專利名稱：：產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從木素纖維素原料中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的酶學(xué)方法。
背景技術(shù)：
：隨著世界范圍內(nèi)石油、天然氣資源的逐漸衰竭，需要提供替代能源。如今，通過發(fā)酵含有淀粉的原料，大量生產(chǎn)燃料乙醇。也有人建議從木素纖維素原料中生產(chǎn)乙醇，因?yàn)榇祟愒蠟榱畠r(jià)且可再生的碳源。木素纖維素原料(通常稱為生物質(zhì)(biomass))是大多數(shù)植物主要的結(jié)構(gòu)組分，包括纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素。WO2004/099381涉及以外源木糖異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)化的遺傳修飾酵母，該基因能增強(qiáng)酵母將木糖發(fā)酵為乙醇和其它所需發(fā)酵產(chǎn)物的能力。Chandrakant等(ApplMicrobiolBiotechnol(2005)53:301-309)公開了啤酒糖酵母(5"acc/zoramycesceWWae)對葡萄糖與木糖的同時異構(gòu)化和共發(fā)酵。發(fā)酵葡萄糖的酵母也發(fā)酵木酮糖，此木酮糖是木糖異構(gòu)酶作用于木糖而產(chǎn)生的。為了經(jīng)濟(jì)地開發(fā)木素纖維素原料，必須有效地將木糖轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖蓟蚱渌璋l(fā)酵產(chǎn)物。因此，有必要改進(jìn)從木素纖維素原料中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了從木素纖維素原料中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物，特別是乙醇的方法。本發(fā)明第一個方面涉及從木素纖維素原料中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其中該方法包括以下步驟i)對木素纖維素原料進(jìn)行預(yù)處理，以釋放或分離纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素，ii)所述預(yù)處理的原料用纖維素酶進(jìn)行處理，iii)在發(fā)酵有機(jī)體存在時，進(jìn)行發(fā)酵，其中在步驟ii)和/或步驟iii)中加入木糖異構(gòu)酶。本發(fā)明的方法可以用于產(chǎn)生大量的發(fā)酵產(chǎn)物，包括醇(如乙醇、曱醇和丁醇)；有機(jī)酸(如檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(如丙酮)；氨基酸(如谷氨酸)；糠醛，氣體(如&和C02)以及更加復(fù)雜的化會物，例如，包括抗生素(如青霉素和四環(huán)素)、酶、維生素(如核黃素、B12,p-胡羅卜素)、激素以及其它難以通過合成產(chǎn)生的化合物。發(fā)酵產(chǎn)物也可以為々束用酒精(如啤酒和葡萄酒)、乳制品(例如，在酸奶和奶酪的生產(chǎn)中)、皮革以及煙草行業(yè)制品。圖1所示為C02的損耗，其與試驗(yàn)中乙醇的產(chǎn)量成正比，該實(shí)驗(yàn)向含有葡萄糖和木糖的預(yù)處理的玉米秸(PCS)中添加或未添加木糖異構(gòu)酶。發(fā)明詳述本發(fā)明提供從木素纖維素中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法。本發(fā)明的發(fā)酵過程總的來說本發(fā)明的方法包含四個主要的步驟預(yù)處理、水解預(yù)處理的原料、發(fā)酵以及任選地回收所述的發(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇。本發(fā)明第一個方面涉及從木素纖維素原料中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其中該方法包括以下步驟i)對木素纖維素原料進(jìn)行預(yù)處理，以釋放或分離纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素，ii)所述預(yù)處理的原料用纖維素酶進(jìn)行處理，iii)在發(fā)酵有機(jī)體存在時，進(jìn)行發(fā)酵，其中在步驟ii)和/或步驟iii)中加入木糖異構(gòu)酶。在一實(shí)施例中，步驟ii)中的預(yù)處理通過組合使用纖維素酶與木糖異構(gòu)酶進(jìn)行。在另一實(shí)施例中，發(fā)酵步驟iii)在發(fā)酵有機(jī)體和木糖異構(gòu)酶存在時進(jìn)行。預(yù)處理一步驟i)依據(jù)本發(fā)明，預(yù)處理木素纖維素原料是為了提高酶的水解速度并進(jìn)一步提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。進(jìn)行步驟i)的預(yù)處理是為了分離和/或釋放纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。木素纖維素原料在預(yù)處理過程中的含量可以為10-80wt.%，優(yōu)選20-50wt.%。其目的是打破木質(zhì)素密封層(seal),并破壞木素纖維素原料6的晶體結(jié)構(gòu)。在以后的處理步驟中，當(dāng)碳水化合物聚合物(例如纖維素和半纖維素)轉(zhuǎn)變?yōu)榭砂l(fā)酵的己醣和戊糖時，木素纖維素原料的結(jié)構(gòu)被改變，特別是聚合物的組成更易于被酶水解接近。步驟i)的預(yù)處理可以以任意適宜的方式進(jìn)行，以分離和/或釋放纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素。適宜的預(yù)處理方法例如見Schell等(Appl.BiochemandBiotechn.Vol.105-108，p.69-85,2003)以及Mosier等(BioresourceTechnology96(2005)673-686)，其在此引入作為參考。在優(yōu)選的實(shí)施例中，以化學(xué)和/或機(jī)械的方式處理木素纖維素原料。化學(xué)和/或機(jī)械處理在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，化學(xué)處理和機(jī)械處理(后者通常稱為物理處理)可單獨(dú)使用或與隨后的或同時的酶促步驟組合使用，以促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從木素纖維素原料中分離和/或釋放。在預(yù)處理步驟中，化學(xué)和/或機(jī)械處理步驟優(yōu)選在酶促步驟之前進(jìn)行，以改善在此所述的酶促步驟。作為選擇，化學(xué)和/或機(jī)械處理步驟可與一或多個酶促步驟同時進(jìn)行，如可同時加入一或多種半纖維素酶，以釋》文木糖和其它的半纖維素糖。在加入或者未加半纖維素酶的情況下，預(yù)處理步驟也可以和步驟ii)(參見下文)同時進(jìn)行。化學(xué)處理如本發(fā)明所述，"化學(xué)處理"指可用來促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從木素纖維素原料中分離和/或釋放的任意化學(xué)處理方法。適宜的化學(xué)處理方法的實(shí)例包括，例如酸處理和堿處理，稀酸(diluteacid)、石灰(lime)和氨(ammonia)預(yù)處理，濕法氧化(wetoxidation)以及溶劑處理?；瘜W(xué)處理方法優(yōu)選為酸處理方法，更優(yōu)選為連續(xù)的稀酸或溫和酸(mildacid)處理，如用碌^酸或另一種有才幾酸，如乙酸、4寧檬酸、酒石酸、琥珀酸或其混合物進(jìn)行處理。也可使用其它的酸。在本發(fā)明的上下文中，溫和酸處理是指處理時pH介于l-5，優(yōu)選l-3。在具體的實(shí)施例中，酸的濃度范圍為0.1-2.0wt.%的硫酸。將酸與木素纖維素原料混合或接觸，并且將混合物在160-220。C(如165-195。C)維持?jǐn)?shù)分鐘至數(shù)秒，例如l-60分鐘，如2-30分鐘或3-12分鐘。可加入^Tu酸以除去半纖維素。其可增強(qiáng)纖維素的可消化性。依據(jù)本發(fā)明，也可以考慮使用堿，如NaOH或Na2C03進(jìn)行堿化學(xué)處理(alkalinechemicaltreatment)。已顯示，纖維素溶劑處理能將90%的纖維素轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?，還顯示一旦生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞，可極大地促進(jìn)酶水解。堿性的11202、臭氧(ozone)、有機(jī)溶膠((organosol)(使用含水醇溶液中的路易斯酸(Lewisacids)、FeCl3、(A12)S04)、甘油、二氧六環(huán)(dioxane)、酚或乙二醇均為已知的能破壞纖維素結(jié)構(gòu)和促進(jìn)水解的溶劑的例子(Mosieretal.BioresourceTechnology96(2005),p.673-686)。濕法氧化技術(shù)涉及使用氧化劑，如基于亞硫酸根的氧化劑及其類似物。溶劑處理的實(shí)施例包括，用DMSO(二曱基亞砜)及其類似物處理。化學(xué)處理方法一般進(jìn)行約5-10分鐘，但可也可以進(jìn)行更短或更長的時間。機(jī)械處理如本發(fā)明所述，術(shù)語"機(jī)械處理"指可用來促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從木素纖維素原料中分離和/或釋放的任意機(jī)械或物理處理方法。機(jī)械處理包括粉碎(comminution)(機(jī)械減小生物質(zhì)顆粒大小)、蒸汽爆炸(steamexplosion),水熱解(hydrothermolysis)。粉碎包括干振動球研磨和濕振動球研磨。優(yōu)選的機(jī)械處理方法包括使用高壓和/或高溫的方法(蒸汽爆炸)。在本發(fā)明的上下文中，高壓指壓力為300-600psi，優(yōu)選400-500psi,如450psi左右。在本發(fā)明的上下文中，高溫指溫度為100-300°C,優(yōu)選140-235。C。在具體的實(shí)施例中，在壓力約450psi、溫度約235。C進(jìn)行浸漬(impregnation)。更優(yōu)選，機(jī)械處理為使用高壓和高溫進(jìn)行分批處理(batch-process)的蒸汽噴射水解器(steamgunhydrolyzer)體系,如，4吏用SoundsHydrolyzer(可乂人瑞典的SoundsDefibratorAB獲得)?；瘜W(xué)處理和機(jī)械處理的組合在優(yōu)選的實(shí)施例中，既進(jìn)行化學(xué)處理又進(jìn)行機(jī)械處理，如既進(jìn)行稀酸或溫和酸處理又進(jìn)行高溫高壓處理。化學(xué)處理和機(jī)械處理可以根據(jù)需要順序進(jìn)4亍或同時進(jìn)4亍。因此，在優(yōu)選的實(shí)施例中，該過程包括用化學(xué)方法和機(jī)械方法兩者預(yù)處理木素纖維素原料，以促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。在優(yōu)選的實(shí)施例中，步驟i)的預(yù)處理是用稀酸或溫和酸進(jìn)行的蒸汽爆炸步驟。在另一個優(yōu)選的實(shí)施例中，步驟i)的預(yù)處理是氨纖維爆炸步驟(旦mmoniafiber^plosionstep,稱AFEX預(yù)處理步驟)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，可通過蒸汽蒸餾(steamstripping)改善木素纖維素原料(例如經(jīng)稀酸水解的原料，如玉米秸(comstover))的可發(fā)酵性，以解去該材料的毒性。水解一步驟ii)如上所述，預(yù)處理木素纖維素原料以分離和/或釋放纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素。在步驟ii)中，碳水化合物聚合物轉(zhuǎn)變?yōu)閱翁恰＠w維素可以用纖維素酶(參見下文"纖維素酶"部分)或化學(xué)方法(參見上文"化學(xué)處理"部分)酶促水解為葡萄糖。半纖維素可以被半纖維素酶或酸水解而降解，釋放其五碳糖和六碳糖組分。六碳糖(己糖)，如葡萄糖、半乳糖和甘露糖，可以很容易被適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵有機(jī)體(包括酵母)發(fā)酵為例如乙醇、丙酮、丁醇、丙三醇、檸檬酸和延胡索酸。乙醇發(fā)酵中優(yōu)選的酵母為啤酒糖酵母，其對高水平的乙醇，即，例如最多至約10-15vol.%或更多的乙醇有抵抗性。但是，對于在木素纖維素原料如硬木(hardwood)、農(nóng)業(yè)廢物(agriculturalresidues)以及草(grasses)中含量通常相當(dāng)大的五碳糖(戊糖)如木糖來說，它(們)僅能被少數(shù)發(fā)酵有機(jī)體發(fā)酵，得到例如乙醇，且產(chǎn)量很小。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，預(yù)處理的木素纖維素原料的量在步驟ii)中可以是約10-50wt.%,優(yōu)選約15-35wt.%,特別是約20-30wt.%。在一實(shí)施例中，預(yù)處理步驟ii)可以在纖維素酶或纖維素酶和木糖異構(gòu)酶的組合存在時進(jìn)行。木糖異構(gòu)酶還可以出現(xiàn)于隨后的發(fā)酵步驟iii)中。在優(yōu)選的實(shí)施例中，步驟i)中獲得的預(yù)處理的木素纖維素原料首先以半纖維素酶處理，優(yōu)選以木聚糖酶、酯酶、纖維二糖酶或其組合處理?；蛘?，步驟ii)在半纖維素酶和/或纖維素酶和/或木糖異構(gòu)酶的組合存在時進(jìn)行。可加入半纖維素酶以提供來自半纖維素組分的更多可利用的木糖和其它糖，包括葡萄糖。然而，根據(jù)本發(fā)明，半纖維素酶處理并非是強(qiáng)制性的。纖維素酶將纖維素水解為葡萄糖。木糖異構(gòu)酶將木糖轉(zhuǎn)變?yōu)槟就?，后者在酵母如啤酒糖酵母的發(fā)酵過程中能被轉(zhuǎn)變?yōu)樗璋l(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇。據(jù)信，在步驟ii)和/或步驟iii)中加入木糖異構(gòu)酶，導(dǎo)致對纖維素酶作用進(jìn)行的木糖抑制被降低。換句話說，通過將木糖轉(zhuǎn)變?yōu)槟就牵档土藢w維素酶的抑制作用。在優(yōu)選的實(shí)施例中，木糖異構(gòu)酶先于纖維素酶加入。在優(yōu)選的實(shí)施例中，木糖連續(xù)地轉(zhuǎn)變?yōu)槟就侨缓蟊话l(fā)酵。由于木糖異構(gòu)化為木酮糖，降低了木糖的含量，可以提高纖維素轉(zhuǎn)化速率。這降低了用于產(chǎn)生所需發(fā)酵產(chǎn)物(如乙醇)的處理時間。而且，木素纖維素原材料得以更有效地利用，因?yàn)槟舅乩w維素原料如玉米秸，包含大約35wt.%的纖維素和25%的木聚糖。酶處理在適宜的水環(huán)境中、在本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定的條件下進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施例中，步驟ii)在所用纖維素酶和/或木糖異構(gòu)酶的最佳條件下進(jìn)行。適宜的處理時間、溫度和pH條件是本發(fā)明領(lǐng)域技術(shù)人員可以4艮容易地確定的。優(yōu)選，步驟ii)在30-70。C進(jìn)行，優(yōu)選40-60。C，特別是約50。C。優(yōu)選，步驟ii)在pH3-8進(jìn)行，優(yōu)選pH4-6，特別是約pH5。優(yōu)選，步驟ii)進(jìn)行8-72個小時，優(yōu)選12-48個小時，特別是約24個小時。發(fā)酵一步驟iii)步驟iii)為發(fā)酵步驟，包括但不局限于，用于產(chǎn)生任一發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵，該發(fā)酵產(chǎn)物包括醇(如乙醇、曱醇、丁醇)、有機(jī)酸(如檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)、S同(如丙酮)、氨基酸(如谷氨酸)、氣體(如H2和C02)、抗生素(如青霉素和四環(huán)素)、酶、維生素(如核黃素、B12、P-胡羅卜素)以及激素。步驟iii)也可是用于飲用醇工業(yè)(例如啤酒和葡萄酒)、乳品工業(yè)(例如發(fā)酵的乳制品)、皮革工業(yè)以及煙草工業(yè)中的發(fā)酵步驟。在優(yōu)選的實(shí)施例中，發(fā)酵步驟iii)為醇發(fā)酵。優(yōu)選發(fā)酵步驟iii)是厭氧的。在實(shí)施例中，步驟ii)加入的一或多種酶，即半纖維素酶、纖維素酶、木糖異構(gòu)酶，在發(fā)酵過程中也具有活性。然而，也可以考慮在步驟iii)中加入更多的半纖維素酶、纖維素酶、木糖異構(gòu)酶、或其組合。換句話說，在實(shí)施例中，步驟iii)可以同時進(jìn)行異構(gòu)化和發(fā)酵步驟，以便木糖異構(gòu)酶將木糖轉(zhuǎn)變?yōu)槟就?，發(fā)酵有機(jī)體(如酵母)將木酮發(fā)酵為所需發(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇。發(fā)酵有機(jī)體術(shù)語"發(fā)酵有機(jī)體"指適宜產(chǎn)生所需發(fā)酵產(chǎn)物的任意有機(jī)體，包括細(xì)菌有機(jī)體和真菌有機(jī)體。根據(jù)本發(fā)明，特別適宜的發(fā)酵有機(jī)體能將糖(如木酮糖和/或葡萄糖)直接或間接地發(fā)酵(即轉(zhuǎn)化)為所需發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵有機(jī)體的實(shí)例包括真菌有機(jī)體，如酵母。優(yōu)選的酵母包括糖酵母屬種類(&cc/z"ramyc^spp)的菌抹，特別是啤酒糖酵母或葡萄汁糖酵母(S.Mvarwm)的菌抹；畢赤酵母屬(尸/c/^)菌抹，優(yōu)選柄狀畢赤酵母(P幼>/他)，如柄狀畢赤酵母CBS5773;假絲酵母屬(Om^^)菌林，特別是產(chǎn)朊假絲酵母(C.W/fe)，迪丹氏假絲酵母(C.A^fera/0或博伊丁氏假絲酵母(C.幻Wm7)菌抹，它們能發(fā)酵葡萄糖和木酮糖產(chǎn)生乙醇。其它可考慮的酵母包括發(fā)酵單胞菌屬(Z;ymomoww)菌抹；漢遜氏酵母屬(//""^做^),特別是異常漢遜氏酵母(//.朋oma/a)菌抹；克魯維酵母屬(《/z<yvmm_yce"，特別是脆壁克魯維酵母(K./ragW力菌林；以及裂殖糖酵母屬(Sc/n^wacc/^ram少c&sO，特別是粟酒裂殖糖酵母(S./70w6e)菌株?？少徺I到的酵母包括如REDSTAR/LesaffreEthanolRed(可從美國RedStar/Lesaffre獲4尋)、FALI(可乂人美國BurnsPhilpFoodInc.的分支Fleischmannn，sYeast獲得)、SUPERSTAR(可從Alltech獲得)、GERTSTRAND(可從瑞典的GertStrandAB獲得)以及FERMIOL(可從DSMSpecialties獲得)。同時進(jìn)行水解和發(fā)酵在一實(shí)施例中，本發(fā)明的方法所用的木糖異構(gòu)酶在適于發(fā)酵有機(jī)體的溫度附近具有顯著的活性。在這種情況下，步驟ii)和步驟iii)中的水解和發(fā)酵可同時進(jìn)行。"顯著的活性"是指在最佳發(fā)酵條件下所獲得的活性的至少50%,優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選80%,再更優(yōu)選至少90%，再更優(yōu)選在最佳發(fā)酵條件下的活性的至少95%。在優(yōu)選的實(shí)施例中，最佳的發(fā)酵條件是溫度為28-40。C，優(yōu)選32。C左右，且pH為3-7，優(yōu)選3.5-5左右。通常，如果木糖異構(gòu)酶要求的條件與發(fā)酵有機(jī)體所需的最佳條件顯著不同，則在發(fā)酵啟動前，完成水解步驟。當(dāng)木糖異構(gòu)酶來自博伊丁氏假絲酵母(Kloeckem)，特別是博伊丁氏假絲酵母(Kloeckera2201)(DSM70034或ATCC4818)(如下文所述)，則可以在約28-40°C同時進(jìn)行水解和發(fā)酵，優(yōu)選約30-38°C,特別是約32。C，且pH約3-7,優(yōu)選約3.5-5。ii木素纖維素原料(lignocellulosicmaterial)木素纖維素原料為碳水化合物聚合物(纖維素和半纖維素)與木質(zhì)素的異質(zhì)復(fù)合物。纖維素，如同淀粉，為葡萄糖的同質(zhì)聚合物。但，和淀粉不同，纖維素的特殊結(jié)構(gòu)有利于聚合物鏈排列為高度緊密、高度結(jié)晶的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)不溶于水且能抵抗解聚作用。半纖維素為葡萄糖或木糖的支鏈聚合物，在不同的物種中，它具有阿拉伯糖、木糖、半乳糖、果糖、甘露糖、葡萄糖或葡糖酸取代(MosieretalBioresourceTechnology96(2005)673-686)。木質(zhì)素為芳香醇(aromaticalcohol)的不溶性高分子量物質(zhì)，它加固木素纖維素原料。通常木質(zhì)素包含三種芳香醇(+>柏醇、芥子醇、以及p-香豆醇(p-coumarylalcohol))。另外禾本科植物和雙子葉植物的木質(zhì)素還含有大量的酚酸(phenolicacids),如p-香豆酸(p-coumaricacid)以及阿魏酸，所述酚酸相互酯化到彼此的醇基團(tuán)上，并且酯化到其它的醇(如芥子醇和p-香豆醇)上。木質(zhì)素進(jìn)一步和半纖維素以及纖維素連接，在后兩者周圍形成物理密封部分，該密封部分為不可穿透的屏障,阻止;容'液和酶的穿透(HowardR.Letal,AfricanJournalofBiotechonologyVol.2(12)pp,602-619,December2003)。依據(jù)本發(fā)明，可以使用任意適宜的木素纖維素原料。適宜用于本發(fā)明方法的可考慮的木素纖維素原料的實(shí)例，包括秸(stover)、穗軸(cob)、莖(stalk)、果殼(husk)、糠(bran)、種子(seed)、果皮(peel)、果核(fmitstone)、莢(shell)、甘y^j查(bagasse)、類月巴(manure)、廢才才(woodresidues)、才對皮(bark)、沖對口十(leave)、木屑(woodchip)、刨花(woodshaving)、鋸末(sawdust)、纖維廢沖牛(fiberwaste)、才艮纟氏(newspapers)、辦乂iH氏(officepaper)、卡纟氏才反(cardboard)、草(grass)等。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，木素纖維素原料包括玉米秸、玉米纖維(comfiber)、;^木(pinewood)、木屑(woodchip)、才為杉于(poplar)、麥岸干(wheatstraw)、杉卩4支牙夏(switchgrass)以及紙張或其混合物。酵半纖維素酶在本發(fā)明的實(shí)施例中，用半纖維素酶處理已預(yù)處理的木素纖維素原料。任何適于在半纖維素水解為木糖的過程中使用的半纖維素酶都可以用。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選所用的半纖維素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰基木聚糖酯酶(acetylxylanesterase)、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖香酶、內(nèi)切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、內(nèi)切或外切阿拉伯糖酶(arabinase)、外切半乳聚糖酶(exo-galactanses)、及其混合物。本發(fā)明所用的半纖維素酶優(yōu)選為具有外切活性(ex-acting)的半纖維素酶，更優(yōu)選，半纖維素酶為在pH低于7優(yōu)選pH為3-7的酸性條件下能水解半纖維素的外切半纖維素酶。適于本發(fā)明所用的半纖維素酶的實(shí)例包括VIS-COZYMETM(可從丹麥的NovozymesA/S獲得)。半纖維素酶的加入量是有效分解纖維素形成木糖的量，如，約0.001-0.5wt.%總固體(TS)，更優(yōu)選約0.05-0.5wt.%TS。纖維素酶根據(jù)本發(fā)明，可以使用任一能將纖維素水解為葡萄糖的纖維素酶。依據(jù)本發(fā)明所用的纖維素酶活性可以來自任意適宜的來源，優(yōu)選纖維素酶具有微生物來源，如來自絲狀真菌(如曲霉屬C^;wg〃/w力、木霉屬(7Hc/zoc^ma)、腐質(zhì)霉屬(7/w脂'co/a)、鐮刀菌屬CFwran'MW)、草根霉屬(77^/av/fl))菌林。優(yōu)選，纖維素酶組合物對纖維素原料和木素纖維素原料都起作用。本發(fā)明所用的優(yōu)選的纖維素酶包括具有外切活性的纖維素酶和纖維二糖酶以及其組合。更優(yōu)選包括用纖維二糖酶和具有外切活性的纖維素酶的組合進(jìn)行處理。優(yōu)選，纖維素酶在pH低于7的酸性條件下，能水解纖維素或木素纖維素。適于本發(fā)明所用的纖維素酶的實(shí)施例包括，例如，CELLULCLAS丁tm(可從NovozymesA/S獲得)，NOVOZYM188(可從NovozymesA/S獲得)。其它可購買到的含可以使用的纖維素酶的制劑包括CELLUZYME、CEREFLO和ULTRAFLO(NovozymesA/S)、LAMINEX和SPEZYMECP(GenencorInt.)以及ROHAMENT7069W(來自R6hmGmbH)。在步驟ii)中加入一或多種纖維素酶，其添加量是能將預(yù)處理的木素纖維素原料中的纖維素水解為葡萄糖的有效量，如產(chǎn)生0.1-100FPU/g總固體(TS)、優(yōu)選0.5-50FPU/gTS、特別是1-20FPU/gTS的活性水平的量，或者是0.1-100mg酶蛋白/g總固體(TS),優(yōu)選0.5-50mg酶蛋白/gTS，特別是20mg酶蛋白/gTS。木糖異構(gòu)酶木糖異構(gòu)酶(D-木糖酮異構(gòu)酶(D-xyloseketoisomerase))(E.C.5.3.1.5)是催13化D-木糖到D-木酮糖的可逆異構(gòu)化反應(yīng)的酶。一些木糖異構(gòu)酶也能催化D-葡萄糖到D-果糖的可逆異構(gòu)化。因此，木糖異構(gòu)酶有時稱為"葡萄糖異構(gòu)酶"。本發(fā)明的方法所用的木糖異構(gòu)酶可以為具有木糖異構(gòu)酶活性的任何酶且可以為任意來源的，優(yōu)選為細(xì)菌或真菌來源，如絲狀真菌或酵母來源。細(xì)菌木糖異構(gòu)酶的實(shí)例包括屬于鏈霉菌屬(5^印tomyces)、游動放線菌屬(J"/"op/朋e5)、芽孢桿菌屬(3""7/w"、黃桿菌屬(F/avo6acen'ww)以及熱袍菌屬(7Tzermotoga)的種類，包括新阿波羅棲熱^包菌(7:"eqpo/Zto"a)(Vieilleetal,Appl.Environ.Microbiol.1995,61(5),1867畫1875)以及海棲熱對包菌(7:mw/"ma)。真菌木糖異構(gòu)酶的實(shí)例來自擔(dān)子菌門CSosWomycetes)的物種。優(yōu)選的木糖異構(gòu)酶為來自假絲酵母屬(OwA^0的酵母菌抹，優(yōu)選博伊丁氏假絲酵母菌林，特別是例如Vongsuvanlert等1988年在Agric.Biol.Chem.52(7):1817-1824中所公開的博伊丁氏假絲酵母木糖異構(gòu)酶。木糖異構(gòu)酶優(yōu)選來自博伊丁氏假絲酵母(Kloeckera2201)，該菌抹的保藏號為DSM70034和ATCC48180，為Ogata等在Agric.Biol.Chem,Vol.33，p.1519-1520或Vongsuvanlert等1988年在Agric.Biol.Chem,52(2),p.1519-1520中公開。在一個實(shí)施例中，木糖異構(gòu)酶來自鏈霉菌屬(5V^pto^yc^),如來自鼠灰鏈霉菌(5:w訓(xùn)'""力菌株(美國專利號4，687，742),以及公開于美國專利號3，616,221中的黃微綠鏈霉菌(S.y7avovz>era)、白色鏈霉菌(S.ac/zramoge"""、多刺鏈霉菌(S.ec/2/"a^s)和威德摩爾鏈霉菌(S.vt^/附wera^)。其它的木糖異構(gòu)酶公開于美國專利號3,622,463、4,351,903、4,137,126、3,625,828、匈牙利專利號12,415、德國專利號2,417,642、日本專利號69，28，473和WOMO4/044129中(所有這些專利在此引入作為參考)。木糖異構(gòu)酶可以為固定化形式，也可以為液體形式，優(yōu)選液體形式。加入木糖異構(gòu)酶以提供在0.01-100IGIU/g總固體的范圍內(nèi)的活性水平。商業(yè)上可利用的木糖異構(gòu)酶的實(shí)例包括來自丹麥NovozymesA/S的SWEETZYMETMT?；厥赵趦?yōu)選的實(shí)施例中，回收發(fā)酵產(chǎn)物，例如，通過使用本領(lǐng)域已知的任一蒸餾法。發(fā)酵醪液可以經(jīng)蒸餾來提取發(fā)酵產(chǎn)物，特別是乙醇。根據(jù)本發(fā)明所獲得的終產(chǎn)物可以用作，例如燃料乙醇；飲用乙醇，即適于飲用的酒精(potable14neutralspirits);或工業(yè)乙醇。有關(guān)如何進(jìn)行磨碎、液化、糖化作用、發(fā)酵、蒸餾以及乙醇回收的進(jìn)一步詳情，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，對在此所述的本發(fā)明做各種改善是顯而易見的。此類改善在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)。材料和方法木糖異構(gòu)酶:固定化的木糖異構(gòu)酶來自鼠灰鏈霉菌(S.mMn力w"并公開于美國專利號4，687,742中。木沖唐異構(gòu)酶:來自Vongsuvvanlert等1988年在Agric.Biol.Chem.52(2)，p.419-426中所描述的博伊丁氏假絲酵母菌抹(Kloeckera2201akaDSM70034akaATCC48480)。纖維素酶:源自里氏木霉(7Hc/wAm2a"ew")的纖維素酶復(fù)合物，可作為CELLUSCLAST1.5L從丹麥的NovozymesA/S購得。纖維二jf唐酶:纖維二糖酶來自黑曲霉(A/wg/〃w，可作為Novozym188從丹麥的NovozymesA/S購得。酵母RedStarTM，可從美國的RedStar/Lesaffre購得。方法木糖/葡萄糖異構(gòu)酶試驗(yàn)(IGIU)1IGIU為在標(biāo)準(zhǔn)分析條件下，以1微摩爾/分鐘的初始速率將葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)楣堑拿噶?。?biāo)準(zhǔn)條件葡萄糖濃度pH:Mg2+濃度。32+濃度激活劑，S02濃度緩沖液，Na2C03濃度45%w/w7.560。C99mg/l(1.0g/1MgS04*7H20)<2ppm100ppm(0.18g/lNa2S2O5)2mMNa2C03以濾紙?jiān)囼?yàn)法(FPUassay)測量纖維素酶的活性1.方法來源1.1本方法參見題為"MeasurementofCellulaseActivities"的文獻(xiàn)(Adney，B.andBaker,J.1996.LaboratoryAnalyticalProcedure,LAP-006,NationalRenewableEnergyLaboratory(NREL))。其基于測定纖維素酶活性的IUPAC法(Ghose,T.K.，MeasurementofCellulseActivities,Pure&Appl.Chem.59,pp.257-268,1987)。2.步驟2.1按上述Adney和Baker1996描述的方法進(jìn)行，不同的是使用96孔板在顯色(colordevelopment)后讀取吸光率，如下所述。2.2酶試驗(yàn)管2.2.1將巻起的濾紙條(#1Whatman;1x6cm;50mg)加入試驗(yàn)管(13x100mm)的底部。2.2.2向試管中加入1.0mL的0.05M檸檬酸鈉緩沖液(pH4.80)。2.2.350。C(士0.rC)將含濾紙和緩沖液的試管在循環(huán)水浴中溫育5分鐘。2.2.4溫育后，將0.5mL經(jīng)檸檬酸緩沖液稀釋的酶加入到試管中。酶稀釋度事先設(shè)計(jì)以產(chǎn)生稍微高于和低于2.0mg葡萄糖目標(biāo)值的值。2.2.5溫和渦旋三秒鐘，使試管內(nèi)容物混合。2.2.6渦旋后，將試管在循環(huán)水浴中50。C(土0.1。C)溫育60分鐘。2.2.760分鐘溫育后，將試管^v水浴中拿出，向每一個試管中加入3.0mL的DNA試劑以終止反應(yīng)。將試管渦旋3秒鐘以便混合。2.3空白和對照2.3.1向試管中加入1.5mL檸檬酸緩沖液，制備試劑空白(reagentblank)。2.3.2向試管底放置巻起的濾紙條，并加入1.5mL檸檬酸緩沖液，制備底物只寸照(substratecontrol)。2.3.3將l.OmL檸檬酸緩沖液與0.5mL相應(yīng)酶稀釋物混合，制備每一酶稀釋物的酶對照(enzymecontrols)。2.3.4試劑空白、底物對照和酶對照，以與酶試^^管相同的方式，與酶試驗(yàn)管一起進(jìn)行試驗(yàn)。2.4葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品2.4.1100mL葡萄糖原液(10.0mg/mL)，按5mL的等分試樣進(jìn)行冰凍。使用前，將等分試樣解凍，并通過渦旋進(jìn)行混合。2.4.2如下述在檸檬酸緩沖液中制得原液的稀釋物Gl=1.0mL原液+0.5mL緩沖液=6.7mg/mL=3.3mg/0.5mLG2=0.75mL原液+0.75mL緩沖液=5.0mg/mL=2.5mg/0.5mLG3=0.5mL原液+1.0mL緩沖液=3.3mg/mL=1.7mg/0.5mLG4=0.2mL原液+0.8mL緩沖液=2.0mg/mL=1.0mg/0.5mL2.4.3向1.0mL的檸檬酸緩沖液中加入0.5mL的稀釋物，制得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品試管。2.4.4葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品試管以與酶試驗(yàn)管相同的方式，與酶試驗(yàn)管一起進(jìn)行試驗(yàn)。2.5顯色(colordevelopment)2.5.1溫育60分鐘并加入DNS后，將所有試管一起在水浴中煮沸5分鐘。2.5.2煮沸后，立即將它們在冰/水浴中冷卻。2.5.3冷卻后，短暫地渦旋試管，并使?jié){液沉積。接著每一個試管中取50微升加入96孔板中200微升的ddH20中進(jìn)行稀釋。對每一孔進(jìn)行混合，讀取540nm的吸光率。2.6計(jì)算(NREL文獻(xiàn)中給出了例子)2.6.1繪制四種標(biāo)準(zhǔn)品(G1-G4)的葡萄糖濃度(mg/0.5mL)對As4o的曲線圖，制得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。該曲線用線性回歸(Prism軟件)調(diào)整(fit),用適于所述線的等式確定每一酶試驗(yàn)管中產(chǎn)生的葡萄糖。2.6.2繪制葡萄糖產(chǎn)量(mg/0.5mL)對總的酶稀釋度的圖，使Y軸(酶稀釋度)為log值。2.6.3在產(chǎn)生剛好高于2.0mg葡萄糖的酶稀釋度和產(chǎn)生剛好低于2.0mg葡萄糖的酶稀釋度之間繪制一條線?；谶@條線確定恰好產(chǎn)生2.0mg葡萄糖的酶稀釋度。2.6.4濾紙單位/mL(FPU/mL)如下計(jì)算FPU/mL=0.37/產(chǎn)生2.0mg葡萄糖的酶稀釋度測定纖維二糖酶活性(CBU)纖維二糖酶(P-葡糖苷酶EC3.2.1.21)水解纖維二糖中的p-l,4鍵，釋放兩分子的葡萄糖。用己糖激酶法如下述特異性定量測定葡萄糖的釋放量己糖激酶葡萄糖+ATP-葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)+ADP葡萄糖-6-磷酸脫氫酶G陽6-P+NADP+-葡糖酸-6-石舞酸+NADPH+H+因NADPH在340nm波長處的吸光率高，故隨后測量在此波長處吸光率的增力口。反應(yīng)條件反應(yīng)溫度40°CpH:5.0檢測反應(yīng)時間15分波長340nm一個纖維二糖酶單位(CBU)是以纖維二糖為底物，在以上標(biāo)準(zhǔn)條件下，每分鐘釋放2微摩爾葡萄糖的酶量。更詳細(xì)描述該分析方法的小冊子(EB-SM-0175.02/02)可向丹麥的NovozymesA/S索要，其在此引入作為參考。本文引用了多種文獻(xiàn)，它們公開的完整內(nèi)容在此引入作為參考。純化博伊丁氏假絲酵母的木糖異構(gòu)酶博伊丁氏假絲酵母的純化見Vongsuvanlert等(1998)AgricBiolChem.52(7)，p.1817-1824。細(xì)胞培養(yǎng)的描述見Vongsuvanlert等(1988)Agric.Biol.Chem.52(2)，p.419-426。基本j咅養(yǎng)基，100ml配方0.4gNH4C10.1gKH2P040.1gK2HP040.05gMgS04-7H200.2g酵母提耳又物，以及0.3g聚蛋白胨(Daigo)用于接種(lgD-葡萄糖)用于生長(2gD-木糖)加入ddH20使體積變?yōu)?00ml4L配方用于接種用于生長變?yōu)?L4g4g2g12g(40g)(80g)然后將pH調(diào)整為5.5接種物將博伊丁氏假絲酵母菌抹(Kloeckera2201akaDSM70034akaATCC48180)細(xì)胞在500ml帶擋板燒瓶內(nèi)的100ml含1%w/wD-葡萄糖的基本培養(yǎng)基上，28。C以200rpm搖動培養(yǎng)24小時，制備接種物。將接種物培養(yǎng)物以每500ml生長培養(yǎng)基中含5ml接種物培養(yǎng)物的稀釋度，加入到2L帶擋板燒瓶內(nèi)由500ml含2°/。(w/v)D-木糖的基本培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中。在28。C、200rpm往復(fù)搖動條件下，培養(yǎng)45小時。制備無細(xì)胞的提取物細(xì)胞經(jīng)離心收集，用含0.25mMDTT的50mMKHP04pH7.0沖洗兩次。接著按每克細(xì)胞團(tuán)(cellpaste)lmL緩沖液的稀釋度，將細(xì)胞沉淀(cellpellet)懸浮于同樣的緩沖液中。將混合物裝入水冷的BioSpecBead-Beater室，以每克細(xì)胞團(tuán)4克玻璃珠的比例，將0.52mm的玻璃珠加入室內(nèi)。加入小量蛋白酶抑制劑，將這種細(xì)胞-緩沖液-玻璃珠混合物在BioSpecBeadBeater上擊打(beat)4輪，每輪為，擊打1分鐘接著水上靜置1分鐘。通過在4°C離心，將玻璃珠、細(xì)胞沉淀以及上清液分離。離心后，所得上清液用做無細(xì)胞的提〖咅養(yǎng)取物。純化木糖異構(gòu)酶所有的純化步驟均是在4°C按20，000xg離心20分鐘。除非另有說明，緩沖液為含有0.25mMDTT的50mMKHP04pH7.0。任一濃度的酶用YM-30膜進(jìn)行Amicon超濾。步驟1:硫酸魚精蛋白處理。將1/5體積的2%的硫酸魚精蛋白溶液逐滴加入到無細(xì)胞的提取物中，用10。/。NH40H經(jīng)攪動將pH調(diào)整為7.0，隨后放置30分鐘。離心，除去形成的沉淀物。步驟2:硫酸銨飽和至30%。在所得上清液中攪拌加入固體硫酸銨，直至30%的飽和度(176g/L)，用10%NH4OH將pH調(diào)為7.0。放置1小時后，離心除去形成的沉淀物，在下一步驟中使用上清液。步驟3:硫酸銨飽和至80%。在所得上清液中攪拌加入固體硫酸銨，直至80%的飽和度，用10。/。NH40H溶液將pH調(diào)為7.0。過夜放置后，所得沉淀物經(jīng)離心收集，接著以最小體積的緩沖液溶解。上清液未在以下任一步驟中使用。對重懸的沉淀進(jìn)行純化，并用含有0.25mMDTT的50mMKHP04pH7.0透析過夜。步驟4:MnCl2處理。將經(jīng)過透析的蛋白溶液離心，接著加入1MMnCl2-4H20至濃度為5%(w/v),用10%NH4OH經(jīng)攪拌將pH調(diào)為7.0,隨后放置30分鐘。離心除去所得沉淀物，將所得上清液濃縮。至此，蛋白溶液含有足夠純度的木糖異構(gòu)酶用于初步活性試驗(yàn)?？衫脴?biāo)準(zhǔn)柱層析技術(shù)對樣品進(jìn)行進(jìn)一步純化。實(shí)施例實(shí)施例1玉米秸的木糖發(fā)酵研究了木糖異構(gòu)酶對預(yù)處理的玉米秸(PCS)在有葡萄糖和木糖時的發(fā)酵的影響。玉米秸首先用約0.5%的稀硫酸預(yù)處理，接著進(jìn)行蒸汽爆炸。所述預(yù)處理的材料未經(jīng)壓榨(press)除去水解產(chǎn)物，因此其含有預(yù)處理后的所有可溶物。15wt.%TSPCS在50°C,pH5進(jìn)行水解，水解時有里氏木霉纖維素酶(5FPU/gTS)、黑曲霉纖維二糖酶(1.5CBU/FPU)、以及約13IGIU/gTS固定化的鼠灰鏈霉菌木糖異構(gòu)酶。水解48小時后，用10%批量(即，繁殖物相對于總體積的比例)的酵母(啤酒糖酵母-REDSTARTM)進(jìn)行接種(以確保較高的初始細(xì)胞量)，在32。C開始發(fā)酵。用含有1%酵母提取物和1%蛋白胨的生長培養(yǎng)基作為營養(yǎng)源和氮源。測定C02的損耗，其與乙醇產(chǎn)量成正比。在不加木糖異構(gòu)酶的情況下進(jìn)行同樣的試驗(yàn)。這些試驗(yàn)的結(jié)果如圖1所示。實(shí)施例2同時進(jìn)行木糖異構(gòu)化和發(fā)酵玉米秸首先用約0.5%的稀硫酸預(yù)處理，接著進(jìn)行蒸汽爆炸。所述預(yù)處理的材料未經(jīng)壓榨或洗滌除去液態(tài)的水解產(chǎn)物，因此其含有預(yù)處理后的所有可溶物。隨后，15wt。/。TSPCS在50。C,pH5進(jìn)行水解，水解時有里氏木霉纖維素酶(5FPU/gTS)、黑曲霉纖維二糖酶(1.5CBU/FPU)。最后，在有約13IGIU/gTS博伊丁氏假絲酵母菌林(Kloeckera2201)的木糖異構(gòu)酶時，在pH5進(jìn)行發(fā)酵。水解48小時后，用10%批量(即，繁殖物相對于總體積的比例)的酵母(啤酒糖酵母-REDSTARtm)作為發(fā)酵有機(jī)體進(jìn)行接種(以確保較高的初始細(xì)胞量)，在32。C開始發(fā)酵。用含有1%酵母提取物和1%蛋白胨的生長培養(yǎng)基作為營養(yǎng)源和氮源。發(fā)酵通過用HPLC-RI測量木糖、木酮糖、葡萄糖和乙醇來進(jìn)行監(jiān)控。該試驗(yàn)還包括對照，其未向發(fā)酵中添加木糖異構(gòu)酶，因此可以確定未利用木糖時的乙醇產(chǎn)量。實(shí)施例3同時進(jìn)行水解、木糖異構(gòu)化和發(fā)酵玉米秸首先用約0.5%的稀硫酸預(yù)處理，接著進(jìn)行蒸汽爆炸。所述預(yù)處理的材料未經(jīng)壓榨或洗滌除去液態(tài)的水解產(chǎn)物，因此其含有預(yù)處理后的所有可溶物。在同時進(jìn)行的糖化和發(fā)酵(SSF)步驟中轉(zhuǎn)化15wt.%TSPCS,使用了里氏木霉纖維素酶(5FPU/gTS)、黑曲霉纖維二糖酶(1.5CBU/FPU)、以及約13IGIU/gTS博伊丁氏假絲酵母菌林(Kloeckera2201)的木糖異構(gòu)酶。同時進(jìn)行的21酶處理和發(fā)酵，是在32°C、pH5，用10%批量(即，繁殖物相對于總體積的比例)的酵母(啤酒糖酵母-REDSTARTM)作為發(fā)酵有機(jī)體進(jìn)行，以確保較高的初始細(xì)胞量。用含有1%酵母提取物和1%蛋白胨的生長培養(yǎng)基作為營養(yǎng)源和氮源。發(fā)酵通過用HPLC-RI測量木糖、木酮糖、葡萄糖和乙醇來進(jìn)行監(jiān)控。該試驗(yàn)還包括對照，其未向發(fā)酵中添加木糖異構(gòu)酶，因此可以確定未利用木糖時的乙醇產(chǎn)量。權(quán)利要求1.利用木素纖維素原料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該方法包括以下步驟i)對木素纖維素原料進(jìn)行預(yù)處理，以釋放或分離纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素，ii)所述預(yù)處理的原料用纖維素酶進(jìn)行處理，iii)在發(fā)酵有機(jī)體存在時，進(jìn)行發(fā)酵，其中在步驟ii)和/或步驟iii)中加入木糖異構(gòu)酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，包括以下步驟i)對木素纖維素原料進(jìn)行預(yù)處理，以釋放或分離纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素，ii)所述預(yù)處理的原料用纖維素酶和木糖異構(gòu)酶的組合進(jìn)行處理，iii)在發(fā)酵有機(jī)體存在時，進(jìn)行發(fā)酵。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，包括以下步驟i)對木素纖維素原料進(jìn)行預(yù)處理，以釋放或分離纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素，ii)所述預(yù)處理的原料用纖維素酶進(jìn)行處理，iii)在發(fā)酵有機(jī)體和木糖異構(gòu)酶存在時，進(jìn)行發(fā)酵。4.根據(jù)權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)的方法，其中步驟i)的預(yù)處理通過對木素纖維素原料施以化學(xué)處理和/機(jī)械處理來進(jìn)行。5.根據(jù)權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)的方法，其中步驟i)中的化學(xué)處理為酸處理。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中步驟i)中的酸處理用有機(jī)酸進(jìn)行，優(yōu)選用硫酸、乙酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、和/或它們的混合物進(jìn)行。7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)的方法，其中pH為l-5，優(yōu)選l-3。8.根據(jù)權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)的方法，其中木素纖維素原料用0.1-2.0wt.%的石克酸進(jìn)行酸處理。9.根據(jù)權(quán)利要求4-8任一項(xiàng)的方法，其中步驟i)中的機(jī)械處理包括在高溫和/或高壓處理木素纖維素原料。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中步驟i)中的機(jī)械處理在300-600psi,優(yōu)選400-500psi,如約450psi的高壓進(jìn)4亍。11.根據(jù)權(quán)利要求9或IO的方法，其中步驟i)中的機(jī)械處理在約100-300°C,優(yōu)選約140-235°C的高溫進(jìn)行。12.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其中步驟i)中的預(yù)處理是進(jìn)行稀酸蒸汽爆炸、蒸汽爆炸、濕法氧化或氨纖維爆炸(或AFEX預(yù)處理)。13.根據(jù)權(quán)利要求l-12任一項(xiàng)的方法，其中木素纖維素原料選自玉米秸、玉米纖維、松木、木屑、楊樹、麥稈、柳枝稷、辦公紙。14.根據(jù)權(quán)利要求l-13任一項(xiàng)的方法，其中步驟ii)中木素纖維素原料的量為10-50wt.%，優(yōu)選15-35wt.%，特別是20-30wt.%。15.根據(jù)權(quán)利要求l-14任一項(xiàng)的方法，其中將在步驟i)中獲得的已釋放或分離的纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素物質(zhì)用半纖維素酶處理，優(yōu)選用木聚糖酶、酯酶、和/或纖維二糖酶處理，以釋放木糖。16.根據(jù)權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的方法，其中在另有半纖維素酶，優(yōu)選木聚糖酶、酯酶和/或纖維二糖酶存在時進(jìn)行步驟ii)。17.根據(jù)權(quán)利要求l-16任一項(xiàng)的方法，其中纖維素酶在步驟ii)中加入，以提供0.1-100FPU/g總固體(TS),優(yōu)選0.5-50FPU/gTS，特別是1-20FPU/gTS的活性水平。18.根據(jù)權(quán)利要求l-17任一項(xiàng)的方法，其中纖維素酶在步驟ii)中加入，且加入量為0.1-100mg酶蛋白/g總固體(TS)，優(yōu)選0.5-50mg酶蛋白/gTS，特別是l-20mg酶蛋白/gTS。19.根據(jù)權(quán)利要求l-18任一項(xiàng)的方法，其中木糖異構(gòu)酶來自酵母，優(yōu)選來自假絲酵母屬菌林，更優(yōu)選來自博伊丁氏假絲酵母菌林，特別是博伊丁氏假絲酵母(Kloeckera)菌抹。20.根據(jù)權(quán)利要求l-19任一項(xiàng)的方法，其中在步驟ii)或步驟iii)中，木糖異構(gòu)酶提供0.01-100IGIU/g總固體的活性水平。21.根據(jù)權(quán)利要求l-20任一項(xiàng)的方法，其中步驟ii)在最適于所述纖維素酶的條件下進(jìn)行。22.根據(jù)權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的方法，其中步驟ii)在30-70。C，優(yōu)選40-60。C,特別是約50。C進(jìn)行。23.根據(jù)權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)的方法，其中步驟ii)在pH3-8，優(yōu)選pH4-6,特別是約pH5進(jìn)行。24.根據(jù)權(quán)利要求l-23任一項(xiàng)的方法，其中步驟ii)進(jìn)行8-72小時，優(yōu)選12-48小時，特別是約24小時。25.根據(jù)權(quán)利要求l-24任一項(xiàng)的方法，其中步驟iii)進(jìn)行24-192小時，優(yōu)選48-96小時，特別是約72小時。26.根據(jù)權(quán)利要求l-25任一項(xiàng)的方法，其中步驟iii)中的溫度約為發(fā)酵有機(jī)體的最佳發(fā)酵條件。27.根據(jù)權(quán)利要求l-26任一項(xiàng)的方法，其中步驟iii)中的溫度為28-40°C，優(yōu)選30-38。C,特別是約32。C。根據(jù)權(quán)利要求l-25任一項(xiàng)的方法，其中步驟iii)中的pH為3-7，優(yōu)選3.5-5，特別是約4.5。.根據(jù)權(quán)利要求l-26任一項(xiàng)的方法，其中步驟H)和步驟iii)同時進(jìn)行。28.根據(jù)權(quán)利要求l-27任一項(xiàng)的方法，其中在最佳發(fā)酵條件附近同時進(jìn)行步驟ii)和步驟iii)。29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中同時進(jìn)行的步驟是在約28-40°C，優(yōu)選約30-38。C,特別是約32°C進(jìn)行。30.根據(jù)權(quán)利要求28或29的方法，其中同時進(jìn)行的步驟是在pH約3-7，優(yōu)選約3.5-5進(jìn)行。31.根據(jù)權(quán)利要求l-30任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)酵有機(jī)體為酵母，優(yōu)選糖酵母屬，特別是啤酒糖酵母。32.根據(jù)權(quán)利要求1-31任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇。33.根據(jù)權(quán)利要求l-32任一項(xiàng)的方法，其中步驟ii)和步驟iii)同時進(jìn)行。全文摘要本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括以下步驟i)對木素纖維素原料進(jìn)行預(yù)處理，以釋放或分離纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素，ii)所述預(yù)處理的原料用纖維素酶進(jìn)行處理，iii)在發(fā)酵有機(jī)體存在時，進(jìn)行發(fā)酵，其中在步驟ii)和/或步驟iii)中加入木糖異構(gòu)酶。文檔編號C12P7/06GK101506372SQ200680008541公開日2009年8月12日申請日期2006年3月14日優(yōu)先權(quán)日2005年3月17日發(fā)明者吉勒莫·科沃德-凱利,基思·A·麥考爾,馬茲·P·T·史密斯申請人:諾維信北美公司