得到的質(zhì)粒 pSH71-CM""-4CL-VST含有編碼4CL和VST的基因，每個基因均在各自 lacA啟動子的控制下。通it) t兩個不同的pSH71-CJVT-4CL-VST克隆進行 測序來確認編碼4CL和VST的基因的序列。實施例24在乳酸乳球菌中表達通向白藜,醇的途徑分別或者組合4吏用實施例21、 22和23所述栽體轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌菌林。 根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法進行細菌細胞的轉(zhuǎn)化，例如通過使用感受態(tài)細胞或 者通過電穿孔(參閱如Sambrooketa1.，1989)。在含有抗生素紅霉素和氯 霉素的培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體并在同樣的培養(yǎng)基上劃線純化。分別使用栽體pSH71-ERYr-TAL (實施例22)轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌菌林 MG1363，得到菌林FSLL-TAL;使用pSH71-ERYr-PAL-C4H(實施例21) 進行轉(zhuǎn)化，得到菌株FSLL-PALC4H;使用pSH71-GVf-4CL-VST (實施 例23 )進行轉(zhuǎn)化，得到菌林FSLL-4CLVST。此夕卜，使用pSH71-ERYr-TAL (實施例22 )和pSH71-C]Vf-4CL-VST (實施例23 )共轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌菌 抹MG1363 ， 轉(zhuǎn)化的菌林命名為FSLL-TAL4CLVST 。還使用 pSH71-ERYr-PAL-C4H (實施例21)和pSH71-CMr-4CL-VST (實施例 23)共轉(zhuǎn)化同一菌林，得到菌林FSLL-PALC4H4CLVST。 實施例25在發(fā)酵罐中用重組乳酸乳球菌菌林進行發(fā)酵可以在以分批、補料分批或者恒化培養(yǎng)方式運轉(zhuǎn)的發(fā)酵罐中培養(yǎng)所述 重組酵母菌抹。分批和補料分批培養(yǎng)在帶擋板的生物反應(yīng)器中以1.5升的工作體積在厭氧、需氧或者微量 需氧條件下培養(yǎng)所述微生物。以30t:和350 rpm孵育所有的培養(yǎng)物。通過 自動添加10 M KOH來維持恒定的pH 6.6。;確定成分的MS10培養(yǎng)基中 的乳糖上培養(yǎng)細胞以允許其在需氧條件下生長，所述培養(yǎng)基中補充了 MnS04 (1.25 x 105 g/1),硫胺素(1 mg/1)和DL-6,8畫硫辛酸(2.5 mg/1 )。 乳糖濃度為例如50 g/l。用預(yù)培養(yǎng)物的細胞接種生物反應(yīng)器，所述預(yù)培養(yǎng) 物在30 "C下在搖瓶中以3倍濃度K2HP04和KH2P04緩沖的上述培養(yǎng)基上 培養(yǎng)。通it^接種前以N2 (99.998%純度)沖刷培養(yǎng)基和在培養(yǎng)期間維持 通過生物反應(yīng)器頂部空間的50 ml/分鐘的]\2恒流來確保厭氧#^。用于微 量需氧和需氧培養(yǎng)的生物>^應(yīng)器裝備了用空氣(DOT, 100% )和N2( DOT, 0%)校準的極鐠氧氣傳感器。通過以1 wm的速率向生物^^應(yīng)器噴射空 氣以確保DOT高于80%來獲得需氧條件。在微量需氧試驗期間，通過以 0.25 wm的速率向生物反應(yīng)器噴射氣體使DOT保持恒定為5%，所述氣體由N2和大氣的混合物《且成。恒化培養(yǎng)在恒化培養(yǎng)中，可以在例如1 L工作體積的Applikon實騶^發(fā)酵罐中以 30匸和350 rpm培養(yǎng)所述細胞。稀釋速率(D)可設(shè)定為不同的值，例如 0.050 h1、 0,10 h1、 0.15 !^或0.20 h_1。采用補充有防沫劑(50^1/1)的上 述培養(yǎng)基，通過自動添加5M的KOH來保持pH恒定，例如pH6.6。乳 糖濃度可設(shè)定為不同的值，例如3.0g/1、 6.0g/l、 12.0 g/l、 15.0 g/1或者18.0 g/l。接種生物反應(yīng)器，4吏其初始生物量濃度為1 mg/1,并且在指數(shù)生長期 結(jié)束時打開給料泵。通過向生物反應(yīng)器的頂部導(dǎo)入50 ml/分鐘的N2 (99.998%純度)來獲得厭氧穩(wěn)態(tài)。通過以250ml/分鐘的速率向生物反應(yīng) 器噴射由N2 (99.998%純度)和大氣以不同比例組成的氣體，可以獲得不
同的缺氧穩(wěn)態(tài)。通過向生物反應(yīng)器噴射空氣(100% DOT )和N2( 0% DOT ) 來校準氧電極。對于所有的條件，氣體在導(dǎo)入生物反應(yīng)器之前都要經(jīng)過無 菌過濾。將廢氣導(dǎo)向通過冷卻至低于-8"C的冷凝器，并使用聲學(xué)氣體分析 器分析其C02和02體積含量。在至少5個停留時間之后，如果在最近的 兩個停留時間內(nèi)生物量和發(fā)酵終產(chǎn)物的濃度保持不變(相對差小于5%), 則認為培養(yǎng)處于穩(wěn)態(tài)。實施例26提取和分析乳酸乳球菌中的白藜蘆醇使用如實施例14和15所述的方法進行提取和分析。 實施例27構(gòu)建用于在屬于曲霉屬的物種中表達PAL和C4H的真菌載體以下實施例中使用的質(zhì)粒來自pARpl，其含有來自構(gòu)巢曲霉的AMA1 起始復(fù)制序列，所述序列在黑曲霉和米曲霉中也支持自主質(zhì)粒復(fù)制(Gems etal.，1991)。此外，所述質(zhì)粒為穿梭載體，含有大腸桿菌的復(fù)制序列，因 此通過4吏用大腸桿菌作為構(gòu)建重組質(zhì)粒的中間宿主可以克服其在黑曲霉 和米曲霉中固有的轉(zhuǎn)化困難。所述質(zhì)粒含有一種或多種標記基因，以允許 從不帶有它們的微生物中杏遞出帶有它們的微生物。所述選擇系統(tǒng)可以基 于顯性標記，例如對潮霉素B、腐草霉素和博來霉素的抗性，或者可以為 異源性標記，例如氨基酸和pyrG基因。此外，所述質(zhì)粒含有允許重組基 因表達的啟動子和終止子序列。合適的啟動子取自構(gòu)巢曲霉基因，如alcA、 glaA、 amy、 niaD和gpdA。此外，所述質(zhì)粒含有合適的獨特限制性位點， 以便于克隆DNA片段和隨后對重組體進行鑒定。以下實施例中使用的質(zhì) 粒含有強組成型gpdA-啟動子和營養(yǎng)缺陷型標記，均來自構(gòu)巢曲霉；含有 涉及曱硫氨酸生物合成的基因methG的質(zhì)粒被稱為pAMAl-MET;含有 涉;5U且氨酸生物合成的基因hisA的質(zhì)粒被稱為pAMAl-HIS。使用5，突出端中含有適當限制性位點的正向和反向引物，通過PCR從 質(zhì)粒pESC-URA-PAL-C4H (實施例3)上再擴增如實施例1所述分離的 編碼PAL的基因。在基因的5，和3'末端引入所述限制性位點允許將限制 性PCR產(chǎn)物連接進經(jīng)消化的pAMAl-MET載體，其含有來自構(gòu)巢曲霉的 gpdA啟動子。得到的質(zhì)粒pAMAl-MET-PAL含有在來自構(gòu)巢曲霉的gpdA
啟動子控制下的編碼PAL的基因。使用5，突出端中含有適當限制性位點的 正向和反向引物，通過PCR >^粒pESC-URA-PAL-C4H (實施例3 )上 再擴增如實施例1所述分離的編碼C4H的基因。在基因的5，和3，末端引 入所述限制性位點允許將限制性PCR產(chǎn)物連接進經(jīng)消化的pAMAl-HIS 載體，得到pAMAl-HIS-C4H。使用5，突出端中含有適當限制性位點的正 向和反向引物，通過PCR ^t粒pAMAl-HIS-C4H上以一個片段再擴增 gpdA啟動子和編碼C4H的基因。在所述DNA片段的5，和3，末端引入所 述限制性位點允許將限制性PCR產(chǎn)物連接進經(jīng)消化的質(zhì)粒 pAMAl-MET-PAL。得到的質(zhì)粒pAMAl-MET-PAL-C4H含有編碼PAL 和C4H的基因，每個基因均在各自來自構(gòu)巢曲霉的pgdA啟動子控制之下。 通過對兩個不同的pAMAl-MET-PAL-C4H克隆進行測序來確^人編碼PAL 和C4H的基因的序列。實施例28構(gòu)建用于在屬于曲霉屬的物種中表達TAL的真菌載體使用5，突出端中含有適當限制性位點的正向和反向引物，通過PCR從 質(zhì)粒pESC-URA-TAL (實施例6)上再擴增如實施例1所述分離的編碼 TAL的基因。在基因的5'和3，末端引入所述限制性位點允許將限制性PCR 產(chǎn)物連接進經(jīng)消化的pAMAl-MET載體。得到的質(zhì)粒pAMAl-MET-TAL 含有在來自構(gòu)巢曲霉的gpdA啟動子控制下的編碼TAL的基因。通itxt兩 個不同的pAMAl-MET-TAL克隆進行測序來確定編碼TAL的基因的序 列。實施例29構(gòu)建用于在屬于曲霉屬的物種中表達4CL和VST的真菌載體使用5，突出端中含有適當限制性位點的正向和反向引物，通過PCR從 質(zhì)粒pESC-TRP-4CL-VST (實施例5 )上再擴增如實施例1所述分離的編 碼4CL的基因。在基因的5，和3，末端引入所述限制性位點允許將限制性 PCR產(chǎn)物連接至經(jīng)消化的pAMA1-HIS栽體，其含有來自構(gòu)巢曲霉的gpdA 啟動子。得到的質(zhì)粒pAMAl-HIS-4CL含有在來自構(gòu)巢曲霉的gpdA啟動 子控制下的編碼4CL的基因。使用5，突出端中含有適當限制性位點的正向 和反向引物，通過PCR vMwt粒pESC-TRP-4CL-VST (實施例5)上再擴
增如實施例1所述分離的編碼VST的基因。在基因的5，和3，末端引入所 述限制性位點允許將限制性PCR產(chǎn)物連接進經(jīng)消化的pAMAl-MET載 體，得到pAMAl-MET-VST。使用5，突出端中含有適當限制性位點的正 向和反向引物，通過PCR >^粒pAMAl-MET-VST上以一個片段再擴增 gpdA啟動子和編碼VST的基因。在所述DNA片段的5，和3，末端引入所 述限制性位點允許將限制性PCR產(chǎn)物連接進經(jīng)消化的質(zhì)粒 pAMAl-HIS-4CL。得到的質(zhì)粒pAMAl-HIS-4CL-VST含有編碼4CL和 VST的基因，每個基因均在各自來自構(gòu)巢曲霉的pgdA啟動子控制之下。 通it^f兩個不同的pAMAl-HIS-4CL-VST克隆進行測序來確認編碼4CL 和VST的基因的序列。實施例30在黑曲霉中表iiit向白藜蘆醇的途徑分別或組合使用實施例27、 28和29中所述的載體轉(zhuǎn)化黑曲霉菌林。 按照本領(lǐng)域>^的方法進行真菌細胞的轉(zhuǎn)化，例如電穿孔或者掩^ (參閱 如Sambrook et al., 1989 )。在無甲^t^酸和/或組氨酸的基^^養(yǎng)基上朝遞 轉(zhuǎn)化體。分別用以下載體轉(zhuǎn)化組氨酸和曱硫氨酸營養(yǎng)缺陷型黑曲霉菌林，例如 菌林FGSC A919 (參閱http:〃www.fgscnet):栽體pAMAl-MET-TAL (實 施例28),得到菌林FSAN-TAL;栽體pAMAl-MET-PAL-C4H (實施例 27 )，得到菌林FSAN-PALC4H;栽體pAMAl-HIS-4CL-VST(實施例29 )， 得到菌抹FSAN-4CLVST。此外，用pAMAl-MET-TAL (實施例28)和 pAMAl-HIS-4CL-VST (實施例29)共轉(zhuǎn)化黑曲霉菌株FGSC A919,轉(zhuǎn) 化的菌#^為FSAN-TAL4CLVST。還用pAMAl-MET-PAL-C4H (實施 例27)和pAMAl-HIS-4CL-VST (實施例29)共轉(zhuǎn)化同一菌林，得到菌 林FSAN畫PALC4H4CLVST。實施例31在米曲霉中表iiii向白藜蘆醇的途徑用載體pAMAl-MET-VST (實施例29)轉(zhuǎn)化米曲霉菌林，產(chǎn)生菌 抹FSAO-VST，所述米曲霉菌林含有一組編碼PAL、 C4H和4CL的天然 基因(Seshime et al.， 2005 )，并且為甲絲酸營養(yǎng)缺陷型。根據(jù)本領(lǐng)域公 知的方法進行真菌細胞的轉(zhuǎn)化，例如電穿孔或者#^(參閱如Sambrooket al.， 1989 )。在無曱硫氨酸的基4^養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。實施例32在發(fā)酵罐中用黑曲霉和米曲霉重組菌林進行發(fā)酵可以在以分批、補料分批或者恒化培養(yǎng)方式運作的發(fā)酵罐中培養(yǎng)所 述重組酵母菌株。分批和補料分批培養(yǎng)在帶擋板的生物^^應(yīng)器中以1.5升的工作體積在需氧條件下培養(yǎng)所 述微生物。以30"C500rpm孵育全部培養(yǎng)物。通過自動添加10 M KOH維 持恒定的pH 6.0，并且通過向生物>^應(yīng)器以1 vvm的速率噴射空氣來確保 DOT高于80%，以獲得需氧^H中。在由以下組分組成的確定成分培養(yǎng)基 中的葡萄糖上培養(yǎng)細胞，以允許在分批培養(yǎng)中進行培養(yǎng)7.3 g/1 (NH4)2S04、 1.5 g/1 KH2P04、 1.0 g/lMgS04.7H20、 1.0g/lNaCl、 0.1 g/1 CaCI2.2H20、 0.1 ml/1 Sigma防沫劑、7.2 mg/1 ZnS04.7H20、 1.3 mg/1 CuS04.5H20、 0.3 mg/1 NiCl2.6H20、 3.5 mg/1 MnCl2.4H20和6.9 mg/1 FeS04.7H20。葡萄糖 濃度為例如IO、 20、 30、 40或50g/1。為了允許在補料分批培養(yǎng)中進行培 養(yǎng)，在分批階段中培養(yǎng)基由以下組分組成7.3 g/1 (NH4)2S04、 4.0 g/1 KH2P04、 1.9g/lMgS04.7H20、 1.3g/lNaCl、 0.10 g/1 CaCl2.2H20、 0.1 ml/1 Sigma防沫劑、7.2 mg/1 ZnS04.7H20、 1.3 mg/1 CuS04.5H20、 0.3 mg/1 NiCl2.6H20、 3.5 mg/1 MnCl2.4H20和6.9 mg/1 FeS04.H20。 f^向反應(yīng)器 中補充如285 g/kg葡萄糖和42 g/kg (NH4)2S04。用來自預(yù)分批的游離菌絲 體接種分批和補料分批培養(yǎng)物。用2.109個孢子/1濃度的孢子接種pH 2.5 的預(yù)分批培養(yǎng)物。通過在29g稻中繁殖凍干孢子來獲得孢子，在所述稻中 補充了以下組分6 ml 15 g/1蔗糖、2.3 g/1 (NH4)2S04、 1.0 g/1 KH2P04、 0.5 g/1 MgS04.7H20、 0.50 g/1 NaCl、 14.3 mg/1 ZnS04.7H20 、 2.5 mg/ CuS04.5H20、 0.50 mg/1 NiCl2.6H20和13.8 mg/1 FeS04.7H20。以30"C繁 殖孢子7-14天，以在稻粒上產(chǎn)生黑色孢子層，并且通過加入100 ml無菌 水中的0.1。/。Tween 20來收集孢子。對于所有條件而言，氣體在導(dǎo)入生物 反應(yīng)器之前均經(jīng)過無菌過濾。引導(dǎo)廢氣通過冷卻至低于-8X:的冷凝器，并 使用聲學(xué)氣體分析器分析其co2和02體積含量。
恒化培養(yǎng)在恒化培養(yǎng)中，可以以30"C和500 rpm在例如1.5 L工作體積的 Biostat B實驗室發(fā)酵罐中培養(yǎng)細胞。通過自動添加10 M KOH保持恒定的 pH 6.0,并通過以1 v'v'm的速率向生物反應(yīng)器噴射空氣來確保DOT高于 80%，以獲得需氧條件。稀釋速率(D)可設(shè)置為不同的值，例如0.050 1T1、 0.10 h1、 0.15 h"或0.20 h1。通過自動添加10 M KOH來保持pH恒定， 例如pH 6.6,使用含有以下組分的基本生長培養(yǎng)基2.5 g/1 (NH4)2S04、 0.75 g/1 KH2P04、 1.0 g/1 MgS04.7H20、 1.0 g/1 NaCl、 0.1 g/1 CaCl2.2H20、 0.1 ml/1 Sigma防沫劑、7.2 mg/1 ZnS04.7H20、 1.3 mg/1 CuS04.5H20、 0.3 mg/1 NiCl2.6H20、 3.5 mg/1 MnCl2.4H20和6.9 mg/1 FeS04.7H20。葡萄糖濃度可 以設(shè)置為不同的值，例如3.0g/1、 6.0g/l、 12.0 g/l、 15.0 g/1或者18.0 g/l。 用來自上所述預(yù)分批培養(yǎng)的游離菌絲體接種生物反應(yīng)器，并且在指數(shù)生長 期結(jié)束時開啟給料泵。對于所有條件，氣體在引入生物反應(yīng)器之前均經(jīng)過 無菌過濾。引導(dǎo)廢氣通過冷卻至低于-8lC的冷凝器，并使用聲學(xué)氣體分析 器分析其C02和02體積含量。在至少5個停留時間之后，如果在最近的 兩個停留時間內(nèi)葡萄糖生物量的濃度和廢氣的組成保持不變(相對差小于 5%)，則認為培養(yǎng)處于穩(wěn)態(tài)。實施例33提取和分析黑曲霉和米曲霉中的白藜蘆醇采用如實施例14和15中所述的方法進行提取和分析。參考文獻Patent no, US-A-6521748Patent no, US-A-2001053847Patent no. US-A-2004059103Patent no. US-A—200術(shù)3357Allina, S.M., Pri-Hadash, A., Theilmann, D.A., Ellis, B.E. and Douglas, C.J, (1998〉 4-coumarate: Coenzyme A ligase in hybrid poplar. Properties of enzymes, cDNA cloning, and analysis of recombinant clones. Plant Physiol. 116, 743-754.Aoyama, Y-, Yoshida, Y., Kubota, S., Kumaoka, H. and Furumichi, A* (1978). NADPH-cytochrome P-450 reductase of yeast microsomes. Arch. Biochenu Biophys. 185, 362-369. Becker JV, Armstrong GO, van der Merwe MJ, Lambrechts MG, Vivier MA, Pretorius IS. (2003). Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the synthesis of the wine— related antioxidant resveratrol. FEMS Yeast Res* 4, 79-85,Blanquet, S*, Meunier, J. P*, Minekus, , Marol誦Bonnin, S,, and Alric, M. (2003). Recombinant Saccharomyces cerevisiae Expressing P450 in ArtificialDigestive Systems: a Model for Biodetoxication in the Human Digestive Environment. Appl， Environ, Microbiol. 69, 2884-2892,Celotti E and others. (1996), Resveratrol content of some wines obtained from dried Valpolicella grapes: Recioto and Amarone, Journal of Chromatography A 730, 47-52,Cochrane, F,C,, Davin, H and Lewis N,G* 《2004), The Arajbidojpsis phenylalanine ammonia lyase gene familyz kinetic characterization of the four PAL isoforms. Phytochemistry 65, 1557-1564*Couzin, J* 《2004) Aging Research's Family Feud, Science 303r 1276-1279*Ehlting, J., Blittner, D., Wang, Q,, Douglas, C,J,, Soinssich, I,E. and Kombrink, E. (1999), Three 4-co菌arate:coenzyme A ligases in AraJbidQpsis thaliana represents two evolutionary divergent classes in angiosperms* The plant journal* 19, 9-20，F(xiàn)ilpula, D,, Vaslet, C丄, Levy, A., Sykes, A, and Strausberg, R丄， Nucleotide sequence of gene for phenylalanine ammonia-lyase from 處odotoruia ruixra, (1988) * Nucleic Acids Res. 16, 11381.Gehm, B D*, McAndrews, J.M., Chien, P,Y, and Jameson, J.L, (1997). Resveratrol, a polyphenolic compound found in grapes and wine, is an agonist for the estrogen receptor, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 94, 14138-14143.Gems, , Johnstone, I丄 and Clutterbuck, A, J* (1991) An autonomously replicating plasnvid transforms Aspergillus nicfulans at high frequency. Gene 98, 61-67,Hain, R., Reif, H*J,, Krause, E，, Langebartels, R,, Kindl, H., Vornam, B., Wiese, W., Schmelzer, E., Schreier, P.H" Stocker, R*H* and Stenzel, K, (1993) , Disease resistance results from foreign phytoalexin expression in a novel plant. Nature 361, 153-156.Hwang EI, Kaneko M, Ohnishi Y, Horinouchi S, (2003). Production of plant-specific flavanones by Escherichia coli containing an artificial gene cluster* Appl. Environ* Microbiol, 69, 2699-706*Huang, M-T * (1997) Diet for cancer prevention. Food Sci 24, 713-727Hart, J, H* (1981) An亂Rev. Phytopathology 19, 437-458* Hart,J.H.,Shrimpton,D. M.(1979)Phytopathology 69, 1138-1143，Hall, S,S* (2003) In Vino Vitalis Compounds Activate Life— Extending Genes. Science 301, 1165. Hamberger, B. and Hahlbrock, K. 《2004)* The 4-coumarate:CoA ligase gene family in AraJbidopsis tftaJiana comprises one rare, sinapate-activating and three commonly occurring isoenzymes. Proc, Natl. Acad. Sci, USA, 101, 2209-2214.Jang, M., Cai, , Udeani, GO., Slowing, KV., Thomas, CF., Beecher, CWW., Fong, HHS., Farnsworth, KTR,, Kinghorn, AD,, Mehta, RG., Moon, RC., Pezzuto, JM. (1997)* Cancer Chemopreventive Activity of Resveratrol, a Natural Product Derived from Grapes. Science 275, 218-220*Jeandet, Bessis, R*, Maume, B,F., Meunier, P*, Peyron, D, and Trollat, P, (1995), Effect of Enological Practices on the Resveratrol Isomer Content of Wine J. Agric. Food Chem, 43, 316-319*Jeandet, P. Bessis, R., Sbaghi, M, and Meunier, P. (1994), Occurence of a resveratrol P-D-glucoside in wine: Preliminary studies. Vitis 33, 183-184.Koopmann, E., Logemann, E and Hahlbrock, K, (19 99), Regulation and Functional Expression of Cinnamate 4— Hydroxylase from Parsley, Plant Physiol. 119, 49—55.Kopp, P. (1998). Resveratrol, a phytooestrogen found in red wine. A possible explanation for the conundrum of the "French Paradox" Eur* J* Endocrinol. 138, 619-62CLKyndt JA, Meyer TE, Cusanovich MA, Van Beeumen JJ. 《2002), Characterization of a bacterial tyrosine ammonia lyase, a biosynthetic enzyme for the photoactive yellow protein. FEBS Lett. 512, 240—244. LaGrange, D C., Pretorius, I. S, and Van Zy 1, W. H. (19 97). Cloning of the Saciilus beta-xylosidase gene (xynB)and its expression in Saceharo/nyces cerevisiae, Appl* Microbiol, Biotechnol. 47, 262-266.Lin X., Kaul Sw Rounsley S.D,, Shea T.P" Benito M,-I., Town C,D,, Fujii C,Y" Mason T.M., Bowman C,L,, Barnstead M.E., Feldblyum T.V*, Buell C,R., Ketchum K丄,Lee J,J., Ronning C.M,, Koo H丄，,Moffat K.S., Cronin L.A., Shen M., Pai G*, Van Alcen S., Umayam L,, Tallon L,J*, Gill J,E., Adams M,D., Carrera A.J., Creasy T.H*, Goodman H.M., Somerville C.R,, Copenhaver G,P., Preuss D., Nierman W.C,, White 0., Eisen J丄,Salzberg S丄.,Fraser C,M., Venter J*C. (1999) . Sequence and analysis of chromosome 2 of the plant Araibidopsis thaJiana. Nature 402, 761-768,Lobo, R*A. (1995) Benefits and risks of estrogen replacement therapy. Am, J, Obstet. Gynecol. 173, 982-989,Martin, V,J,J*, Pitera, D.J,, Withers, S.T., Newman, J,D, and Keas1ing, J，D. 《2003). Engineering a mevalonate pathway in ffscherichia coJi for production of terpenoids. Nature biotechnology 21, 796-802.Mizutani, M., Ohta, D.and Sato, R. (1997), Isolation of a cDNA and a genomic clone encoding cinnamate 4-hydroxylase from Arabidopsis and its expression manner in planta. Plant Physiol. 113, 755-763.Ro, D,K., Mah, N., Ellis, B丄 and Douglas, C,J. (2001). Functional Characterization and Subcellular Iiocalization of Poplar (Populus tri chocarpa x Popui us deltoides) Cinnamate "Hydroxylase. Plant Physiol. 126, 317-329, Ro D.K,, Douglas C*J. (2004), Reconstitution of the entry point of plant phenylpropanoid metabolism in yeast 《Sacchajro;nyces cerevisiae) : implications for control of metabolic flux into the phenylpropanoid pathway, J. Biol. Cherru 279, 2600-2607.Rosier J, Krekel F, Amrhein N, Schmid J. (1997) . Maize phenylalanine ammonia-lyase has tyrosine ammonia—lyase activity, Plant Physiol. 113, 175-179. activity. Plant physiol. 113, 175-179,Samappito, S., Page, J.E,, Schmidt, J., De-Eknamkul, W. and Kutchan, H (2003). Aromatic and pyrone polyketides synthesized by a stilbene synthase from 處euin tataricu/n, Phytochemistry 62, 313-323.Sambrook, J., Fritsch, E. F, and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition. Cold Spring Harbor, N,Y,Schoppner, A.; Kindl, H. (1984) Purification and properties of a stilbene synthase from induced cell suspension cultures of peanut， J. Biol. Chem. 259, 6806-6811,Seshiiue, Y*, Juwadi, P.R,, Fujii, I, and Kitamoto, K. (2005). Genomic evidences for the existence of a phenylpropanoid metabolic pathway in Aspergillus oryzae* Biochem Biophys Res Commun. 337, 747-51.Urban P.- Mignotte, C., Kazmaier M,, Delorme F。 And Pompon D,《1997) , Cloning, Yeast Expression, and Characterization of the Coupling of Two Distantly Related Arai idopsis tha_Zian<3 NADPH-Cytochrome 450 Reductases with P450 CYP73A5, J, Biol. Chem. 272, 19176-19186.Watts, K.T., Lee, P.C， and Schmidt-Dannert, C. (2004). Exploring recombinant flavonoid biosynthesis in metabolically engineered Ssc力erichia co_Zi. Chemb丄ochem 5, 500-507.以下是對在本文中出現(xiàn)的核苷酸和M酸序列的總結(jié):SEQ ID NO:SEQ ID NO:SEQ ID NO:SEQ ID NO:SEQ ID NO: (4CL1 )。SEQ ID NO:SEQ ID NO:SEQ ID NO:1是來自擬南芥的核苷酸序列，編碼苯丙氨酸解氨酶(PAL2 )。2是由SEQ ID NO: 1編碼的^J^紗列。 3是來自擬南芥的核苷酸序列，編碼肉桂酸4-羥化酶(C4H )。4是由SEQ ID NO: 3編碼的^J^紗列。5是來自擬南芥的核苷酸序列，編碼4-香豆酸:輔酶A連接酶6是由SEQ ID NO: 5編碼的^J^酸序列。 7是來自圓葉大黃的核苷酸序列，編碼白藜,醇合酶(VST)。 8是由SEQ ID NO: 7編碼的^J^酸序列。SEQ ID NO: 9是來自圓葉大黃的核苷酸序列，編碼白藜聲醇合酶(VST )， 其經(jīng)密碼子優(yōu)化用于在釀酒酵母中表達。SEQ ID NO: 10是由SEQ ID NO: 9編碼的^J^酸序列。SEQ ID NO: 11是來自莢膜紅細菌的核苷酸序列，編碼酪氨酸解氨酶 (TAL )。SEQ ID NO: 12是由SEQ ID NO: 11編碼的^^醋列。SEQ ID NO: 13是來自莢膜紅細菌的核苷酸序列，編碼酪氨濕 (TAL)的，其經(jīng)密碼子優(yōu)化用于在釀酒酵母中表達。〔氨酶SEQ ID NO: 14是由SEQ ID NO: 13編碼的^J^酸序列。SEQ ID NO: 15是來自釀酒酵母的核苷酸序列，編碼NADPH:細胞色素 P450還原酶(CPR1 XSEQ ID NO: 16是由SEQ ID NO: 15編碼的^J^紗列。SEQ ID NO: 17是來自擬南芥的核苷酸序列，編碼NADPH:細胞色素P450 還原酶(AR2)。SEQ ID NO: 18是由SEQ ID NO: 17編碼的^J^紗列。 SEQ ID NO: 19-32是出現(xiàn)在實施例1的表1中的引物序列。 SEQ ID NO: 33-34是出現(xiàn)在實施例16中的引物序列。 SEQ ID NO: 35-38是出現(xiàn)在實施例17中的引物序列。
權(quán)利要求
1.微生物，其具有包含至少一種酶活性的有效代謝途徑，所述途徑產(chǎn)生4-香豆酸，并由其產(chǎn)生白藜蘆醇或者其寡聚或糖苷結(jié)合衍生物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的微生物，其中所述白藜,醇在酶催化的反應(yīng) 中產(chǎn)生，其中內(nèi)源性丙二酰CoA為底物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的微生物，其中所述白藜聲醇由4-香豆酰 CoA產(chǎn)生。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的微生物，其中所述白藜聲醇通過白藜蘆醇合 酶由4-香豆酰CoA產(chǎn)生。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的微生物，其中所述白藜蘆醇合酶在所述微生 物中由編碼所述酶的核酸表達，所述核酸對于該微生物而言是非天然 的。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的微生物，其中所述白藜，醇合酶為白藜蘆醇 合酶(EC 2.3.1.95)，其來自屬于落花生屬的植物、屬于大黃屬的植物、屬 于葡萄屬的植物或者松屬、云杉屬、百合屬、桉屬、爬山虎屬、白粉藤屬、 C"/oc/ioW"s、蓼屬、買麻藤屬、波羅蜜屬、A^/^/flg s、刺葵屬、羊茅屬、 薟草屬、藜，屬、羊蹄甲屬或老虎刺屬中任一屬的植物。
7. 才艮據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的微生物，其中所述4-香豆酸由反式 肉桂酸產(chǎn)生。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的微生物，其中所述4-香豆酸通過酶在由該酶催 化的反應(yīng)中由反式肉桂酸產(chǎn)生，其中氧為底物，NADH或NADPH為輔 因子，NAD或NADP為產(chǎn)物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的微生物，其中所述4-香豆酸通過肉桂酸4-羥 化酶由反式肉桂酸產(chǎn)生。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的微生物，其中所述肉桂酸4-羥化酶在所述微 生物中由編碼所述酶的核酸表達，所述核酸對于該微生物而言是非天然 的。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的微生物，其中所述肉桂酸4-羥化酶為肉桂 酸4-羥化酶(EC 1.14.13.11)，其來自屬于擬南芥屬的植物、屬于柑橘 屬的植物、屬于菜豆屬的植物、屬于松屬的植物、屬于楊屬的植物、屬 于茄屬的植物、屬于葡萄屬的植物、屬于玉蜀黍?qū)俚闹参锘蛘甙⒚讓佟?海欖雌屬、山茶屬、喜樹屬、M花屬、大豆屬、向日葵屬、百^屬、 日中花屬、小立碗蘚屬、蕓香屬、甘蔗屬和SH豆屬中任一屬的植物，或 者來自屬于曲霉屬的絲狀真菌。
12. 根據(jù)權(quán)利要求l-6中任一項的微生物，其中所述4-香豆酸在產(chǎn) 生氨的酶催化反應(yīng)中由酪氨酸產(chǎn)生。
13. 根據(jù)權(quán)利要求l-4中任一項的微生物，其中所述4-香豆酸通過
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的微生物，其中所述4-香豆酸通過來自酵母 或細菌的酪氨酸解氨酶(EC 4.3.1.5)產(chǎn)生。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的微生物，其中所述酪氨酸解氨酶來自酵母 深紅酵母或者來自細菌莢膜紅細菌。
16. 根據(jù)權(quán)利要求12-15中任一項的微生物，其中所述酪氨酸解氨酶在所述微生物中由編碼所述酶的核酸表達，所述核酸對于該微生物而 言是非天然的。
17. 根據(jù)權(quán)利要求9-11中任一項的微生物，其中所述反式肉桂酸 在產(chǎn)生氨的酶催化反應(yīng)中由L-苯丙氨酸產(chǎn)生。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17的微生物，其中所述反式肉桂酸通過L-苯丙 氨酸解氨酶由L-苯丙氨酸形成。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18的微生物，其中所述反式肉桂酸通過L-苯丙 氨酸解氨酶(EC 4.3.1.5)由L-苯丙氨酸形成，所述酶來自屬于擬南芥 屬的植物、屬于蕓苔屬的植物、屬于柑橘屬的植物、屬于菜豆屬的植物、 屬于松屬的植物、屬于楊屬的植物、屬于茄屬的植物、屬于李屬的植物、 屬于葡萄屬的植物、屬于玉蜀黍?qū)俚闹参铮蛘邔儆谵较銓?、鳳梨屬、 天門冬屬、5w附/^flrf/fl、竹屬、甜菜屬、樺木屬、C"c"附/y、山茶屬、辣 椒屬、決明屬、M花屬、鷹嘴豆屬、西瓜屬、咖啡屬、南瓜屬、狗牙根 屬、胡蘿卜屬、石斛屬、石竹屬、毛地黃屬、薯蕷屬、桉屬、G"http://"S、銀 杏屬、大豆屬、大麥屬、向日葵屬、番薯屬、萵苣屬、紫菜屬、百脈限屬、 番茄屬、苜蓿屬、蘋果屬、木薯屬、苜蓿屬、日中花屬、煙草屬、木犀欖 屬、稻屬、豌豆屬、聘梨屬、歐芽屬、蝴蝶蘭屬、剛竹屬、小立碗蘚屬、云杉屬、梨屬、櫟屬、蘿卜屬、地黃屬、懸鉤子屬、高粱屬、^/^m^O;fc、 繁縷屬、筆花豆屬、小麥屬、車軸草屬、小麥屬、越桔屬、豇豆屬、百曰 菊屬中任一屬的植物，或者來自屬于曲霉屬的絲狀真菌。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18或19中任一項的微生物，其中所述苯丙氨酸解 氨酶在所述微生物中由編碼所述酶的核酸表達，所述核酸對于該微生物 而言是非天然的。
21. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的微生物，其中在酶催化的反應(yīng)中 形成4-香豆酰CoA，其中ATP和CoA為底物，ADP為產(chǎn)物。
22. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的微生物，其中在4-香豆酸CoA 連接酶催化的反應(yīng)中形成4-香豆酰CoA。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22的微生物，其中所述4-香豆酸CoA連接酶是 4-香豆酸CoA連接酶(EC 6.2.1.12)，所述酶來自屬于冷杉屬的植物、 屬于擬南芥屬的植物、屬于蕓苦屬的植物、屬于柑橘屬的植物、屬于落葉 松屬的植物、屬于菜豆屬的植物、屬于松屬的植物、屬于楊屬的植物、屬 于癡屬的植物、屬于葡萄屬的植物、屬于玉蜀黍?qū)俚闹参?，或者屬于蓑?屬、矮紫穗槐、4M^屬、雪松屬、番紅花屬、羊茅屬、大豆屬、胡杉fc屬、 油杉屬、紫菜屬、黑麥草屬、百 屬、番茄屬、蘋果屬、苜蓿屬、曰中 花屬、煙草屬、A^/W傷M^1、稻屬、天竺葵屬、歐芹屬、小立碗蘚屬、云 杉屬、李屬、金錢松屬、黃杉屬、薔薇屬、懸鉤子屬、Ryza、甘蔗屬、堿 蓬屬、鹽芥屬、小麥屬或鐵杉屬中任一屬的植物，來自屬于曲霉屬的絲狀 真菌、屬于脈孢菌屬的絲狀真菌、屬于Eimw/fl屬的真菌、屬于球腔菌屬 的真菌、來自屬于分枝桿菌屬的細菌、屬于奈瑟菌屬的細菌、屬于鏈霉菌 屬的細菌、屬于紅細菌屬的細菌，或來自屬于鉤口線蟲屬的線蟲、屬于新 桿狀線蟲屬的線蟲、屬于血矛線蟲屬的線蟲、屬于蚯封l屬的線蟲、屬于 Meilodogyne屬的線蟲、屬于Strongyloidus屬的線蟲或者屬于Pristionchus 屬的線蟲。
24. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的微生物，其中已在所述微生物中 重組引入了編碼所述代謝途徑中相應(yīng)酶的至少一種遺傳序列的至少一 個拷貝。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24的微生物，其中已在所述微生物中過表達了 天然NADPH:細胞色素P450還原酶(CPR)。
26. 根據(jù)權(quán)利要求24的微生物，其中已在所述微生物中重組引入 了 NADPH:細胞色素P450還原酶(CPR)。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26的微生物，其中所述NADPH:細胞色素P450 還原酶為NADPH:細胞色素P450還原酶(EC 1.6.2.4)，其來自屬于擬 南芥屬的植物，例如擬南芥；屬于柑橘屬的植物，例如甜橙、葡萄柚； 屬于菜豆屬的植物，例如菜豆；屬于松屬的植物，例如火炬松；屬于楊屬的植物，例如P de/似iV/e51、 ^附iz/0/flfes1、 加V/^cfl/77fl; 屬于癡屬的植物，例如馬鈴薯；屬于葡萄屬的植物，例如葡萄；屬于玉蜀黍?qū)俚?植物，例如玉蜀黍，或者其它屬的植物例如阿米屬、海欖雌屬、山茶屬、 喜樹屬、"i^^屬、大豆屬、向日葵屬、百糾艮屬、日中花屬、小立碗蘚 屬、蕓香屬、甘蔗屬、Sl豆屬。
28. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的微生物，其中將編碼酪氨酸解氨 酶的遺傳序列的至少一個拷貝與表達信號有效連接，所述表達信號在所 述生物中不與所述遺傳序列天然相關(guān)聯(lián)。
29. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的微生物，其中將編碼苯丙氨酸解 氨酶的遺傳序列的至少一個拷貝與表達信號有效連接，所述表達信號在 所述生物中不與所述遺傳序列天然相關(guān)聯(lián)。
30. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的微生物，其中將編碼肉桂酸4-羥化酶的遺傳序列的至少一個拷貝與表達信號有效連接，所述表達信號 在所述生物中不與所述遺傳序列天然相關(guān)聯(lián)。
31. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的微生物，其中將編碼4-香豆酸 CoA連接酶的遺傳序列的至少一個拷貝與表達信號有效連接，所述表達 信號在所述生物中不與所述遺傳序列天然相關(guān)聯(lián)。
32. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的微生物，其中將編碼白藜蘆醇合 酶的遺傳序列的至少一個拷貝與表達信號有效連接，所述表達信號在所 述生物體中不與所述遺傳序列天然相關(guān)聯(lián)。
33. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的微生物，所述微生物是真菌。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33的微生物，所述微生物是絲狀真菌。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34的微生物，所述微生物是屬于曲霉屬的微生物。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35的微生物，所述微生物是黑曲霉或者米曲霉 菌林。
37. 根據(jù)權(quán)利要求33的微生物，所述微生物是酵母。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37的微生物，所述微生物是屬于酵母菌屬、克 魯維酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、德巴利酵母屬、漢遜酵母屬、 Yarrowia、接合酵母屬或裂殖酵母屬的微生物。
39. 根據(jù)權(quán)利要求38的微生物，所述微生物是釀酒酵母、克魯弗 酵母、貝酵母、少孢酵母、& WVfl^,'、葡萄汁酵母、乳酸克魯維酵母、 馬克斯克魯維酵母馬克斯變種、L AwiiK^/mi"s、產(chǎn)朊假絲酵母、熱 帶假絲酵母、樹干畢赤酵母、巴斯德畢赤酵母、P. wAib/;/ 7fl、漢遜德 巴利酵母、多形漢遜酵母、KimwiVi (yZ/ai、 Zygosfl"AfliYmijces row;d/ 或粟酒裂殖酵母的菌林。
40. 根據(jù)權(quán)利要求1-32中任一項的微生物，所述微生物是細菌。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40的微生物，所述微生物是屬于屬于埃希氏菌 屬或者乳球菌屬的微生物。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41的微生物，所述微生物是大腸桿菌或乳酸乳 球菌菌林。
43. 根據(jù)權(quán)利要求l的微生物，所述微生物含有編碼苯丙氨酸解氨 酶并與表達信號有效連接的異源DNA序列的一個或多個拷貝，含有編 碼肉桂酸-4-羥化酶并與表達信號有效連接的異源DNA序列的一個或多 個拷貝，含有編碼4-香豆酸CoA-連接酶并與表達信號有效連接的異源 DNA序列的一個或多個拷貝，并且含有編碼白藜蘆醇合酶并與表達信 號有效連接的異源DNA序列的一個或多個拷貝。
44. 根據(jù)權(quán)利要求1的微生物，所述微生物無肉桂酸-4-羥化酶活性， 并且含有編碼酪氨酸解氨酶并與表達信號有效連接的異源DNA序列的 一個或多個拷貝，含有編碼4-香豆酸CoA-連接酶并與表達信號有效連 接的異源DNA序列的一個或多個拷貝，并且含有編碼白藜,醇合酶并 與表達信號有效連接的異源DNA序列的一個或多個拷貝。
45. 用于產(chǎn)生白藜聲醇或者其寡聚或糖苷結(jié)合衍生物的方法，包括 在基本無外源4-香豆酸的情況下，使具有產(chǎn)生白藜,醇的適當代謝途徑 的非植物細胞與碳底物接觸。
46. 根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述非植物細胞選自真菌和細菌。
47. 根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述非植物細胞是選自酵母的 真菌。
48. 根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中所述酵母選自酵母屬物種。
49. 根據(jù)權(quán)利要求45-48中任一項的方法，其中所述非植物細胞是 權(quán)利要求1-44中任一項所述的微生物細胞。
50. 根據(jù)權(quán)利要求45-49中任一項的方法，其中所述碳底物選自由 單糖、寡糖和多糖組成的可發(fā)酵碳底物。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述可發(fā)酵碳底物是葡萄糖、 果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、赤蘚糖、蘇糖、 核糖。
52. 根據(jù)權(quán)利要求45-49中任一項的方法，其中所述碳底物選自不 可發(fā)酵的碳底物。
53. 根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中所述不可發(fā)酵的碳底物是乙醇、 乙酸鹽、甘油、乳酸鹽。
54. 根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中所述不可發(fā)酵的碳底物選自氨 基酸。
55. 根據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中所述不可發(fā)酵的碳底物選自苯 丙氨酸和酪氨酸。
56. 產(chǎn)生白藜蘆醇或者其寡聚或糖苷結(jié)合衍生物的方法，所述方法 通過異源表達編碼苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸4-羥化酶、4-肉桂酸CoA 連接酶和白藜，醇合酶的核苷酸序列來實現(xiàn)。
57. 產(chǎn)生白藜蘆醇或者其寡聚或糖普結(jié)合衍生物的方法，通過異源序列來實現(xiàn)。
58. 根據(jù)權(quán)利要求45-57中任一項的方法，所述方法還包括使用所 產(chǎn)生的白藜蘆醇或者其寡聚或糖普結(jié)合衍生物作為乳制品或者飲料中 的營養(yǎng)物。
59. 根據(jù)權(quán)利要求58的方法，其中使用所述白藜，醇或者其寡聚 或糖苷結(jié)合衍生物作為啤酒中的營養(yǎng)物。、4-香豆酸CoA連接酶和白藜，醇合酶的核普酸
全文摘要
通過以下途徑產(chǎn)生白藜蘆醇的重組微生物，其中苯丙氨酸解氨酶(PAL)由苯丙氨酸產(chǎn)生反式肉桂酸，肉桂酸4-羥化酶(C4H)由所述反式肉桂酸產(chǎn)生4-香豆酸，4-香豆酸CoA連接酶(4CL)由所述4-香豆酸產(chǎn)生4-香豆酰CoA，白藜蘆醇合酶(VST)由所述4-香豆酰CoA產(chǎn)生所述白藜蘆醇，或者其中L-苯丙氨酸或酪氨酸解氨酶(PAL/TAL)產(chǎn)生4-香豆酸，4-香豆酸CoA連接酶(4CL)由所述4-香豆酸產(chǎn)生4-香豆酰CoA，白藜蘆醇合酶(VST)由所述4-香豆酰CoA產(chǎn)生所述白藜蘆醇。所述微生物可以是酵母、真菌或者細菌，包括釀酒酵母、大腸桿菌、乳酸乳球菌、黑曲霉或者米曲霉。
文檔編號C12N15/52GK101160393SQ200680009533
公開日2008年4月9日 申請日期2006年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月22日
發(fā)明者延斯·布雷達爾·尼爾森, 漢斯·彼得·斯米茨, 約亨·福斯特, 邁克爾·卡茨 申請人:弗盧克索姆科學(xué)公司