專(zhuān)利名稱(chēng)：：胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及培養(yǎng)多潛能細(xì)胞以促進(jìn)細(xì)胞受控的自我更新的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供從多潛能細(xì)胞擴(kuò)增和分化均一的細(xì)胞群體的集成方法。此外，本發(fā)明提供篩選方法以識(shí)別影響多潛能細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的條件、培養(yǎng)基和刺激因素。
背景技術(shù)：
：術(shù)語(yǔ)"干細(xì)胞"描述的是能夠形成多種組織類(lèi)型細(xì)胞的細(xì)胞。存在不同類(lèi)型的干細(xì)胞。當(dāng)精子使卵受精時(shí)，形成單個(gè)全能細(xì)胞，這個(gè)全能細(xì)胞具有形成整個(gè)生物體的能力。在受精后的第一個(gè)小時(shí)，這一細(xì)胞分裂為完全相同的全能細(xì)胞。受精后大約四天并經(jīng)過(guò)幾個(gè)周期的細(xì)胞分裂之后，這些全能干細(xì)胞開(kāi)始特化。當(dāng)全能細(xì)胞變得更加特化時(shí)，它們隨之被稱(chēng)為"多潛能的(pluripotent)"。多潛能細(xì)胞能夠分化為身體中的每種細(xì)胞類(lèi)型，但是不能形成胎盤(pán)或胎兒發(fā)育所必需的支持組織。由于多潛能干細(xì)胞的分化潛能不是"全體，，的，因此不將這種細(xì)胞稱(chēng)為"全能"，而且它們不是胚胎。多潛能干細(xì)胞進(jìn)一步特化為多能(multipotent)干細(xì)胞，其專(zhuān)用于分化為為特定功能特化的特定種系的細(xì)胞。多能細(xì)胞能夠分化為它們所源自的組織中含有的細(xì)胞類(lèi)型；例如血液干細(xì)胞只能夠分化為紅血細(xì)胞、白血細(xì)胞和血小板。多潛能干細(xì)胞，如胚胎干(ES)細(xì)胞、胚胎生殖干(EG)細(xì)胞以及多能干細(xì)胞，如臍帶千細(xì)胞和成人千細(xì)胞因其自我更新的能力和可塑性能力而是被提議為用于組織工程的有力工具。多潛能干細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞，能夠在體外被誘導(dǎo)分化為中胚層、外胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞譜系的多能細(xì)胞。中胚層^"系的細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和心肌細(xì)胞分別在形成骨的、成軟骨和成肌補(bǔ)充物的影響下產(chǎn)生?，F(xiàn)在，多潛能干細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞和多能細(xì)胞的醫(yī)藥用途受限于缺少關(guān)于組織樣結(jié)構(gòu)形成的知識(shí)和自發(fā)分化為不同細(xì)胞譜系的傾向；甚至這種多譜系潛能可以表現(xiàn)為形成異位組織的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于臨床應(yīng)用，高純度的均一細(xì)胞群體可能是必需的。為有效的使用多潛能細(xì)胞進(jìn)行臨床治療，首要的是提供足夠數(shù)量的用于相關(guān)臨床應(yīng)用的細(xì)胞。未分化的胚胎干細(xì)胞是產(chǎn)生關(guān)鍵分化細(xì)胞類(lèi)型的有希望的來(lái)源；但是對(duì)于許多未分化細(xì)胞群體，現(xiàn)有的培養(yǎng)方法或者不適合擴(kuò)增，或者不能提供有效產(chǎn)量的分化細(xì)胞。現(xiàn)有的維持人胚胎干(hES)細(xì)胞的方法需要使用伺養(yǎng)層、詞養(yǎng)條件培養(yǎng)基(feeder-conditionedmedia)或在培養(yǎng)基中供應(yīng)人或動(dòng)物細(xì)月包提耳又物以擴(kuò)增人胚胎干細(xì)胞和防止自發(fā)分化。如計(jì)劃在隨后將細(xì)胞用于人類(lèi)治療，該方法是不適合的。人胚胎干細(xì)胞的臨床應(yīng)用需要在標(biāo)準(zhǔn)化的、受良好控制的無(wú)動(dòng)物產(chǎn)品的環(huán)境(因此被稱(chēng)為"無(wú)外源物(xeno-free)"的培養(yǎng)環(huán)境，其降低傳輸疾病的風(fēng)險(xiǎn))中培養(yǎng)細(xì)胞的方法。此外，需要在不存在飼養(yǎng)層或支持細(xì)胞的情況下培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法以降低飼養(yǎng)細(xì)胞或源自飼養(yǎng)細(xì)胞的污染物污染人胚胎干細(xì)胞治療產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)。理論上，生產(chǎn)足夠數(shù)量的人胚胎干細(xì)胞的方法應(yīng)該是標(biāo)準(zhǔn)化的和可調(diào)控的。至今還沒(méi)有這樣的方法，并且使用傳統(tǒng)方法分離和維持人胚胎干細(xì)胞是非常需要技術(shù)的過(guò)程，不適于臨床應(yīng)用(1)。因此需要開(kāi)發(fā)改良的培養(yǎng)方法以用于擴(kuò)增和在需要時(shí)接著分化人胚胎干細(xì)胞。轉(zhuǎn)變未分化的鼠胚胎千細(xì)胞(mES)為更分化的細(xì)胞類(lèi)型的方法是已知的。但是，使用已有的二維平板或培養(yǎng)瓶(flask)培養(yǎng)方案，該過(guò)程是分段的，涉及高維持費(fèi)用，對(duì)樣本具有破壞性并且結(jié)果非常易變。傳統(tǒng)上，在二維培養(yǎng)物中胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)方案涉及三個(gè)截然不同的階段，首先胚胎干細(xì)胞維持(即自我更新，也稱(chēng)為擴(kuò)增，以形成干細(xì)胞集落)，然后是導(dǎo)致胚狀體(EB)形成的初始分化，隨后是進(jìn)一步的譜系特異性分化。每個(gè)階段都需要熟練的操作和階段特定的方案。對(duì)于胚胎干細(xì)胞維持，最初是分離胚胎干細(xì)胞細(xì)胞，然后在飼養(yǎng)層上進(jìn)行共培養(yǎng)。隨后發(fā)現(xiàn)可使用條件培養(yǎng)基替代飼養(yǎng)層(2;3),并且對(duì)于鼠胚胎干細(xì)胞，當(dāng)以純化形式供應(yīng)LIF(由飼養(yǎng)細(xì)胞分泌的營(yíng)養(yǎng)因子)時(shí)，其能夠維持多潛能性(4)。通過(guò)監(jiān)測(cè)Octamer結(jié)合因子3/4(表示為Oct-4)的表達(dá)評(píng)測(cè)胚胎干細(xì)胞的多潛能。Oct-4是限于早期胚胎、生殖系細(xì)胞和未分化胚胎干細(xì)胞(胚胎性癌)、胚胎生殖干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的Pit-Oct-Unc(POU)家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(5)。Oct-4在體內(nèi)的表達(dá)是發(fā)展內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)細(xì)胞的多潛能能力所必需的(6),在體外其被化學(xué)穩(wěn)態(tài)地控制以維持多潛能性(7)。在傳統(tǒng)的分化方法中，經(jīng)過(guò)形成胚狀體(EB)的階段，源自內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的胚胎干細(xì)胞分化為各種細(xì)胞類(lèi)型。胚狀體的形成，即胚胎干細(xì)胞的初始分化可以通過(guò)各種刺激啟動(dòng)，例如移除飼養(yǎng)細(xì)胞、消除與LIF的接觸(對(duì)于鼠胚胎干細(xì)胞)或消除與飼養(yǎng)條件培養(yǎng)基的接觸。被開(kāi)發(fā)用于胚胎性癌(EC)細(xì)胞的胚狀體(EB)懸浮方法(8)通過(guò)形成全部三個(gè)胚層中胚層、外胚層和內(nèi)胚層導(dǎo)致形成多重分化結(jié)構(gòu)，其類(lèi)似于植入后的胚胎組織(9)。在懸浮培養(yǎng)的2到4天中，在ICM表面形成外胚層，其形成稱(chēng)為"簡(jiǎn)單胚狀體，，的結(jié)構(gòu)。在分化的第4天左右，具有基底層的柱狀上皮發(fā)育，并且形成中央空腔。這些結(jié)構(gòu)被稱(chēng)為"嚢狀胚狀體(cysticEB)，，，并且通過(guò)在體外繼續(xù)培養(yǎng)，出現(xiàn)內(nèi)胚層和中胚層細(xì)胞(10)。外胚層細(xì)胞是多能的，能夠分化為神經(jīng)組織、上皮和牙齒組織。內(nèi)胚層細(xì)胞是多能的，能夠分化為胃腸道、呼吸道和內(nèi)分泌腺。中胚層細(xì)胞是多能的，能夠分化為造血和骨骼譜系，后者包括形成心肌(cardiomyogenic)、形成專(zhuān)欠骨(chondrogenic)和形成骨(osteogenic)的纟田月包。在中胚層，已^口形成心臟的分化是最初的和主要的分化過(guò)程。通常認(rèn)為形成心臟的分化會(huì)阻止和延遲其它分化過(guò)程，例如形成軟骨和形成骨的分化。通過(guò)在二維培養(yǎng)物中功能性成骨細(xì)胞的分化已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了形成骨的分化，即在體外形成礦化的小結(jié)，其顯示體內(nèi)形成的交織的骨的形態(tài)上、超微結(jié)構(gòu)上和生化上的特征。然而，在培養(yǎng)瓶和有孔平板中進(jìn)行的二維培養(yǎng)只能使少量細(xì)胞分化到能夠使它們的細(xì)胞外基質(zhì)組織成與骨類(lèi)似的結(jié)構(gòu)的程度(11-13)。此外，二維培養(yǎng)是分段的，勞動(dòng)密集的并且在所包括的不同培養(yǎng)步驟期間需要操作者的"判斷"。通過(guò)在培養(yǎng)物中分化有功能的軟骨細(xì)胞已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了成軟骨分化，即在體外形成軟骨小結(jié)，其顯示體內(nèi)形成的軟骨細(xì)胞的形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)和生化特征?，F(xiàn)在，已經(jīng)進(jìn)行了很多誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞體外分化為軟骨生成譜系的嘗試。據(jù)報(bào)道通過(guò)在胚狀體(EB)分化期間加入各種成軟骨補(bǔ)充物，如BMP-2和BMP-4(Kramer等人,(2000).Embryonicstemcell-derivedchondrogenicdifferentiationinvitro:activationbyBMP-2andBMP-4Dev.92,193-205)、TGF-b3(Kawaguchi等人.，(2005).Osteogenicandchondrogenicdifferentiationofembryonicstemcellsinresponsetospecificgrowthfactors36,758-769.)、地塞米松(Tanaka等人，(2004).Chondrogenicdifferentiationofmurineembryonicstemcells:effectsofcultureconditionsanddexamethasoneJCe〃93,454-462.)可誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞的成軟骨分化。作為其它的途徑，據(jù)報(bào)道通過(guò)供應(yīng)IGF-I,TGF-b3，BMP-4和PDGF在源成(Nakayama等人，(2003).Macroscopiccartilageformationwithembryonicstem-cell-derivedmesodermalprogenitorcells/Ce//5W.116，2015-2028,)。然而，盡管對(duì)于胚胎干細(xì)胞的成軟骨分化已有大量成功的方法，但是已建立的這些方法需要形成胚狀體。從胚胎干細(xì)胞形成軟骨已經(jīng)在二維培養(yǎng)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)。為將胚胎干細(xì)胞用于軟骨組織工程，必須開(kāi)發(fā)明確的和有效的方案，用于指導(dǎo)在集成和不涉及操作者決定的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中體外分化為軟骨生成譜系。靜置培養(yǎng)，如傳統(tǒng)用于胚胎干細(xì)胞維持、培養(yǎng)和分化的二維方法，具有幾個(gè)限制，例如缺少混合、缺乏控制選項(xiàng)和需要頻繁的喂飼。在二維培養(yǎng)細(xì)胞的試驗(yàn)中，與細(xì)胞外基質(zhì)和其它細(xì)胞的正常三維關(guān)系被扭曲，其導(dǎo)致反常的細(xì)胞行為并因此產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)論。攪拌的懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)具有可量測(cè)性和相對(duì)簡(jiǎn)單這些吸引人的優(yōu)點(diǎn)，這會(huì)影響特定階段和類(lèi)型的干細(xì)胞的生存力和利用率(14)。然而，在懸浮細(xì)胞的攪動(dòng)培養(yǎng)中，由于攪動(dòng)所產(chǎn)生的動(dòng)蕩和剪切力將導(dǎo)致細(xì)胞損傷?，F(xiàn)正在開(kāi)發(fā)使用生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞的方法，以提供具有受控培養(yǎng)條件的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)，其能夠在三維環(huán)境中擴(kuò)增細(xì)胞。分析更天然的三維設(shè)定中的細(xì)胞相互作用可提供更接近活體內(nèi)條件的條件(15;16)。將生物反應(yīng)器用于人胚胎千細(xì)胞培養(yǎng)已有記載，并且已提供了一些初步的證據(jù)表明動(dòng)態(tài)、三維的條件將為培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞形成胚狀體提供合適的環(huán)境(17)。Chang等人(18)在二十世紀(jì)六十年代開(kāi)創(chuàng)了生物包裹法，Lim等人(19)最終包裹異種移植物胰島細(xì)胞用于移植到大鼠中以改善糖尿病。藻酸鹽包裹的應(yīng)用主要限于成體細(xì)胞。Magyar等人(20)將鼠胚胎干細(xì)胞包裹在1.1%藻酸鹽微型小珠中，然后在組織培養(yǎng)平板上二維培養(yǎng)，即靜置培養(yǎng)。這導(dǎo)致形成"盤(pán)狀，，群體，其進(jìn)一步在小珠中分化以產(chǎn)生囊狀胚狀體，隨后形成含有自發(fā)搏動(dòng)區(qū)域的胚狀體。當(dāng)Magyar等人將胚胎千細(xì)胞包裹于1.6%藻酸鹽微型小珠中并三維培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在桑椹胚樣階段分化被抑制，因此小珠中沒(méi)有形成嚢狀胚狀體；雖然當(dāng)將胚胎干細(xì)胞集落從小珠中釋放出來(lái)并二維培養(yǎng)時(shí)，它們能夠進(jìn)一步分化為具有搏動(dòng)的心肌細(xì)胞的嚢狀胚狀體。已有人嘗試將鼠胚胎干細(xì)胞包裹于藻酸鹽小珠中以從鼠胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生胚狀體，但是未能產(chǎn)生足夠的成軟骨分化(21)。已將包裏在藻酸鹽小珠中的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)三維培養(yǎng)，其中細(xì)胞小珠被置于靜置培養(yǎng)瓶培養(yǎng)物中并用生長(zhǎng)培養(yǎng)基覆蓋從而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生透明軟骨的成軟骨分化，雖然發(fā)現(xiàn)在藻酸鹽培養(yǎng)物中充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力被抑制(22)。已經(jīng)證明了三維培養(yǎng)中的成軟骨分化，其使用接種在藻酸鹽或瓊脂糖水凝膠中和在多孔明膠支架(Surgifoam)中的人脂肪來(lái)源的成體干(//ADAS)細(xì)胞(32)。從干細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)分化細(xì)胞需要整合胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)中的各個(gè)步驟。現(xiàn)有的從多潛能細(xì)胞，如胚胎千細(xì)胞形成分化細(xì)胞的方法是分段的，勞動(dòng)密集的并且需要高水平的訓(xùn)練，其不可避免的會(huì)引入操作者與操作者之間的差異；而且，這些方法在二維培養(yǎng)物中進(jìn)行，其沒(méi)有模擬體內(nèi)存在的三維環(huán)境。這不符合臨床應(yīng)用的要求，因?yàn)楝F(xiàn)有的維持培養(yǎng)和分化的方法不能產(chǎn)生臨床相關(guān)的細(xì)胞數(shù)量。因此，需要改良千細(xì)胞培養(yǎng)的方法以擴(kuò)增和集成擴(kuò)增和分化干細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞。該方法對(duì)于未分化多潛能細(xì)胞有效的維持生長(zhǎng)和分化以及對(duì)外胚層、中胚層和內(nèi)胚層語(yǔ)系部分分化的多能細(xì)胞的進(jìn)一步分化是必須的。對(duì)于臨床的骨組織工程應(yīng)用，需要能夠形成"骨小結(jié)(bonenodules)，，(骨樣組織)或其它組織類(lèi)型的方法。根據(jù)本發(fā)明，這能夠在三維培養(yǎng)中實(shí)現(xiàn)，其中使用包裹在支持基質(zhì)中的單個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。單個(gè)細(xì)胞或克隆的培養(yǎng)，以及單個(gè)克隆隨后的擴(kuò)增和分化被稱(chēng)為"克隆形成能力"。已知當(dāng)來(lái)源于無(wú)性繁殖的胚胎干細(xì)胞被移植到小鼠中時(shí)其在體內(nèi)分化，但是到目前為止，在體外培養(yǎng)單個(gè)未分化胚胎干細(xì)胞的嘗試都被證明是不成功的(23;24)。在這些已報(bào)道的研究中，二維培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞，該細(xì)胞沒(méi)有最終分化為成熟細(xì)胞?，F(xiàn)在，沒(méi)有可用于篩選細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境對(duì)單個(gè)多潛能或多能細(xì)胞的影響的方法。因此需要識(shí)別細(xì)胞培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基和試驗(yàn)化合物(例如合成的化學(xué)個(gè)體或天然來(lái)源的材料，如條件培養(yǎng)基、生長(zhǎng)因子)對(duì)個(gè)體細(xì)胞的影響的方法。此外，同時(shí)進(jìn)行大量這種篩選實(shí)驗(yàn)的能力使得能夠進(jìn)行大量工藝參數(shù)(化學(xué)制品、濃度、組合)的大量篩選。發(fā)明詳述本發(fā)明提供細(xì)胞培養(yǎng)的方法，其包括(a)提供包裹(encapsulate)在支持基質(zhì)中的人胚胎千(ES)細(xì)胞以形成支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)，和，(b)通過(guò)在維持培養(yǎng)基中維持位于三維(3D)培養(yǎng)物中的被包裹的細(xì)胞來(lái)維持培養(yǎng)。在本發(fā)明的培養(yǎng)方法中，所提供的胚胎干細(xì)胞可以是包裹在支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)中的多個(gè)個(gè)體細(xì)胞和/或細(xì)胞聚集體，或者是包裹在支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)中用于無(wú)性擴(kuò)增的單個(gè)細(xì)胞。用于維持細(xì)胞生長(zhǎng)以增加支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)中細(xì)胞數(shù)量(即擴(kuò)增，其中細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞分裂進(jìn)行自我更新)的維持培養(yǎng)基的選擇取決于所使用細(xì)胞的類(lèi)型以及它們對(duì)生長(zhǎng)的需求。任何支持細(xì)胞生長(zhǎng)，且理想的是具有最小的或沒(méi)有細(xì)胞分化的培養(yǎng)基都適合在本發(fā)明的方法中用作維持培養(yǎng)基。本領(lǐng)域已知多種合適的維持培養(yǎng)基。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，維持培養(yǎng)不包括在維持培養(yǎng)基中使用飼養(yǎng)細(xì)胞、條件培養(yǎng)基或者人或動(dòng)物的細(xì)胞提取物，因此維持培養(yǎng)是在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞和不存在甸養(yǎng)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的情況下進(jìn)行的?，F(xiàn)有的培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法需要使用飼養(yǎng)細(xì)胞以支持未分化狀態(tài)的人胚胎千細(xì)胞的維持或者使用條件培養(yǎng)基(l)。另外，在現(xiàn)有的方法中，細(xì)胞需要經(jīng)常傳代以除去自發(fā)分化的人胚胎干細(xì)胞。此外，如果將所產(chǎn)生的人胚胎干細(xì)胞用于臨床治療，培養(yǎng)條件可能需要源自動(dòng)物的產(chǎn)品，而這樣的產(chǎn)品有傳輸疾病的風(fēng)險(xiǎn)。研究者正致力于開(kāi)發(fā)適于大規(guī)模生產(chǎn)的維持和擴(kuò)增人胚胎干細(xì)胞的方法以為臨床應(yīng)用提供足夠數(shù)量的人胚胎干細(xì)胞或其分化衍生物。本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了令人驚奇的簡(jiǎn)單方法，其顯示復(fù)制了胚胎植入前的早期胚胎的物理環(huán)境，并且能夠長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)未分化狀態(tài)的被包裹的人胚胎干細(xì)胞，而不需要傳代。令人驚奇的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用本發(fā)明的方法人胚胎干細(xì)胞可以在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下于非條件培養(yǎng)基中在多至130天的時(shí)間內(nèi)維持未分化。發(fā)明人假設(shè)在本發(fā)明方法中包裹人胚月臺(tái)丁糊/J巴日3久仔丞乂臾尸/T3疋狀日3柳-主外現(xiàn)》F]■)巧介5田月巴.件培養(yǎng)基的需求。本發(fā)明的方法適于為治療應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化、調(diào)控和擴(kuò)大人胚胎干細(xì)胞的生產(chǎn)。適合人胚胎千細(xì)胞的維持培養(yǎng)基包括補(bǔ)充有20%v/vKNOCKOUTSR，2mML-谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸溶液(均得自GibcoInvitrogen,LifeTechnologies,Paisley，UK)，0.1mM2-巰基乙醇(2ME)(Sigma-Aldrich,Dorset,UK)和4ng/ml人重組石威性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF,FGF-2)(157個(gè)氨基酸)(R&DSystems,Oxon,UK)的DMEM/F12培養(yǎng)基。補(bǔ)充有4ng/ml人重組》威性成纖維細(xì)』包生長(zhǎng)因子(hrbFGF)的VitroHESTM(VitrolifeAB,Kungsbacka,Sweden,http:〃www.vitrolife.com)也是適合J咅養(yǎng)人胚月臺(tái)干纟田胞的培養(yǎng)基，這兩種培養(yǎng)基通常都與飼養(yǎng)細(xì)胞共同使用，但是在本發(fā)明的細(xì)胞被包裹的培養(yǎng)方法中，可以在不伴隨使用飼養(yǎng)層的情況下使用這些培養(yǎng)基?？梢杂脳l件培養(yǎng)基和另加的生長(zhǎng)因子進(jìn)行未包裹的人胚胎干細(xì)胞的無(wú)詞養(yǎng)層培養(yǎng)。然而，Xu等人(2005)(25)已經(jīng)顯示含有KNOCKOUTSR的非條件培養(yǎng)基(unconditionedmedia)能夠激活未包裹的人胚胎干細(xì)胞中的BMP信號(hào)傳導(dǎo)活性，其程度超過(guò)MEF條件培養(yǎng)基，因此現(xiàn)在無(wú)法獲得成分明確的用于未包裹的人胚胎干細(xì)胞的無(wú)飼養(yǎng)層的維持培養(yǎng)基。使用特異細(xì)胞信號(hào)分子在無(wú)飼養(yǎng)層環(huán)境中維持未包裹的人胚胎干細(xì)胞僅能夠?qū)崿F(xiàn)相對(duì)短的時(shí)間(Sato等人(2004)Nat,Med"10，55-63)。令人驚奇的是，在本發(fā)明的方法中，將人胚胎干細(xì)胞維持于未分化狀態(tài)不需要特異信號(hào)分子。然而，當(dāng)該研究繼續(xù)識(shí)別改善未分化狀態(tài)的人胚胎干細(xì)胞的維持和擴(kuò)增的分子時(shí)，能夠在本發(fā)明的方法中使用這些分子以進(jìn)一步增強(qiáng)包裹的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的體外環(huán)境。在本發(fā)明的方法中，包裹的胚胎干細(xì)胞能夠在非條件培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在(1)中綜述了現(xiàn)在用于維持未包裹人胚胎千細(xì)胞的各種培養(yǎng)基和生長(zhǎng)因其中沒(méi)有飼養(yǎng)細(xì)胞且不需要培養(yǎng)基被條件化。在優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供細(xì)胞培養(yǎng)的方法，其包括(a)提供包裹在支持基質(zhì)中的人胚胎干細(xì)胞以形成支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)，(b)通過(guò)在適合細(xì)胞維持的條件下在維持培養(yǎng)基中維持位于三維培養(yǎng)物中的被包裹細(xì)胞而維持培養(yǎng)，被包裹的細(xì)月包。用于分化多潛能人胚胎干細(xì)胞的分化培養(yǎng)基的選擇取決于使用的細(xì)胞類(lèi)型、它們對(duì)生長(zhǎng)的需求和分化所需的刺激因素。任何支持分化的培養(yǎng)基都適合用作本發(fā)明方法中的分化培養(yǎng)基。實(shí)際上，分化培養(yǎng)基在成分上可制分化的一種或多種物質(zhì)。適合人胚胎干細(xì)胞的分化培養(yǎng)基包括培養(yǎng)基[Alpha-ModifiedEaglesMedium(aMEM),10%(v/v)胎牛血清，100單位/mL青霉素和100嗎/mL鏈霉素]。通過(guò)向維持培養(yǎng)基中加入分化的刺激因素，例如生長(zhǎng)因子可以產(chǎn)生分化培養(yǎng)基。適合在三維培養(yǎng)物中的被包裹的多潛能干細(xì)胞或被包裹的多能干細(xì)胞維持和/或分化的條件包括對(duì)于所用細(xì)胞類(lèi)型的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件，例如，對(duì)于胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)，合適的條件包括使用胚胎干細(xì)胞維持和/或分化培養(yǎng)基和例如37°C和5%C02的環(huán)境條件。使用本發(fā)明的維持(擴(kuò)增)和/或分化方法，集落或組織的形成是在三維培養(yǎng)中進(jìn)行的，其可以是靜態(tài)的，例如在組織培養(yǎng)皿中或者在懸浮液中，例如在燒瓶或生物反應(yīng)器中。在三維培養(yǎng)中可以形成有組織的結(jié)構(gòu)和更大量的細(xì)胞，因?yàn)槠錀l件更接近于符合體內(nèi)情況中的物理環(huán)境。在三維培養(yǎng)物中細(xì)胞三維生長(zhǎng)。通過(guò)使用低剪切、高混合的"動(dòng)態(tài)，，環(huán)境可以實(shí)現(xiàn)適合用于進(jìn)行本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)方法的三維懸浮培養(yǎng)條件。這使得足夠的營(yíng)養(yǎng)物和氣體能夠滲入到所使用的支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)中。為三維培養(yǎng)提供低剪切、高混合的動(dòng)態(tài)環(huán)境的合適的生物反應(yīng)器包括NASAHARV生物反應(yīng)器(Synthecon，USA)、EuropeanSpaceAgency生物反應(yīng)器(Fokker，Netherlands)、RWV生物反應(yīng)器(Synthecon，USA)或其它模擬微重力或灌注系統(tǒng)，例如氣升式生物反應(yīng)器。對(duì)于涉及形成骨的分化的方法，NASAHARV生物反應(yīng)器是合適的。合適的維持和培養(yǎng)方法被作為集成(integrated)的方法進(jìn)行，其中在單個(gè)，即同一個(gè)容器中連續(xù)進(jìn)行維持和分化步驟。維持和分化方法的集成方法在燒瓶或生物反應(yīng)器中的懸浮培養(yǎng)物中適當(dāng)進(jìn)行。在維持生長(zhǎng)階段，一個(gè)或多個(gè)被包裹的多潛能胚胎干細(xì)胞分裂，細(xì)胞數(shù)量增加，因此在支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)中形成細(xì)胞集落，隨后被包裹的細(xì)胞分化形成進(jìn)一步分化的或終末分化的細(xì)胞，所有這些都在三維基質(zhì)結(jié)構(gòu)中。本發(fā)明的方法中，接著可以維持進(jìn)一步分化的或終末分化的細(xì)胞，其使得細(xì)胞分裂從而增加細(xì)胞數(shù)量和在支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)中形成細(xì)胞集落。使用完全集成的方法使得能夠進(jìn)行從未分化細(xì)胞的擴(kuò)增到通過(guò)由增加或減少培養(yǎng)基中的關(guān)鍵信號(hào)分子觸發(fā)的定時(shí)的和受控制的分化的連續(xù)改變。使用本發(fā)明方法導(dǎo)致的對(duì)細(xì)胞操作的需求降低限制了細(xì)胞與可能影響細(xì)胞生存力的潛在污染物和環(huán)境的接觸。此外，以實(shí)時(shí)方式監(jiān)控細(xì)胞培養(yǎng)條件使得能夠建立臨床產(chǎn)品所需的標(biāo)準(zhǔn)。在維持生長(zhǎng)中，一些細(xì)胞在幾個(gè)循環(huán)的細(xì)胞分裂后出現(xiàn)自發(fā)分化，特別是在條件沒(méi)有抑制分化的時(shí)候。適合細(xì)胞分化的條件可以包括使多潛能胚胎干細(xì)胞分化為多能細(xì)胞的刺激因素。胚胎干細(xì)胞分化為多能細(xì)胞的刺激因素可以是胚狀體形成的刺激因素，例如消除或減少與抑制分化的物質(zhì)的接觸；和/或添加或增加與促進(jìn)胚狀體形成的物質(zhì)的接觸。適合細(xì)胞分化的條件包括使多能細(xì)胞進(jìn)一步分化的刺激因素；例如，其能夠在胚胎干細(xì)胞分化的刺激因素之前、同時(shí)或之后被提供。本發(fā)明的涉及分化的方法可以在沒(méi)有提供胚狀體形成的刺激因素的情況下進(jìn)行，相反適合分化的條件筒單的包括分化為，例如外胚層、內(nèi)胚層或中胚層細(xì)胞系的刺激因素。分化的刺激因素可以是分化為外胚層、內(nèi)胚層或中胚層譜系的刺激因素。如下所列，合適的刺激因素是本領(lǐng)域已知的，并且在例如參考文獻(xiàn)(l)中被論述。優(yōu)選的，分化的刺激因素是分化為中胚層骨骼謙系細(xì)胞的刺激因素，例如形成骨的或形成軟骨的分化的刺激因素。形成骨的分化的刺激因素可以是向培養(yǎng)基中提供的補(bǔ)充物，例如抗壞血酸、p-磷酸甘油或地塞米松中的一種或多種。成軟骨分化的刺激因素可以是向培養(yǎng)基中提供的補(bǔ)充物，例如一硫代甘油(MTG)和IGF-l,TGF卩l(xiāng),BMP2或BMP4。維持和分化步驟持續(xù)的時(shí)間取決于所培養(yǎng)的細(xì)胞類(lèi)型以及細(xì)胞培養(yǎng)的目的。發(fā)明人已經(jīng)證明通過(guò)使用本發(fā)明的方法，被包裹的人胚胎干細(xì)胞可以在沒(méi)有常規(guī)用于維持多潛能的飼養(yǎng)細(xì)胞或條件培養(yǎng)基的情況下在未分化情況下維持130天。在維持培養(yǎng)中，可能期望在需要時(shí)培養(yǎng)被包裹的人胚胎干細(xì)胞多至130天或更長(zhǎng)時(shí)間以提供增加數(shù)量的未分化細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供能夠用于長(zhǎng)期維持培養(yǎng)被包裹的人胚胎干細(xì)胞的方法，例如超過(guò)8天，如約14,21,28,35,42,49,56天，多至130天和更多。在集成的維持和分化方法中，步驟(b)中被包裹細(xì)胞的初始維持培養(yǎng)應(yīng)該達(dá)到足夠長(zhǎng)的時(shí)間以形成細(xì)胞蔟，例如1到6天，優(yōu)選2到5天，最優(yōu)選3或4天。分化培養(yǎng)可以多至40天。本發(fā)明的一些培養(yǎng)方法包括在存在胚狀體形成刺激因素的情況下的初始分化時(shí)期，隨后是在存在將多能細(xì)胞分化為更加分化的細(xì)胞譜系，如成骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞的刺激因素的情況下的進(jìn)一步分化時(shí)期。合適地，初始分化時(shí)期為3到7天，優(yōu)選4到6天，最優(yōu)選約5天。當(dāng)進(jìn)行進(jìn)一步的分化時(shí)，進(jìn)一步分化時(shí)期通常為14到28天，合適的約20到22天，如21天。對(duì)于根據(jù)本發(fā)明方法的被包裹的胚胎干細(xì)胞的形成骨的分化，初始維^持時(shí)期一^:為2到4天，如3天；初始分化時(shí)期通常為4到6天，如5天；進(jìn)一步分化時(shí)期為14到28天，如20,21或22天；這些培養(yǎng)時(shí)間通常適于實(shí)現(xiàn)骨誘導(dǎo)和三維骨形成。使用包括分化階段的本發(fā)明的方法，被包裹的多能細(xì)胞能夠分化為更加分化的細(xì)胞，例如終末分化的細(xì)胞。為將多能細(xì)胞分化為更加分化或終末分化的細(xì)胞適宜使用細(xì)胞分化條件實(shí)現(xiàn)，所述條件包括多能細(xì)胞進(jìn)一步分化的刺激因素。本發(fā)明的方法還被用于在體外維持和/或分化被包裹在支持基質(zhì)中的單個(gè)細(xì)胞，從而例如提供均一集落或組織。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，在步驟(a)中支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)為單個(gè)胚胎干細(xì)胞被包裹在支持基質(zhì)中以形成支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)?？梢詫⑴咛ジ杉?xì)胞包裹在支持基質(zhì)中，以提供含有單個(gè)細(xì)胞的支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)，例如小珠。隨后，被包裹的單個(gè)細(xì)胞可以生長(zhǎng)為細(xì)胞集落，可選的形成胚狀體結(jié)構(gòu)，最終，部分分化的細(xì)胞可以分化為預(yù)期的細(xì)胞語(yǔ)系。這對(duì)于獲得源自無(wú)性繁殖的細(xì)胞群體是有用的，這些細(xì)胞群體對(duì)于為臨床應(yīng)用提供純均一細(xì)胞群體是有用的。而且，這對(duì)于篩選目的是有用的，因?yàn)樗沟媚軌驒z測(cè)三維胚狀體的形成、胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞分裂，或者研究微環(huán)境對(duì)單個(gè)多潛能細(xì)胞的影響。還可以研究單個(gè)胚胎干細(xì)胞向分化的成熟細(xì)胞類(lèi)型的分化，從而證明胚胎干細(xì)胞在體外的多潛能性潛力?？蛇x的，在步驟(a)中將多個(gè)細(xì)胞包裹于支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)中。這些可以以多個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞或細(xì)胞聚集體(即塊/集落)或其混合物存在。這些方面對(duì)于為諸如組織工程應(yīng)用、研究或臨床應(yīng)用產(chǎn)生大量分化細(xì)胞特別有用，但是也能夠用于篩選目的。通常，在本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法中，在步驟(a)中提供多個(gè)支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明提供用于胚胎干細(xì)胞維持、可選的胚狀體形成和分化的集成的三維培養(yǎng)方法。源自胚胎干細(xì)胞的中胚層細(xì)胞能夠分別在形成心肌的、形成軟骨的或形成骨的刺激因素的影響下分化為形成心肌的、形成軟骨的或形成骨的細(xì)胞。使用本發(fā)明的方法，已在三維培養(yǎng)中實(shí)現(xiàn)形成骨的分化，導(dǎo)致形成"骨小結(jié)(骨樣組織)"，或者在三維培養(yǎng)中能夠?qū)崿F(xiàn)用于臨床骨組織工程應(yīng)用的其它組織類(lèi)型。本發(fā)明的方法可以為培養(yǎng)系統(tǒng)的自動(dòng)化進(jìn)行調(diào)整，從而提供低維持費(fèi)用、高效的系統(tǒng)用于產(chǎn)生分化細(xì)胞。例如，這些方法可以被用于從鼠胚胎干細(xì)胞或hES(人胚胎干)細(xì)胞生產(chǎn)形成心肌的、形成軟骨的或形成骨的細(xì)胞。因此，在可選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的培養(yǎng)方法對(duì)于胚胎干細(xì)胞的形成骨的分化特別有效，特別優(yōu)選的細(xì)胞培養(yǎng)方法包括(a)提供包裹在支持基質(zhì)中的單個(gè)胚胎干細(xì)胞或多個(gè)胚胎干細(xì)胞以形成支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)，(b)在適合胚胎干細(xì)胞維持的條件下，在維持培養(yǎng)基中維持位于三維培養(yǎng)物中的一個(gè)或多個(gè)被包裹的細(xì)胞，(c)在適合形成骨的分化的條件下通過(guò)在分化培養(yǎng)基中分化位于三維培養(yǎng)物中的被包裹的細(xì)胞進(jìn)行形成骨的分化。胚胎干細(xì)胞優(yōu)選鼠或人胚胎干細(xì)胞，但是本發(fā)明的形成骨的分化方法適用于人、非人靈長(zhǎng)類(lèi)、馬、犬、牛、豬、山羊、綿羊、魚(yú)、嚙齒動(dòng)物、鼠或鳥(niǎo)來(lái)源的胚胎干細(xì)胞。優(yōu)選的支持基質(zhì)包含藻酸鹽，特別優(yōu)選含有藻酸鹽和明膠的那些支持基質(zhì)。優(yōu)選支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)為小珠形式。本方法可以在靜置的懸浮培養(yǎng)物中進(jìn)行，但是優(yōu)選在例如由生物反應(yīng)器，如NASAHARV生物反應(yīng)器所提供的低剪切、高混合的動(dòng)態(tài)環(huán)境中進(jìn)行。如上述其它培養(yǎng)基一樣，通常用于二維培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的維持培養(yǎng)基適合在本方法中使用。合適的條件為37。C，5%C02。維持培養(yǎng)進(jìn)行1到6天，優(yōu)選2到4天，更優(yōu)選約3天。被包裹的細(xì)胞的形成骨的分化是通過(guò)下列進(jìn)行的(i)在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)位于三維培養(yǎng)物中的被包裹的胚胎干細(xì)胞并提供胚狀體形成的刺激因素，然后，(ii)在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)(i)中產(chǎn)生的被包裹的細(xì)胞并提供形成骨的分化的刺激因素。例如，分化培養(yǎng)基可以是通常在二維培養(yǎng)中用于胚胎千細(xì)胞形成骨的分化的任何培養(yǎng)基。在適合胚狀體形成和隨后形成骨的分化的條件中使用的分化培養(yǎng)基可以是不同的。對(duì)于鼠細(xì)胞，胚狀體形成的刺激因素可以是消除與LIF的接觸，或者當(dāng)以共培養(yǎng)形式進(jìn)行維持階段時(shí)，消除與分泌LIF的細(xì)力包的纟妄觸。為進(jìn)行形成骨的分化以形成骨小結(jié)，步驟(i)中的溫育一般進(jìn)行約1到6天，優(yōu)選約2到5天，最優(yōu)選約3到4天，步驟(ii)中的溫育一般進(jìn)行21到28天，優(yōu)選20到22天，例如21天。在本發(fā)明的分化方法中，形成胚狀體的步驟不總是必需的，因此，在一些實(shí)施方式中省略了與胚狀體形成的刺激因素接觸，在這方面被包裹的細(xì)胞的形成骨的分化適當(dāng)?shù)厥峭ㄟ^(guò)下列進(jìn)行的(i)在分化培養(yǎng)基中溫育在三維培養(yǎng)物中的被包裹的胚胎干細(xì)胞，然后，(ii)在分化培養(yǎng)基中溫育(i)中產(chǎn)生的被包裹的細(xì)胞并提供形成骨的分化的刺激因素。合適的，在步驟(i)中胚胎干細(xì)胞與分化培養(yǎng)基接觸約1到6天，優(yōu)選約2到5天，最優(yōu)選約3或4天，并且在步驟(ii)中提供形成骨的分化的剌激因素之后，培養(yǎng)一般進(jìn)行21到28天，優(yōu)選20到22天，例如21天?？蛇x的，可以通過(guò)在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)被包裹的細(xì)胞并提供形成骨的分化的刺激因素進(jìn)行被包裹的細(xì)胞的形成骨的分化。在此情況中，細(xì)胞可以在存在形成骨的分化的刺激因素的情況下于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)21到28天?？梢允褂靡阎男纬晒堑姆只捏w外誘導(dǎo)物，優(yōu)選在步驟(ii)中以進(jìn)一步分化多能細(xì)胞。簡(jiǎn)要的，血清、抗壞血酸鹽(抗壞血酸)、或L-抗壞血酸-2-磷酸鹽(長(zhǎng)效抗壞血酸類(lèi)似物)，)3-磷酸甘油和地塞米松中的每一種已知作為形成骨的分化的體外誘導(dǎo)物起作用。在現(xiàn)有技術(shù)中，血清、抗壞血酸鹽和地塞米松是小結(jié)形成所絕對(duì)需要的，而P-磷酸甘油促進(jìn)或增強(qiáng)礦化(26)。唯一特異于成骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征以礦化的細(xì)胞外基質(zhì)的形式位于細(xì)胞外。在體外骨節(jié)的形成被細(xì)分為三個(gè)階段(i)增殖，(ii)ECM分泌/成熟和(iii)礦化(mineralisation)。本發(fā)明的方法可以以工業(yè)化規(guī)模進(jìn)行以生產(chǎn)特異的分化細(xì)胞類(lèi)型。例如，從包裹在藻酸鹽或基于藻酸鹽的小珠中的胚胎干細(xì)胞和在生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)開(kāi)始，可以實(shí)現(xiàn)骨形成。這個(gè)自動(dòng)、集成的過(guò)程是有效的、易于控制的并且與現(xiàn)有技術(shù)中的二維方法和三維方法相比明顯減少了形成骨組織所耗費(fèi)的時(shí)間。將一個(gè)或多個(gè)胚胎干細(xì)胞包裹在支持基質(zhì)中，例如以形成小珠，導(dǎo)致產(chǎn)生有益于胚胎干細(xì)胞維持、分化，可選通過(guò)胚狀體形成，和進(jìn)一步分化，例如形成骨的分化的環(huán)境。本發(fā)明的方法使該過(guò)程自動(dòng)化、可控制、最優(yōu)化和強(qiáng)化，從而能夠生產(chǎn)臨床應(yīng)用所需的臨床相關(guān)數(shù)量的細(xì)胞，例如形成骨的細(xì)胞。本發(fā)明的形成骨的方法適用于任何來(lái)源的多潛能細(xì)胞，例如人、非人靈長(zhǎng)類(lèi)、馬、犬、牛、豬、山羊、綿羊、魚(yú)、嚙齒動(dòng)物、鼠或鳥(niǎo)來(lái)源的多潛能細(xì)胞。通過(guò)對(duì)本發(fā)明的維持人胚胎干細(xì)胞的方法進(jìn)行調(diào)整可提供篩選方法以評(píng)估細(xì)胞環(huán)境(培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基、試驗(yàn)刺激因素、化合物)對(duì)維持生長(zhǎng)和/或分化的影響。因此，本發(fā)明提供包裹在支持基質(zhì)中的人胚胎干細(xì)胞在評(píng)估試驗(yàn)化合物或刺激因素對(duì)細(xì)胞維持和/或分化的影響中的用途。本發(fā)明還進(jìn)一步提供包裹在支持基質(zhì)中的人胚胎干細(xì)胞在評(píng)估培養(yǎng)基和/或條件對(duì)細(xì)胞維持和/或分化的影響中的應(yīng)用。還提供識(shí)別能夠調(diào)控人胚胎干細(xì)胞維持和/或分化的化合物的方法，其包括(a)提供包裹在支持基質(zhì)中的人胚胎干細(xì)胞以形成支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)，(b)在存在試驗(yàn)化合物的情況下在維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)被包裹的人胚胎干細(xì)月包，(c)評(píng)估試驗(yàn)化合物對(duì)人胚胎干細(xì)胞維持和/或分化的影響。使用本發(fā)明的篩選方法有可能識(shí)別通過(guò)抑制多潛能或多能細(xì)胞分化促進(jìn)細(xì)胞維持的化合物，和識(shí)別促進(jìn)分化的化合物。試驗(yàn)化合物或化合物的混合物可以是天然產(chǎn)生的或化學(xué)合成的。此外提供識(shí)別能夠調(diào)控人胚胎干細(xì)胞分化的刺激因素的方法，其包括(a)提供包裹在支持基質(zhì)中的人胚胎干細(xì)胞以形成支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)，(b)在存在試驗(yàn)刺激因素的情況下在適于細(xì)胞維持和/或分化的培養(yǎng)基和條件中溫育被包裹的人胚胎干細(xì)胞，(c)評(píng)估試驗(yàn)刺激因素對(duì)人胚胎干細(xì)胞分化的影響。使用本發(fā)明的方法能夠識(shí)別抑制或促進(jìn)分化的刺激因素，例如化合物和/或條件。另一方面，本發(fā)明提供評(píng)估培養(yǎng)基和/或條件對(duì)人胚胎千細(xì)胞維持和/或分化的影響的方法，其包括(a)提供包裹在支持基質(zhì)中的人胚胎干細(xì)胞以形成支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)，(b)在存在試驗(yàn)培養(yǎng)基和/或試驗(yàn)化合物的情況下溫育被包裹的人胚胎干細(xì)胞，(c)評(píng)估試驗(yàn)培養(yǎng)基和/或試驗(yàn)條件對(duì)人胚胎干細(xì)胞維持和/或分化的影響。本方法可用于優(yōu)化培養(yǎng)條件以增強(qiáng)細(xì)胞維持、抑制分化或促進(jìn)分化。在本評(píng)估方法中，可選地在存在試驗(yàn)化合物/刺激因素的情況下溫育細(xì)胞，并評(píng)估試驗(yàn)化合物/刺激因素對(duì)細(xì)胞維持/分化的影響。進(jìn)行篩選方法以在步驟(a)中在每個(gè)支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)中包裹多個(gè)細(xì)胞，或者在步驟(a)中在每個(gè)支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)中包裹單個(gè)細(xì)胞。在本發(fā)明優(yōu)選的篩選方法中，例如以小珠的形式用被包裹的單個(gè)細(xì)胞，其中每個(gè)小珠含有單個(gè)細(xì)胞，例如胚胎干細(xì)胞。通過(guò)分開(kāi)培養(yǎng)含有單個(gè)細(xì)胞的小珠，合適地在多孔的平板(其可以是陣列形式，例如多孔平板，如96孔平板)或微型生物反應(yīng)器中?？梢酝瑫r(shí)進(jìn)行多重篩選以評(píng)估和優(yōu)化培養(yǎng)基和條件，以及篩選化學(xué)合成的化合物、多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的影響?？梢栽O(shè)定篩選方法，使得在一組培養(yǎng)容器中提供被包裹的細(xì)胞，例如作為多孔或多室陣列。優(yōu)選在步驟(a)中，每個(gè)培養(yǎng)容器中存在多個(gè)被包裹的細(xì)胞，這可以通過(guò)提供含有多個(gè)細(xì)胞的單個(gè)支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)，如小珠實(shí)現(xiàn)，或者更優(yōu)選的通過(guò)在步驟(a)中在每個(gè)培養(yǎng)容器中提供大量支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)。在這第二個(gè)途徑中，每個(gè)支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)，如小珠可以含有單個(gè)細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞。在可選的篩選方法中，每個(gè)培養(yǎng)容器中存在一個(gè)被包裹的細(xì)胞。使用本發(fā)明所述的方法可以在受控制的環(huán)境中快速培養(yǎng)單個(gè)的人胚胎干細(xì)胞。這使得能夠并行的高通量篩選許多不同的培養(yǎng)環(huán)境，或在相同的培養(yǎng)環(huán)境中并行的高通量篩選許多不同的細(xì)胞類(lèi)型。適宜地在單個(gè)培養(yǎng)容器，如多孔板的孔中加入5到20個(gè)小珠，每個(gè)小珠含有單個(gè)人胚胎干細(xì)胞。因?yàn)樾≈橹械膯蝹€(gè)細(xì)胞不會(huì)直接與附近小珠中包裹的單個(gè)細(xì)胞接觸，所以每個(gè)小珠構(gòu)成單獨(dú)的生長(zhǎng)環(huán)境。在單個(gè)孔中放置多個(gè)小珠能夠進(jìn)行時(shí)間研究分析，因?yàn)槊總€(gè)小珠將面臨相同的條件。在多孔平板中培養(yǎng)使得能夠?qū)Χ喾N條件進(jìn)行篩選，并且便于結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析。使用機(jī)器人技術(shù)推進(jìn)該過(guò)程的自動(dòng)化，例如通過(guò)喂飼培養(yǎng)物。小珠中單個(gè)細(xì)胞的包裹確保了在銅喂或其它操作期間單個(gè)培養(yǎng)物不會(huì)被打擾。本發(fā)明的篩選方法可以在培養(yǎng)容器中的二維培養(yǎng)物(靜態(tài)或懸浮液)中進(jìn)行，或者在生物反應(yīng)器，如HARV生物反應(yīng)器中的三維培養(yǎng)物中進(jìn)行。使用具有微通道的微型生物反應(yīng)器能夠?qū)θS培養(yǎng)物進(jìn)行恒定的灌注的飼喂，從而便于進(jìn)行更加精細(xì)的篩選試驗(yàn)和自動(dòng)化。本發(fā)明的篩選方法可以以高通量的形式進(jìn)行。對(duì)于本發(fā)明的篩選用途和方法，試驗(yàn)化合物、試驗(yàn)刺激因素、培養(yǎng)基和/或條件對(duì)細(xì)胞維持和/或分化的影響可以通過(guò)選自下組的一種或多種方法進(jìn)行評(píng)估顯微鏡檢查、一種或多種階段特異性抗原的檢測(cè)、基因表達(dá)水平的檢測(cè)，例如通過(guò)RT-PCR或使用DNA或RNA微陣列。用于包裹的支持基質(zhì)具有滲透性，能夠容許營(yíng)養(yǎng)物、代謝物和生長(zhǎng)因子的擴(kuò)增和質(zhì)量傳遞。一個(gè)或多個(gè)包裹在支持基質(zhì)中的細(xì)胞可以以小珠，如一般的球形小珠的形式提供。"包裹"表示一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞被完全包埋在支持基質(zhì)中。小珠的形狀不是特別相關(guān)，只要其尺寸，如表面積與體積的比例使得營(yíng)養(yǎng)物、代謝物、細(xì)胞因子等能夠容易的擴(kuò)散進(jìn)入/出小珠，達(dá)到包埋在小珠中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。特別優(yōu)選支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)，如小珠由在培養(yǎng)期間保持完整的支持基質(zhì)材料構(gòu)成，其中培養(yǎng)時(shí)間可以是3到4個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間以用于維持；或者如同在形成骨的分化培養(yǎng)方法的實(shí)例中那樣多至30到40天。將一個(gè)或多個(gè)包裹在支持基質(zhì)中的細(xì)胞置于三維培養(yǎng)容器，如RWV生物反應(yīng)器(Synthesis:USA)或其它模擬微重力或灌注的(perfUsed)生物反應(yīng)器中，然后在沒(méi)有明顯損傷的情況下在維持和/或分化培養(yǎng)基中長(zhǎng)期培養(yǎng)。優(yōu)選支持基質(zhì)材料由水凝膠材料組成或包含水凝膠材料，例如形成凝膠的多糖，如瓊脂糖或藻酸鹽(通常為約0.5到約2%w/v的范圍，優(yōu)選為約0.8到約1.5%w/v,更優(yōu)選約0.9到1.2%v/v)。基質(zhì)可以單獨(dú)由藻酸鹽組成，或可以包含更多的成分，如明膠(通常為約0.05到約l%w/v,優(yōu)選為約0.08到約0.5%v/v)。包含明膠可以幫助獲得相同的小珠大小，和幫助維持結(jié)構(gòu)完整。這是重要的，因?yàn)樵逅猁}水凝膠會(huì)在長(zhǎng)期培養(yǎng)后失去Ca^陽(yáng)離子，這將削弱小珠的結(jié)構(gòu)完整性。藻酸鹽支持基質(zhì)小珠中包含明膠使得能夠進(jìn)行細(xì)胞介導(dǎo)的收縮和支架材料的包裝。藻酸鹽是從褐海藻中提取的水溶性線性多糖，其由交替單元的1-4連接的a-L-葡萄糖醛酸和(3-D-甘露糖醛酸殘基組成。藻酸鹽可和大部分二價(jià)和多價(jià)陽(yáng)離子形成凝膠，但Ca^是最常用的。鈣陽(yáng)離子參與G-塊(G-blocks)之間的鏈間結(jié)合，形成凝膠形式的三維網(wǎng)絡(luò)。G-塊之間的結(jié)合區(qū)通常表示為"蛋一盒模型(egg-boxmodel)"(27)。我們發(fā)現(xiàn)藻酸鹽和基于藻酸鹽的支持基質(zhì)，合適的是以小珠的形式(如藻酸鹽加明膠小珠)，特別適合在本發(fā)明的方法中使用，因?yàn)樗鼈冊(cè)谒玫呐囵B(yǎng)條件中保持其完整性?？梢杂酶鞣N信號(hào)(如層粘連蛋白、膠原或生長(zhǎng)因子)改良支持基質(zhì)以提高所需的細(xì)胞性能。因此，支持基質(zhì)可以包含一種或多種選自下組的材料層粘連蛋白，BioglassTM,羥基磷灰石，細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，生長(zhǎng)因子；來(lái)自其它細(xì)胞培養(yǎng)物的提取物，以及對(duì)于形成骨的分化而言，來(lái)自成骨細(xì)胞培養(yǎng)物的提取物。在二維培養(yǎng)中細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)已被用作刺激因素以實(shí)現(xiàn)胚胎干細(xì)月包的形成骨的分<匕(Hausemann&Pauken,2003，Differentiationofembryonicstemcellstoosteoblastsonextracellularmatrix,10AnnualUndergraduateresearchPosterSymposium,ArizonaStateUniversity:http:〃lifesciences.asu.edu/ubep2003/participants/hausmann)。本領(lǐng)域已知大量能夠刺激多潛能干細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞分化的生長(zhǎng)因子，例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4),其增強(qiáng)中胚層形成和骨形成，Nakayama等人.(2003)JCe〃Scf116(10):2015.(http:〃ics.biologists.org/cgi/r印rint/116/10/2015):視黃酸，其刺激中胚層形成，hedgehog蛋白，例如sonichedgehog,其刺激中胚層向骨祖細(xì)胞分化以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP1-3和5-9，其刺激骨誘導(dǎo)。藻酸《丐或基于藻酸鈣的支持基質(zhì)有利于形成骨的培養(yǎng)和分化。鈣離子在小珠的形成中被用作螯合劑，可以提供4丐的本地來(lái)源以對(duì)形成骨的礦化提供幫助。在單個(gè)細(xì)胞被包裹以形成每個(gè)小珠具有單個(gè)細(xì)胞的小珠，然后培養(yǎng)形成集落的方法中，特別優(yōu)選使用含有明膠的藻酸鹽作為用于包裹的支持基質(zhì)材料，以形成支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)，例如形成小珠。合適的，含有單個(gè)細(xì)胞的小珠的直徑為大約20到150微米，優(yōu)選約40到約100微米。含有多個(gè)細(xì)胞的小珠的直徑通常為約2.0到約2.5毫米，優(yōu)選約2.3毫米。在發(fā)明的一些方面，優(yōu)選所用的支持基質(zhì)易于被溶解以釋放細(xì)胞，不需使用胰蛋白酶處理。在希望除去支持基質(zhì)以釋放細(xì)胞時(shí)，水凝膠基質(zhì)，例如藻酸鹽和基于藻酸鹽的基質(zhì)是有利的，因?yàn)橥ㄟ^(guò)使用檸檬酸鈉和氯化鈉溶液很容易將它們?nèi)芙狻？梢詫⒁粋€(gè)或多個(gè)細(xì)胞包裹在生物相容性材料中，從而使獲得的被包裹的細(xì)胞(如形成骨的細(xì)胞)能夠直接施用給受試患者，而不需要從包裹材料中收獲細(xì)胞。為了這個(gè)目的，使用藻酸鹽或基于藻酸鹽的支持基質(zhì)包裹細(xì)胞是有利的，因?yàn)樵逅猁}材料是生物相容性的，并且藻酸鹽是FDA批準(zhǔn)的。被包裹的細(xì)胞，特別是包裹在藻酸鹽或基于藻酸鹽的材料中那些，可以通過(guò)例如注射或內(nèi)窺鏡檢查法直接施用給患者。本發(fā)明的方法或用途可進(jìn)一步包括水凍被包裹的細(xì)胞用于儲(chǔ)存。被包裹的細(xì)胞可以使用標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行水凍，并且可以在其培養(yǎng)用的維持或分化培養(yǎng)基中冰凍。適合用于冰凍被包裹的細(xì)胞的方法包括使用Stensvaag等人.(20(M)CellTransplantation13(1):35-"所述的緩慢冰凍程序在二曱基亞砜(DMSO)中低溫貝i藏。本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括從支持基質(zhì)中釋放一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。本發(fā)明因此提供如此獲得的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。當(dāng)使用藻酸鹽或基于藻酸鹽的基質(zhì)進(jìn)行包裹時(shí)，可通過(guò)藻酸鹽溶解實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的釋放。與會(huì)影響長(zhǎng)期培養(yǎng)物中細(xì)胞性能的標(biāo)準(zhǔn)酶促方法，如胰蛋白酶處理相比，這種溫和的溶解方法更具優(yōu)勢(shì)。個(gè)被包裹的細(xì)胞；該被包裹的細(xì)胞可以是多能的，如形成骨的、形成軟骨的或形成心肌的細(xì)胞，或者是終末分化的，如成熟的成骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞。進(jìn)一步提供本發(fā)明的被包裹的細(xì)胞作為藥物的用途。通過(guò)本發(fā)明方法獲得的被包裹的形成骨的細(xì)胞在骨重建(bonereconstruction),例如在治療性頜面夕卜科(maxifacialsurgery)或在整容夕卜科(cosmeticsurgery)中是有用的。本發(fā)明還提供被包裹的形成骨的細(xì)胞作為治療選自下組的疾病或病癥的藥物的用途骨質(zhì)疏松癥、骨斷裂、骨折、骨癌癥、骨癌、成骨不全(osteogenesisimperfecta)、Paget's病、纖維性結(jié)構(gòu)不良(fibrousdysplasia)、與聽(tīng)力喪失有關(guān)的骨疾病、低磷酸酯酶癥、骨髓瘤骨病、骨硬化癥、骨過(guò)度使用損傷(over-useinjurytobone)、骨的運(yùn)動(dòng)損傷、牙周(齒齦)疾病。進(jìn)一步提供本發(fā)明的被包裹的形成軟骨的細(xì)胞作為用于治療選自下組的疾病或病癥的藥物的用途關(guān)節(jié)炎、軟骨疾病或紊亂、軟骨修復(fù)、整容成形外科。軟骨疾病包括特別在關(guān)節(jié)軟骨中的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎；所述紊亂包括先天或遺傳性缺陷，例如需要通過(guò)鼻和鼻中隔軟骨的面部重建進(jìn)行治療的那些。還進(jìn)一步提供本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)被包裹的形成骨的細(xì)胞在制備用于治療選自下組的需要骨重建的疾病或病癥的藥物中的用途，例如下列的疾病或病癥骨質(zhì)疏松癥、骨斷裂、骨折、骨癌癥、骨癌、成骨不全、Paget's病、纖維性結(jié)構(gòu)不良、與聽(tīng)力喪失有關(guān)的骨疾病、低磷酸酯酶癥、骨髓瘤骨病、骨硬化癥、骨過(guò)度使用損傷、骨的運(yùn)動(dòng)損傷、牙周(齒齦)疾病。另外提供被包裹的一個(gè)或多個(gè)形成軟骨的細(xì)胞在制備用于治療選自下組的疾病或病癥的藥物中的用途關(guān)節(jié)炎、軟骨疾病或紊亂、軟骨修復(fù)、成形外科、整容成形外科、類(lèi)風(fēng)濕性和骨關(guān)節(jié)炎。在另一方面，本發(fā)明提供治療受試者的方法，其包括施用本發(fā)明的被包裹的細(xì)胞。本發(fā)明的被包裹的形成骨的細(xì)胞可以被施用給受試者以治療需要骨重建的疾病或病癥骨質(zhì)疏松癥、骨斷裂、骨折、骨癌癥、骨癌、成骨不全、Paget's病、纖維性結(jié)構(gòu)不良、與聽(tīng)力喪失有關(guān)的骨疾病、低磷酸酯酶癥、骨髓瘤骨病、骨硬化癥、骨過(guò)度使用損傷、骨的運(yùn)動(dòng)損傷、牙周(齒齦)疾病。本發(fā)明的被包裹的形成軟骨的細(xì)胞可以被施用給受試者以治療選自下組的疾病或病癥關(guān)節(jié)炎、軟骨疾病或紊亂、軟骨修復(fù)、類(lèi)風(fēng)濕性和骨關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明還提供成形外科的方法，其可以是治療性的或整容外科(cosmeticsurgery),包括施用本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)被包裹的細(xì)月包，優(yōu)選祐L包裹的形成骨或形成軟骨的細(xì)胞?？梢耘渲票景l(fā)明的被包裹的細(xì)胞以提供藥物組合物，其含有一個(gè)或多個(gè)被包裹的細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。優(yōu)選藥物組合物被配制用于通過(guò)注射或內(nèi)窺鏡檢查法施用。從本發(fā)明的被包裹的細(xì)胞得到的骨或軟骨組織也在本發(fā)明范圍中，其適宜地在細(xì)胞支架上或細(xì)胞支架中提供。被包裹的細(xì)胞可以接種到細(xì)胞支架上，和/或灌輸入細(xì)胞支架中，所述細(xì)胞支架隨后被移植以使細(xì)胞在體內(nèi)原位生長(zhǎng)。該支架在骨和軟骨組織的成形外科中特別有用。圖1和2:用Oct4的抗體染色的免疫萸光130天的石蠟包埋/切片的人胚胎干細(xì)胞(hESC)聚集體顯示Oct-4的陽(yáng)性免疫染色。(嵌入的小圖一一陰性和陽(yáng)性對(duì)照)圖3和4:用抗-TRA-l-81染色的免疫熒光石蠟包埋/切片的130天的人胚胎干細(xì)胞聚集體的免疫染色顯示對(duì)該抗體的強(qiáng)免疫反應(yīng)性，表明保留了多潛能性。(嵌入的小圖一一陰性和陽(yáng)性對(duì)照)圖5和6:用抗-SSEA-4染色的免疫焚光未分化的人胚胎干細(xì)胞聚集體，顯示SSEA-4抗體的陽(yáng)性免疫染色。(嵌入的小圖——陰性和陽(yáng)性對(duì)照)圖7:RT-PCR分析RT-PCR分析顯示在175天和260天的人胚胎干細(xì)胞聚集體中多潛能標(biāo)記物Oct4和Nanog的表達(dá)。泳道A是175天齡的人胚胎干細(xì)胞聚集體，泳道B是260天齡的人胚胎干細(xì)胞聚集體，泳道C是陰性對(duì)照。GAPDH的表達(dá)被用作內(nèi)對(duì)照。圖8:包裹在水凝膠小珠(1.1%w/v藻酸鹽，0.1%v/v明膠)中的單個(gè)鼠胚胎干(mES)細(xì)胞在靜態(tài)三維培養(yǎng)物中在M2培養(yǎng)基中生長(zhǎng)10天。比例尺為50pm。單個(gè)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行分裂，在大約10天時(shí)形成細(xì)胞的小集落。圖9:整合的維持和形成骨的分化策略的示意圖。步驟為a)在藻酸鹽加明膠的微型小珠中包裹未分化的鼠胚胎千細(xì)胞，然后導(dǎo)入三維生物反應(yīng)器中；b)在維持培養(yǎng)基(M2)中培養(yǎng)3天以增加鼠胚胎干細(xì)胞數(shù)量，并形成合適的細(xì)胞群，以使得形成三維多先祖細(xì)胞(multiprogenitors);c)在EB形成培養(yǎng)基(Ml)中培養(yǎng)5天；d)在形成骨的培養(yǎng)基(Buttery)中培養(yǎng)21天以使得進(jìn)行骨誘導(dǎo)和三維骨形成。圖10:藻酸鹽小珠中的組織形態(tài)。藻酸鹽小珠保持其球形，細(xì)胞群集變得明顯(a)第3天(比例尺長(zhǎng)度=lOOO)iim);(b)第7天(比例尺長(zhǎng)度=500(im);(c)第21天(刻度尺長(zhǎng)度=500|am)。在各個(gè)時(shí)間的蘇木精/曙紅染色的水凝膠薄切片顯示組織發(fā)育(d)第3天(比例尺長(zhǎng)度=20pm);(e)第8天(比例尺長(zhǎng)度二20^im);(f)第22天(比例尺長(zhǎng)度==20jim)。圖11:由存活/死亡染色表示的藻酸鹽小珠中細(xì)胞的存活能力(嵌入的小圖)(綠色表示活細(xì)胞，紅色表示死細(xì)胞；比例尺長(zhǎng)度=100。通過(guò)使用針對(duì)代謝活動(dòng)的MTS分析(A;n-24),和堿性磷酸酶分析O;n=6)和用于礦化組織形成的茜素紅定量—；n=6)評(píng)估三維培養(yǎng)物中每個(gè)小珠的生物化學(xué)表現(xiàn)。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)誤差。*/#:顯著增加/降低(p<0.05)。圖12:對(duì)被包裹的鼠胚胎干細(xì)胞的表征。免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)在第3天維持未分化狀態(tài)(a)DAPI(藍(lán)色)和CD9(紅色),(b)DAPI(藍(lán)色)，(c)Oct-4(綠色)，。當(dāng)三維培養(yǎng)物在EB形成培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)(第3-8天)，在第8天明顯可見(jiàn)中胚層組織的產(chǎn)生(d)DAPI(藍(lán)色)和Flk-l(綠色)。嵌入的小圖表示從在組織培養(yǎng)平板(二維)上培養(yǎng)的鼠胚胎干細(xì)胞中獲得的陰性對(duì)照。比例尺長(zhǎng)度=20pm。圖13:對(duì)礦化組織形成的表征。(a)Balb/c小鼠骨茜素紅S陽(yáng)性對(duì)照和，(b)Balb/c小鼠vonKossa陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)(c)茜素紅S和(d)vonKossa染色證明在第22天藻酸鹽小珠中的礦化組織形成。蘇木精/曙紅染色的藻酸鹽小珠的正中切開(kāi)顯示第29天在水凝膠核心的組織形成(e-f)。在第29天檢測(cè)同一切片的骨形成，顯示更加明顯的茜素紅S(g)和vonKossa(h)染色。在第29天進(jìn)行的免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)終末分化的成骨細(xì)胞的存在(i)用DAPI染色的(藍(lán)色)和骨鈣素免疫染色(綠色)的第29天的切片，并且嵌入的小圖(j)顯示以同樣方式染色的Balb/c小鼠骨陰性對(duì)照；(k)更高放大倍率的用DAPI染色的(藍(lán)色)和對(duì)骨鈣素免疫染色的(綠色)第29天的切片，嵌入的小圖(l)顯示Balb/c小鼠骨陽(yáng)性對(duì)照；(m)用DAPI染色的(藍(lán)色)和對(duì)OB-鈣粘蛋白的免疫染色的(綠色)第29天的切片，嵌入的小圖顯示(n)Balb/c小鼠骨陽(yáng)性對(duì)照，和(o)Balb/c小鼠骨陰性對(duì)照；(p)用DAPI染色的(藍(lán)色)和對(duì)膠原-I的免疫染色的(綠色)第29天的切片，嵌入的小圖顯示(q)Balb/c小鼠骨陽(yáng)性對(duì)照，和(r)Balb/c小鼠骨陰性對(duì)照。(a-f)的比例尺長(zhǎng)度為100,，(g-j)的為20(im。圖14:在骨形成期間在第15天(dl5)、第22天(d22)和第29天(d29)對(duì)骨形成標(biāo)記物的基因表達(dá)分析。L=100bpDNA梯度。RT-ve=第29天在沒(méi)有逆轉(zhuǎn)錄酶的情況下用GapDH引物的RT-陰性對(duì)照。-ve=用水替代模板的用GapDH引物的PCR陰性對(duì)照。+ve=使用MC-3T3-E1細(xì)胞在骨形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天的陽(yáng)性對(duì)照。圖15:使用微型計(jì)算機(jī)X線斷層攝影術(shù)(微型CT)評(píng)估組織礦化。在第29天評(píng)估藻酸鹽小珠的骨聚集體礦化程度。(a-b)假顏色(falsecolour),隨機(jī)選擇的單個(gè)藻酸鹽小珠在第29天的三維區(qū)域再現(xiàn)(3Dsectorreconstruction)。嵌入的小圖代表使用Balb/c小鼠大腿骨的假顏色陽(yáng)性對(duì)照。假顏色圖像的著色顯示從最高(黃色)到紫色到最低(黑色)的衰減水平，其分別表示硬到軟組織。(c)顯示第29天藻酸鹽小珠的灰度傳遞圖像(紅色箭頭指示礦化聚集體周?chē)能浗M織)。嵌入的小圖顯示使用沒(méi)有任何細(xì)胞的藻酸鹽小珠的陰性對(duì)照灰度傳遞圖像(虛線表示小珠邊沿)。(d)假顏色，第29天藻酸鹽小珠的二維橫切面。比例尺長(zhǎng)度100nm。實(shí)施例實(shí)施例1:在藻酸鹽小珠中包裹人胚胎干細(xì)胞1.1細(xì)胞培養(yǎng)1.1.1飼養(yǎng)層原代鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)簡(jiǎn)要的，在雌性小鼠(SwissMF1品系)懷孕的第13天通過(guò)進(jìn)度表I處死方法(scheduleIkilling)將其處死。然后取出胚胎，并除去他們的內(nèi)臟。在胰蛋白酶/EDTA溶液(0.1MPBS中的0.05%胰蛋白酶/0.53mMEDTA,不含4丐或4美；GibcoInvitrogen,LifeTechnologies,Paisley,UK)中4子細(xì)切碎胚胎尸體，將其在培養(yǎng)弁瓦中接種于補(bǔ)充有10%v/v熱滅活FBS、O.lmMMEM非必需氨基酸溶液、100U/ml青霉素，100pg/ml鏈霉素(均得自GibcoInvitrogen,LifeTechnologies,Paisley,UK)的高葡萄糖DMEM中。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到鋪滿時(shí)，收集成纖維細(xì)胞，將其水凍于含有60°/。v/v高葡萄糖DMEM、20%v/v熱滅活FBS(均得自GibcoInvitrogen,LifeTechnologies,Paisley，UK)和20%v/v二曱基亞砜Hybri-Max⑧(DMSO)(Sigma陽(yáng)Aldrich,Dorset,UK)的MEF冰凍培養(yǎng)基中。為培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞，優(yōu)選不超過(guò)三或四代的MEF。在除青霉素和鏈霉素外其它與上述相同的培養(yǎng)基中，于明膠包被的培養(yǎng)容器表面培育解凍的MEF細(xì)胞。在用作飼養(yǎng)層之前，用絲裂霉素C消除MEF細(xì)胞的有絲分裂活性。然后用胰蛋白酶(0.1MPBS中的0.05%胰蛋白酶/0.53mMEDTA,不含4丐或4美；GibcoInvitrogen,LifeTechnologies,Paisley,UK)處理滅活的細(xì)胞，并或者將其冷凍，或者轉(zhuǎn)移到6孔平板中作為人胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的詞養(yǎng)層。在MEF水凍培養(yǎng)基中冰凍MEF(方案來(lái)自WiCellResearchInstituteInc,Madison,July2000)。人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)1.1.2.1未分化細(xì)胞的培養(yǎng)將滅活的原代MEF細(xì)胞接種至少一天，然后將未分化的人胚胎干細(xì)胞在上述培養(yǎng)基中解凍。第二天，解凍未分化的人HI細(xì)胞(WiCellResearchInstituteInc,Madison),將其接種于MEF細(xì)胞上，采用供應(yīng)商建議的方案培育未分化狀態(tài)的細(xì)胞。培養(yǎng)基由補(bǔ)充有20%v/vKNOCKOUTSR、2mML-谷氨酸鹽、0.1mM非必需氨基酸溶液(均得自GibcoInvitrogen,LifeTechnologies,Paisley,UK)、0.1mM2-巰基乙醇(2ME)(Sigma-Aldrich，Dorset,UK)和4ng/ml人重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF,FGF-2)(157個(gè)氨基酸)(R&DSystems,Oxon，UK)的DMEM/F12培養(yǎng)基組成。每?jī)商煳顾偶?xì)胞。這些細(xì)胞的生長(zhǎng)率比小鼠胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)率慢很多。由于滅活的MEF細(xì)胞在培養(yǎng)物中7-10天會(huì)死亡，因此每7-10天將人胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的飼養(yǎng)層上。細(xì)胞解凍后，需要花費(fèi)約4-6周獲得亞鋪滿的培養(yǎng)孔，然后將細(xì)胞分板。只有當(dāng)細(xì)胞處于集落中時(shí)，他們才生長(zhǎng)并保持它們的未分化狀態(tài)。單個(gè)細(xì)胞不生長(zhǎng)。偶爾，一些集落進(jìn)行自發(fā)分化。1.2在藻酸鹽小珠(alginatebead)中包裹人胚胎干細(xì)胞1.2.1包裹過(guò)程用胰蛋白酶消化未分化的、4-5天的人胚胎干細(xì)胞，然后在室溫下重懸于1.1%(w/v)低粘性褐藻酸承(Sigma，UK)和0.1%(v/v)豬明膠(Sigma,UK)(均溶解在PBS中，pH7.4)溶液中。低粘性褐藻酸是基本由具有1—4連接的無(wú)水-(3-D-甘露糖醛酸殘基組成的直鏈、親水、膠態(tài)聚糖醛酸。采用Pharmacia蠕動(dòng)泵[AmershamBiosciences,UK(ModelP-l)]，以x20的流速、30mm的落差[(對(duì)管道進(jìn)行高壓滅菌，然后用1MNaOH滅菌30分鐘并用無(wú)菌PBS洗三次)]，4吏細(xì)胞-凝膠溶液通過(guò)蠕動(dòng)泵(peristalticpump),用25口徑的針(BectonDickinson,UK)將其滴入無(wú)菌、室溫的CaCl2溶液中[于蒸餾水中的100mM氯化釣(CaCl2)(Sigma,UK)和10mMN-(2-羥乙基)旅。秦-N-(2-乙烷磺酸)(HEPES)(Sigma,UK),pH7.4]。凝為膠體的細(xì)胞-凝膠溶液立刻與CaCl2溶液接觸，形成球形小珠(膨脹后直徑2.3mm)。室溫下將小珠在輕輕攪動(dòng)的CaCl2溶液中保持6-10分鐘。將小珠在PBS中洗三次，然后放入維持培養(yǎng)基中。在人胚胎干細(xì)胞維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)包裹在藻酸鹽小珠中的未分化人胚胎干細(xì)胞，所述人胚胎干細(xì)胞維持培養(yǎng)基為補(bǔ)充有20%v/vKNOCKOUTSR、2mML-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸溶液(均得自GibcoInvitrogen:LifeTechnologies,Paisley,UK)、0.1mM2誦巰基乙醇(2ME)(Sigma-Aldrich,Dorset,UK)和4ng/ml人重組石成性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF，F(xiàn)GF-2)(157個(gè)氨基酸)(R&DSystems,Oxon,UK)的DMEM/F12培養(yǎng)基。生長(zhǎng)的條件為濕潤(rùn)孵箱中、37°C,5%C02,小珠在標(biāo)準(zhǔn)的塑料組織培養(yǎng)皿中于靜態(tài)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每3-4天飼喂細(xì)胞。使用附有彩色CoolPix950數(shù)碼相機(jī)(Nikon,Kingston-upon-Thames,UK)的倒置顯微鏡(01ympus，Southall,UK)評(píng)估和記錄結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)上的任何改變。小珠既含有人胚胎干細(xì)胞的聚集體，也含有單個(gè)人胚胎干細(xì)胞，單個(gè)人胚胎干細(xì)胞在小珠中形成集落。在維持培養(yǎng)基中130天后，于PBS中洗小珠兩次，然后將其溶解以釋放細(xì)胞/集落。1.2.2藻酸鹽小珠的溶解將用于溶解小珠的無(wú)菌解聚緩沖液[(Ca2+耗盡的)(50mM二水合檸檬酸三鈉(Fluka,UK),77mM氯化鈉(BDHLaboratorySupplies,UK)和10mMHEPES)](20)加入到用PBS洗過(guò)的小珠中15-20分鐘，同時(shí)輕輕攪動(dòng)。溶液于400g下離心10分鐘，用PBS洗滌沉淀物，然后再于300g下離心3分鐘。1.3組織學(xué)1.3.1石蠟包埋室溫下用4%多聚曱酪(PFA)固定來(lái)自小珠的no天齡的人胚胎干細(xì)胞聚集體一小時(shí)，然后保持在0.1%疊氮化鈉中以進(jìn)行短期或長(zhǎng)期保存(4°C)。脫水過(guò)程前，將人胚胎干細(xì)胞聚集體置于PBS中15分鐘。隨后經(jīng)過(guò)依次提高乙醇濃度的程序除去所有的水。然后用純二曱苯完全替換乙醇以除去所有痕量乙醇。然后在室溫下用石蠟飽和的二曱苯替換二甲苯過(guò)夜。然后將在石蠟飽和的二曱笨中的人胚胎干細(xì)胞聚集體置于烤箱(60。C)中20分鐘。然后用液體石蠟完全替換二甲苯。然后包埋樣本，切片(4pm),室溫下過(guò)夜以粘附于Vectabonded(VectorLaboratories,UK)載玻片上。1.3.2免疫細(xì)胞化學(xué)通過(guò)在二曱苯中沉浸、逐漸降低的乙醇濃度、然后用自來(lái)水沉浸，從切片除去石蠟。然后，將切片浸入二水合擰檬酸三鈉緩沖液(10mM,pH6.0)中進(jìn)行高溫滅菌，然后冷卻和干燥，以取回(retrieve)抗原。隨后用3%(v/v)封閉山羊或兔血清(VectorLaboratories)在室溫下在作為一級(jí)稀釋劑(primarydiluent)的PBS中的0.05%(w/v)牛血清白蛋白(BSA;Sigma),0.01%(w/v)NaN3(Sigma)中溫育樣本30分鐘。為進(jìn)行免疫熒光染色，根據(jù)制造商的方案使用胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物樣本試劑盒(Chemicon,International;Cat.no.SCR002)。所使用的單克隆抗體為抗-SSEA-4，抗-TRA-l-60和抗-TRA-l-81(試劑盒中提供)。對(duì)于Oct-4抗體(SantaCmzBiotechnology),用在一級(jí)稀釋劑中稀釋的一級(jí)抗體(1:300)于4。C溫育樣本過(guò)夜，隨后洗兩次，用在二級(jí)稀釋劑中稀釋的二級(jí)抗體(山羊抗-兔1:300)(SantaCruz,International)在室溫于黑暗中溫育1小時(shí)，第二稀釋劑由PBS中0.05%(w/v)BSA組成。隨后，在PBS中洗樣本兩次，用Vectashield固定。在1X70焚光倒置顯微鏡(Olympus,Southall,UK)下觀察制品。1.3.2.1陰性對(duì)照如在間接二層熒光標(biāo)記中那樣，可以通過(guò)省去一級(jí)抗體以檢測(cè)所使用的二級(jí)抗體的背景熒光，獲得陰性對(duì)照樣本。隨后可以用這些數(shù)據(jù)準(zhǔn)確解釋陽(yáng)性樣本。陰性對(duì)照可用于將標(biāo)記物定位在熒光直方圖上，從而識(shí)別陰性群體的確切位置，和估計(jì)單克隆或多克隆抗體與細(xì)胞表面抗原非特異性結(jié)合的數(shù)量。陽(yáng)十生3十照對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照，人胚胎干細(xì)胞在MEF上生長(zhǎng)，然后用胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物試劑盒免疫染色。使用陽(yáng)性對(duì)照識(shí)別單克隆和多克隆抗體與陽(yáng)性樣本上細(xì)胞表面抗原的特異性結(jié)合。RNA提耳又和逆轉(zhuǎn)錄根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用TRIzol試劑(LifeTechnologies,UK)和RNeasyMini試劑盒(Qiagen，UK)從藻酸鹽小珠中形成的175天和260天人胚胎干細(xì)胞聚集體中提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)(Invitrogen，UK)在20pi終體積中從1|ig總RNA合成cDNA。使用寡(&)20引發(fā)(prime)進(jìn)行RT反應(yīng)，其能夠用不同位點(diǎn)的基因特異引物PCR擴(kuò)增同一cDNA。在沒(méi)有cDNA模板的情況下進(jìn)行陰性對(duì)照。使用PrimerExpress2軟件(AppIiedBiosystems,UK)設(shè)計(jì)引物。RT-PCR序列如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>對(duì)于持家mRNA，使用3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，因?yàn)閾?jù)顯示在分化的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物中GAPDHmRNA比其他持家mRNA序列更穩(wěn)擴(kuò)增子序列與其他人DNA和cDNA序列的相似性。發(fā)現(xiàn)配對(duì)的引物退火位點(diǎn)和擴(kuò)增子序列對(duì)于目標(biāo)人序列是唯一的。在50|ilPCR反應(yīng)混合物中，MgCh和dNTP的終濃度分別為3和10mM。在Mastercyclerep(EppendorfAG,Germany)中進(jìn)4亍DNA擴(kuò)增雙鏈DNA變性和AmpliTaqGoldDNA聚合酶的活化在94°C進(jìn)行10分鐘，然后在94°C進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的模板變性(5秒)，在55°C進(jìn)行引物退火(對(duì)于Oct4和GAPDH;對(duì)于Nanog為55。C)和在72°C進(jìn)行引物延伸(30秒)。在3。/。(w/v)瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，通過(guò)溴化乙錠熒光顯像，使用100bp梯度(Fermentas)估計(jì)產(chǎn)物的大小。使用與計(jì)算機(jī)連接的Fluor-SMultilmager系統(tǒng)(Bio-Rad,UK)捕捉溴化乙錠染色的凝膠的數(shù)碼圖象，該系統(tǒng)由所附的平板式紫外光掃描器和CCD相機(jī)組成。使用Bio-RadQuantityOne軟件(Bio-Rad,UK)分析圖象，該軟件可檢測(cè)單個(gè)條帶并減去背景噪音，獲得完全由基因特異性擴(kuò)增的產(chǎn)物產(chǎn)生的強(qiáng)度值。RT-PCR分析(圖7)顯示在175天和260天的人胚胎干細(xì)胞聚集體中多潛能標(biāo)記物Oct4和Nanog的表達(dá)。泳道A是175天齡的人胚胎干細(xì)胞聚集體，泳B是260天齡的人胚胎干細(xì)胞聚集體，泳道C是陰性對(duì)照。使用GAPDH表達(dá)作為內(nèi)對(duì)照。這些結(jié)果顯示在超過(guò)100天的階段中人胚胎干細(xì)胞聚集體仍然保留了人胚胎干細(xì)胞的多潛能性而沒(méi)有傳代。這些結(jié)果也支持先前對(duì)多潛能標(biāo)記物的免疫細(xì)胞化學(xué)觀測(cè)結(jié)果。結(jié)論和討論獲得的結(jié)果證明人胚胎千細(xì)胞能夠在不存在祠養(yǎng)細(xì)胞且不存在伺養(yǎng)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的情況下保持未分化狀態(tài)至少130天。人胚胎干細(xì)胞包裹過(guò)程提供了物理環(huán)境，該物理環(huán)境使得不再需要這種詞養(yǎng)細(xì)胞支持。所開(kāi)發(fā)的該過(guò)程使得能夠采用類(lèi)似于小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)方法的方法培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞。本發(fā)明所開(kāi)發(fā)的用于人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)程序使得能夠?qū)崿F(xiàn)人胚胎干細(xì)胞分化方案，該方案基于現(xiàn)已用小鼠胚胎干細(xì)胞驗(yàn)證過(guò)的方案，但至今仍由于無(wú)法獲得數(shù)量足夠用于這些實(shí)驗(yàn)的未分化胚胎干細(xì)胞而沒(méi)有在人胚胎干細(xì)胞中進(jìn)行研究。所開(kāi)發(fā)的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)為用于開(kāi)發(fā)使用人胚胎干細(xì)胞的治療性產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化可調(diào)節(jié)系統(tǒng)提供了有用的平臺(tái)。實(shí)施例2:單個(gè)鼠胚胎干(mES)細(xì)胞的分化將單個(gè)的鼠胚胎干細(xì)胞包裹在水凝膠小珠(直徑40-100nm)中，然后在維持培養(yǎng)基M2[Dulbecco，sModifiedEaglesMedium(DMEM),10%(v/v)胎牛血清，100單位/mL青霉素和100)ig/mL鏈霉素，2mML-谷氨酰胺(均由Invitrogen,UK提供)，O.lmM2-巰基乙醇(Sigma,UK)和1000單位/mLEsgro(LIF)(Chemicon,UK)]中生長(zhǎng)10天。單個(gè)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行分裂，10天左右形成小的細(xì)胞集落(圖8)。通過(guò)用已確定的種系特異性信號(hào)進(jìn)行刺激可以使這些細(xì)胞分化為不同種系的成熟細(xì)胞。例如，對(duì)于形成骨的分化，采用下述的方案。實(shí)施例3:比較方法，傳統(tǒng)的二維鼠胚胎干細(xì)胞常規(guī)維持和傳代(參考文獻(xiàn)2和3)E14Tg2a鼠胚胎干(mES)細(xì)胞系在設(shè)定為37°C和5%C02(h37/5)的濕潤(rùn)孵箱中在0.1。/。明膠包被的組織培養(yǎng)容器上常規(guī)傳代。未分化的鼠胚胎干細(xì)胞(<p20)每2或3天進(jìn)行傳代，并且每天喂飼新鮮的M2培養(yǎng)基[Dulbecco，sModifiedEaglesMedium(DMEM),10%(v/v)胎牛血清，100單位/mL青霉素和100嗎/mL鏈霉素，2mML-谷氨酰胺(均由Invitrogen,UK提供),O.lmM2-巰基乙醇(Sigma,UK)和1000單位/mLEsgro(LIF)(Chemicon，UK)]。為分離鼠胚胎干細(xì)胞，在吸出培養(yǎng)基后向鼠胚胎干細(xì)胞中加入需要量的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)(TE)(Invitrogen，UK)3-5分鐘(h37/5),然后用預(yù)熱的PBS洗一次。二舉綠，多4胚狀體(embryoidbody)形成涉及懸浮培養(yǎng)前鼠胚胎干細(xì)胞的精心制備，這已經(jīng)有詳細(xì)的記載(8;9;24;28-30)。然而，本發(fā)明用E14Tg2a細(xì)胞系確定了懸浮前正確條件的經(jīng)驗(yàn)測(cè)定。單層培養(yǎng)物中的細(xì)胞應(yīng)為80%鋪滿，其為2或3天的培養(yǎng)物，并且在形態(tài)學(xué)上未分化的與已分化的比值很高。像正常一樣用胰蛋白酶處理鼠胚胎干細(xì)胞，但是在胰蛋白酶作用23分鐘而不是5分鐘后可見(jiàn)100-200個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞隨后在室溫下以300g離心3分鐘(22。C，(RT))。在^42培養(yǎng)基中生長(zhǎng)2或3天后，鋪滿的T乃培養(yǎng)瓶中通常產(chǎn)生大約5-7x106個(gè)細(xì)胞，將其重新懸浮于30mL的Ml培養(yǎng)基[Alpha-ModifiedEaglesMedium(aMEM),10%(v/v)胎牛血清，100單位/mL青霉素和100嗎/mL鏈霉素]中，然后均勻散布在兩個(gè)90mm直徑的細(xì)菌學(xué)等級(jí)的培養(yǎng)皿(BibbySterilin，UK)中。為通過(guò)這種方法正確形成胚狀體，10-20個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)是必需的，因?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞懸浮液或^:千個(gè)細(xì)胞的大細(xì)胞團(tuán)會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的三維聚集體。在胚狀體形成(h37/5)的第三天更換培養(yǎng)基，因此必需的生長(zhǎng)因子已經(jīng)耗盡(如L-谷氨酰胺)，且有毒代謝物已經(jīng)開(kāi)始積聚(如氨)。在培養(yǎng)的第5天，通過(guò)從細(xì)菌學(xué)平板中抽吸而收獲胚狀體，然后以66g離心4分鐘。吸出培養(yǎng)基，用預(yù)熱的PBS替換以洗去痕量血清。細(xì)胞再次以66g離心4分鐘，吸出PBS。洗3-5分鐘(h37/5)后向胚狀體中加入lmL的TE。然后加入預(yù)熱的M1培養(yǎng)基(lmL)以停止胰蛋白酶消化作用，將細(xì)胞重新懸浮于需要的培養(yǎng)基中作為用于骨小結(jié)形成分析的單個(gè)細(xì)胞懸浮液。二舉矛V、錄為、浙如以前所述(31)的標(biāo)準(zhǔn)的骨小結(jié)(bonenodule)形成分析是使用Ml培養(yǎng)基進(jìn)行的，其從第8天到第29天不斷補(bǔ)入卩adex[10mM(3-磷酸甘油，50pg/ml抗壞血酸和的地塞米松(終濃度)]。將解聚的胚狀體(dEB)在塑料組織培養(yǎng)容器或載玻片上培養(yǎng)21天(h37/5),每2或3天更換培養(yǎng)基。dEB的鋪板密度為每平方厘米5.208x103個(gè)細(xì)胞，每25個(gè)細(xì)胞l(iL培養(yǎng)基。實(shí)施例4:鼠胚胎干細(xì)胞的藻酸鹽小珠包裹將未分化的鼠胚胎干細(xì)胞(mESC)包裹于1.1%(w/v)低粘性褐藻酸和0.1%(v/v)豬明膠的水凝膠小珠(d=2.3mm)中。在50mL水平的方向比率容器(aspectratiovessel)(HARV)生物反應(yīng)器中培養(yǎng)大約600個(gè)小珠，每個(gè)小珠中含有10,000個(gè)鼠胚胎干細(xì)胞。設(shè)定生物反應(yīng)器培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)動(dòng)速度為17.5rpm，在含有白血病抑制因子(LIF)的維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，然后替換為胚狀體形成培養(yǎng)基，培養(yǎng)5天，接著用含有2-磷酸-L-抗壞血酸(501Lig/mL)，p-磷酸甘油(10mM)和地塞米松(1pM)的形成骨的培養(yǎng)基再培養(yǎng)21天。29天后觀察到培養(yǎng)物中每個(gè)小珠的細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)了84倍，并且在藻酸鹽小珠中形成了礦化的(mineralised)基質(zhì)。骨生成通過(guò)vonKossa和萏素紅S染色、堿性磷酸酶活性、骨4丐素(osteocalcin)的免疫細(xì)胞化學(xué)，OB-鈣粘蛋白和I型膠原、RT-PCR和微計(jì)算機(jī)X線斷層攝影術(shù)(微CT)進(jìn)行評(píng)估。這些發(fā)現(xiàn)提供了一種簡(jiǎn)單、集成的生物學(xué)方法，用于從鼠胚胎干細(xì)胞可再生地生產(chǎn)具有潛在臨床應(yīng)用的三維(3D)礦化組織。才才津+禾口方法虞嚴(yán)應(yīng)干勿#凝#;^嚴(yán)炎#:多成'E14Tg2a細(xì)胞的培養(yǎng)和胚狀體的形成如先前所述的進(jìn)行(32)。簡(jiǎn)要的，每2_3天傳代未分化的鼠胚胎干細(xì)胞pp20),并且每天用維持培養(yǎng)基進(jìn)行喂詞，維持培養(yǎng)基由補(bǔ)充有10%(v/v)胎牛血清(FCS;Invitrogen)、100單位/mL青霉素(Invitrogen)、100jig/mL鏈霉素(Invitrogen)、2mML-谷氨酰胺(Invitrogen)、0.1mM2-巰基乙醇(Sigma，UK)、和1000單位/mLLIF(Chemicon,ChandlersFord,UK)的Dulbecco，sModifiedEagle'sMedium(DMEM;Invitrogen,Paisley,UK)組成。分裂胚狀體，將細(xì)胞團(tuán)(10-20個(gè)纟田月包)置于由alpha-ModifiedEagle'sMedium(aMEM;Invitrogen)、10%(v/v)FCS(Invitrogen)、100單位/mL青霉素(Invitrogen)、和100|ig/mL鏈霉素(Invitrogen)組成的胚狀體分化培養(yǎng)基中懸浮5天。礦化紐織和矛V、潛為Vf如先前所述，使用補(bǔ)充有50pg/mL2-磷酸-L-抗壞血酸(Sigma)、10mM(3-磷酸甘油(Sigma)和ljLiM地塞米松(Sigma)的a-MEM(Invitrogen)從第8天到第29天的培養(yǎng)物中在保持在37。C和5%C02條件下的塑料組織培養(yǎng)容器中或載玻片上進(jìn)行礦化組織的形成(13)。鋪板密度為5.2x103個(gè)細(xì)胞/cm2,每2或3天更換培養(yǎng)基。逸,和蘭#及^器培#未分化的鼠胚胎干細(xì)胞以1.56x106個(gè)細(xì)胞/mL懸浮于無(wú)菌的1.1%(w/v)低粘性褐藻酸(Sigma)，0.1%(v/v)豬明膠(Sigma)磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS;pH7.4)中。將細(xì)胞-凝膠溶液通過(guò)蠕動(dòng)泵(ModelP-l;AmershamBiosciences,Amersham,UK),然后使用25-口徑將其從30mm滴入100mMCaCl2，10mMN-(2-羥乙基)哌。秦-N-(2-乙烷磺酸)的無(wú)菌溶液(HEPES;pH7.4)(均得自Sigma)中。在室溫下凝膠化6-10分鐘所形成的小珠為球形(膨脹后直徑^2.3mm)。包裹的鼠胚胎干細(xì)胞在水平的方向比率容器生物反應(yīng)器(Cdlon，Bereldange，LUX)中在維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，每天更換培養(yǎng)基。每個(gè)反應(yīng)器含有600個(gè)小珠，在培養(yǎng)的第0-21天以17.5rpm旋轉(zhuǎn)，在培養(yǎng)的第22-29天以20rpm旋轉(zhuǎn)。提高旋轉(zhuǎn)速度以抵消藻酸鹽小珠中礦化組織的形成，其導(dǎo)致小珠變得更重。從第3天直到第8天，用胚狀體分化培養(yǎng)基(aMEM,如先前所述)喂飼生物反應(yīng)器培養(yǎng)物，該培養(yǎng)基在第6天補(bǔ)滿，然后在第8天如早先所述的用形成骨的補(bǔ)充物進(jìn)行骨形成的誘導(dǎo)(每2-3天補(bǔ)滿)。存浮〃"S亡為、浙懸浮細(xì)胞或藻酸鹽小珠在室溫下于暗處用PBS中的4(iMEthD-l和2鈣黃綠素AM溶液(Invitrogen)溫育30分鐘，然后用PBS洗滌。死亡細(xì)胞被用作陰性對(duì)照。勿應(yīng)樣本處理將在Flaskette載玻片(Nalgene,Hereford,UK)上生長(zhǎng)的對(duì)照二維細(xì)胞培養(yǎng)物于4%(w/v)多聚曱醛(PFA;BDHLaboratorySupplies)中固定20分鐘，然后在PBS中洗滌。在室溫下將藻酸鹽小珠于4。/。(v/v)多聚曱醛(PFA;由BDHLaboratorySupplies,Poole,UK)中固定30分鐘，然后在濃度逐漸增加的乙醇中脫水，用二曱苯(BDHLaboratorySupplies)處理，接著用石蠟包埋。將包埋的樣本連續(xù)切片(4(im)至VectabondTM-包被的載玻片(VectorLaboratories,OrtonSouthgate,UK)上。對(duì)于免疫細(xì)胞化學(xué)，在通過(guò)加熱取回抗原前，將脫水的切片浸入10mM二水合檸檬酸三鈉緩沖液(pH6.0;Sigma)中。Balb/c小鼠骨骼用與藻酸鹽小珠相同的方式進(jìn)行加工，用作對(duì)照。逸歡夢(mèng)通過(guò)常規(guī)的蘇木精/曙紅染色檢測(cè)含水的二維細(xì)胞培養(yǎng)物或在藻酸鹽小珠中生長(zhǎng)的細(xì)胞的脫石蠟切片的組織學(xué)。吝,虹5*和v。"《OWfl染悉如別處所述，含水(hydrated)二維細(xì)胞培養(yǎng)物和石蠟切片用菡素紅S或vonKossa著色劑染色(33)。VonKossa染色的切片用核堅(jiān)牢紅復(fù)染色，連續(xù)脫水，在二曱苯中清除，然后在DPX中固定。Balb/c小鼠骨被用作對(duì)照，用與藻酸鹽小珠相同的方式對(duì)其進(jìn)行加工。名瘦勿應(yīng)化學(xué)將含水二維細(xì)胞培養(yǎng)物或石蠟切片浸入10mM二水合檸檬酸三鈉緩沖液(pH6.0;Sigma)中，然后高壓滅菌以取回抗原，隨后在室溫下用0.2%(v/v)Triton-X-100(BDHLaboratorySupplies)溫育45分鐘。如表1中所示，樣本依次用下列溫育a)在作為一級(jí)稀釋劑的PBS中的0.01%(w/v)NaN3(Sigma)中，于室溫下用在0.05%(w/v)牛血清白蛋白(BSA;Sigma)中的3%(v/v)封閉山羊或兔血清(VectorLaboratories)溫育30分鐘；b)與在一級(jí)稀釋劑中稀釋的針對(duì)若干干細(xì)胞和成骨細(xì)胞標(biāo)記物的一級(jí)抗體于4。C溫育過(guò)夜;c)與在二級(jí)稀釋劑[PBS中的0.05%(w/v)BSA]中的二級(jí)抗體在室溫下于暗處溫育1小時(shí)。然后用PBS洗滌樣本，再用含有1.5pg/mL4'，6聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)的Vectashield(VectorLaboratories)固定。Balb/c小鼠骨被用作對(duì)照，用與藻酸鹽小^N目同的方式對(duì)其進(jìn)行加工。使用總RNA分離試劑盒(QiagenLtd,Crawley，UK)提取總RNA。使用1嗎總RNA、隨機(jī)引物和具有Rnase抑制劑的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega，UK)進(jìn)行單鏈cDNA的合成。PCR反應(yīng)緩沖液由1xAmplitaqGold緩沖液，2mMMgCl2,200juMdNTPs,1.25單位的AmplitaqGoldDNA聚合酶(AppliedBiosystems，Warrington,UK)和500nM的每種引物(Invitrogen)組成。如先前所述(32),使用2(iL(來(lái)自20^L)的cDNA進(jìn)行RT-PCR分析；引物序列如表1中所列。使用MC-3T3-E1細(xì)胞的陽(yáng)性對(duì)照在形成骨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天。移除逆轉(zhuǎn)錄酶作為陰性對(duì)照。表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>膠原IICTGCTCATCGCCGCGGTCCTAAGGGGTACCAGGTTCTCCATC432(剪接A,早期發(fā)育)225(剪接B,成熟軟骨)94°C下10分鐘，30個(gè)循環(huán)的94°C60秒，60°C60秒，72°C60秒&72°C下7分鐘骨鈣素COCN)CGGCCCTGAGTCTGACAAAACCTTATTGCCCTCCTGCTT19394°C10分鐘，30個(gè)循環(huán)的94°C60秒，60°C60秒，72°C60秒和72°C7分鐘。MTS#浙采用CellTiter96AQueousOneSolutionReagent分才斤(Promega，Southampton,UK)評(píng)估整個(gè)培養(yǎng)期間的代謝活動(dòng)。使用生長(zhǎng)于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)物(二維)或包裹于藻酸鹽小珠(三維)中的已知數(shù)量的鼠胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。進(jìn)行陰性對(duì)照(無(wú)細(xì)胞)。所有的試驗(yàn)都在三個(gè)不同的場(chǎng)合、一式兩份地進(jìn)行，并且對(duì)于每個(gè)試驗(yàn)，都一式四份地進(jìn)行測(cè)定。簡(jiǎn)要的，二維培養(yǎng)的鼠胚胎干細(xì)胞在37°C于24孔平板中用200(iL的無(wú)酚紅維持培養(yǎng)基和40|iL的MTS試劑溫育2小時(shí)。只有二維反應(yīng)通過(guò)加入50的10%(v/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)停止。類(lèi)似的，隨機(jī)選擇三個(gè)藻酸鹽小珠，將其放入24孔平板的不同孔中，然后在37。C用300pL的無(wú)酚紅維持培養(yǎng)基和60jiL的MTS試劑溫育4小時(shí)。從每個(gè)反應(yīng)中取100pL轉(zhuǎn)移入96孔平板中，然后使用MRXII平板讀數(shù)器(DynexTechnologies,Worthing,UK)于450■讀數(shù)。DiVJ定量使用DNA特異性染料Hoechst33258(Sigma)測(cè)定用蛋白酶K消化的樣本的總DNA含量，以其作為評(píng)估藻酸鹽小珠中細(xì)胞數(shù)量的間接方法。簡(jiǎn)要的，小珠在室溫下于解聚緩沖液(20)中溶解20分鐘，然后以400g離心10分鐘，收集細(xì)胞沉淀，用PBS洗滌。沉淀在液氮中速凍，然后在-80°C下保存直到進(jìn)行分析。為進(jìn)行DNA分析，沉淀在37。C下于含有50(ig/mL蛋白酶K(Sigma)的100mM磷酸氬二鉀(Sigma)溶液中消化過(guò)夜。熱滅活蛋白酶K并且以12,000g離心10分鐘之后，將100jiL上清液與100pL的Hoescht33258溶液(2嗎/mL)混合。最后，<吏用MFX樣i滴定平4反焚光計(jì)(Dy腦Technologies)以365■激發(fā)波長(zhǎng)、460nm發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)100(iL試樣讀數(shù)。使用高度聚合的小牛胸腺DNA(Sigma)產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線。在培養(yǎng)的第0天和第29天，樣品一式兩份的用于三個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)。礦化W定#吝,扭為V^f被包裹的鼠胚胎干細(xì)胞的礦化的萏素紅S(ARS)分析在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)改造Gregory等人的方法(34)進(jìn)行定量。簡(jiǎn)要的，將100個(gè)小珠用10%(v/v)曱醛固定30分鐘，然后在解聚緩沖液(20)中;容解20分鐘。通過(guò)以400g離心10分鐘回收細(xì)胞沉淀，然后以與二維培養(yǎng)物相同的方式將其染色。4V4禱虔爽(^丄i30^通過(guò)在37。C于暗處用150(iL的石咸性磷酸酶緩沖液(pNPP;Sigma)和150的磷酸對(duì)硝基酚溶液溫育細(xì)胞或小珠30分鐘檢測(cè)培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)物中或包裹于藻酸鹽小珠(n=6)中的鼠胚胎干細(xì)胞的堿性磷酸酶活性。通過(guò)向每孔中加入100|uL的0.5NNaOH溶液終止反應(yīng)，然后從每個(gè)反應(yīng)中取100pL轉(zhuǎn)移到96孔平板的孔中，使用MRXII平板讀數(shù)器(DynexTechnologies)于410nm讀數(shù)。成澩使用配置有CoolPix950數(shù)碼相機(jī)(Nikon,Kingston-upon-Thames,UK)的1X70倒置顯樣i鏡(Olympus,Southall,UK)或配置有Axiocam(Zeiss)的BX60豎式(Olympus)顯微鏡獲取圖象。圖象沒(méi)有進(jìn)行人工增強(qiáng)；但是使用AdobePhotoshop7.0對(duì)圖象進(jìn)行采集(crop)。存活/死亡的染色樣本在30分鐘的制備過(guò)程中使用Bio-RadMRC600共焦顯微鏡(Bio-Rad/Zeiss，Welwyn-Garden-City,UK)成像，然后使用COMOS軟件(Bio-Rad,UK)處理。使用設(shè)定為70kV、160jiA并相應(yīng)校準(zhǔn)的Phoenixx-rayv|tome|x計(jì)算機(jī)X線斷層攝影機(jī)(Phoenixx-ray3DImagingSystem,Fareham,UK)進(jìn)行微型-CT分析以再現(xiàn)(reconstruct)在藻酸鹽小珠中形成的三維礦化聚集體。使用一個(gè)檢測(cè)器獲取圖像，并在360。內(nèi)旋轉(zhuǎn)，每個(gè)截面相隔6.75^m。使用最初由Siemens,Germany開(kāi)發(fā)的Sixtos軟件產(chǎn)生三維再現(xiàn)。使用不含一皮包裹的細(xì)胞的藻酸鹽小珠的陰性對(duì)照，和使用Balb/c小鼠pup骨碎片的陽(yáng)性對(duì)照。遂#》、浙將結(jié)果表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)差(SEM),并使用方差分析(ANOVA)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。在P〈0.05時(shí)認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。結(jié)果對(duì)來(lái)自包裹于藻酸鹽小珠中和培養(yǎng)于HARV生物反應(yīng)器中的鼠胚胎千細(xì)胞的三維礦化組織進(jìn)行形態(tài)、表型(表面和分子)以及功能性(礦化程度)的評(píng)估。作為對(duì)照，我們根據(jù)傳統(tǒng)的在培養(yǎng)瓶(二維)培養(yǎng)物中形成骨小結(jié)的方案培養(yǎng)鼠胚胎干細(xì)胞，重復(fù)先前已顯示的結(jié)果(31),從而證實(shí)發(fā)生了形成骨的分化(數(shù)據(jù)未顯示)。誕逸襲W多,悉夢(mèng),在將分散的未分化鼠胚胎干細(xì)胞包裹于平均直徑為2.3mm的藻酸鹽水凝膠小珠中(大約每個(gè)小珠IO,000個(gè)細(xì)胞)。在維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后，一開(kāi)始分散在藻酸鹽小珠中的鼠胚胎干細(xì)胞形成了細(xì)胞個(gè)數(shù)為4-10個(gè)細(xì)胞、直徑在20-5(Him之間的集落(圖la)。這些集群是為球形、盤(pán)形或梭形，在小珠各處平均分布，但是很少位于緊鄰小珠外表面的地方(圖la)。在第3天除去LIF、然后在EB形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天之后，大部分集落表現(xiàn)出一致的外觀，并顯示在藻酸鹽基質(zhì)內(nèi)離散的"口袋(pockets)"中細(xì)胞數(shù)量和整體大小都有所增加(圖lb),集落的大小范圍在直徑50-400(^m。到培養(yǎng)的第22天，集落已經(jīng)非常緊密地堆積。大部分大集落位于小珠中心(圖1C)，在外圍可以見(jiàn)到不含任何細(xì)胞材料的區(qū)域。培養(yǎng)29天后，集落的直徑超過(guò)了500pm。細(xì)乂敏^長(zhǎng)和/七談活動(dòng)隨著集落大小增加，被包裹的鼠胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞生存力并未隨著培養(yǎng)時(shí)間而明顯降低。在第3天，出現(xiàn)有限的細(xì)胞死亡跡象，其表現(xiàn)為少許紅色細(xì)胞(圖2);但多數(shù)細(xì)胞開(kāi)始形成離散的、存活的集落。雖然集落大小隨著培養(yǎng)時(shí)間而增加，但是在培養(yǎng)的最初3周集落的數(shù)量沒(méi)有明顯的增加，盡管事實(shí)上生存力非常高(圖2)。最終，培養(yǎng)29天后，明顯可見(jiàn)的存活集落在數(shù)量上多于第22天時(shí)，也比他們?cè)谂囵B(yǎng)更早期時(shí)更大。通過(guò)檢測(cè)單個(gè)小珠中DNA量進(jìn)行評(píng)估的第O天時(shí)每個(gè)小珠中具有代謝活性的、未分化的鼠胚胎干細(xì)胞的數(shù)量為每個(gè)小珠中10,287±228個(gè)細(xì)胞(平均值士SE;n=2，每個(gè)重復(fù)試驗(yàn)分析150個(gè)小珠)。在HARV生物反應(yīng)器中培養(yǎng)29天后，每個(gè)小珠中有859,716±13,492個(gè)細(xì)胞(平均值±SE;n二6),其表明從培養(yǎng)開(kāi)始增加了84倍。代謝活性的改變顯示出與培養(yǎng)的階段、所使用的培養(yǎng)基類(lèi)型和喂銅的時(shí)間有關(guān)。從第0天到第3天，小珠培養(yǎng)于維持培養(yǎng)基中，每個(gè)小珠的代謝活動(dòng)保持不變(圖2)。在第3天，用胚狀體形成培養(yǎng)基替換維持培養(yǎng)基，如圖2所示，可以觀察到每個(gè)小珠的代謝活性明顯增加(p<0.05)。在第8天，加入分化培養(yǎng)基，如圖2所示，每個(gè)小珠的代謝活動(dòng)到第15天略有降低，僅在到第29天明顯增加(p<0.05)。但是，由于到培養(yǎng)的第29天藻酸鹽小珠中細(xì)胞的數(shù)量增加了84倍，因此每個(gè)細(xì)胞的代謝活性沒(méi)有增加。ALPase活性和礦化的量被用于指示形成骨的培養(yǎng)基中骨形成期間(培養(yǎng)的第15天到第29天)的形成骨的分化。在培養(yǎng)的第15天和第29天之間ALPase活性降低了3倍(p<0.05)(圖2)。相反，如圖2所示，每個(gè)小珠中礦化的量(基于410nm的吸光率)明顯增加(p<0.05)，從第15天的0.0021±0.0003增加到第29天的0.0999±0.0035(平均值±SE)。吸光率讀數(shù)被標(biāo)準(zhǔn)化為每個(gè)小珠的，但是實(shí)際讀數(shù)是在每次讀數(shù)使用100個(gè)小珠的礦化量獲得的。^分化^嚴(yán)靡"f勿應(yīng)和胚炎體的^在在培養(yǎng)的第3天Oct-4(細(xì)胞核中)和CD9(在細(xì)胞表面上)的表達(dá)證明在維持培養(yǎng)基中的最初3天的培養(yǎng)期間被包裹的鼠胚胎干細(xì)胞保持未分化表型(圖3a-c)。此外，在胚狀體形成階段，被包裹的鼠胚胎千細(xì)胞在第8天顯示表達(dá)Flk-l，一種中胚層標(biāo)記物(圖3d)。三舉礦化逸織多成通過(guò)檢測(cè)藻酸鹽小珠的一系列切片，詳細(xì)了解在培養(yǎng)的形成骨階段(第15-29天)由被包裹的鼠胚胎干細(xì)胞在藻酸鹽水凝膠中形成的三維礦化組織的性質(zhì)。圖4a-h表明，如深萏素紅S和vonKossa染色所示，三維礦化組織早在第22天就已明顯形成，并在藻酸鹽小珠中進(jìn)一步發(fā)展至第29天。顯然，樣本含有高比例的礦化組織，其滲透到整個(gè)切片。在培養(yǎng)的第22天和第29天之間觀察到染色強(qiáng)度的變化。尤其是在骨形成中期(第22天)，茜素紅S染色的組織在顏色上為均一的紅色(圖4c-d),但沒(méi)有達(dá)到小鼠骨陽(yáng)性對(duì)照中所示的紅/黑程度。此外，第22天的樣本含有直徑范圍為100到300nm的組織，其中礦化區(qū)域的寬度在50-100itmi。相反，在骨形成階殺二的末期(第29天)，如蘇木素/曙紅染色所示，藻酸鹽小珠含有更大的組織聚集體(圖4e-f);最大的組織切片的尺寸大于500x500(im。如生存力染色所證實(shí)，所形成的組織的某些區(qū)域表現(xiàn)出壞死，但是大部分都是存活的(圖2)。此外，所產(chǎn)生的組織趨向于占據(jù)小珠的中心，并且高度整齊，具有柱形細(xì)胞的邊緣(圖4e)。最后，在第29天(圖4g-h)，所形成的礦化組織達(dá)到如陽(yáng)性對(duì)照(圖4a-b)中所示的紅/黑茜素紅S染色強(qiáng)度。還通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)通過(guò)評(píng)估骨特異性標(biāo)記物OB-鈣粘蛋白、I型膠原和骨鈣素的表達(dá)研究藻酸鹽水凝膠中礦化組織的形成。在培養(yǎng)的第15、22和29天檢測(cè)標(biāo)志成骨細(xì)胞(35)的OB-鈣粘蛋白的表達(dá)(圖4i-k)，其在所形成的組織的大塊區(qū)域中普遍分布。大部分的染色局限在組織的邊緣，在這里細(xì)胞組織成柱狀形式。在OB-鈣粘蛋白染色陽(yáng)性的同一組織樣本的礦化切片外圍檢測(cè)到骨4丐素染色(圖4m)。最后，還檢測(cè)到I型膠原，雖然與小鼠骨陽(yáng)性對(duì)照相比水平較低，并且僅在第29天可見(jiàn)(圖4p)，這可能是由于所使用的多克隆抗體的靈敏度較低。通過(guò)分析基因表達(dá)證實(shí)免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果。尤其是，RT-PCR證明(圖5)在第15、22和29天小珠中CZ)/a-J和I型膠原表達(dá)。在第15、22和29天發(fā)現(xiàn)IIA型膠原(其為短暫的胚胎形式(21))和骨鈣素表達(dá)；在第29天小珠中骨鈣素的表達(dá)顯示與陽(yáng)性對(duì)照(MC-3T3-E1細(xì)胞)類(lèi)似的強(qiáng)度。通過(guò)微型-CT分析評(píng)估組織礦化。由置于維持培養(yǎng)基中的不含被包裹的鼠胚胎干細(xì)胞的藻酸鹽小珠組成的陰性對(duì)照的微型-CT圖象產(chǎn)生具有非常小反差的圖像，這表明缺乏能夠衰減X-射線的致密材料(圖6)。相反，在藻酸鹽小珠中由鼠胚胎干細(xì)胞形成的礦化組織提供合適的反差。除致密的骨聚集體外，在第15、22天(數(shù)據(jù)未顯示)和第29天(圖6)，通過(guò)微型-CT還檢測(cè)到藻酸鹽小珠的表面"外殼"，其描畫(huà)出藻酸鹽小珠外周的輪廓。小珠外殼含有低水平的致密材料(紫色)，小珠本身中的礦化骨聚集體在它們的中心顯示高水平的衰減(黃色)，并且隨著與骨聚集體核心距離的增加，衰減降低。對(duì)小鼠大腿骨的陽(yáng)性對(duì)照成像以比較礦化的程度(圖6)。對(duì)隨機(jī)選擇的藻酸鹽小珠進(jìn)行完整的掃描從而提供藻酸鹽小珠中礦化組織區(qū)域的三維再現(xiàn)。在第15天，沒(méi)有看見(jiàn)礦化組織聚集體，但是到第22天，可以看見(jiàn)14個(gè)直徑小于50^m的離散的小聚集體。但是在第29天，大小范圍從50到250pm的44±7(平均值±SE;n=2)個(gè)礦化組織聚集體(圖6)已存在。如圖4所示這些礦化聚集體被軟組織包圍，其在圖6(紅色箭頭)中可被微弱的識(shí)別為圍繞礦化聚集體的較暗區(qū)域。討論胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)被高維持費(fèi)用所阻礙，這是其維持是分段的過(guò)程，需要經(jīng)專(zhuān)門(mén)訓(xùn)練的操作者，和取決于操作者的決定?，F(xiàn)在，鼠胚胎干細(xì)胞在組織培養(yǎng)塑料容器上以單層培養(yǎng)，其所處的微環(huán)境由于分批型培養(yǎng)、頻繁的使用者介入和培養(yǎng)區(qū)域的快速耗盡而有所變化。最近，其它研究者也已經(jīng)強(qiáng)調(diào)傳統(tǒng)胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的問(wèn)題，并且提供了完整的解決方法(36)。在本報(bào)告中，我們證實(shí)了新的生物過(guò)程，藉此未分化的鼠胚胎干細(xì)胞在完整過(guò)程中在藻酸鹽小珠中形成三維礦化組織，其使用HARV生物反應(yīng)器，不需要介入和培養(yǎng)操作。在鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的維持階段，維持多潛能性和細(xì)胞生存力是必需的，其通過(guò)存在LIF實(shí)現(xiàn)(4)。因此，必須保證LIF滲透藻酸鹽小珠，其被認(rèn)為是"半固體"，且鈣分布和多糖單元的排列都不均勻。小珠中存在鈣和藻酸鹽梯度，該梯度從表面外殼(最高濃度)向小珠中心(弱膠凝區(qū)域)展開(kāi)(37)。這些濃度梯度可以解釋為什么集落似乎在離小珠外殼500Mm處生長(zhǎng)。所制備的藻酸鹽小珠可滲透分子量為68kDa的蛋白(38),可以允許例如LIF的擴(kuò)散(39;40)。通過(guò)在氯化鈣溶液中進(jìn)行凝膠作用6到10分鐘，每批制備600個(gè)小珠。藻酸鹽的凝膠作用是反應(yīng)-擴(kuò)散過(guò)程，其中4丐和藻酸鹽越過(guò)組成恒定(constantconstituting)的邊界相互擴(kuò)散以形成名為0&++-藻酸鹽凝膠網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。有理由認(rèn)為小珠上的表面外殼始終形成(因?yàn)樗行≈楸３滞暾?，因此與氯化鈣溶液接觸時(shí)間較短的小珠形成鈣-藻酸鹽梯度的時(shí)間較少，在小珠的中心具有更大的弱凝膠的區(qū)域(37)。在胚狀體形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天后，藻酸鹽小珠中集落大小顯著增加，在一些情況下直徑達(dá)到400)im,而生存力沒(méi)有明顯降低。集落均勻生長(zhǎng)于小珠內(nèi)離散的"口袋，，中，據(jù)報(bào)道這更有益于生長(zhǎng)(37)。即使我們包裹了未分化的鼠胚胎干細(xì)胞，并且使用傳統(tǒng)的懸浮方法沒(méi)有形成胚狀體，但在培養(yǎng)3-8天期間Flk-l抗原在培養(yǎng)物中的表達(dá)證明發(fā)育出了中胚層(23;41)。在骨生成早期(第15天)OB-鈣粘蛋白的表達(dá)表明在三維培養(yǎng)物中存在成骨細(xì)胞(42)。這些成骨細(xì)胞在第15天是存活的(酯酶活性)而且具有代謝活性(脫氬酶活性)。在培養(yǎng)期間代謝活性變化不定。在形成骨的分化開(kāi)始時(shí)(第8天)，每個(gè)小珠的代謝活性高，在第15天達(dá)到低點(diǎn)，其與ALPase活性達(dá)到最高水平而礦化接近其最低水平相關(guān)。隨著骨生成進(jìn)展(15到29天)，觀察到(每個(gè)小珠的)ALPase活性降低，礦化增強(qiáng)，這與成骨細(xì)胞分化和生長(zhǎng)的其它模型中所顯示的一致(43)。除其它功能外，骨骼組織中ALPase活性被認(rèn)為增加局部無(wú)機(jī)磷酸鹽水平，破壞羥基磷灰石晶體生長(zhǎng)抑制劑和幫助磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)(44)。骨生成后期可能是成骨細(xì)胞被捕獲到分泌的基質(zhì)中，并顯著降低其代謝活動(dòng)從而將資源轉(zhuǎn)向礦化的階段。在22和29天ALPase活性的降低，礦化的增長(zhǎng)以及每個(gè)細(xì)胞的低代謝活性表明該階段細(xì)胞表型可能為成熟成骨細(xì)胞的表型。在骨生成結(jié)束時(shí)(第29天)檢測(cè)到骨鈣素、OB-鈣粘蛋白和I型膠原蛋白的事實(shí)進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。Shimko等人(45)誘導(dǎo)鼠胚胎干細(xì)胞朝骨分化而沒(méi)有胚狀體形成，導(dǎo)致的礦化如他們自己所承認(rèn)的不被認(rèn)為是常規(guī)的骨生成。他們報(bào)導(dǎo)骨鈣素和I型力交原的產(chǎn)生都被延遲，且ALPase活性與正常骨生成不一致。相反，我們的數(shù)據(jù)證明發(fā)生了常規(guī)的三維骨生成，表現(xiàn)為ALPase的水平降低和表達(dá)骨特異性蛋白，OB-釣粘蛋白在早至第15天即表達(dá)。在胚胎骨中骨鈣素的表達(dá)是短暫的，但是它是成人骨中最豐富的蛋白之一，并以4丐依賴的方式與羥磷灰石結(jié)合(46;47)。交織(woven)的骨表現(xiàn)為不規(guī)則的膠原纖維束，巨大和眾多的骨細(xì)胞，以及以不規(guī)則分布的小片出現(xiàn)的延遲、雜亂的鈣化(48)。本研究中，在第22和29天骨鈣素以環(huán)形和在三維組織聚集體邊緣存在，這與微型-CT結(jié)果一致。這些觀察結(jié)果提示藻酸鹽小珠中礦化組織由磷灰石晶體的濃縮(骨發(fā)育)形成，并且可能位于骨樣前沿的前緣(成人板層骨)。我們的數(shù)據(jù)推知細(xì)胞大部分為具有增殖能力的成骨細(xì)胞(49),并且已經(jīng)堆積羥磷灰石。一般認(rèn)為多能祖細(xì)胞分化為成熟的骨細(xì)胞依照增殖、細(xì)胞外基質(zhì)形成和礦化的階段進(jìn)行，其伴有見(jiàn)于成熟骨小結(jié)中的少量凋亡(50)。RT-PCR分析進(jìn)一步證實(shí)存在末期分化的礦化骨組織，其具有骨生成的終點(diǎn)的明顯表型，該表型為表達(dá)C6/fl-7,I型膠原和骨鈣素的有絲分裂活躍的成熟成骨細(xì)胞(49;51)。在鼠胚胎干細(xì)胞的形成骨的分化期間表達(dá)胚胎II型膠原(剪接變體A)是正常的(21;52)，并且類(lèi)似的，也曾報(bào)道骨鈣素在形成骨的分化的第7天至第21天表達(dá)(53),相當(dāng)于本研究中的第15天至第29天。缺少任何成熟的II型膠原(剪接變體B)表達(dá)表明不存在成人軟骨，及骨組織主要由I型膠原組成。將這一方法改編用于人胚胎干細(xì)胞很可能導(dǎo)致其臨床應(yīng)用。尤其，對(duì)于手術(shù)操作，例如腰推骨脫離，其需要松質(zhì)骨移植物以修補(bǔ)3-4mm的松解術(shù)(54),含有來(lái)自10，000個(gè)胚胎干細(xì)胞的44±7(平均值±SE,n=2)個(gè)礦化聚集體的單個(gè)藻酸鹽小珠(直徑=2.3mm)可以提供足夠的材料用于修補(bǔ)這一缺陷。此外，可能直接注射充滿礦化組織的藻酸鹽凝膠進(jìn)入到缺損區(qū)域中(55-57)。本方法提供了不同于傳統(tǒng)胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的引人注目的有益的可選方法，消除了提供大規(guī)模三維組織用于臨床應(yīng)用的瓶頸?？傊覀兲峁┝艘环N用于從未分化鼠胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生三維礦化組織的簡(jiǎn)單、集成的方法，其最小限度的依賴操作者的介入，提供可重復(fù)的結(jié)果，易于擴(kuò)大規(guī)模和在線監(jiān)控。實(shí)施例5:被包裹的細(xì)胞的低溫保存使用Stensvaag等人(2004)記載的方法(59)，在冷凍步驟前逐漸增加DMSO濃度。將低溫試管進(jìn)一步過(guò)度冷卻至-7.5d。C,然后成核。其后，樣本以0.25。C/分鐘的速率冷卻，然后儲(chǔ)存在液氮中。使用共焦顯微鏡定量(CLSM)技術(shù)和NITS分析評(píng)估被包裹的細(xì)胞的生存力。參考文獻(xiàn)(1)Ulloa-MontoyaF，VerfaillieCM,HuWS.Culturesystemsforpluripotentstemcells,JBiosciBioeng2005Jul;100(l):12-27.(2)SmithTA,HooperML.Mediumconditionedbyfeedercellsinhibitsthedifferentiationofembryonalcarcinomacultures,ExpCellRes1983May;145(2):458-62.(3)SmithAG,HooperML.Buffaloratlivercellsproduceadiffusibleactivitywhichinhibitsthedifferentiationofmurineembryonalcarcinomaandembryonicstemcells.DevBiol1987May;121(l):卜9.(4)SmithAG，HeathJK,DonaldsonDD，WongGG，MoreauJ，StahlM，etal.Inhibitionofpluripotentialembryonicstemcelldifferentiationbypurifiedpolypeptides.Nature1988Dec15;336(6200》688-90.(5)PesceM，GrossMK，ScholerHR.Inlinewithourancestors:Oct-4andthemammaliangerm.Bioessays1998Sep;20(9):722-32.(6)NicholsJ,ZevnikB,AnastassiadisK，NiwaH,Klewe-NebeniusD，ChambersI，etal.FormationofpluripotentstemcellsinthemammalianembryodependsonthePOUtranscriptionfactorOct4,Cell1998Oct30;95(3):379-91.(7)NiwaH，MiyazakiJ,SmithAG.QuantitativeexpressionofOct-3/4definesdifferentiation,dedifferentiationorself-renewalofEScells.NatGenet2000Apr;24(4):372-6.(8)MartinGR，EvansMJ.Differentiationofclonallinesofteratocarcinomacells:formationofembryoidbodiesinvitro.ProcNatlAcadSciUSA1975Apr;72(4):1441-5.(9)DesbaiIIetsI.EmbiyoidBodies:an//vz7romoddofmouseembryogenesis.ExperimentalPhysiology2000.(10)LeahyA，XiongJW，KuhnertF，StuhlmannH.Useofdevelopmentalmarkergenestodefinetemporalandspatialpatternsofdifferentiationduringembryoidbodyformation.JExpZool1999Jun15;284(1):67-81.(11)SottileV,ThomsonA,McWhirJ.InvitroosteogenicdifferentiationofhumanEScells.CloningStemCells2003;5(2):149-55.(12)PhillipsBW,BelmonteN,VernochetC，AilhaudG，DaniC.Cornpactinenhancesosteogenesisinmurineembryonicstemcells.BiochemBiophysResCommun2001Jun8;284(2):478-84.(13)ButteryLD，BourneS，XynosJD,WoodH,HughesFJ，HughesSP，etal.Differentiationofosteoblastsandinvitroboneformationfrommurineembryonicstemcells.TissueEng2001Feb;7(1):89-99.(14)ZandstraPW，NagyA.Stemcellbioengineering.AnnuRevBiomedEng2001;3:275-305.(15)AbbottA.Cellculture:biology'snewdimension.Nature2003Aug21;424(6951):870-2.(16)YamadaKM,ClarkK.Cellbio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單個(gè)細(xì)胞。28.權(quán)利要求22至27任一項(xiàng)的方法，其中在培養(yǎng)容器的陣列中提供被包裹的細(xì)胞。29.權(quán)利要求28的方法，其中培養(yǎng)容器的陣列是多孔或多管陣列。30.權(quán)利要求22至29任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(a)中在每個(gè)培養(yǎng)容器中提供多個(gè)被包裹的細(xì)胞。31.權(quán)利要求22至30任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(a)中在每個(gè)培養(yǎng)容器中提供多個(gè)支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)。32.權(quán)利要求22至29任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(a)中在每個(gè)培養(yǎng)容器中存在單個(gè)的被包裹的細(xì)胞。33.權(quán)利要求22至32任一項(xiàng)的方法，其中所述支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)為小珠的形式。34.權(quán)利要求20至33任一項(xiàng)的用途或方法，其中通過(guò)選自下組的一種或多種方法來(lái)評(píng)估對(duì)細(xì)胞維持和/或分化的影響顯微鏡檢查、一種或多種階段特異性抗原的檢測(cè)以及基因表達(dá)的檢測(cè)。35.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述支持基質(zhì)由水凝膠組成或包含水凝膠。36.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述支持基質(zhì)由藻酸鹽組成或包含藻酸鹽。37.權(quán)利要求36或權(quán)利要求37的方法，其中支持基質(zhì)還包含明膠。38.權(quán)利要求35至37任一項(xiàng)的方法，其中支持基質(zhì)進(jìn)一步包含選自下組的一種或多種材料明膠、層粘連蛋白、Bioglass、羥基磷灰石、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、生長(zhǎng)因子、來(lái)自另一種細(xì)胞培養(yǎng)物的提取物、來(lái)自成骨細(xì)胞培養(yǎng)物的提取物。39.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法或用途，其還包括冰凍被包裹的細(xì)胞。40.權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)或權(quán)利要求39的方法，其還包括從支持基質(zhì)中釋放一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。41.通過(guò)權(quán)利要求40的方法獲得的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。42.可通過(guò)或通過(guò)權(quán)利要求1至19任一項(xiàng)的方法得到的一個(gè)或多個(gè)被包裹的細(xì)胞。43.通過(guò)權(quán)利要求1的方法得到的一個(gè)或多個(gè)被包裹的人胚胎干細(xì)胞。44.通過(guò)權(quán)利要求3至19任一項(xiàng)的方法得到的一個(gè)或多個(gè)^f皮包裹的多能細(xì)胞。45.可通過(guò)或通過(guò)權(quán)利要求3至19任一項(xiàng)的方法得到的一個(gè)或多個(gè)被包裹的形成骨的細(xì)胞、形成軟骨的細(xì)胞或形成心肌的細(xì)胞。46.可通過(guò)或通過(guò)權(quán)利要求3至19任一項(xiàng)的方法得到的一個(gè)或多個(gè)被包裹的終末分化細(xì)胞。47.權(quán)利要求42至46任一項(xiàng)的被包裹的細(xì)胞或權(quán)利要求41的細(xì)胞作為藥物的用途。48.權(quán)利要求45的一個(gè)或多個(gè)被包裹的形成骨的細(xì)胞作為治療需要骨重建的疾病或病癥的藥物的用途。49.權(quán)利要求45的一個(gè)或多個(gè)被包裹的形成骨的細(xì)胞作為治療選自下組的疾病或病癥的藥物的用途骨質(zhì)疏松癥、骨斷裂、骨折、骨癌癥、骨癌、成骨不全、Paget's病、纖維性結(jié)構(gòu)不良、與聽(tīng)力喪失有關(guān)的骨疾病、低磷酸酯酶癥、骨髓瘤骨病、骨硬化癥、骨過(guò)度使用損傷、骨的運(yùn)動(dòng)損傷、牙周(齒齦)疾病、和成形外科如治療性頜面外科、或整容外科。50.權(quán)利要求45的一個(gè)或多個(gè)被包裹的形成軟骨的細(xì)胞作為治療選自下組的疾病或病癥的藥物的用途關(guān)節(jié)炎、軟骨疾病或紊亂、軟骨修復(fù)、整容成形外科、類(lèi)風(fēng)濕性和骨關(guān)節(jié)炎。51.權(quán)利要求45的一個(gè)或多個(gè)被包裹的形成骨的細(xì)胞在制備用于治療需要骨重建的疾病或病癥的藥物中的用途。52.權(quán)利要求45的一個(gè)或多個(gè)被包裹的形成骨的細(xì)胞在制備用于治療選自下組的疾病或病癥的藥物中的用途骨質(zhì)疏松癥、骨斷裂、骨折、骨癌癥、骨癌、成骨不全、Paget's病、纖維性結(jié)構(gòu)不良、與聽(tīng)力喪失有關(guān)的骨疾病、低磷酸酯酶癥、骨髓瘤骨病、骨硬化癥、骨過(guò)度使用損傷、骨的運(yùn)動(dòng)損傷、和牙周(齒齦)疾病。53.權(quán)利要求45的一個(gè)或多個(gè)被包裹的形成軟骨的細(xì)胞在制備用于治療選自下組的疾病或病癥的藥物中的用途關(guān)節(jié)炎、軟骨疾病或紊亂、軟骨修復(fù)、成形外科、整容成形外科、類(lèi)風(fēng)濕性和骨關(guān)節(jié)炎。54.治療受試者的方法，包括向受試者施用權(quán)利要求42至46任一項(xiàng)的被包裹的細(xì)胞。55.治療需要骨重建的疾病或病癥的方法，包括向受試者施用一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求45的被包裹的形成骨的細(xì)胞。56.治療選自下組的疾病或病癥的方法，包括施用一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求45的包裹的形成骨的細(xì)胞骨質(zhì)疏松癥、骨斷裂、骨折、骨癌癥、骨癌、成骨不全、Paget's病、纖維性結(jié)構(gòu)不良、與聽(tīng)力喪失有關(guān)的骨疾病、低磷酸酯酶癥、骨髓瘤骨病、骨硬化癥、骨過(guò)度使用損傷、骨的運(yùn)動(dòng)損傷、和牙周(齒齦)疾病。57.治療選自下組的疾病或病癥的方法，包括向受試者施用一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求45的被包裹的細(xì)胞關(guān)節(jié)炎、軟骨疾病或紊亂、軟骨修復(fù)、類(lèi)風(fēng)濕性和骨關(guān)節(jié)炎。58.選自治療性或整容外科的成形外科方法，包括向受試者施用一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求45的被包裹的細(xì)胞。59.選自治療性或整容外科的成形外科方法，其包括向受試者施用權(quán)利要求45的被包裹的一個(gè)或多個(gè)形成骨的細(xì)胞或一個(gè)或多個(gè)形成軟骨的細(xì)胞。60.藥物組合物，其包括權(quán)利要求42至46任一項(xiàng)的一個(gè)或多個(gè)被包裹的細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。61.權(quán)利要求60的藥物組合物，其被配制為通過(guò)注射或通過(guò)內(nèi)窺鏡檢查法施用。62.由一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求42至46任一項(xiàng)的被包裹的細(xì)胞得到的骨或軟骨組織。63.細(xì)胞支架，其具有種植于其上或灌輸于其中的權(quán)利要求42至46任一項(xiàng)的纟皮包裹的細(xì)月包。64.預(yù)裝填的施用裝置，如注射器，其含有權(quán)利要求62或權(quán)利要求63的藥物組合物。全文摘要本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)的方法，包括提供包裹在支持基質(zhì)中的多潛能胚胎干細(xì)胞以形成支持基質(zhì)結(jié)構(gòu)，在維持培養(yǎng)基中維持位于三維培養(yǎng)物中的被包裹的細(xì)胞，以及可選的在分化培養(yǎng)基中分化位于三維培養(yǎng)物中的被包裹的細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)使用被包裹的細(xì)胞的篩選方法。文檔編號(hào)C12N5/06GK101248172SQ200680008686公開(kāi)日2008年8月20日申請(qǐng)日期2006年1月30日優(yōu)先權(quán)日2005年1月28日發(fā)明者薩基斯·曼塔拉里斯,韋斯利·蘭德?tīng)柹暾?qǐng)人:諾瓦塞拉有限公司;帝國(guó)大學(xué)改革有限公司