專利名稱：：產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用一種或多種發(fā)酵生物體從含木質(zhì)纖維素材料中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法。
背景技術(shù)：
：由于化石燃料的有限儲量和關(guān)于溫室氣體排放的擔(dān)憂，對于使用可再生能源有越來越多的關(guān)注。從含木質(zhì)纖維素材料中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物是本領(lǐng)域已知的，且包括將含木質(zhì)纖維素材料預(yù)處理、水解和發(fā)酵。發(fā)酵步驟使用能夠?qū)⒖砂l(fā)酵糖轉(zhuǎn)化為期望的發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵生物體進(jìn)行。在將發(fā)酵生物體接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中后，它經(jīng)過許多階段。起始階段稱作"遲滯期"且為其中未產(chǎn)生顯著量的發(fā)酵產(chǎn)物的適應(yīng)期。在接下來的生長增加的稱作"指數(shù)期"和作為在最大生長后的階段的稱作"穩(wěn)定期"的兩個(gè)階段中，產(chǎn)生顯著量的發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵循環(huán)通?？蛇M(jìn)行多至96小時(shí)或更長，使得每個(gè)循環(huán)耗時(shí)且昂貴。從含木質(zhì)纖維素材料或纖維素"生物質(zhì)"中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝還受到發(fā)酵生物體對在發(fā)酵工藝中所使用的粗水解物中發(fā)現(xiàn)的許多毒素的耐受性的限制。從水解物中除去毒素是困難、耗時(shí)且昂貴的。為了避免昂貴的毒素去除步驟，在水解物中固體的百分比常規(guī)地保持低于10。/?？偣腆w(w/w),由此使毒素對發(fā)酵生物體的影響最小。不幸地，總固體濃度的限制意味著較少可用的發(fā)酵底物和每批次較低的發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)率(yield)。因此，高度期望利用具有高總固體濃度的粗水解物和降低從含木質(zhì)纖維素材料中產(chǎn)生期望的發(fā)酵產(chǎn)物所需的發(fā)酵時(shí)間。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及使用一種或多種發(fā)酵生物體從含木質(zhì)纖維素材料中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法。7本發(fā)明涉及從含木質(zhì)纖維素材料中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其中該方法包括i)預(yù)處理含木質(zhì)纖維素材料；ii)使經(jīng)預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料水解；iii)使用發(fā)酵生物體發(fā)酵；其中在以下條件下開始并進(jìn)行發(fā)酵a)發(fā)酵生物體細(xì)胞計(jì)數(shù)在10-250x10IQ個(gè)細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)；或b)發(fā)酵生物體濃度在2-90g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)。圖1表明各種量的糖溶液和經(jīng)過濾的預(yù)處理的玉米秸(PCS)酶水解物對在兩種不同的酵母菌抹中在96小時(shí)后的分批發(fā)酵乙醇產(chǎn)生的影響。圖2表明高細(xì)胞密度的REDSTARTM對在各種起始酵母細(xì)胞濃度的經(jīng)過濾的預(yù)處理的玉米秸(PCS)酶水解物的乙醇分批發(fā)酵的影響。圖3表明高細(xì)胞密度的酵母RWB218對在各種起始酵母細(xì)胞濃度的預(yù)處理的玉米秸(PCS)酶水解物的乙醇分批發(fā)酵的影響。圖4表明高細(xì)胞密度的REDSTAR和在pH5的細(xì)胞再循環(huán)對在40g/L的起始酵母細(xì)胞濃度的經(jīng)過濾的預(yù)處理的玉米秸(PCS)酶水解物的分批發(fā)酵乙醇產(chǎn)生的影響。圖5表明高細(xì)胞密度的REDSTARTM和在pH6的細(xì)胞再循環(huán)對在40g/L的起始酵母細(xì)胞濃度的經(jīng)過濾的預(yù)處理的玉米秸(PCS)酶水解物的分批發(fā)酵乙醇產(chǎn)生的影響。圖6a表明高細(xì)胞密度的酵母RWB218和細(xì)胞再循環(huán)對在20g/L的酵母細(xì)胞濃度的經(jīng)離心的預(yù)處理的玉米秸(PCS)酶水解物的補(bǔ)料分批發(fā)酵乙醇產(chǎn)生的影響。圖6b表明高細(xì)胞密度的酵母RWB218對在20g/L的酵母細(xì)胞濃度從0至24小時(shí)的經(jīng)離心的預(yù)處理的玉米秸(PCS)酶水解物的補(bǔ)料分批發(fā)酵乙醇產(chǎn)生的影響。圖7表明高密度的酵母RWB218對在各種起始酵母細(xì)胞濃度從對預(yù)處理的玉米秸(PCS)酶；酵乙醇產(chǎn)生的影響。具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及使用一種或多種發(fā)酵生物體從含木質(zhì)纖維素材料中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法。根據(jù)本發(fā)明，可通過在整個(gè)發(fā)酵中在非常高細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行發(fā)酵而顯著縮短發(fā)酵時(shí)間。即使每發(fā)酵生物體的發(fā)酵速度可以不高于在常失見發(fā)酵工藝中的速度，在整個(gè)發(fā)酵中發(fā)酵生物體的絕對數(shù)量高的事實(shí)也導(dǎo)致期望的發(fā)酵產(chǎn)物的快速產(chǎn)生(以每時(shí)間單位的發(fā)酵產(chǎn)物的絕對量確定)。此外，根據(jù)本發(fā)明，發(fā)酵生物體可如下所述回收和再使用。與常規(guī)方法相比，縮短的發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵生物體的任選的再使用降低了本發(fā)明方法的總成本。因此，本發(fā)明涉及從含木質(zhì)纖維素材料中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其中該方法包才舌i)預(yù)處理含木質(zhì)纖維素材料；ii)使經(jīng)預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料水解；iii)使用發(fā)酵生物體發(fā)酵；其中在以下條件下開始并進(jìn)行發(fā)酵a)發(fā)酵生物體細(xì)胞計(jì)數(shù)在10-250x101Q個(gè)細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)；或b)發(fā)酵生物體濃度在2-90g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，在發(fā)酵前除去不溶性固體(包括木質(zhì)素和未轉(zhuǎn)化的多糖)。例如，可在步驟i)中預(yù)處理含木質(zhì)纖維素材料后除去不溶性固體。根據(jù)本發(fā)明，然后可使已除去不溶性固體的源自預(yù)處理的木質(zhì)纖維素的材料發(fā)酵。在另一實(shí)施方式中，可在步驟ii)中使該預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料水解后除去不溶性固體。根據(jù)本發(fā)明，然后可使已除去不溶性固體的源自水解的預(yù)處理的木質(zhì)纖維素的材料發(fā)酵。待發(fā)酵的源自木質(zhì)纖維素的可發(fā)酵糖為來自預(yù)處理或水解步驟i)或ii)或來自步驟i)和ii)兩者的液體形式(例如，濾出液)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟ii)中的水解和步驟iii)中的發(fā)酵作為單獨(dú)的水解和發(fā)酵步驟(SHF)、作為混合的水解和發(fā)酵步驟(HHF)或作為同時(shí)的水解和發(fā)酵步驟(SSF)進(jìn)行。SSF、HHF和SHF步驟是本領(lǐng)域公知的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，發(fā)酵可在20-250x10"個(gè)細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在50-250x101G個(gè)細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在100-250x1(T個(gè)細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi),更優(yōu)選在150-250xl。10個(gè)細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)，例如在200-250x1(T個(gè)細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)的發(fā)酵生物體細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，發(fā)酵可在3-卯g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基、3-50g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)，優(yōu)選在4-50g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)，優(yōu)選在5-50g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在10-50g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在10-40g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)，特別地在10-30g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)的發(fā)酵生物體濃度進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)酵生物體可為固定化的。例如，發(fā)酵生物體可固定在惰性的高表面積的支持物上，該支持物懸浮在發(fā)酵罐/容器中，通過該發(fā)酵罐/容器供給(feed)待發(fā)酵的源自水解和/或預(yù)處理的木質(zhì)纖維素的材料。根據(jù)本發(fā)明可使用任何固定化技術(shù)。用于固定化發(fā)酵生物體的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。合適的固定化技術(shù)的實(shí)例可在例如以下中找到Kesava等，1996，"EthanolproductionbyimmobilizedwholecellsofZ戸omo"osmo6/toinacontinuousflowexpandedbedbioreactorandacontinuousflowstirredtankbioreactor",JournalofIndustrialMicrobiology17:11-14;Gough等，1998,"Productionofethanolfrommolassesat45degreesCusing尺/甲erawyces扁nc/朋wsIMB3immobilizedincalciumalginategelsandpoly(vinylalcohol)cryogel"，BioprocessEngineering19:87-90;Love等，1998，"Continuousethanolfermentationat45degreesCusingA7wyveram少c^smarx/a"wsIMB3immobilizedinCalciumalginateandkissiris"，BioprocessEngineering18:187-189;Abbi等，1996,"BioconversionofpentosesugarstoethanolbyfreeandimmobilizedcellsofCaw//das/7e/2atoe(NCL-3501):Fermentationbehaviour"ProcessBiochemistry31:555-560;Krishnan等，2000,"EthanolproductionfromglucoseandxylosebyimmobilizedZymomowosmoZu7^CP4(pZB5)"，AppliedBiochemistryAndBiotechnology84-6:525-541;Chibata等，1981,Ann.Rev.Microphys.Bioeng10:197-216;Fukui等，1982,Ann.Rev.Microbial36:145-172;JohnF.Kennedy,101982,Nature,299:777-778(全部文獻(xiàn)通過引用并入本文)。在一個(gè)實(shí)施方式中，發(fā)酵生物體可有利地回收和再使用。例如，發(fā)酵生物體可通過在發(fā)酵罐/容器中將它們與發(fā)酵培養(yǎng)基分離而回收?；蛘?，發(fā)酵生物體可通過在發(fā)酵后將它們與發(fā)酵培養(yǎng)基分離而回收。包含發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)基的部分(fraction)可進(jìn)一步處理或回收，例如通過蒸餾。回收的發(fā)酵生物體可再循環(huán)至同一發(fā)酵罐/容器或一個(gè)或多個(gè)其它發(fā)酵罐/容器。換句話說，根據(jù)本發(fā)明，發(fā)酵生物體可回收和再循環(huán)至發(fā)酵培養(yǎng)基，且這樣在一個(gè)或多個(gè)另外的發(fā)酵循環(huán)中再使用。其中可使用再循環(huán)的發(fā)酵生物體的發(fā)酵循環(huán)的數(shù)目可取決于許多因素，所述因素包括但不限于，pH、發(fā)酵生物體的類型、發(fā)酵產(chǎn)物濃度如乙醇濃度、或總固體(TS)的濃度。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明改變這些因素以優(yōu)化再循環(huán)事件(event)的數(shù)目。在另一實(shí)施方式中，增殖步驟可添加到回收和再循環(huán)發(fā)酵生物體的工藝中。例如，在將回收的發(fā)酵生物體再循環(huán)或再使用于隨后的發(fā)酵循環(huán)之前，可使其增殖一段時(shí)間。任何技術(shù)可用于回收發(fā)酵生物體。本領(lǐng)域中公知的合適技術(shù)包括過濾(例如^f吏用壓濾才幾)和離心。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，能夠?qū)⒛咎寝D(zhuǎn)化為木酮糖的酶可存在于水解和/或發(fā)酵的過程中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，這種木糖向木酮糖的轉(zhuǎn)化酶可為木糖異構(gòu)酶(有時(shí)稱為葡萄糖異構(gòu)酶)。合適的木糖異構(gòu)酶的實(shí)例可在以下的"木糖異構(gòu)酶"部分中找到。將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖是有利的，因?yàn)檫@容許一些通常使用的C6發(fā)酵生物體例如釀酒酵母將木酮糖轉(zhuǎn)化為期望的發(fā)酵產(chǎn)物例如乙醇，同時(shí)發(fā)酵C6糖，例如特別是葡萄糖。在一個(gè)實(shí)施方式中，C6和C5可發(fā)酵糖的發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行。C5和C6糖的同時(shí)發(fā)酵可如下進(jìn)行發(fā)酵步驟iii)進(jìn)一步包括a)源自預(yù)處理步驟i)或水解步驟ii)的C5和C6糖的同時(shí)發(fā)酵；b)回收和再循環(huán)發(fā)酵生物體?；蛘?，在另一實(shí)施方式中，水解步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)進(jìn)一步包括1)源自預(yù)處理步驟i)的C5和C6糖的同時(shí)水解和同時(shí)發(fā)酵。在另一實(shí)施方式中，水解步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)進(jìn)一步包括1)源自預(yù)處理步驟i)的C5和C6糖的同時(shí)水解和同時(shí)發(fā)酵；2)回收和再循環(huán)發(fā)酵生物體?；蛘撸诹硪粚?shí)施方式中，C5可發(fā)酵糖的發(fā)酵在C6可發(fā)酵糖的發(fā)酵之后進(jìn)行。C5和C5糖的相繼發(fā)酵可如下進(jìn)行發(fā)酵步驟iii)進(jìn)一步包括a)源自預(yù)處理步驟i)或水解步驟ii)的C6糖的發(fā)酵；b)回收和再循環(huán)C6發(fā)酵生物體；c)發(fā)酵C5糖；d)回收和再循環(huán)C5發(fā)酵生物體?；蛘?，在另一實(shí)施方式中，水解步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)進(jìn)一步包括1)源自預(yù)處理步驟i)的C6糖的同時(shí)水解和發(fā)酵；2)發(fā)酵C5糖?；蛘撸诹硪粚?shí)施方式中，水解步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)進(jìn)一步包括1)源自預(yù)處理步驟i)的C6糖的同時(shí)水解和發(fā)酵；2)除去不溶性固體；3)發(fā)酵C5糖；4)回收和再循環(huán)發(fā)酵生物體。在一個(gè)實(shí)施方式中，可使含木質(zhì)纖維素材料解毒(detoxify)。在一個(gè)實(shí)施方式中，在水解和/或發(fā)酵之前洗滌該材料。在另一實(shí)施方式中，含木質(zhì)纖維素材料可為未解毒的，例如未洗滌的。含木質(zhì)纖維素材料"木質(zhì)纖維素，，或"含木質(zhì)纖維素材料"是指主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成的材料。這種材料經(jīng)常稱作"生物質(zhì)"。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)為纖維素纖維包裹在木質(zhì)素和半纖維素鞘(sheath)中的復(fù)合結(jié)構(gòu)。木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)使得其對于酶水解不敏感。為了增強(qiáng)酶水解，木質(zhì)纖維素必須進(jìn)行預(yù)處理，例如通過在適當(dāng)?shù)膲毫蜏囟葪l件下的酸水解進(jìn)行，以打破木質(zhì)素的封閉、使半纖維素糖化和溶解、并破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)。然后可使纖維素進(jìn)行酶水解，例如通過纖維素分解酶處理來進(jìn)行，以將糖聚合物轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖，該可發(fā)酵糖可發(fā)酵為期望的發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇。也可采用半纖維素分解酶處理以使在預(yù)處理生物質(zhì)中的任何殘留的半纖維素水解。含木質(zhì)纖維素材料可為任何含木質(zhì)纖維素的材料。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，含木質(zhì)纖維素材料包含至少30重量％，優(yōu)選至少50重量％，更優(yōu)選至少70重量％,甚至更優(yōu)選至少90重量％的木質(zhì)纖維素。應(yīng)理解，含木質(zhì)纖維素材料也可包括其它組成部分如蛋白質(zhì)材料、淀粉和糖如可發(fā)酵或不可發(fā)酵糖，或其混合物。含木質(zhì)纖維素材料通常在例如植物的莖、葉、殼、莢和穗軸或樹的葉、枝和木質(zhì)中得到。含木質(zhì)纖維素材料包括，但不限于，草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙、以及紙漿廠和造紙廠殘余物。應(yīng)理解，含木質(zhì)纖維素材料可為在混合基質(zhì)中包含木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的植物細(xì)胞壁材料的形式。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，含木質(zhì)纖維素材料選自如下的一種或多種玉米纖維、稻草、松木、木片、楊樹、甘蔗渣、以及紙和紙漿加工廢物。合適的含木質(zhì)纖維素材料的其它實(shí)例包括玉米秸、玉米穗軸、硬木如楊樹和樺樹、軟木、谷類莖稈如麥秸、柳枝稷(switchgrass)、芒屬(Miscanthus)、稻殼、城市固體廢物(MSW)、工業(yè)有機(jī)廢物、辦公紙張、或其混合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，含木質(zhì)纖維素材料為玉米秸或玉米穗軸。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，含木質(zhì)纖維素材料為玉米纖維。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，含木質(zhì)纖維素材料為柳枝稷。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，含木質(zhì)纖維素材料為甘蔗渣。預(yù)處理含木質(zhì)纖維素材料可以任何合適的方式預(yù)處理。在水解或發(fā)酵之前進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理的目的是分離或釋放纖維素、半纖維素和木質(zhì)素且這樣改善水解的速度或效率。包括濕氧化和堿預(yù)處理的預(yù)處理方法目標(biāo)為木質(zhì)素釋》i，而稀酸處理和自水解(auto-hydrolysis)目標(biāo)為半纖維素釋放。蒸汽爆炸(steamexplosion)是目標(biāo)為纖維素釋放的預(yù)處理的實(shí)例。根據(jù)本發(fā)明，預(yù)處理步驟可為使用本領(lǐng)域公知技術(shù)的常規(guī)預(yù)處理步驟。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，預(yù)處理發(fā)生在含水漿料中。在預(yù)處理過程中，含木質(zhì)纖維素材料可以10-80重量％,優(yōu)選20-70重量％，特別地30-60重量％,例如約50重量°/。的量存在。13根據(jù)本發(fā)明，在水解之前或水解過程中，含木質(zhì)纖維素材料可化學(xué)地、機(jī)械地、生物地、或以其任意組合進(jìn)行預(yù)處理。優(yōu)選地，在水解之前進(jìn)行化學(xué)、機(jī)械或生物預(yù)處理?；蛘撸稍谒獾耐瑫r(shí)，例如在添加一種或多種纖維素分解酶或其它酶活性的同時(shí)進(jìn)行化學(xué)、機(jī)械或生物預(yù)處理，以釋放例如可發(fā)酵糖如葡萄糖或麥芽糖。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料可進(jìn)行洗滌或以另外的方式解毒。但是，洗滌或解毒不是必需的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料不進(jìn)行洗滌或解毒?；瘜W(xué)預(yù)處理用語"化學(xué)預(yù)處理"是指促進(jìn)纖維素、半纖維素或木質(zhì)素的分離或釋放的任何化學(xué)預(yù)處理。合適的化學(xué)預(yù)處理方法的實(shí)例包括用例如稀酸、石灰、堿、有機(jī)溶劑、氨、二氧化硫或二氧化碳的預(yù)處理。此外，濕氧化和pH受控的水熱分解(hydrothermolysis)也被認(rèn)為是化學(xué)預(yù)處理。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，化學(xué)預(yù)處理是酸處理，更優(yōu)選地，連續(xù)的稀酸或弱酸(mildacid)處理如用硫酸、或另外的有機(jī)酸如乙酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫或其混合物的處理。也可使用其它酸。弱酸處理是指處理pH在pH1-5、優(yōu)選pHl-3的范圍內(nèi)。在具體的實(shí)施方式中，酸濃度在0.1-2.0重量％酸的范圍內(nèi)，且優(yōu)選為石克酸。酸可與含木質(zhì)纖維素材料接觸，并將該混合物在160-220。C例如165-195。C范圍內(nèi)的溫度保持若干分鐘至若干秒的時(shí)間，例如1-60分鐘，如2-30分鐘或3-12分鐘。也可應(yīng)用添加強(qiáng)酸如硫酸以除去半纖維素。這種添加強(qiáng)酸增強(qiáng)纖維素的可消化性。根據(jù)本發(fā)明還包括其它化學(xué)預(yù)處理技術(shù)。已顯示纖維素溶劑處理將約90%纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖。已顯示，當(dāng)破壞木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)時(shí)可大大增強(qiáng)酶水解。已知溶劑中的堿11202、臭氧、有機(jī)溶劑(organosolv)(使用在含水醇中的路易斯酸、FeCl3、(A1)2S04)、甘油、二嗯烷(dioxane)、酚、或乙二醇破壞纖維素結(jié)構(gòu)和促進(jìn)水解(Mosier等，2005,BioresourceTechnology96:673-686)。根據(jù)本發(fā)明還包括用堿例如NaOH、Na2C03和氨等的堿化學(xué)預(yù)處理。使用氨的預(yù)處理方法描述在例如WO2006/110891、WO2006/11899、WO2006/11900、WO2006/110卯1中，其通過引用并入本文。濕氧化技術(shù)包括使用氧化劑如基于亞硫酸鹽的氧化劑等。溶劑預(yù)處理的實(shí)例包括用DMSO(二曱亞石風(fēng))等的處理?；瘜W(xué)預(yù)處理通常進(jìn)行l(wèi)-60分鐘，例如5-30分鐘，但是取決于待預(yù)處理的材料可進(jìn)行更短或更長的時(shí)間。合適的預(yù)處理方法的其它實(shí)例由Schell等，2003,Appl.BiochemandBiotechn.Vol.105-108,p.69-85和Mosier等，2005,BioresourceTechnology96:673-686以及美國申請公開No.2002/0164730描述，其各自通過引用并入。才幾械預(yù)處理用語"機(jī)械預(yù)處理，，是指促進(jìn)纖維素、半纖維素或木質(zhì)素從含木質(zhì)纖維素材料分離或釋放的任何機(jī)械或物理預(yù)處理。例如，機(jī)械預(yù)處理包括各種類型的研磨(milling)、輻照、汽蒸/蒸汽爆炸、和水熱處理。機(jī)械預(yù)處理包括粉碎，即尺寸的機(jī)械降低。粉碎包括干磨、濕磨和振動球磨。機(jī)械預(yù)處理可涉及高壓和/或高溫(蒸汽爆炸)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，高壓意味著在300-600psi，優(yōu)選400-500psi范圍內(nèi)，例如約450psi的壓力。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，高溫意味著在約100-30(TC,優(yōu)選約140-235。C范圍內(nèi)的溫度。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，機(jī)械預(yù)處理為使用以上限定的高壓和高溫的分批法蒸汽槍水解器系統(tǒng)。為此可使用SundsHydrolyzer(可得自SundsDefibratorAB(瑞典))。化學(xué)和機(jī)械的組合預(yù)處理在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，以化學(xué)和機(jī)械兩者預(yù)處理含木質(zhì)纖維素材料。例如，預(yù)處理步驟可包括稀酸或弱酸處理以及高溫和/或高壓處理?；瘜W(xué)和機(jī)械預(yù)處理可自由地順序或同時(shí)進(jìn)行。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，使含木質(zhì)纖維素材料經(jīng)歷化學(xué)和機(jī)械預(yù)處理兩者以促進(jìn)纖維素、半纖維素或木質(zhì)素的分離或釋放。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，以稀酸或弱酸蒸汽爆炸步驟進(jìn)行預(yù)處理。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，以氨纖維爆裂步驟(或AFEX預(yù)處理步驟)進(jìn)行預(yù)處理。生物預(yù)處理用語"生物預(yù)處理，，是指促進(jìn)纖維素、半纖維素或木質(zhì)素從含木質(zhì)纖維素材料分離或釋放的任何生物預(yù)處理。生物預(yù)處理技術(shù)可涉及應(yīng)用木質(zhì)素-溶解微生物。參見，例如，Hsu，T,A.，1996,Pretreatmentofbiomass，于//aMGfeoo^:ow5z.oef/za"o/:iVotiwcf/owaw<iL^7feadow，Wyman，C.E.纟扁,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212;Ghosh,P.和Singh,A.，1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,廟M/c油'o/.39:295-333;McMillan,J.D.，1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,inE"^ym加'cCb"v^57'o"y》rFwe/j尸r。(iwc"o",Himmel,M.E"Baker,J.O.和Overend,R.P.編，ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.，Cao,N丄,Du,J.和Tsao，G.T"1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,于v4(ivawces5ZocAem/ca/Ewg/neen'wg/Bz'ofec/wo/ogy,Scheper，T.編,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241;Olsson,L和Hahn-Hagerdal，B.，1996，F(xiàn)ermentationoflignocellulosichydrolyzatesforethanolproduction,￡>7z.Mz.cra6.Tec/z.18:312-331;及Vallander,L和Eriksson,K.-E.L.，1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,爿cfv.所0c/7em.j5Vzg./Bz.oto;/wo/.42:63-95。水解在4吏預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料發(fā)酵前，可使其水解以將纖維素和半纖維素分解為可發(fā)酵糖。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，在發(fā)酵前使預(yù)處理的材料水解，優(yōu)選酶水解。在水解過程中干固體含量可在5-50重量％,優(yōu)選10-40重量％,優(yōu)選20-30重量％的范圍內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，水解可作為補(bǔ)料分批工水解溶液。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，可進(jìn)行酶水解。根據(jù)本發(fā)明，預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料可通過一種或多種纖維素分解酶例如纖維素酶或半纖維素酶或其組合進(jìn)行水解。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用包括一種或多種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的纖維素分解酶制備物進(jìn)行水解。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽是家族GH61A來源的。合適且優(yōu)選的纖維素分解酶制備物和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的實(shí)例在以下的"纖維素分解酶"部分和"纖維素分解增強(qiáng)多肽"部分中描述。由于含木質(zhì)纖維素材料可包含除木質(zhì)素、纖維素和半纖維素之外的組成部分，步驟ii)和iii)中的水解和/或發(fā)酵可在另外的酶活性如蛋白酶活性、淀4分酶;舌'l"生、津唐-產(chǎn)生酶(carbohydrate-generatingenzyme》舌'l"生、牙口酉旨酶;舌'1"生^口脂肪酶活性存在下進(jìn)行。酶水解優(yōu)選在合適的水相環(huán)境中在由本領(lǐng)域4支術(shù)人員可容易地確定的條件下進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，水解在對于所述酶合適的條件，優(yōu)選最佳的條件下進(jìn)行。合適的處理時(shí)間、溫度和pH條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。優(yōu)選地，水解在25-70。C,優(yōu)選40-60。C，特別是約50°C的溫度下進(jìn)行。該步驟優(yōu)選在pH3-8，優(yōu)選pH4-6，特別是約pH5的pH進(jìn)行。水解通常進(jìn)行12-96小時(shí),優(yōu)選16-72小時(shí)，更優(yōu)選24-48小時(shí)。發(fā)酵根據(jù)本發(fā)明，來自預(yù)處理和/或水解的含木質(zhì)纖維素材料的可發(fā)酵糖可通過一種或多種能夠?qū)⑻侨缙咸烟?、木糖、甘露糖和半乳糖直接或間接發(fā)酵成期望的發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵生物體發(fā)酵。發(fā)酵條件取決于期望的發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵生物體，且可由本領(lǐng)域普通^R術(shù)人員容易地確定。特別是在乙醇發(fā)酵的情況下，發(fā)酵可進(jìn)行l(wèi)-48小時(shí)，優(yōu)選l-24小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方式中，發(fā)酵在20-40。C,優(yōu)選26-34。C，特別是約32。C的溫度進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方式中，pH大于5。在另一實(shí)施方式中，pH為pH3-7，優(yōu)選4-6。但是，一些發(fā)酵生物體例如細(xì)菌發(fā)酵生物體具有較高的最適發(fā)酵溫度(fermentationtemperatureoptima)。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，發(fā)酵在40-60°C,例如50-60。C的溫度進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定合適的發(fā)酵條件。發(fā)明可在分批式、補(bǔ)料分批式或連續(xù)式反應(yīng)器中進(jìn)行。補(bǔ)料分批發(fā)酵可為固定體積或可變體積的補(bǔ)料分批式。在一個(gè)實(shí)施方式中，采用補(bǔ)料分批發(fā)酵。補(bǔ)料分批發(fā)酵的體積和速度取決于例如發(fā)酵生物體、可發(fā)酵糖的身份(identity)和濃度、以及期望的發(fā)酵產(chǎn)物。這種發(fā)酵速度和體積可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。SSF、HHF和SHF在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，水解和發(fā)酵以同時(shí)的水解和發(fā)酵步-驟(SSF)進(jìn)行。通常，這意味著組合的/同時(shí)的水解和發(fā)酵在對于所述發(fā)酵生物體合適的，優(yōu)選最佳的條件(例如，溫度和/或pH)下進(jìn)行。在另一實(shí)施方式中，水解步驟和發(fā)酵步驟以混合的水解和發(fā)酵(HHF)進(jìn)行。HHF通常以單獨(dú)的部分水解步驟開始并以同時(shí)的水解和發(fā)酵步驟結(jié)束。單獨(dú)的部分水解步驟為酶促纖維素糖化步驟，其通常在對于所述水解酶合適的，優(yōu)選最佳的條件(例如，在較高的溫度)下進(jìn)行。隨后的同時(shí)的水更低的溫度)下進(jìn)行。在另一實(shí)施方式中，水解和發(fā)酵步驟也可以單獨(dú)的水解和發(fā)酵進(jìn)行，其中在發(fā)酵開始前完成水解。這經(jīng)常稱作"SHF"?；厥赵诎l(fā)酵后，可任選地以任何合適的方式將發(fā)酵產(chǎn)物與發(fā)酵培養(yǎng)基分離。例如，可將培養(yǎng)基蒸餾以提取發(fā)酵產(chǎn)物，或可通過微濾技術(shù)或膜過濾技術(shù)從發(fā)酵培養(yǎng)基提取發(fā)酵產(chǎn)物?；蛘撸l(fā)酵產(chǎn)物可通過汽提(stripping)回收。回收方法是本領(lǐng)域公知的。發(fā)酵產(chǎn)物本發(fā)明可用于產(chǎn)生任何發(fā)酵產(chǎn)物。優(yōu)選的發(fā)酵產(chǎn)物包括醇(例如，乙醇、曱醇、丁醇)；有機(jī)酸(例如，檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如，丙醇)；氨基酸(例如，谷氨酸)；氣體(例如，H2和CO。；抗生素(例如，青霉素和四環(huán)素)；酶；維生素(例如，核黃素、B12、P-胡蘿卜素)；和激素。其它產(chǎn)物包括消耗性醇工業(yè)產(chǎn)品，例如啤酒和葡萄酒(wine);乳品工業(yè)產(chǎn)品，例如發(fā)酵乳制品；皮革工業(yè)產(chǎn)品和煙草工業(yè)產(chǎn)品。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，發(fā)酵產(chǎn)物為醇，特別是乙醇。根據(jù)本發(fā)明得到的發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇可優(yōu)選用作燃料醇/乙醇。但是，在乙醇的情況下，其也可用作飲用乙醇。發(fā)酵生物體18用語"發(fā)酵生物體，，是指適于產(chǎn)生期望的發(fā)酵產(chǎn)物的任何生物，包括細(xì)菌和真菌生物體。發(fā)酵生物體可為C6或C5發(fā)酵生物體、或其組合。C6和C5發(fā)酵生物體兩者是本領(lǐng)域公知的。合適的發(fā)酵生物體能夠?qū)⒖砂l(fā)酵糖如葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、甘露糖和或阿拉伯糖直接或間接發(fā)酵(即轉(zhuǎn)化)為期望的發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵生物體的實(shí)例包括真菌生物體如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬的菌抹，特別是釀酒酵母或葡萄汁酵母OSacc/"ramyc^mwww)的菌抹；畢赤酵母屬，優(yōu)選樹干畢赤酵母(尸/c/n'a幼;^to)的菌林如樹干畢赤酵母CBS5773或巴斯德畢赤酵母的菌抹；假絲酵母屬(Cflw/Wa)的菌抹，特別是產(chǎn)朊假絲酵母(Ca"力(iawrito)、阿斗唐發(fā)酵々支絲酵母(Ga"(iWaara6zVo/erme"tora)、迪丹其斤4艮絲酵母(Q^油(i/必myz7)、C"/^油so"orms7》、休哈塔假絲酵母(G3wd油s/ze/2"toe)、^i帶作支絲酵母(Ga"(iz'(ia/ro//ca/z'力或十專^f尹丁布i絲酵母(Ca"c^ia6o/<i/"")的菌抹。其它發(fā)酵生物體包括以下的菌抹漢遜酵母屬(/Z(mse"w/a)，特別是多形漢遜酵母(/Zflm^ww/a/o/拜o—a)或異常漢遜酵母(i/ims6做/aawo,/a)的菌抹；克魯維酵母(《/^yveram;/cay),特別是脆壁克魯維酵母(i:/甲era/^cayA"gZfo)或馬克斯克魯維酵母(i^/t/戸ram戸smflo;Zo"us);和裂殖酵母(5"cA/zosacc/7aramyces)，斗爭另'J是粟酒裂歹直酵母(5b/H'zcwflCc/ifl/xw^ces/om6e)。優(yōu)選的細(xì)菌發(fā)酵生物體包括埃希氏菌屬(五sc;jen'c/H'a),特別是大腸桿菌(^^/^&/^"http://)的菌株；發(fā)酵單胞菌屬(Z》womo"oy)，特別是運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Zymomo"omo&7/力的菌抹；發(fā)酵桿菌屬(Z少mo6acfer),特別是棕櫚發(fā)酵4干菌(Zymo6ac妙戶/mae)的菌林；克雷伯氏菌屬(尺/^wW/a)，特別是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(尺/eZmW/aojqvtoca)的菌抹；明串珠菌屬(丄ewcowo5toc),特別是腸膜明串珠菌tocw^e"/erazVfes)的菌才朱；梭菌屬(C7osnWww7)，特另'J是酪酸氺炎菌(C/osrrWww6w(yn'cww)的菌林；腸桿菌屬(五"fera6acfer)，特別是產(chǎn)氣腸桿菌(五"teraZ)acferaerage恥s)的菌4朱；以及熱厭氧4干菌屬(77zem7oa"(3era6acfer),4爭別是熱厭氧桿菌BG1L1(Appl.Microbiol.Biotech.77:61-86)和乙醇熱厭氧桿菌(3T^,膨a""e,oZwc/e,ef/2awo//c—、熱解糖熱厭氧桿菌(TTzemoaraera^c^f/zermc^acc/wro/j^cMw)或馬瑞氏^li厭氧4干菌(7T2erwo"""ero6(3c/ermaf/2ra;w7)的菌林。還預(yù)見乳桿菌屬(丄acto6ac!7/ws)的菌抹，以及預(yù)見谷氨酸棒桿菌R、熱葡糖苷酶芽孢桿菌(5a"7/usAemzog/wcowWa^ws)和熱葡糖苷酶地芽孢桿菌(Geo6(3a'〃ws^emzog/wcay/血》Ms)的菌抹。19在一個(gè)實(shí)施方式中，發(fā)酵生物體為C6糖發(fā)酵生物體，例如釀酒酵母的菌抹。關(guān)于源自木質(zhì)纖維素的材料的發(fā)酵，C5糖發(fā)酵生物體是期望的。大部分C5糖發(fā)酵生物體也使C6糖發(fā)酵。C5糖發(fā)酵生物體的實(shí)例包括畢赤酵母屬的菌抹，如樹干畢赤酵母菌種的菌株。C5糖發(fā)酵細(xì)菌也是已知的。一些釀酒.酵母菌抹也使C5(和C6)糖發(fā)酵。實(shí)例是能夠發(fā)酵C5糖的酵母屬菌種的遺傳修飾的菌林，包括在例如Ho等，1998，々/fed五"v/rawnewta/Mt'cra6z'o/ogy,p.1852-1859和Karhumaa等，2006,M.cra6/a/Ce//Factohas5:18，和Kuyper等，2005,F五MS論aWie"mr/z5,p.925-934中涉及的那些。一些發(fā)酵生物體的發(fā)酵性能可通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中存在抑制劑而被抑制，并由此降低乙醇產(chǎn)生能力。已知在生物質(zhì)水解物中的化合物和高濃度的乙醇抑制一些酵母細(xì)胞的發(fā)酵能力。預(yù)適應(yīng)或適應(yīng)方法可降低該抑制作用。通常，酵母細(xì)胞的預(yù)適應(yīng)或適應(yīng)包括在發(fā)酵前順序地生長酵母細(xì)胞以增加酵母的發(fā)酵性能和增加乙醇產(chǎn)生。酵母預(yù)適應(yīng)和適應(yīng)的方法是本領(lǐng)域已知的。這些方法可包括，例如，在粗生物質(zhì)水解物的存在下生長酵母細(xì)胞；在抑制劑如酚化合物、呔喃曱醛(furaldehydes)和有機(jī)酸的存在下生長酵母細(xì)胞；在非抑制量的乙醇的存在下生長酵母細(xì)胞；和向酵母培養(yǎng)物補(bǔ)充乙醛。在一個(gè)實(shí)施方式中，發(fā)酵生物體為在發(fā)酵前經(jīng)歷一種或多種預(yù)適應(yīng)或適應(yīng)方法的酵母菌抹。一些發(fā)酵生物體如酵母需要適當(dāng)?shù)牡从糜谠鲋澈桶l(fā)酵?？墒褂迷S多氮源，且這些氮源是本領(lǐng)域公知的。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用低成本的氮源。這些低成本來源可為有機(jī)的如尿素、DDG、濕濾餅(wetcake)或谷物醪(cornmash),或無才幾的如氨或氫氧化銨。適于乙醇產(chǎn)生的商業(yè)上可得到的酵母包括，例如，ETHANOLREDtm酵母(可得自Fermentis/Lesaffie,USA)、FALI(可得自Fleischmann，sYeast，USA)、SUPERSTART和THERMOSACC新鮮酵母(可得自EthanolTechnology,WI,USA)、BIOFERMAFT和XR(可得自NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA，USA)、GERTSTRAND(可得自GertStrandAB，Sweden)和FERMIOL(可得自DSMSpecialties)。發(fā)酵培養(yǎng)基用語"發(fā)酵培養(yǎng)基"是指其中進(jìn)行發(fā)酵的環(huán)境，其包括發(fā)酵底物，即，由發(fā)酵生物體代謝的糖源，且可包括發(fā)酵生物體。發(fā)酵培養(yǎng)基可包括用于發(fā)酵生物體的營養(yǎng)物和生長刺激物。營養(yǎng)物和生長刺激物在發(fā)酵領(lǐng)域中廣泛使用，且包括氮源如氨；維生素和礦物質(zhì)、或其組合。在發(fā)酵后，發(fā)酵培養(yǎng)基可進(jìn)一步包括發(fā)酵產(chǎn)物。酵即使在本發(fā)明方法或工藝的上下文中沒有具體提及，也應(yīng)理解酶以及其它化合物以有效量使用。纖維素分解活性本文中使用的用語"纖維素分解活性"理解為包括具有如下活性的酶纖維二糖水解酶活性(EC3.2.1.91)例如纖維二糖水解酶I和纖維二糖水解酶II、以及內(nèi)切葡聚糖酶活性(EC3.2丄4)和卩-葡糖苷酶活性(EC3.2.1.21)。至少三種類型的酶對于將纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖是重要的內(nèi)切葡聚糖酶(EC3.2丄4)，其隨機(jī)地切割纖維素鏈；纖維二糖水解酶(EC3.2丄91)，其從纖維素鏈末端切割纖維二糖單元；和(3-葡糖苷酶(EC3.2丄21)，其將纖維二糖和可溶纖維糊精轉(zhuǎn)化為葡萄糖。在纖維素生物降解中所涉及的這三種類型的酶中，纖維二糖水解酶似乎是用于降解天然結(jié)晶纖維素的關(guān)鍵酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，纖維素分解活性可為真菌來源的酶的制備物的形式，該真菌來源例如來自木霉屬(7h'c/wArma)的菌抹，優(yōu)選里氏木霉(7Hc/zocfemwree化/)的菌抹；腐質(zhì)霉屬(//Mw/co/a)的菌抹，如特異腐質(zhì)霉(//ww/co/<3/"jo/era)的菌抹；或金孢子菌屬(C7^7Joy/o/7'M附)的菌抹，優(yōu)選C77，os/on,訓(xùn)/wcbowerae的菌林。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，纖維素分解酶制備物包含以下活性的一種或多種纖雄素酶、半纖維素酶、纖維素分解酶增強(qiáng)活性、P-葡糖苷酶活性、內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、或木糖異構(gòu)酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，纖維素酶可為在PCT/US2008/065417中限定組合物，其通過引用并入本文。具體地，在一個(gè)實(shí)施方式中是在下述實(shí)施例1中使用的纖維素酶組合物(纖維素酶制備物A)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，纖維素分解酶制備物包括具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽，優(yōu)選家族GH61A多肽，優(yōu)選在WO2005/074656(Novozymes)中公開的多肽。纖維素分解酶制備物可進(jìn)一步包括p-葡糖苷酶，如源自木霉屬、曲霉屬(yl^^^7/w)或青霉屬(戶em'c涯'ww)的菌抹的P-葡糖苷酶，包括在WO2008/057637中7>開的具有(3-葡糖苷酶活性的融合蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，纖維素分解酶制備物還可包括CBHII酶，優(yōu)選土生4臾孢霉(77n'e/m^ferms^力纖維二糖水解酶IICEL6A。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，纖維素分解酶制備物還可包括纖維素分解酶，優(yōu)選源自里氏木霉或特異腐質(zhì)霉的纖維素分解酶。纖維素分解酶制備物還可包括在WO2005/074656中公開的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(GH61A);源自里氏木霉的纖維素分解酶和P-葡糖苦酶(在WO2008/057637中公開的融合蛋白)。在一個(gè)實(shí)施方式中，纖維素分解酶為可得自NovozymesA/S，Denmark的商業(yè)上可得到的產(chǎn)品CELLUCLAST1.5L或CELLUZYME、或ACCELERASE1000(來自GenencorInc.,USA)?？商砑永w維素分解酶用于使預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料水解。纖維素分解酶的劑量可為0.1-100FPU/克總固體(TS),優(yōu)選0.5-50FPU/克TS，特別是1-20FPU/克TS的范圍內(nèi)。在另一實(shí)施方式中，至少O.lmg纖維素分解酶/克總固體(TS),優(yōu)選至少3mg纖維素分解酶/克TS，例如5-10mg纖維素分解酶/克TS用于水解。內(nèi)切葡聚糖酶(EG)術(shù)語"內(nèi)切葡聚糖酶，，是指內(nèi)-l,4-(l，3;1,4)-(3-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.No.3.2丄4),其催化在纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉、在混合的(3-l，3葡聚糖如谷類P-D-葡聚糖或木葡聚糖(xyloglucan)中的(3-l，4鍵、和其它含纖維素組分的植物物質(zhì)中的1，4-p-D-糖苷鍵的內(nèi)水解(endo-hydrolysis)。內(nèi)切葡聚糖酶活性可根據(jù)Ghose,1987，尸wre""d，p/.C72em.59:257-268的步驟使用羧曱基纖維素(CMC)水解確定。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，內(nèi)切葡聚糖酶可源自木霉屬的菌林，優(yōu)選里氏木霉的菌抹；腐質(zhì)霉屬的菌抹，如特異腐質(zhì)霉的菌抹；或金孢子菌屬的菌才朱,4尤選C/7^so5^or/w附/wcAzcwerae的菌4朱。纖維二糖水解酶(CBH)術(shù)語"纖維二糖水解酶"是指1,4-P-D-葡聚糖纖維二糖水解酶(E.C321.9)，其催化在纖維素、纖維寡糖或任何包含卩-l,4-連接的葡萄糖的聚合物中的M-(3-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖。纖維二糖水解酶的實(shí)例在以上提及，包括來自里氏木霉、特異腐質(zhì)霉的CBHI和CBHII;和來自土生梭孢霉纖維二糖水解酶(CELL6A)的CBHII。纖維二糖水解酶活性可根據(jù)由在Lever等，1972,ja/.所oc/zem.47:273-279和vanTilbeurgh等，1982，尸五^S丄e故ra149:152-156;vanTilbeurgh和Claeyssens,1985,F五^S丄e"era187:283-288所述的方法確定。Lever等的方法適于評價(jià)玉米秸中纖維素的水解，和vanTilbeurgh等的方法適于確定熒光二糖衍生物的纖維二糖水解酶活性。3-葡糖苷酶在水解過程中可存在一種或多種P-葡糖苷酶。術(shù)語"p-葡糖苷酶"是指p-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2丄21),其催化末端非還原P-D-葡萄糖殘基的水解，釋放(3-D-葡萄糖。對于本發(fā)明來說，卩-葡糖普酶活性根據(jù)由Venturi等，2002,/SaWcM/craWo/.42:55-66描述的基本方法確定，只是如本文中所述使用不同的條件。一單位的j3-葡糖苷酶活性定義為在100mM檸檬酸鈉，0.01%TWEEN20中由作為底物的4mM對硝基苯基-(3-D-吡喃葡萄糖苷在50。C、pH5每分鐘產(chǎn)生l.O凝摩爾的對硝基苯酚。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，P-葡糖苷酶是真菌來源的，如木霉屬、曲霉屬或青霉屬的菌抹。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，(3-葡糖苷酶源自里氏木霉，如由6g〃基因編碼的[3-葡糖苷酶(參見EP562003的圖1)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，p-葡糖苷酶源自米曲霉(根據(jù)WO2002/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生)、煙曲霉0艮據(jù)WO2002/095014的實(shí)施例22在米曲霉中重組產(chǎn)生)或黑曲霉(簡，J.Appl.Vol3,pp157-163)。半纖維素酶半纖維素可通過半纖維素酶和/或酸水解破壞以釋放其五和六碳糖組分。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，源自木質(zhì)纖維素的材料可用一種或多種半纖維素酶處理。23可使用任何適用于水解半纖維素，優(yōu)選水解為木糖的半纖維素酶。優(yōu)選的半纖維素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖香酶、乙?；揪厶酋ッ?、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、內(nèi)-半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、內(nèi)或外阿拉伯糖酶、外-半乳聚糖酶、及其兩種或多種的混合物。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的半纖維素酶為外作用的半纖維素酶，且更優(yōu)選地，半纖維素酶為具有在pH7以下，優(yōu)選pH3-7的酸性條件下水解半纖維素的能力的外作用的半纖維素酶。適用于本發(fā)明的半纖維素酶的實(shí)例包括VISCOZYME(可得自NovozymesA/S,Denmark)。在一個(gè)實(shí)施方式中，半纖維素酶為木聚糖酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，木聚糖酶可優(yōu)選為微生物來源的，例如真菌來源的(例如，木霉屬、多孔菌屬(Men>//w)、腐質(zhì)霉屬、曲霉屬、鐮孢屬(尸^an'MW))或來自細(xì)菌(例如，芽孢桿菌屬(Bacillus))。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，木聚糖酶源自絲狀真菌，優(yōu)選源自曲霉屬例如棘孢曲霉0^/e^7/z^flcw/eartw)的菌抹或腐質(zhì)霉屬優(yōu)選疏棉狀腐質(zhì)霉(7^m/co/a/am^mwa)的菌抹。木聚糖酶可優(yōu)選為內(nèi)-l,4-(3-木聚糖酶，更優(yōu)選GH10或GH11的內(nèi)-l，4-P-木聚糖酶。商業(yè)木聚糖酶的實(shí)例包括來自NovozymesA/S，Denmark的SHEARZYMEtm和BIOFEEDWHEAT。半纖維素酶可以水解半纖維素的有效量，例如以約0.001-0,5重量％的總固體(TS)，更優(yōu)選0.05-0.5重量％的TS的量添加。木聚糖酶可以0.001-1.0g/kgDM(干物質(zhì))底物的量，優(yōu)選以0.005-0.5g/kgDM底物且最優(yōu)選0.05-0.10g/kgDM底物的量添加。木糖異構(gòu)酶木糖異構(gòu)酶(D-木糖酮異構(gòu)酶(ketoisomerase))(E.C.5.3.1.5.)是催化D-木糖到D-木酮糖的可逆異構(gòu)化反應(yīng)的酶。一些木糖異構(gòu)酶還轉(zhuǎn)化D-葡萄糖到D-果糖的可逆異構(gòu)化。因此，木糖異構(gòu)酶有時(shí)稱作"葡萄糖異構(gòu)酶"。用于本發(fā)明的方法或工藝中的木糖異構(gòu)酶可為任何具有木糖異構(gòu)酶活性的酶且可源自任意來源，優(yōu)選細(xì)菌或真菌來源，例如絲狀真菌或酵母。細(xì)菌木糖異構(gòu)酶的實(shí)例包括屬于鏈霉菌屬CSfr^>ow_yce》、游動放線菌屬(乂W"op/a"w)、芽孢桿菌屬和黃桿菌屬(F/avo6acten'MW)、及棲熱孢菌屬(772wmotoga)的那些，包4舌77zermotogawea;o"to"a(Vieille等，1995，Appl.Environ.Microbiol.61(5),1867-1875)禾口海棲^;孑包菌(r/2ermotogaman'"me)。真菌木糖異構(gòu)酶的實(shí)例源自擔(dān)子菌綱(萬osWcw;^efey)的菌種。優(yōu)選的木糖異構(gòu)酶源自假絲酵母屬酵母的菌抹，優(yōu)選博伊丁假絲酵母的菌抹，特別是公開在例如Vongsuvanlert等，1988，Agric.Biol.Chem.,52(7):1817-1824中的博伊丁假絲酵母木糖異構(gòu)酶。木糖異構(gòu)酶可優(yōu)選源自公開在Ogata等，Agric.Biol.Chem.,Vol,33,p.1519-1520或Vongs麵nlert等，1988，Agric.Biol.Chem.,52(2),p.1519-1520中作為DSM70034和ATCC48180保藏的伊丁假絲酵母菌林(Kloeckera2201)。在一個(gè)實(shí)施方式中，木糖異構(gòu)酶源自鏈霉菌屬的菌株，例如源自鼠灰鏈霉菌CS^e;tom;;cM(美國專利No.4,687,742)、都/>開在美國專利No.3,616,221中的黃微綠鏈霉菌(5:y7avov^""、白色鏈霉菌(Sa/6w)、不產(chǎn)色鏈霉菌(S:ac/zrawoge/ms)、多刺鏈霉菌(51.ec/n>ra^s)、》S.weofrworem/s。其它；i0唐異構(gòu)酶公開在美國專利No.3,622,463、美國專利No.4，351，卯3、美國專利No.4,137,126、美國專利No.3,625,828、匈牙利專利no.12，415、德國專利2,417,642、日本專利no.69,28,473和WO2004/044129中，各自通過引用并入本文。木糖異構(gòu)酶可為固定化或液體形式。優(yōu)選液體形式。商業(yè)上可得到的木糖異構(gòu)酶的實(shí)例包括來自NovozymesA/S，Denmark的SWEETZYMET?？商砑幽咎钱悩?gòu)酶以提供在0.01-100IGIU/克總固體范圍內(nèi)的活性水平。纖維素分解增強(qiáng)活性用于"纖維素分解增強(qiáng)活性，，在本文中定義為通過具有纖維素分解活性的蛋白質(zhì)增強(qiáng)源自木質(zhì)纖維素的材料的水解的生物活性。對于本發(fā)明，纖維素分解增強(qiáng)活性通過在以下條件下測量來自源自木質(zhì)纖維素的材料例如預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料通過纖維素分解蛋白質(zhì)的水解的還原糖的增加或纖維二糖和葡萄糖的總量的增加而確定1-50mg總蛋白質(zhì)/g在PCS(預(yù)處理的玉米秸)中的纖維素，其中總蛋白質(zhì)由80-99.5%w/w的纖維素分解蛋白質(zhì)/g在PCS中的纖維素和0.5-20%w/w的與在相同的總蛋白質(zhì)負(fù)載而沒有纖維素分解增強(qiáng)活性的對照水解(1-50mg纖維素分解蛋白質(zhì)/g在PCS中的纖維素)相比在50。C下1-7天的纖維素分解增強(qiáng)活性的蛋白質(zhì)構(gòu)成。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽通過降低達(dá)到相同水解程度所需的纖維素分解酶的量使由具有纖維素分解活性的蛋白質(zhì)催化的源自木質(zhì)纖維素25的材料的水解增強(qiáng)優(yōu)選至少0.1倍，更為至少0.2倍，更優(yōu)選至少0.3倍，更優(yōu)選至少0.4倍，更優(yōu)選至少0.5倍，更優(yōu)選至少1倍，更優(yōu)選至少3倍，更優(yōu)選至少4倍，更優(yōu)選至少5倍，更優(yōu)選至少10倍，更優(yōu)選至少20倍，甚至更優(yōu)選至少30倍，最優(yōu)選至少50倍，和甚至最優(yōu)選至少IOO倍。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，水解和/或發(fā)酵在纖維素分解酶和具有增強(qiáng)活性的多肽的組合的存在下進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，具有增強(qiáng)活性的多肽是家族GH61A多肽。WO,2005/074647公開了來自土生梭孢霉的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離多肽及其多核苦酸。WO2005/074656公開了來自桔橙嗜熱子嚢菌(77zem20(^cw⑧ra""acw力的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離多肽及其多核苷酸。美國申請公開No.2007/0077630公開了來自里氏木霉的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離多肽及其多核苷酸。a-淀粉酶根據(jù)本發(fā)明，可使用任何a-淀粉酶。優(yōu)選的a-淀粉酶為微生物例如細(xì)菌或真菌來源的。哪種a-淀粉酶最合適取決于工藝條件，但是可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。在一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選的a-淀粉酶為酸性a-淀粉酶，例如真菌酸性a-淀粉酶或細(xì)菌酸性a-淀粉酶。用語"酸性a-淀粉酶，，是指以有效量添加的、在3-7,優(yōu)選3.5-6，或更優(yōu)選4-5的范圍內(nèi)的pH具有最佳活性的a-淀粉酶(E.C.3.2丄1)。細(xì)菌a-淀4分酶在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，a-淀粉酶為芽孢桿菌屬來源的。芽孢桿菌屬a-淀粉酶可優(yōu)選源自地衣芽孢桿菌(及//c/zem/orw/"、解淀粉芽孢桿菌(及am少/owe/ac/era)、枯草芽孢桿菌(5.w6"fc)或嗜熱脂肪芽孢桿菌(及Wearaf/^mopMw)的菌抹，還可源自其它芽孢桿菌屬菌種。期望的a-淀粉酶的具體實(shí)例包括WO1999/19467中SEQIDNO:4所示的地衣芽孢4干菌a-淀粉酶、WO1999/19467中SEQIDNO:5的解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶、和WO1999/19467中SEQIDNO:3所示的嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶(所有序列通過引用并入本文)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，a-淀粉酶可為與WO1999/19467中SEQIDNO:1、2或3分別所示的任一序列具有至少60%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%,甚至更優(yōu)選至少90%，如至少95%,至少96%，至少97%,至少98%,或至少99%的同一性程度的酶。芽孢桿菌屬a-淀粉酶還可以是變體和/或雜合體，特別是WO1996/23873、WO1996/23874、WO1997/41213、WO1999/19467、WO2000/60059和WO2002/10355中任一篇中所述的變體和/或雜合體(所有文獻(xiàn)通過引用并入本文)。特別期望的a-淀粉酶變體在美國專利No.6,093,562、6,297,038或6，187,576(通過引用并入本文)中公開，而且包括在位置R179至G182缺失一個(gè)或兩個(gè)氨基酸的嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶(BSGa-淀粉酶)變體，優(yōu)選WO1996/023873中公開的雙缺失一參見例如，第20頁，第1-10行(通過引用并入本文)，優(yōu)選與WO1999/19467中公開的SEQIDNO:3所列的野生型BSGa-淀粉酶氨基酸序列相比對應(yīng)于A(181-182),或缺失氨基酸R179和G180，使用WO1999/19467中SEQIDNO:3的編號(其通過引用并入本文)。甚至更優(yōu)選的是芽孢桿菌屬a-淀粉酶，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶，其具有對應(yīng)于A(181-182)的雙缺失，而且與WO1999/19467中公開的SEQIDNO:3所列的野生型BSGa-淀粉酶氨基酸序列相比，還包含Nl93F耳又代(也表示為II81*+Gl82*+N193F)。細(xì)菌雜合a-淀粉酶特別期望的雜合a-淀粉酶包含(如WO1999/19467中SEQIDNO:4所示的)地衣芽孢桿菌a-淀粉酶的445C末端氨基酸殘基，和(如WO1999/194676中SEQIDNO:5所示的)源自解淀粉芽孢桿菌的a-淀粉酶的37N末端氨基酸殘基，具有一種或多種(特別是全部)下述取代G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+Nl90F+I201F+A209V+Q264S(使用在WO1999/19647的SEQIDNO:4中的地衣芽孢桿菌編號)。還優(yōu)選的是具有一個(gè)或多個(gè)下述突變(或在其它芽孢桿菌屬a-淀粉酶骨架中的相應(yīng)突變)的變體H154Y，A181T，N190F,A209V和Q264S和/或位置176和179之間缺失兩個(gè)殘基，優(yōu)選缺失E178和G179(使用WO1999/19467中SEQIDNO:5的編號方式)。真菌a-淀粉酶真菌a-淀粉酶包括源自曲霉屬的菌抹的a-淀粉酶，如米曲霉、黑曲霉27(j，rg/〃z^川地曲霉(y4s戸g〃/ws^a而c/7")a-淀粉酶。優(yōu)選的酸性真菌a-淀粉酶是Fungamyl樣a-淀粉酶，其源自米曲霉的菌抹。根據(jù)本發(fā)明，用語"Fungamyl樣a-淀粉酶，，表示與WO1996/23874中SEQIDNO:10所示氨基酸序列的成熟部分顯示高度同一性，即高于70%，高于75%，高于80%,高于85%，高于90%，高于95%,高于96%,高于97%，高于98%,高于99%,或者甚至100%同一性的a-淀粉酶。另一種優(yōu)選的酸性a-淀粉酶源自黑曲霉菌抹。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，酸性真菌a-淀粉酶是來自黑曲霉的a-淀粉酶，其在Swiss-prot/TeEMBL數(shù)據(jù)庫中以"AMYA—ASPNG，，公開，初級登錄號為P56271，并在WO1989/01969(實(shí)施例3)中進(jìn)行了描述。商業(yè)上可得到的源自黑曲霉的酸性真菌a-淀粉酶是SP288(可從NovozymesA/S,Denmark獲得)。其它期望的野生型a-淀粉酶包括源自根毛霉屬(i/2/zomwcor)或多孔菌屬的菌抹，優(yōu)選微小根毛霉(i/^owwcwpw/〃w)(WO2004/055178,通過引用并入)或巨多孔菌(Men》//^^ga"&iw)的菌4朱的那些。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，a-淀4分酶源自川地曲霉，并由Kaneko等，1996，J.Ferment.Bioeng.81:292-298,"Molecular-cloninganddeterminationofthenucleotide-sequenceofageneencodinganacid-stablealpha-amylasefrom爿^ergf〃wA:mvac/n'/"公開；還作為EMBL:#AB008370公開。真菌a-淀粉酶還可以是包含淀粉結(jié)合域(SBD)和ot-淀粉酶催化域的野生型酶(即，非雜合體)，或其變體。在一個(gè)實(shí)施方式中，野生型a-淀粉酶源自川地曲霉的菌抹。真菌雜合a-淀粉酶在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，真菌酸性a-淀粉酶是雜合a-淀粉酶。真菌雜合a-淀4分酶的優(yōu)選實(shí)例包括WO2005/003311或美國申諱_公開No.2005/0054071(Novozymes)或美國專利申請No.60/638,614(Novozymes)中公開的a-淀粉酶，上迷文件通過引用并入本文。雜合a-淀粉酶可以包含a-淀粉酶催化域(CD)和糖結(jié)合域/才莫塊(CBM)，如淀粉結(jié)合域，和任選的接頭。期望的雜合a-淀粉酶的具體實(shí)例包括美國專利申請No.60/638,614中實(shí)施例的表1至5中公開的那些，其包括具有催化域JA118和羅耳阿太菌C4f/ze//aro訴")SBD的Fungamyl變體(US60/638,614中的SEQEDNO:100),具有羅耳阿太菌AMG接頭和SBD的微小根毛霉(i/^omwcor/tm7/船)a-淀粉酶(US60/638,614中的SEQIDNO:101),具有黑曲霉葡糖淀粉酶接頭和SBD的微小根毛霉a-淀粉酶(其在美國申請No.11/316,535的表5中作為氨基S^列SEQIDNO:20，SEQIDNO:72和SEQIDNO:96的組合公開)或作為WO2006/069290中表5的V039，和具有羅耳阿太菌葡糖淀粉酶接頭和SBD的巨多孔菌a-淀粉酶(美國申請No.60/638614中SEQIDNO:102)。其它特別期望的雜合a-淀粉酶是美國申請No.11/316,535或WO2006/069290(各自通過引用并入本文)的實(shí)施例4中表3、4、5和6中列出的4壬何雜合a-淀粉酶。期望的雜合a-淀粉酶的其它具體實(shí)例包括美國申請公開No.2005/0054071中公開的那些，包括第15頁上表3中公開的那些，如具有川地曲霉接頭和淀粉結(jié)合域的黑曲霉a-淀粉酶。期望的還有與上述任何a-淀粉酶顯示高度同一性的a-淀粉酶，即與成熟酶序列顯示高于70%,高于75%，高于80%，高于85%，高于90%，高于95%，高于96%，高于97%，高于98%，高于99°/?；蛘呱踔?00%同一性的a-淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明的酸性a-淀粉酶可以0.1-10AFAU/gDS，優(yōu)選0,10-5AFAU/gDS，特別是0.3-2AFAU/gDS的量添加。商業(yè)a-淀粉酶產(chǎn)品優(yōu)選的包含a-淀粉酶的商業(yè)組合物包括來自DSM的MYCOLASE、BAN,TERMAMYLSC、FUNGAMYL、LIQUOZYMEX和SANSUPER、SANEXTRAL(NovozymesA/S)和CLARASEL-40，000、DEX-LOTM、SPEZYMEFRED、SPEZYMEAA和SPEZYMEDELTAAA(GenencorInt.),和以商品名SP288出售的酸性真菌a-淀粉酶(可從NovozymesA/S，Denmark獲得)。糖-源產(chǎn)生酶用語"糖-源產(chǎn)生酶，，包括葡糖淀粉酶(其為葡萄糖產(chǎn)生者)、P-淀粉酶和產(chǎn)麥芽糖淀粉酶(其為麥芽糖產(chǎn)生者)。糖-源產(chǎn)生酶能產(chǎn)生糖，所述糖可由所述發(fā)酵生物體作為能量來源使用，例如，當(dāng)用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇的方法時(shí)。產(chǎn)生的糖可以直接或間接轉(zhuǎn)化成期望的發(fā)酵產(chǎn)物，優(yōu)選乙醇。根據(jù)本發(fā)明，可存在糖-源產(chǎn)生酶的混合物。特別期望的混合物是至少葡糖淀粉酶和a-淀粉酶(特別是酸性淀粉酶，甚至更優(yōu)選酸性真菌a-淀粉酶)的混合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，酸性真菌a-淀粉酶活性(AFAU)對葡糖淀粉酶活性(AGU)之間的比(AFAU/AGU)可為至少0.1，特別是至少0.16，如0.12-0.50或者更高。葡糖淀粉酶根據(jù)本發(fā)明使用的葡糖淀粉酶可以源自任何合適的來源，例如，源自微生物或植物。優(yōu)選的葡糖淀粉酶是選自下組的真菌或細(xì)菌來源的曲霉屬葡糖淀粉酶，特別是黑曲霉Gl或G2葡糖淀粉酶(Boel等，(1984)，EMBOJ.3(5),p.1097-1102),和它們的變體，如WO1992/00381、WO2000/04136和WO2001/04273中所公開的那些(來自Novozymes，Denmark);公開在WO1984/02921中的泡盛曲霉(Aammon')葡糖淀粉酶、米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.(1991),55(4),p.941-949)，或其變體或片段。其它曲霉屬葡糖淀粉酶變體包括具有增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性的變體G137A和G139A(Chen等，1996,Prot.Eng.9,499-505);D257E和D293E/Q(Chen等，1995,Prot.Engng.8,575-582);N182(Chen等，1994，Biochem.J.301,275-281);二硫鍵、A246C(Fierobe等，1996，Biochemistry,35,8698-8704);和在A435和S436位置引入Pro殘基(Li等，1997,ProteinEngng.10，1199-1204)。其它葡糖淀粉酶包括羅耳阿太菌(過去稱作羅耳伏革菌(Co^c/wm葡糖淀粉酶(參見美國專利No.4,727,026和(Nagasaka,Y.等，1998,"Purificationandpropertiesoftheraw-starch-degradingglucoamylasesfromCoW"'w附ra折"，ApplMicrobiolBiotechnol50:323-330)、踝節(jié)菌屬(ra/arawyce;y)葡糖淀粉酶，特別地，源自埃默森踝節(jié)菌(ra/ara附;;casewerao"")(WO1999/28448)、7^/a,omycas/e_yceWaw(美國專利號Re.32,153)、T^/aramycas<iw_po"ri、口耆熱踝節(jié)菌(ra/ara附y(tǒng)cej^erwop/z//^)(美國專利號4，587，215)。期望的細(xì)菌葡糖淀粉酶包括來自梭菌屬(C7o^n'^wm)，特別是熱解淀粉梭菌(C.Aemoamy/o/,'cw—(EP135,138)和熱硫化氫梭菌(C,f/zeww/2_>^rara//wn.cwm)(WO1986/01831),以及公開在WO2006/069289(其通過引用并入本文)中的環(huán)帶栓菌(rrawefeyc/"gw/W")的葡糖淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明，雜合葡糖淀粉酶也是期望的。雜合葡糖淀粉酶的實(shí)例公開在WO2005/045018中。具體實(shí)例包括公開在WO2005/045018的實(shí)施例1的表1和4中的雜合葡糖淀粉酶，其通過引用并入本文中至教導(dǎo)雜合葡糖淀粉酶的程度。期望的還有與上述任何a-淀粉酶顯示高度同一性的a-淀粉酶，即與成熟酶序列顯示高于70%,高于75%,高于80%，高于85%,高于90°/。，高于95%，高于96%,高于97%，高于98%，高于99%或者甚至100°/。同一性的a-淀粉酶。商業(yè)上可得到的包含葡糖淀粉酶的組合物包括AMG200L;AMG300L;SANTMSUPER、SANEXTRAL、SPIRIZYMEPLUS、SPIRIZYMEFUEL、SPIRIZYMEB4U和AMGE(來自NovozymesA/S);OPTIDEX300(來自GenencorInt.);AMIGASEtm和AMIGASEPLyS(來自DSM);G-ZYMEG900、G畫ZYMEtm和G990ZR(來自GenencorInt)。在一個(gè)實(shí)施方式中，葡糖淀粉酶可以0.02-20AGU/gDS,優(yōu)選0.1-10AGU/gDS，特別是l響5AGU/gDS，如0.5AGU/gDS的量加入。|3-淀粉酶術(shù)語"(3-淀粉酶"(E.C3.2丄2)是傳統(tǒng)上給予外作用的(exo-acting)產(chǎn)麥芽糖淀粉酶的名稱，其催化直鏈淀粉、支鏈淀粉和相關(guān)葡萄糖聚合物中l(wèi)，4-a-糖苷鍵的水解。以逐步的方式接續(xù)從非還原鏈末端去除麥芽糖單元，直至分子降解或者，在支鏈淀粉的情況下，直至到達(dá)分支點(diǎn)。釋放的麥芽糖具有卩異頭物構(gòu)型，因此稱為(3-淀粉酶。已經(jīng)從各種植物和微生物中分離出P-淀粉酶(W.M.Fogarty和C.T.Kdly，ProgressinIndustrialMicrobiology,vol.15，pp.112-115,1979)。這些p-淀粉酶的特征為在40。C至65。C具有最適溫度和在4.5至7具有最適pH。商業(yè)上可得到的來自大麥的(3-淀粉酶是來自NovozymesA/S,Denmark的NOVOZYM德A和來自GenencorInt.,USA的SPEZYMEBBA1500。產(chǎn)麥芽糖淀粉酶淀粉酶還可以是產(chǎn)麥芽糖a-淀粉酶。產(chǎn)麥芽糖a-淀粉酶(葡聚糖1,4-a-麥芽糖水解酶，E.C.3.2丄133)能將直鏈淀粉和支鏈淀粉水解成a構(gòu)型的麥芽糖。來自嗜熱脂肪芽孢桿菌菌抹NCIB11837的產(chǎn)麥芽糖淀粉酶可從31NovozymesA/S購得。在美國專利號4,598,048、4,604,355和6,162,628中描述了產(chǎn)麥芽糖oc-淀粉酶，其通過引用并入本文。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，產(chǎn)麥芽糖淀粉酶可以0.05-5mg總蛋白質(zhì)/gDS或0.05-5MANU/gDS的量加入。蛋白酶在步驟ii)中的水解、步驟iii)中的發(fā)酵或同時(shí)的水解和發(fā)酵過程中可添加蛋白酶?？稍诎l(fā)酵過程中添加蛋白酶以使發(fā)酵生物體，特別是酵母抗絮凝。蛋白酶可為任何蛋白酶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，蛋白酶為微生物來源的酸性蛋白酶，優(yōu)選真菌或細(xì)菌來源的酸性蛋白酶。優(yōu)選酸性真菌蛋白酶，但也可l吏用其它蛋白酶。合適的蛋白酶包括微生物蛋白酶，例如真菌和細(xì)菌蛋白酶。優(yōu)選的蛋白酶是酸性蛋白酶，即，特征為在低于pH7的酸性條件下水解蛋白的能力的蛋白酵。期望的酸性真菌蛋白酶包括源自曲霉屬、毛霉屬(Mwcw)、根霉屬0R/^o;^)、假絲酵母屬、革蓋菌屬(Con'o/iw)、內(nèi)座殼屬0&^oA/a)、￡"Aowo//^ra、耙菌屬(/^e;c)、青霉屬、絲核菌屬(Sc/era"ww)和球擬酵母屬(7bnJc^/"的真菌蛋白酶。尤其期望的是源自黑曲霉(參見例如，Koaze等,1964，Agr.Biol.Chem.Japan,28，216),齋藤曲霉(^^erg/〃iw^z'toz')(參見例如，Yoshida,1954,J.Agr.Chem.Soc.Japan,28，66),泡盛曲霉(Hayashida等，1977，Agric.Biol.Chem.,42(5),927-933，棘孢曲霉(WO1995/02044)，或米曲霉的蛋白酶，例如pepA蛋白酶；以及來自微小毛霉(Mwcor;us/〃w力或米黑毛霉(Mwcorm/e/2e!')的酸性蛋白酶。期望的還有中性或堿性蛋白酶，例如源自芽孢桿菌屬菌抹的蛋白酶。本發(fā)明期望的具體蛋白酶源自解淀粉芽孢桿菌并且具有可在Swissprot以登錄號P06832獲得的序列。期望的還有與可在Swissprot以登錄號P06832獲得的序列具有至少90%同一性，例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98。/?；蛱貏e是至少99%的同一性的蛋白酶。進(jìn)一步期望的是與在WO2003/048353中公開的SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少90%同一性，例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或特別是至少99%的同一性的蛋白酶。期望的還有木瓜蛋白酶樣蛋白酶例如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)內(nèi)的蛋白酶，例如EC3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC3.4.22.7(蘿蘼蛋白酶)、EC3.4.22.14(奇異果蛋白酶)、EC3.4.22.15(組織蛋白酶L)、EC3.4.22.25(甘氨酰內(nèi)肽酶)和EC3.4.22.30(caricain)。在一個(gè)實(shí)施方式中，蛋白酶為源自曲霉屬，例如米曲霉的菌抹的蛋白酶制備物。在另一實(shí)施方式中，蛋白酶源自根毛霉屬，優(yōu)選曼赫根毛霉(i/zz'zomwcww^7^)的菌株。在另一期望的實(shí)施方式中，蛋白酶為蛋白酶制備物，優(yōu)選為源自曲霉屬例如米曲霉的菌抹的蛋白水解制備物和源自根毛霉屬優(yōu)選曼赫根毛霉的菌抹的蛋白酶的混合物。天冬氨酉臾蛋白酶4苗述在，例^口，Hand-bookofProteolyticEnzymes,由A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner編，Aca-demicPress,SanDiego,1998,第270章中。天冬氨酸蛋白酶的合適實(shí)例包括，例如，在R.M.Berka等，Gene,96,313(1990));(R.M.Berka等,Gene,125,195-198(1993));和Gomi等，Biosci.Biotech.Biochem.57，1095-1100(1993)中描述的那些，其通過引用并入本文。商業(yè)上可得到的產(chǎn)品包括ALCALASE、ESPERASETM、FLAVOURZYME、PROMIX、NEUTRASE、RENNILASE、NOVOZYMTMFM2.0L和NOVOZYM50006(可得自NovozymesA/S，Denmark)及來自GenencorInt.,Inc.,USA的GC106"tm和SPEZYMEFAN。蛋白酶可以0.0001-1mg酶蛋白質(zhì)/gDS，優(yōu)選0.001-0.1mg酶蛋白質(zhì)/gDS的量存在?；蛘?，蛋白酶可以0.0001-1LAPU/gDS,優(yōu)選0.001-0.1LAPU/gDS和/或0.0001-1mAU-RH/gDS,優(yōu)選0.001-0.1mAU-RH/gDS的量存在。式的范圍，因?yàn)檫@些實(shí)施方式意欲作為本發(fā)明幾個(gè)方面的說明。任何等同的實(shí)施方式以及所述實(shí)施方式的一個(gè)或多個(gè)的組合意欲在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。從前面的說明中，除本文所顯示和描述的那些之外，本發(fā)明的多種修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。這些修改也意欲落入所附的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。本文引用了多篇文獻(xiàn)，其公開的內(nèi)容通過引用全體并入。通過下述實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，所述實(shí)施例不解釋為限制本發(fā)明范圍。材料與方法材料纖維素酶制備物A:纖維素分解組合物，其包括公開在WO2005/074656中的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(GH61A);(3-葡糖苷酶(在WO2008/057637中公開的融合蛋白)和源自里氏木霉的纖維素分解酶制備物。纖維素酶制備物A公開在共同未決申請PCT/US2008/065417中。酵母可得自RedStar/Lesaffre，USA的REDSTAR。RWB218從RoyalNedalco/TheNetherlands得到并且描述在Kuyper等,2005，&aW/a^flw/25,p.925-934中。-未洗滌的預(yù)處理的玉米秸(PCS):從TheNationalRenewableEnergyLaboratory,Golden,CO.得到的、經(jīng)酸催化的、蒸汽爆炸的。方法同一性的確定通過參數(shù)"同一性，，描述兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性。兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度使用具有同一性表和以下多重比對參數(shù)(alignmentparameter)的LASERGENEMEGALIGNtm軟件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)通過Clustal法(Higgins，1989,5:151-153)確定缺口罰分10和缺口長度罰分10。配對比對參數(shù)為K元組(Ktuple)=1，缺口罰分=3，窗口=5和對角線=5。兩個(gè)核苷酸序列之間的同一性程度使用具有同一性表和以下多重比對參數(shù)的LASERGENEMEGALIGNtm軟件(DNASTAR，Inc.,Madison,WI)通過Wilbur-Lipman'法(Wilbur和Lipman,1983,/Voceec^"gso/A￡iVaf/o""/爿c^femyo/\SWe"ce675^80:726-730)確定缺口罰分10和缺口長度罰分10。配對比對參數(shù)為K元組(Ktuple"3，缺口罰分=3和窗口=20。使用濾紙測定法(FPU測定法V測量纖維素酶活性1.方法的來源1.1該方法7^開在名稱為"MeasurementofCellulaseActivities",Adney,B.和Baker,J.,1996，LaboratoryAnalyticalProcedure,LAP-006,NationalRenewableEnergyLaboratory(NREL)的文件中。其是基于用于測量纖維素酶活寸生的IUPAC方法(Ghose，T.K.，MeasurementofCellulseActivities,Pure&Appl.Chem.59,pp.257-268，1987)。2.步驟2.1該方法如Adney和Baker,1996，見上文所述進(jìn)行，只是在顯色后使用96孔^L讀^f又吸光率值，如下所述。2.2耀試—發(fā)^:2.2.1將巻起的(rolled)濾紙條(strip)(#1Whatman;1x6cm;50mg)添力口到試管(13x100mm)的底部。2.2.2向所述管添加1.0mL的0.05M檸檬酸鈉緩沖液(pH4.80)。2.2.3將包含濾紙和緩沖液的所述管在循環(huán)水浴中在5(TC(士0.rC)溫育5分鐘。2.2.4在溫育后，向所述管添加0.5mL在檸檬酸鹽緩沖液中的酶稀釋物。酶稀釋物設(shè)計(jì)為產(chǎn)生略微高于和低于2.0mg葡萄糖的目標(biāo)值的值。2.2.5通過輕輕渦旋3秒混合所述管內(nèi)容物。2.2.6在渦旋后，將所述管在循環(huán)水浴中在50。C(土0.rC)溫育60分鐘。2.2.7在60分鐘溫育后立即從水浴中取出所述管，并向每個(gè)管添加3.0mL的DNS試劑以停止反應(yīng)。將所述管渦旋3秒以混合。2.3玄冷和對,裙2.3.1通過向試管添加1.5mL檸檬酸鹽緩沖液來制備試劑空白。2.3.2通過將巻起的濾紙條添加到試管的底部中并添加1.5mL檸檬酸鹽緩沖液制備底物對照。2.3.3對于每個(gè)酶稀釋物，通過將1.0mL檸檬酸鹽緩沖液和0.5mL適當(dāng)?shù)拿赶♂屛锘旌蟻碇苽涿笇φ铡?.3.4以與酶試驗(yàn)管相同的方式測定試劑空白、底物對照和酶對照，并與酶試驗(yàn)管一起進(jìn)行。2.4葡萄潛^^凌錄2.4.1制備100mL葡萄糖的原液(IO.Omg/mL)，并將5mL等分試樣凍35結(jié)。在使用前，將等分試樣解凍并渦旋以混合。2.4.2如下在檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行原液的稀釋Gl=1.0mL原液+0.5mL緩沖液=6.7mg/mL=3.3mg/0.5mLG2=0.75mL原液+0.75mL緩沖液=5.0mg/mL=2.5mg/0.5mLG3二0.5mL原液十1.0mL緩沖液=3.3mg/mL=1.7mg/0.5mLG4=0.2mL原液十0.8mL緩沖液=2.0mg/mL=1.0mg/0.5mL2.4.3通過將0.5mL的各個(gè)稀釋物添加到1.0mL檸檬酸鹽緩沖液中制備葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物管。2.4.4以與酶試驗(yàn)管相同的方式測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物管，并與酶試驗(yàn)管一起進(jìn)行。2.5^悉2.5.1在60分鐘溫育和添加DNS后，使所有管在水浴中一起煮沸5分鐘。2.5.2在煮沸后，將它們立即在冰/水浴中冷卻。2.5.3當(dāng)冷卻時(shí)，簡單地渦旋所述管，并容許漿狀物沉降。然后，通過將來自各個(gè)管的50微升添加到在96孔板中的200微升ddH20中來稀釋各個(gè)管?；旌细骺?，并在540nm讀取吸光度。2.6^,(^夠4A^5丄X妖^給;^2.6.1通過將四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物(Gl-G4)的葡萄糖濃度(mg/0.5mL)相對于A540作圖來制備葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。這使用線性回歸(PrismSoftware)擬合，并且使用用于該線的方程以確定各個(gè)酶試驗(yàn)管所產(chǎn)生的葡萄糖。2.6.2制備所產(chǎn)生的葡萄糖(mg/0.5mL)相對于總的酶稀釋物的曲線，Y軸(酶稀釋物)為對數(shù)標(biāo)度。2.6.3在產(chǎn)生剛剛大于2.0mg葡萄糖的酶稀釋物和產(chǎn)生剛剛小于2.0mg葡萄糖的酶稀釋物之間畫線。從該線確定產(chǎn)生恰好2.0mg葡萄糖的酶稀釋物。2.6.4如下計(jì)算濾紙單位/mL(FPU/mL):FPU/mL=0.37/產(chǎn)生2.0mg葡萄糖的酶稀釋物。葡糖淀粉酶活性可以AGI單位或以葡糖淀粉酶單位(AGU)測量葡糖淀粉酶活性。葡糖淀粉酶活性(AGI)36葡糖淀粉酶(等同于淀粉葡萄糖苷酶)將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖。在此通過用于活性測定的葡萄糖氧化酶方法來確定確定葡萄糖的量。該方法描述于來自AmericanAssociationofCerealChemists,2000;ISBN:1-891127-12-8的"ApprovedmethodsoftheAmericanAssociationofCerealChemists".Vol.1-2AACC中的76-11節(jié)"淀粉-葡糖淀粉酶方法及用葡萄糖氧化酶進(jìn)行葡萄糖的后續(xù)測量"。一個(gè)葡糖淀粉酶單位(AGI)是在該方法的標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘形成1微摩葡萄糖的酶量。標(biāo)準(zhǔn)條件/反應(yīng)條件底物可溶性淀粉，濃度約16g干物質(zhì)/L.緩沖液乙酸鹽(acetate),約0.04M,pH=4.3pH:4.3溫育溫度60°C反應(yīng)時(shí)間15分鐘反應(yīng)的終止NaOH至約0.2g/L的濃度(pH9)酶濃度0.15-0.55AAU/mL.淀粉應(yīng)該是Linter淀粉，其為在實(shí)驗(yàn)室中用作比色指示劑的稀糊淀粉(thin-boilingstarch)。將天然淀粉用稀鹽酸處理，使其保持與碘生成藍(lán)色的能力，從而獲得Lintner淀粉。葡糖淀粉酶活性(AGU)將Novo葡糖淀粉酶單位(AGU)定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶量，所述標(biāo)準(zhǔn)條件為37。C、pH4.3,底物麥芽糖23.2mM，緩沖液乙酸鹽0.1M,反應(yīng)時(shí)間為5分鐘?？梢允褂米詣臃治銎飨到y(tǒng)。向葡萄糖脫氫酶試劑中加入變旋酶(mutarotase)，從而將存在的任何a-D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成(3-D-葡萄糖。在上述反應(yīng)中，葡萄糖脫氫酶特異性地與(3-D-葡萄糖反應(yīng)形成NADH,使用光度計(jì)在340nm處測定形成的NADH,作為起始葡萄糖濃度的量度。AMG溫育底物麥芽糖23.2mM緩沖液乙酸鹽0.1MpH:4.30±0.05溫育溫度37。C±1反應(yīng)時(shí)間5分鐘酶工作范圍0.5-4.0AGU/mL顯色反應(yīng)GlucDH:430U/L變旋酶9U/LNAD:0.21mM緩沖液磷酸鹽0.12M;0.15MNaClpH:7.60±0.05溫育溫度37。C土l反應(yīng)時(shí)間5分鐘波長340nm更詳細(xì)描述這種分析方法的文件央(EB-SM-0131.02/01)可根據(jù)向NovozymesA/S,Denmark要求而獲得，所述文件夾通過引用并入本文。a-淀粉酶活性a-淀粉酶活性(KNU)可使用馬鈴薯淀粉作為底物來確定a-淀粉酶活性。該方法基于改性馬鈴薯淀粉通過酶的分解，并通過將淀粉/酶溶液的樣品與碘溶液混合來跟蹤反應(yīng)。起初，形成藍(lán)黑色，但是在淀粉分解過程中，藍(lán)色變?nèi)醪⒅饾u變?yōu)榧t褐色，其與有色的玻璃標(biāo)準(zhǔn)物相比。將一個(gè)KiloNovoa-淀粉酶單位(KNU)定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下(即在37°C+/-0.05;0.0003MCa2+;和pH5.6)將5260mg淀4分干物質(zhì)MerckAmylumsolubile糊精化的酶量。更詳細(xì)描述該分析方法的文件夾EB-SM-0009.02/01可根據(jù)向NovozymesA/S，Denmark要求而獲得，所述文件夾通過引用并入本文。酸性a-淀粉酶活性當(dāng)根據(jù)本發(fā)明使用時(shí)，任何酸性a-淀粉酶的活性可以AFAU(酸性真菌a-淀粉酶單位)測量?？蛇x擇地，酸性a-淀粉酶的活性可以AAU(酸性a-淀粉酶單位)測量。酸性a-淀粉酶單位(AAU)可以AAU(酸性a-淀粉酶單位)測量酸性a-淀粉酶活性，這是一種絕對(absolute)方法。一個(gè)酸性淀粉酶單位(AAU)是在標(biāo)準(zhǔn)化的條件下，每小時(shí)將1g淀粉(100。/。干物質(zhì))轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量，所述產(chǎn)物在與已知強(qiáng)度(strength)的碘溶液反應(yīng)后在620nm處具有與顏色參照之一等同的透射(transmission)。標(biāo)準(zhǔn)條件/反應(yīng)條件底物可溶性淀粉濃度約20gDS/L.緩沖液檸檬酸鹽，約0.13M,pH=4.2碘溶液40.176g石典化鉀+0.088g碘/L自來水15。-20。dH(德國硬度(Germandegreehardness))pH:4.2溫育溫度30。C反應(yīng)時(shí)間11分鐘波長620nm酶濃度0.13-0.19AAU/mL酶工作范圍0.13-0.19AAU/mL淀粉應(yīng)為Lintner淀粉，其為在實(shí)驗(yàn)室中用作比色指示劑的稀糊淀粉。通過將天然淀粉用稀鹽酸處理，使其保持與碘生成藍(lán)色的能力，從而獲得Lintner淀粉。進(jìn)一步細(xì)節(jié)可以在EP0140410B2中找到，其乂>開內(nèi)容通過引用并入本文。酸性a-淀粉酶活性(AFAU)可以AFAU(酸性真菌a-淀粉酶單位)測量酸性a-淀粉酶活性，其相對于酶標(biāo)準(zhǔn)物確定。將lAFAU定義為在下述標(biāo)準(zhǔn)條件下每小時(shí)降解5.260mg淀粉干物質(zhì)的酶量。酸性a-淀粉酶，一種內(nèi)切-a-淀粉酶(l，4-a-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶,E,C.3.2丄1)，水解淀粉分子內(nèi)部區(qū)中的oc-l,4-糖苷鍵以形成具有不同鏈長的糊精和寡糖。與碘形成的顏色的強(qiáng)度與淀粉濃度成正比。使用反向比色法在特定的分析條件下測定淀粉濃度的減少作為淀粉酶活性。淀粉+碘"定騎糊精+寡糖40°C,2.5;i二590,藍(lán)/紫1=23秒脫色標(biāo)準(zhǔn)條件/反應(yīng)條件底物可溶性淀粉約0.17g/L緩沖液檸檬酸鹽，約0.03M碘(12):0.03g/LCaCl2:1.85mMpH:2.50±0.05溫育溫度40。C反應(yīng)時(shí)間23秒波長590nm酶濃度0.025AFAU/mL酶工作范圍0.01-0.04AFAU/mL更詳細(xì)描述該分析方法的文件夾EB-SM-0259.02/01可根據(jù)向NovozymesA/S,Denmark要求而獲得，所述文件夾通過引用并入本文。木糖/葡萄糖異構(gòu)酶測定法(IGIU)1IGIU是在標(biāo)準(zhǔn)分析條件下以l微摩爾/分鐘的起始速率將葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖的酶量。標(biāo)準(zhǔn)條件葡萄糖濃度pH:溫度Mg2+濃度Ca2+濃度活化劑，S02濃度緩沖液，Na2C03濃度45%w/w7,560。C99mg/1(1.0g/1MgS04*7H20)<2ppm100ppm(0.18g/1Na2S205)2mMNa2C03蛋白酶活性蛋白酶測定方法(LAPU)1亮氨酸氨基肽酶單位(LAPU)是在以下條件下每分鐘分解1pM底物的酶量26mM作為底物的L-亮氨酸-對-硝基?；桨?，0.1MTris緩沖液(pH8.0)，37°C,IO分鐘反應(yīng)時(shí)間。LAPU描述在可根據(jù)向NovozymesA/S,Denmark要求而獲得的EB-SM-0298,02/01中。蛋白酶測定方法-AU(RH)可以用變性血紅蛋白作為底物來確定蛋白水解活性。在用于確定蛋白水解活性的Anson-Hemoglobin方法中，消化變性的血紅蛋白，并用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血紅蛋白。用酚試劑確定TCA可溶產(chǎn)物的量，所述酚試劑與酪氨酸和色氨酸顯藍(lán)色一個(gè)Anson單位(AU(RH))定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件(即25°C、pH5.5和10分鐘反應(yīng)時(shí)間)下以起始速率消化血紅蛋白，使得每分鐘釋放一定量的TCA可溶產(chǎn)物的酶量，所述可溶產(chǎn)物與酚試劑給出與一毫當(dāng)量(mmiequivaknt)酪氨酸相同的顏色。AU(RH)描述在可根據(jù)向NovozymesA/S,Denmark要求而獲得的EAL-SM-0350中。產(chǎn)麥芽糖淀粉酶活性(MANU)的確定一個(gè)MANU(產(chǎn)麥芽糖淀粉酶Novo單位)可以定義為在底物麥芽三4唐(SigmaM8378)濃度為10mg/ml的0.1M檸檬酸鹽緩沖液，pH5.0、在37°C下30分鐘的條件下，每分鐘釋放一微摩爾麥芽糖所需的酶量。酵母千重的測量通過直接稱量干酵母細(xì)胞粒子確定REDSTAR的干重。通過在600nm用分光光度計(jì)測量細(xì)胞的光密度(OD)，使用OD與干細(xì)胞重量的預(yù)定關(guān)聯(lián)確定RWB218的千重。IOD與0.26g/L干細(xì)胞相關(guān)聯(lián)。實(shí)施例41實(shí)施例1高細(xì)胞計(jì)數(shù)的乙醇產(chǎn)生通過在各種起始酵母細(xì)胞濃度下將過濾的經(jīng)預(yù)處理的玉米秸(PCS)酶水解物接種來測試高酵母投料(yeastpitch)(細(xì)胞計(jì)數(shù))和細(xì)胞再循環(huán)對乙醇產(chǎn)生的影響。在發(fā)酵開始后24和48小時(shí)時(shí)，通過離心使細(xì)胞再循環(huán)，除去用過的(spent)水解物，并加入新鮮的水解物。方法使用20%(w/w)的起始可溶固體濃度和10mg纖維素酶制備物A/g纖維素在5(TC將未洗滌的PCS(酸催化的、蒸汽爆炸的，TheNationalRenewableEnergyLaboratory,Golden,CO)水解72小時(shí)。在水解后，將漿;扦在3000印m下離心10分鐘，使用0.45微米Whatman過濾器通過過濾收集上清液。向24孑L細(xì)胞培養(yǎng)板(WhatmanInternationalLtd.,FlorhamPark,NJ)的孑L中加入范圍為1g干細(xì)胞/L至50g干細(xì)胞/L的變化量的REDSTAR酵母。向每個(gè)孔加入4mLPCS酶水解物，pH5.0，并以溫和的攪動使細(xì)月包重懸。將該板密封并在干空氣溫育器中在32。C以150rpm振蕩進(jìn)行溫育。在0、4、8和24小時(shí)時(shí)收集樣品用于乙醇測定。將酶-偶聯(lián)的微滴定板測定法用于乙醇定量(來自DiagnosticChemicalsLtd.,PrinceEdwardIsland,Canada的i式劑)。在24小時(shí)后，通過在3000rpm離心12分鐘收集細(xì)胞，并丟棄上清液。接著，向每個(gè)孔加入4mL新鮮的PCS水解物，并用玻璃攪拌棒使酵母細(xì)胞重懸。立即收集樣品并在32。C下再次24小時(shí)溫育后收集樣品，在該時(shí)間后將發(fā)酵板再離心并丟棄上清液。再次向每個(gè)孔加入4mL新鮮的PCS水解物，并重懸細(xì)胞。立即收集樣品并在第三天的發(fā)酵過程中在4、8和24小時(shí)時(shí)收集樣品。在起始后72小時(shí)結(jié)束發(fā)酵，并從每個(gè)孔取樣用于標(biāo)準(zhǔn)HPLC分析。表1隨時(shí)間的乙醇濃度(g/L)作為酵母細(xì)胞投料和細(xì)胞再循環(huán)的函數(shù)時(shí)間，酵母投料，g干細(xì)胞/L小時(shí)1三102030405001.81.81.81.81.81.81.841.73.69.018.129.335.533.881.78.014.134.635,840.941.9241318.830.631.732.735.338,042<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>實(shí)施例2低細(xì)胞計(jì)數(shù)的乙醇產(chǎn)生測試各種量的糖溶液和過濾的經(jīng)預(yù)處理的玉米秸(PCS)酶水解物對以不同的酵母菌^M々分批發(fā)酵乙醇產(chǎn)生的影響。結(jié)果總結(jié)在圖i中。方法使十種不同的培養(yǎng)基通過REDSTARTm酵母和RWB218(Nedalco)分批發(fā)酵以產(chǎn)生乙醇。培養(yǎng)基1至5為補(bǔ)充有0.5%(w/v)酵母提取物和1%(w/v)胨的葡萄糖和木糖溶液。培養(yǎng)基6至10為具有不同水平的總固體的過濾的未洗滌的經(jīng)預(yù)處理的玉米秸(fowPCS)酶水解物。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基5至9的糖水平以使木糖和葡萄糖濃度等價(jià)于在20%總固體的fliwPCS水解物中得到的濃度以測試菌林對不同水平的抑制的抗性。所有培養(yǎng)基是過濾除菌的。培養(yǎng)基1:僅40g/L的木糖培養(yǎng)基2:僅40g/L的葡萄糖培養(yǎng)基3:木糖20g/L和葡萄糖20g/L(低劑量)培養(yǎng)基4:木糖60g/L和葡萄糖80g/L(高劑量)培養(yǎng)基5:在木糖40g/L和葡萄糖75g/L中的0%TS的fowPCS培養(yǎng)基6:在木糖40g/L和葡萄糖75g/L中的1%TS的fliwPCS培養(yǎng)基7:在木糖40g/L和葡萄糖75g/L中的5°/。TS的fowPCS培養(yǎng)基8:在木糖40g/L和葡萄糖75g/L中的10%TS的fiiwPCS培養(yǎng)基9:在木糖40g/L和葡萄糖75g/L中的15°/。TS的fUwPCS培養(yǎng)基10:在木糖40g/L和葡萄糖75g/L中的20%TS的fuwPCS將未洗滌的PCS(酸催化的、蒸汽爆炸的，TheNationalRenewableEnergyLaboratory,Golden,CO)用水稀釋并用NaOH調(diào)節(jié)至pH5.0。在水解前還加入青霉素、檸檬酸鹽緩沖液和YP培養(yǎng)基(0.5。/。(w/v)酵母提取物和l%(w/v)胨)。將樣品用纖維素酶制備物A在20%(w/w)的總固體濃度下在50"C水解96小時(shí)。在水解后，將漿料在3000rpm離心IO分鐘，并將pH5.0的上清液通過無菌過濾收集并用于發(fā)酵。在高壓滅菌的20ml小瓶(minivial)中在30。C進(jìn)行發(fā)酵96小時(shí)。在如上列出的十種發(fā)酵培養(yǎng)基中測試兩種酵母。所有測試一式三份地進(jìn)行。將預(yù)培養(yǎng)物接種到具有約0.25g/L的起始細(xì)胞密度的包含在20ml小瓶中的5ml發(fā)酵培養(yǎng)基中。然后將小瓶在振蕩器中在150rpm溫育4天。在發(fā)酵結(jié)尾取樣以通過HPLC測量乙醇、葡萄糖、木糖、乙酸和甘油水平。HPLC準(zhǔn)備由以下組成通過加入40%H2S04(1%v/v添加)停止反應(yīng)、離心和通過0.20微米過濾器過濾。在4。C下儲存樣品直到分析。使用與RI檢測器偶聯(lián)的Agilent1100HPLC系統(tǒng)。分離柱為來自BioRad的aminexHPX-87H離子排阻柱(300mmx7.8醒)。實(shí)施例3高細(xì)胞計(jì)數(shù)的乙醇產(chǎn)生通過在各種起始酵母細(xì)胞濃度下將過濾的經(jīng)預(yù)處理的玉米秸(PCS)酶水解物接種來測試高REDSTAR酵母投料(細(xì)胞計(jì)數(shù))對分批發(fā)酵乙醇產(chǎn)生的影響。結(jié)果總結(jié)在圖2中。方法使用20%(w/w)的起始固體濃度和50mg纖維素酶制備物A/g纖維素在50°C、pH5.0將未洗滌的PCS(來自TheNationalRenewableEnergyLaboratory,Golden,CO的酸催化的、預(yù)處理的玉米秸)水解120小時(shí)。在水解后，使用Beckman-Coulter臺面離心機(jī)將漿料在3000rpm離心10分鐘以分離固體。向所得液體水解物補(bǔ)充營養(yǎng)物各自5g/L水平的酵母提取物和胨，并使用振蕩溫育器在150rpm在32°C的溫度和pH5.0在具有150mL工作容積的250mLnalgene瓶中通過從20g/L至90g/L改變r(jià)edstar干酵母的起始酵母細(xì)胞濃度進(jìn)行發(fā)酵。將樣品在3、7和24小時(shí)時(shí)收集并使用HPLC分析葡萄糖消耗和乙醇產(chǎn)生。實(shí)施例4高細(xì)胞計(jì)數(shù)的乙醇產(chǎn)生通過在各種起始酵母細(xì)胞濃度下將經(jīng)預(yù)處理的玉米秸(PCS)酶水解物接種來測試高RWB218酵母投料(細(xì)胞計(jì)數(shù))對分批發(fā)酵乙醇產(chǎn)生的影響。結(jié)果總結(jié)在圖3中。方法將未洗滌的PCS(酸催化的、蒸汽爆炸的，TheNationalRenewableEnergyLaboratory,Golden,CO)用水稀釋并用NaOH調(diào)節(jié)至pH5.0。在水解前還加入青霉素和檸檬酸鹽緩沖液。用纖維素酶制備物A在23%(w/w)的總固體濃度下在50。C將樣品水解96小時(shí)。在水解后，將漿一+在3000rpm離心15分鐘，并收集上清液。在發(fā)酵前，向上清液補(bǔ)充0.5。/。酵母提取物(w/v)和0.5%(w/v)胨，并用NH40H調(diào)節(jié)至pH6.0。加入一定量的水以使水解物的最終總固體濃度為20%(w/w)。在125ml燒瓶中在3(TC進(jìn)行發(fā)酵。各燒瓶包含50ml上述水解物液體，并用RWB218以2、5、10、20、40和60g細(xì)胞/升的初始細(xì)胞密度進(jìn)行接種。將燒瓶在振蕩器中在150rpm溫育24小時(shí)。在發(fā)酵的0、2、4、6、8、10、12、22和24小時(shí)取樣以通過HPLC測量乙醇、葡萄糖、木糖、乙酸和甘油水平。HPLC準(zhǔn)備由以下組成通過加入40%H2S04(1%v/v添加)停止反應(yīng)、離心和通過0.20微米過濾器過濾。在4。C儲存樣品直到分析。使用與RI檢測器偶聯(lián)的Agilent1100HPLC系統(tǒng)。分離柱為來自BioRadTM的aminexHPX-87H離子排阻柱(300mmx7.8mm)。實(shí)施例5再循環(huán)的高細(xì)胞計(jì)數(shù)的乙醇產(chǎn)生通過在40g/L的起始酵母細(xì)胞濃度下將過濾的經(jīng)預(yù)處理的玉米秸(PCS)酶水解物接種來測試高REDSTARTM酵母投料(細(xì)胞計(jì)數(shù))和在pH5的細(xì)胞再循環(huán)對分批發(fā)酵乙醇產(chǎn)生的影響。在發(fā)酵開始后24和48小時(shí)時(shí)，通過離心將細(xì)胞再循環(huán)，除去用過的水解物并加入新鮮的水解物。結(jié)果總結(jié)在圖4中。方法45使用20。/。(w/w)的起始固體濃度和50mg纖維素酶制備物A/g纖維素在5CTC、pH5.0將未洗滌的PCS(來自TheNationalRenewableEnergyLaboratory,Golden,CO的酸催化的、預(yù)處理的玉米秸)水解120小時(shí)。在水解后，使用Beckman-Coulter臺面離心機(jī)將漿料在3000rpm離心10分鐘以分離固體。向所得液體水解物補(bǔ)充營養(yǎng)物各自5g/L水平的酵母提取物和胨，并使用振蕩溫育器在150rpm在32。C的溫度和pH5.0在具有150mL工作容積的250mLnalgene瓶中在40g/L的起始酵母細(xì)胞濃度下發(fā)酵24小時(shí)。每24小時(shí)，使用Beckman-Coulter臺面離心機(jī)將包含液體水解物和酵母細(xì)胞的nalgene瓶在3000rpm離心10分鐘。將包含乙醇的發(fā)酵的液體水解物傾析并加入包含營養(yǎng)物的新鮮水解物(150mL容積)，將酵母細(xì)胞在同一nalgene瓶中重懸并如前所述在32'C和150rpm在振蕩溫育器中再溫育。對于每個(gè)發(fā)酵循環(huán)，在3、7和23.5小時(shí)時(shí)收集樣品并使用HPLC分析葡萄糖消耗和乙醇產(chǎn)生。實(shí)施例6再循環(huán)的高細(xì)胞計(jì)數(shù)的乙醇產(chǎn)生通過在40g/L的起始酵母細(xì)胞濃度下將過濾的經(jīng)預(yù)處理的玉米秸(PCS)酶水解物接種來測試高REDSTARTM酵母投料(細(xì)胞計(jì)數(shù))和在pH6下的細(xì)胞再循環(huán)對分批發(fā)酵乙醇產(chǎn)生的影響。在每個(gè)發(fā)酵循環(huán)開始后12小時(shí)時(shí)，通過離心回收細(xì)胞，除去用過的水解物并加入新鮮的水解物。結(jié)果總結(jié)在圖5中。方法使用20%(w/w)的起始固體濃度和50mg纖維素酶制備物A/g纖維素在50°C、pH5.0將未洗滌的PCS(來自TheNationalRenewableEnergyLaboratory,Golden,CO的酸催化的、預(yù)處理的玉米秸)水解120小時(shí)。在水解后，使用Beckman-Coulter臺面離心機(jī)將漿料在!3000rpm離心10分鐘。向所得液體水解物補(bǔ)充營養(yǎng)物各自5g/L水平的酵母提取物和胨，并使用振蕩溫育器在150rpm在32。C的溫度和pH6.0在具有l(wèi)50mL工作容積的250mLnalgene瓶中在40g/L的起始酵母細(xì)胞濃度下發(fā)酵12小時(shí)。使用10%(w/w)氮氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至6.0。每12小時(shí)，使用Beckman-Coulter臺面離心機(jī)將包含液體水解物和酵母細(xì)胞的nalgene瓶在3000rpm離心10分鐘。將包含乙醇的發(fā)酵的液體水解物傾析并加入包含營養(yǎng)物的新鮮水解物(150mL容積)，將酵母細(xì)胞在同一nalgene瓶中重懸并如前所述在32。C和150rpm在振蕩溫育器中再溫育。在每個(gè)發(fā)酵循環(huán)開始后3、7和11.5小時(shí)時(shí)收集樣品，并使用HPLC分析葡萄糖消耗和乙醇產(chǎn)生。在15。/。(w/w)起始固體濃度下在補(bǔ)充有約20g/L葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行相同的試驗(yàn)。將細(xì)胞再循環(huán)八(8)次以進(jìn)行總共九(9)個(gè)發(fā)酵循環(huán)。各發(fā)酵循環(huán)產(chǎn)生約37g/L乙醇，表明即使在9個(gè)發(fā)酵循環(huán)后在再循環(huán)的酵母的發(fā)酵生產(chǎn)力(fermentationproductivity)方面也沒有損失。(數(shù)據(jù)未示出)實(shí)施例7再循環(huán)的高細(xì)胞計(jì)數(shù)的乙醇產(chǎn)生通過在20g/L的酵母細(xì)胞濃度下將離心的、預(yù)處理的玉米秸(PCS)酶水解物接種來測試高RWB218酵母投料(細(xì)胞計(jì)數(shù))和細(xì)胞再循環(huán)對補(bǔ)料分批發(fā)酵乙醇產(chǎn)生的影響。在每個(gè)發(fā)酵循環(huán)開始后24小時(shí)時(shí)，通過離心將細(xì)胞再循環(huán)，除去用過的水解物并加入新鮮的水解物。對于各發(fā)酵循環(huán)的結(jié)果示于圖6a中，且第一個(gè)發(fā)酵循環(huán)的細(xì)節(jié)示于圖6b中。方法將未洗滌的PCS(酸催化的、蒸汽爆炸的，TheNationalRenewableEnergyLaboratory,Golden,CO)用水稀釋并用NaOH調(diào)節(jié)至pH5.0。在水解前還加入青霉素和檸檬酸鹽緩沖液。用纖維素酶制備物A在23%(w/w)的總固體濃度下在50。C將樣品水解96小時(shí)。在水解后，將漿料在3000rpm離心15分鐘，并收集上清液。在發(fā)酵前，向上清液補(bǔ)充0.5。/。(w/v)酵母提取物和0,5。/。(w/v)胨、或0.1。/。(w/v)尿素，并用NH40H調(diào)節(jié)至pH6.0。加入水以使水解物的最終總固體濃度為20%(w/w)。在250mlNalgene瓶中在30。C進(jìn)行發(fā)酵。一瓶起始包含40ml補(bǔ)充有酵母提取物和胨的上述水解物液體，和另一瓶包含40ml補(bǔ)充有尿素的上述水解物液體。將兩瓶用RWB218以20g細(xì)胞/升(基于200ml的總工作容積)的細(xì)胞密度進(jìn)行接種。然后將瓶在振蕩器中在150rpm溫育。在2小時(shí)的發(fā)酵后開始補(bǔ)料與分批相同的水解物液體?？傃a(bǔ)料體積為160ml，和總補(bǔ)料時(shí)間為22至40小時(shí)。在完成補(bǔ)料后，將包含發(fā)酵醪(beer)和酵母細(xì)胞的Nalgene瓶在3000rpm離心15分鐘。傾析160ml包含乙醇的上清液，并將殘留在瓶中的40ml與酵母細(xì)胞充分混合。將該瓶如前所述在振蕩器中在30。C和150rpm再溫育，并用再裝有另外的160ml如之前相同的水解物液體的補(bǔ)料瓶再開始補(bǔ)料。在每個(gè)發(fā)酵循環(huán)的過程中收集樣品以通過HPLC測量乙醇、葡萄糖、木糖、乙酸和甘油水平。HPLC準(zhǔn)備由以下組成通過加入40%H2S04(1%v/v添加)停止反應(yīng)、離心和通過0.20微米過濾器過濾。在4。C儲存樣品直到分析。使用與RI檢測器偶聯(lián)的Agilent1100HPLC系統(tǒng)。分離柱為來自BioRadTM的aminexHPX-87H離子排阻柱(300腿x7.8腿)。實(shí)施例8高細(xì)胞計(jì)數(shù)的乙醇產(chǎn)生通過在各種起始酵母細(xì)胞濃度下將經(jīng)預(yù)處理的玉米秸(PCS)酶水解物接種來測試高RWB218酵母投料(細(xì)胞計(jì)數(shù))對由用各種預(yù)處理方法預(yù)處理的玉米秸(CS)的分批發(fā)酵乙醇產(chǎn)生的影響。結(jié)果總結(jié)在圖7中。方法將未洗滌的自-預(yù)處理的玉米秸和未洗滌的苛性-預(yù)處理的玉米秸(TheNationalRenewableEnergyLaboratory,Golden,CO)用水稀釋并分別用NaOH或H2S04調(diào)節(jié)至pH5.0。在水解前還加入青霉素和檸檬酸鹽緩沖液。用纖維素酶制備物A和SHEARSYMETM在20%(w/w)的總固體濃度下在50'C將樣品水解48小時(shí)。在水解后，將漿料在3000rpm離心15分鐘，并收集上清液。在發(fā)酵前，向上清液補(bǔ)充0.5%(w/v)酵母提取物和0.5%(w/v)胨。在125ml燒瓶中在30。C進(jìn)行發(fā)酵。各燒瓶包含50ml的上述水解物液體，并用RWB218以2、5、10、20和40g細(xì)胞/升的初始細(xì)胞密度進(jìn)行接種。將燒瓶在振蕩器中在150rpm溫育24小時(shí)。在發(fā)酵的0、2、4、6、20和24小時(shí)取樣以通過HPLC測量乙醇、葡萄糖、木糖、乙酸和甘油水平。HPLC準(zhǔn)備由以下組成通過加入40%H2S04(1%v/v添加)停止反應(yīng)、離心和通過0.20微米過濾器過濾。在4。C儲存樣品直到分析。使用與RI檢測器偶聯(lián)的Agilent1100HPLC系統(tǒng)。分離柱為來自BioRadTM的aminexHPX-87H離子排阻柱(300mmx7.8mm)。權(quán)利要求1.從含木質(zhì)纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其中該方法包括i)預(yù)處理含木質(zhì)纖維素材料；ii)使經(jīng)預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料水解；iii)使用發(fā)酵生物體發(fā)酵；其中在以下條件下開始并進(jìn)行發(fā)酵a)發(fā)酵生物體細(xì)胞計(jì)數(shù)在10-250×1010個(gè)細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)；或b)發(fā)酵生物體濃度在2-90g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)。2.權(quán)利要求l的方法，其中在發(fā)酵前或發(fā)酵過程中除去不溶性固體。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中在步驟i)中預(yù)處理含木質(zhì)纖維素材料后除去不溶性固體。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中在步驟ii)中使該經(jīng)預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料水解后除去不溶性固體。5.權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵在20-250x1(T個(gè)細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵生物體細(xì)胞計(jì)數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行。6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵在50-250xTt嚴(yán)個(gè)細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵生物體細(xì)胞計(jì)數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行。7.權(quán)利要求I-6任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵在100-250x101()個(gè)細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵生物體細(xì)胞計(jì)數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行。8.權(quán)利要求l-7任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵在200-250x101()個(gè)細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵生物體細(xì)胞計(jì)數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行。9.權(quán)利要求l-8任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵在3-90g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基范圍內(nèi)的發(fā)酵生物體濃度下進(jìn)行。10.權(quán)利要求l-9任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵在3-50g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基范圍內(nèi)的發(fā)酵生物體濃度下進(jìn)行。11.權(quán)利要求l-10任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵在4-50g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基范圍內(nèi)的發(fā)酵生物體濃度下進(jìn)行。12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵在10-50g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基范圍內(nèi)的發(fā)酵生物體濃度下進(jìn)行。13.權(quán)利要求l-12任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵在10-40g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基范圍內(nèi)的發(fā)酵生物體濃度下進(jìn)行。14.權(quán)利要求l-13任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵在10-30g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基范圍內(nèi)的發(fā)酵生物體濃度下進(jìn)行。15.權(quán)利要求l-14任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵生物體是固定化的。16.權(quán)利要求l-15任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵生物體在發(fā)酵后回收。17.權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵生物體通過將發(fā)酵生物體與發(fā)酵培養(yǎng)基分離而回收。18.權(quán)利要求l的方法，其中所述發(fā)酵生物體在發(fā)酵后回收并再使用。19.權(quán)利要求1的方法，其中所述發(fā)酵生物體在發(fā)酵后與發(fā)酵培養(yǎng)基分離并再使用于權(quán)利要求1的方法中。20.權(quán)利要求16-19任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵生物體通過使用壓濾機(jī)過濾或通過離心從發(fā)酵培養(yǎng)基回收。21.權(quán)利要求l-20任一項(xiàng)的方法，其中所述水解步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)作為SSF、HHF或SHF進(jìn)行。22.權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的方法，其中在水解過程中使用木糖異構(gòu)酶。23.權(quán)利要求l-22任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)酵步驟iii)進(jìn)一步包括a)源自預(yù)處理步驟i)或水解步驟ii)的C6糖的發(fā)酵；b)回收和再循環(huán)C6發(fā)酵生物體；c)使C5糖發(fā)酵；d)回收和再循環(huán)C6發(fā)酵生物體。24.權(quán)利要求l-22任一項(xiàng)的方法，其中所述水解步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)進(jìn)一步包括1)源自預(yù)處理步驟i)的C6糖的同時(shí)水解和發(fā)酵；2)使C5糖發(fā)酵。25.權(quán)利要求l-22任一項(xiàng)的方法，其中所述水解步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)進(jìn)一步包括1)源自預(yù)處理步驟i)的C6糖的同時(shí)水解和發(fā)酵；2)除去不溶性固體；3)使C5糖發(fā)酵；4)回收和再循環(huán)發(fā)酵生物體。26.權(quán)利要求l-22任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵步驟iii)進(jìn)一步包括a)源自預(yù)處理步驟i)或水解步驟ii)的C5和C6糖的同時(shí)發(fā)酵；b)回收和再循環(huán)發(fā)酵生物體。27.權(quán)利要求l-22任一項(xiàng)的方法，其中所述水解步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)進(jìn)一步包括1)源自預(yù)處理步驟i)的C5和C6糖的同時(shí)水解和同時(shí)發(fā)酵。28.權(quán)利要求l-22任一項(xiàng)的方法，其中所述水解步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)進(jìn)一步包括1)源自預(yù)處理步驟i)的C5和C6糖的同時(shí)水解和發(fā)酵；2)回收和再循環(huán)發(fā)酵生物體。29.權(quán)利要求1-28任一項(xiàng)的方法，其中在發(fā)酵或水解前使所述含木質(zhì)纖維素材料解毒。30.權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)的方法，其中所述含木質(zhì)纖維素材料是未解毒的。31.權(quán)利要求1-30任一項(xiàng)的方法，其中所述含木質(zhì)纖維素材料已進(jìn)行化學(xué)、機(jī)械或生物預(yù)處理。32.權(quán)利要求1-31任一項(xiàng)的方法，其中所述含木質(zhì)纖維素材料已通過用一種或多種纖維素酶或半纖維素酶或其組合處理而水解。33.權(quán)利要求32的方法，進(jìn)一步其中在水解過程中存在一種或多種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。34.權(quán)利要求32或33的方法，其中具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽為家族GH61A多肽。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述家族GH61A多肽源自嗜熱子嚢菌屬(T7zermocwcus)的菌才朱。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述嗜熱子嚢菌屬的菌株為桔橙嗜熱子37.權(quán)利要求36的方法，其中所述GH61A多肽為公開在WO2005/074656中的多肽。38.權(quán)利要求34的方法，其中所述家族GH61A多肽源自梭孢殼屬(7Tz/e/av^)的菌抹。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述梭孢殼屬的菌抹為土生梭孢霉40.權(quán)利要求39的方法，其中所述GH61A多肽為公開在WO2005/074656中的多肽。41.權(quán)利要求34的方法，其中所述家族GH61A多肽源自木霉屬(7h'c/20(ie簡af)的菌抹。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述木霉屬的菌抹為里氏木霉(7h'c/zc^wma43.權(quán)利要求42的方法，其中所述GH61A多肽為公開在US2007/0077630中的多肽。44.權(quán)利要求l-43任一項(xiàng)的方法，其中在水解過程中存在一種或多種卩-葡糖苷酶。45.權(quán)利要求44的方法，其中所述(3-葡糖苷酶源自曲霉屬(A/^^7/w)的菌抹。46.權(quán)利要求45的方法，其中所述曲霉屬的菌抹為米曲霉(^sp^^7/ws47.權(quán)利要求44的方法，其中所述P-葡糖苷酶源自木霉屬的菌抹。48.權(quán)利要求47的方法，其中所述木霉屬的菌林為里氏木霉。49.權(quán)利要求1-48任一項(xiàng)的方法，其中用于水解的纖維素酶為源自木霉屬的菌林的纖維素分解制備物。50.權(quán)利要求49的方法，其中所述木霉屬的菌抹為里氏木霉的菌株。51.權(quán)利要求l-50任一項(xiàng)的方法，其中在水解步驟ii)中使用纖維素酶制備物A。52.權(quán)利要求1-51任一項(xiàng)的方法，其中將經(jīng)預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料用選自下組的一種或多種淀粉降解酶進(jìn)一步處理糖-產(chǎn)生酶、a-淀粉酶及其組合。53.權(quán)利要求52的方法，其中所述糖-源產(chǎn)生酶選自下組葡糖淀粉酶、P-淀粉酶、產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、及其兩種或多種的混合物。54.權(quán)利要求l-53任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇。55.權(quán)利要求l-54任一項(xiàng)的方法，其中使用C6或C5發(fā)酵生物體進(jìn)行所述發(fā)酵。56.權(quán)利要求1-55任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵生物體為酵母，優(yōu)選酵母屬(5bcc/z(3ramycas)的菌才朱，寸尤選酉良酒酵母(5"acc/zara附y(tǒng)cecerev/wV2e)。57.權(quán)利要求56的方法，其中所述酵母選自下組釀酒酵母和樹干畢58.權(quán)利要求1-57任一項(xiàng)的方法，其中步驟ii)或步驟iii)在25。C至40匸的溫度進(jìn)行。59.權(quán)利要求58的方法，其中步驟ii)或步驟iii)在29。C至35。C的溫度進(jìn)行。60.權(quán)利要求58的方法，其中步驟ii)或步驟iii)在30。C至34。C的溫度進(jìn)行。61.權(quán)利要求58的方法，其中步驟ii)或步驟iii)在約32。C的溫度進(jìn)行。62.權(quán)利要求l-61任一項(xiàng)的方法，其中在發(fā)酵過程中的pH為3至7。63.權(quán)利要求62的方法，其中在發(fā)酵過程中的pH為4至6。64.權(quán)利要求l-63任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵進(jìn)行1-48小時(shí)。65.權(quán)利要求64的方法，其中所述發(fā)酵進(jìn)行l(wèi)-24小時(shí)。66.權(quán)利要求1-65任一項(xiàng)的方法，其中所述含木質(zhì)纖維素材料源自玉米秸、玉米纖維、硬木、軟木、谷類莖稈、柳枝稷、芒屬、稻殼、城市固體廢物、工業(yè)有機(jī)廢物、辦公紙張、或其混合物。67.權(quán)利要求1-66任一項(xiàng)的方法，其中引入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的所述含木質(zhì)纖維素材料是未洗滌的。68.權(quán)利要求l-67任一項(xiàng)的方法，其中引入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的所述含木質(zhì)纖維素材料是未洗滌的且預(yù)處理的，而且所述含木質(zhì)纖維素材料選自下組玉米秸、玉米穗軸、玉米纖維、木材、柳枝稷、甘蔗渣和谷類莖稈。69.權(quán)利要求l-68任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵是分批發(fā)酵。70.權(quán)利要求l-68任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵是補(bǔ)料分批發(fā)酵。71.權(quán)利要求l-71任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物在發(fā)酵后回收。72.權(quán)利要求1-72任一項(xiàng)的方法，其中在發(fā)酵過程中的pH大于pH5.0。全文摘要本發(fā)明涉及從含木質(zhì)纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括i)預(yù)處理含木質(zhì)纖維素材料；ii)使經(jīng)預(yù)處理的含木質(zhì)纖維素材料水解；iii)使用發(fā)酵生物體發(fā)酵；其中在以下條件下開始并進(jìn)行發(fā)酵a)發(fā)酵生物體細(xì)胞計(jì)數(shù)在10-250×10¹⁰個(gè)細(xì)胞/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)；或b)發(fā)酵生物體濃度在2-90g干重發(fā)酵生物體/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)。文檔編號C12P1/00GK101680004SQ200880021367公開日2010年3月24日申請日期2008年6月27日優(yōu)先權(quán)日2007年6月27日發(fā)明者丹·尼爾森,蘭迪·戴因哈默,吉勒莫·科沃德-凱利,康正芳,普拉尚特·艾耶,馬茲·T·史密斯申請人:諾維信公司