專利名稱：：生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法涉及的序列表本申請含有計算機可讀形式的序列表。此計算機可讀形式在此并入以供參考。本發(fā)明的背景本發(fā)明的領域本發(fā)明涉及在低于磨細的含淀粉材料的起始糊化(gelatinization)溫度的溫度下在葡糖淀粉酶存在下從磨細的含淀粉材料，例如粒狀淀粉生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法。相關技術的描述谷物，谷類或植物的塊莖含有淀粉。該淀粉為顯微顆粒形式，室溫下不溶于水。當加熱含水淀粉漿料時，顆粒膨脹并最終破裂，將淀粉分子分散進溶液中。在該"糊化，，過程期間，粘度顯著增加。由于在典型的工業(yè)加工中固形物水平為大約30-40%,因此淀粉必須磨細(thinned)或"溶解"使其可被處理。該粘度的減d、一般在稱為溶解(liquefaction)的過程中通過酶降解來完成。溶解期間，長鏈淀粉通過a-淀粉酶降解為更小的支鏈和直鏈的葡萄糖單元(糊精)。常規(guī)的酶溶解過程可按三步熱漿料加工進行。漿料加熱到80-85。C之間并加入耐熱a-淀粉酶開始溶解。然后將漿料在105-125。C之間的溫度下噴射蒸煮以完成漿料的糊化，冷卻到60-95。C,且一般來說，再加入a-淀粉酶完成水解。溶解過程一般在5和6之間的pH下進行。磨細并溶解的整體谷物稱為麥芽汁(mash)。在糖化期間，溶解的糊精進一步水解產(chǎn)生低分子糖DPw,可通過發(fā)酵諸如酵母的生物將其代謝。水解一般使用葡糖淀粉酶完成，作為選擇或者除了葡糖淀粉酶外，可使用a-葡糖苷酶和/或酸性a-淀粉酶。完全糖化步驟一般持續(xù)達72小時，然而，共同的僅是在超過5(TC的溫度下進行例如40-90分鐘的預糖化，接著在稱為同時糖化和發(fā)酵(SSF)的過程中在發(fā)酵期間完成4唐化。使用發(fā)酵生物，例如酵母，加入麥芽汁進行發(fā)酵。然后回收發(fā)酵產(chǎn)物。對于乙醇，例如燃料，飲料，或工業(yè)乙醇，一般在大約32。C的溫度下進行發(fā)酵一般35-60小時。當發(fā)酵產(chǎn)物是啤酒時，一般在大約14。C的溫度下進行發(fā)酵一J&達8天。發(fā)酵后，麥芽汁可用作，例如啤酒，或者蒸餾回收乙醇。該乙醇可用作，例如，燃料乙醇，々大料乙醇，和/或工業(yè)乙醇。從上文的討論顯而易見的是常規(guī)方法中的淀粉水解由于在各步驟期間需要不同的溫度因此非常耗能。美國專利號4,316，956提供了將粒狀淀粉轉變成乙醇的發(fā)酵方法。歐洲專利號140410提供了用于淀粉水解的酶組合物。WO2004/081193涉及在發(fā)酵植物材料期間生產(chǎn)高水平乙醇的方法。該方法包括i)制備用于糖化的植物材料，ii)不需蒸煮將制備的植物材料轉變成糖，和iii)發(fā)酵糖。本發(fā)明的目的是提供將磨細的含淀粉材料，例如粒狀淀粉轉化成發(fā)酵產(chǎn)物，例如乙醇的改進方法。本發(fā)明小結本發(fā)明提供了使用葡糖淀粉酶從含淀粉材料生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物而不需糊化所述含淀粉材料的方法。在第一個方面，本發(fā)明提供了從磨細的含淀粉材料生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括(a)用具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的葡糖淀粉酶，或與其至少70%相同的葡糖淀粉酶在低于所述含淀粉材料的起始糊化溫度的溫度下糖化磨細的含淀粉材料，(b)使用發(fā)酵生物發(fā)酵。步驟(a)和(b)可依次或同時進行。優(yōu)選的是，在(a)步驟前制備含有水和磨細的含淀粉材料的漿料。干固形物含量(DS)位于20-55wt,。/o的范圍內(nèi)。為了暴露更多含淀粉材料的表面，可磨細該材料。在一個實施方案中，顆粒大小在0.05-3.0mm之間，或者至少30%的磨細的含淀粉材料可以通過具有0.05至3.0mm篩網(wǎng)的篩子。本發(fā)明的方法可在1到250小時的期間完成。糖化和/或發(fā)酵期間的pH可在3至7之間的范圍內(nèi)。發(fā)酵期間葡萄糖濃度可保持在低于大約3wt-。/。的水平。在一個優(yōu)選的實施方案中，糖化和發(fā)酵同時進行。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，葡糖淀粉酶來自于A/zWa菌林，優(yōu)選^/^/^^//^7菌林。葡糖淀粉酶以0.001至10AGU/gDS的含量存在。在優(yōu)選的實施方案中，還存在酸性a-淀粉酶。酸性a-淀粉酶可以是真菌或細菌a-淀粉酶，優(yōu)選來自于曲霉屬(/1spwg/〃"力菌株，特別是黑曲霉(Am'ger)或米曲霉(Aoo;zae)的真菌a-淀粉酶。酸性a-淀粉酶以0.1至10AFAU/gDS的濃度存在。酸性a-淀粉酶與葡糖淀粉酶之間的比率在0.1至10AGU/AFAU之間。任選發(fā)酵后回收發(fā)酵產(chǎn)物，例如乙醇。在本發(fā)明過程中也可存在其它成份和酶活性。其它酶活性的例子有木聚糖酶，纖維素酶，和植酸酶活性。本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明提供了從含淀粉材料生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物而不需糊化所述含淀粉材料的方法。在一個實施方案中，糖化和發(fā)酵期間僅需要葡糖淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明，無須溶解含淀粉材料的含水漿料可生產(chǎn)所需的發(fā)酵產(chǎn)物，例如乙醇。如果將含淀粉材料的含水漿料加熱到超過糊化溫度，則必須溶解。一般來說，本發(fā)明的方法包括在具有SEQIDNO:2所示序列的葡糖淀粉酶，或其同源物存在下在低于糊化溫度下糖化磨細的含淀粉材料，以產(chǎn)生可被合適的發(fā)酵生物發(fā)酵成所需發(fā)酵產(chǎn)物的糖類。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當使用SEQIDNO:2所示的來自于A/zWa的葡糖淀粉酶從未蒸煮的磨細玉米生產(chǎn)乙醇時，與使用來自黑曲霉或ra/aramycMemer加m7的葡糖淀粉酶的相應方法相比獲得了明顯更高的乙醇產(chǎn)量。在該方法中添加來自黑曲霉的真菌酸性a-淀粉酶(SEQIDNO:3)時，與使用黑曲霉葡糖淀粉酶和來自黑曲霉的真菌酸性a-淀粉酶的相應方法相比效果明顯更高。因此，在第一個方面，本發(fā)明涉及從磨細的含淀粉材料生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包^^舌(a)用具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的葡糖淀粉酶，或者與其至少70%相同的葡糖淀粉酶在低于所述含淀粉材料的起始糊化溫度的溫度下糖化磨細的含淀粉材料，(b)使用發(fā)酵生物發(fā)酵。本發(fā)明方法的步驟(a)和(b)可依次或同時進行。在步驟(a)之前，制備具有20-55wt,。/。含淀粉材料的干固形物，優(yōu)選25-40wt.-。/。干固形物，更優(yōu)選30-35%干固形物的諸如粒狀淀粉的含淀粉材料的漿料。該漿料可包含水和/或生產(chǎn)用水，例如釜餾物(stillage)(逆流)，洗滌水，蒸發(fā)冷凝物或餾出物，蒸餾的側線餾分(stripper)分離用水，或其它發(fā)酵產(chǎn)物工廠生產(chǎn)用水。由于本發(fā)明的方法在低于糊化溫度下進行，因此不會發(fā)生明顯的粘度增加，可按需要使用高水平的釜餾物(stillage)。在一個實施方案中，含水漿料含有從大約1到大約70vol,。/o的釜餾物，優(yōu)選15-60%vol,。/。的釜餾物，特別是從大約30到50vol,。/。的釜餾物。磨細的含淀粉材料可通過將含淀粉材料磨成0.05至3.0mm，優(yōu)選0.1-0.5mm的顆粒大小來制備。進行本發(fā)明的方法后，至少85%,至少86%,至少87%,至少88%，至少89%，至少90%,至少91%,至少92%,至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%,或優(yōu)選至少99%的該含淀粉材料的干固形物轉化成可溶性淀粉水解產(chǎn)物。溫度在30-75。C之間，優(yōu)選在45-60。C之間。在一個優(yōu)選的實施方案中，步驟(a)和(b)以同時糖化和發(fā)酵過程進行。在該優(yōu)選的實施方案中，該方法一4殳在28。C至36°C之間，例如29°C至35°C之間，例如30。C至34°C之間，例如大約32。C的溫度下進行。根據(jù)本發(fā)明，該溫度可在發(fā)酵期間上下調(diào)節(jié)。在一個實施方案中，進行同時糖化和發(fā)酵使得糖水平，例如葡萄糖水平保持在低水平，例如，低于大約3wt.-。/。，優(yōu)選低于大約2wt.-%,更優(yōu)選低于大約lwt,。/。.，甚至更優(yōu)選低于大約0.5%,或甚至更優(yōu)選低于大約0.1wt.-%。該低水平的糖可通過僅僅釆用調(diào)節(jié)酶和發(fā)酵生物的量來實現(xiàn)。本領域的技術人員可容易地測定使用的酶和發(fā)酵生物的量。也可選擇使用的酶和發(fā)酵生物的量以維持麥芽糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的低濃度。例如，麥芽糖水平可維持在低于大約0.5wt.-。/?；虻陀诖蠹s0.2wt,%。8本發(fā)明的方法可在3至7之間，優(yōu)選從3.5至6，或更優(yōu)選從4到5范圍內(nèi)的pH下進行。含淀粉材料根據(jù)本發(fā)明可使用任何合適的含淀粉起始材料，包括粒狀淀粉。起始材料一般根據(jù)所需發(fā)酵產(chǎn)物來選擇。適用于本發(fā)明方法的含淀粉起始材料的例子包括塊莖，根，莖，所有谷物(wholegrains),玉米，穗軸(cobs),小麥，大麥,黑麥，milo，西米(sago)，木薯(cassava)，木薯淀4分(tapioca),高梁，水稻，豌豆，菜豆，或谷類，含糖原材料，例如糖蜜，水果材料，糖，甘蔗或甜菜，馬鈴薯，和含纖維素材料，例如木材或植物殘渣。蠟狀(waxy)和非蠟狀(non-waxy)類型的玉米和大麥都包含在內(nèi)。術語"粒狀淀粉"是指原始未蒸煮的淀粉，即以其在谷類，塊莖或谷物中發(fā)現(xiàn)的天然形式的淀粉。淀粉在植物細胞內(nèi)形成不溶于水的微d、顆粒。當放入冷水中時，淀粉顆?？晌丈倭恳后w并膨脹。在溫度達到50。C至75°C時，膨脹是可逆的。然而，在更高溫度下，開始稱為"糊化，，的不可逆膨脹。需加工的粒狀淀粉可以是高度精煉的淀粉品質(zhì)，優(yōu)選至少90%，至少95%,至少97%或至少99.5%純或者可以是更粗制的含淀粉材料，包括含有諸如胚芽(germ)殘留物和纖維的非淀粉成份的磨細的整體谷物。將諸如完整谷物的原材料磨細以打開該結構并允許進一步加工。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選兩種磨細方法即濕磨和干磨。在干磨中，磨細并使用全部谷粒(kemels)。濕磨可較好地分離胚芽和粉(meal)(淀粉顆粒和蛋白質(zhì))且通常應用于使用淀粉水解產(chǎn)物生產(chǎn)糖漿的情況。干磨和濕磨是淀粉加工領域熟知的且同樣包含在本發(fā)明的方法中。磨細含淀粉材料以暴露更多表面。在一個實施方案中，顆粒大小在0.05至3.0mm之間，或者使得至少30%，優(yōu)選至少50%,更優(yōu)選至少70%,甚至更優(yōu)選至少90%的磨細含淀粉材料可通過具有0.05至3.0mm篩網(wǎng)，優(yōu)選0.1-0.5mm篩網(wǎng)的篩子。術語"起始糊化溫度"是指開始淀粉糊化的最低溫度。在水中加熱的淀粉在50°C至75°C之間開始糊化；準確的糊化溫度取決于特定的淀粉，且技術人員可容易地測定。因此，起始糊化溫度可隨植物種類，植物種類的特定品種以及生長條件而變化。在本發(fā)明上下文中，給定含淀粉材料的起始糊化溫度是使用Gorinstein.S.和Lii.C.,Starch/Starke，Vol.44(12),第461-466頁(1992)所述的方法5%的淀粉顆粒喪失雙折射的溫度。發(fā)酵產(chǎn)物術語"發(fā)酵產(chǎn)物"是指使用發(fā)酵生物通過包括發(fā)酵步驟的方法生產(chǎn)的產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明涉及的發(fā)酵產(chǎn)物包括醇(例如，乙醇，曱醇，丁醇)，有機酸(例如，檸檬酸，乙酸，衣康酸，乳酸，葡萄糖酸)；S同(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；氣體(例如，H2和C02);抗生素(例如，青霉素和四環(huán)素)；酶；維生素(例如，核黃素，B12,(3-胡蘿卜素)；和激素。在一個優(yōu)選的實施方案中，發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇，例如，燃料乙醇；飲料乙醇，即飲用中性酒精；或工業(yè)乙醇或用于消費醇產(chǎn)業(yè)(例如，啤酒或葡萄酒)，乳產(chǎn)業(yè)(例如，發(fā)酵的乳產(chǎn)品)，皮革工業(yè)和煙草工業(yè)的產(chǎn)物。優(yōu)選的啤酒類型包括麥芽酒(ales),濃烈黑啤酒(stouts),黑啤酒(porters),貯陳啤酒(lagers),苦啤酒(bitter)，麥芽酒(maltliquors)，happoushu,高酒精啤酒，低酒精啤酒，低熱量啤酒或淡啤酒(lightbeer)。優(yōu)選使用的發(fā)酵方法包括本領域熟知的乙醇發(fā)酵方法。優(yōu)選的發(fā)酵方法是本領域熟知的厭氧發(fā)酵方法。發(fā)酵生物"發(fā)酵生物"是指適用于發(fā)酵方法且能夠產(chǎn)生所需的發(fā)酵產(chǎn)物的任何生物，包括細菌和真菌生物。特別合適的發(fā)酵生物能夠?qū)⒅T如葡萄糖或麥芽糖的糖類直接或間接發(fā)酵，即轉化成所需發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵生物的例子包括真菌生物，例如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬CSacc/2aramyce"菌抹，且特別是啤酒糖酵母(Sacc/wram3;cescerev/w'ae)。商業(yè)上可獲得的酵母包括，例如，RedStarTM/LesaffreEthanolRed(可從RedStar/Lesaffre,USA獲得)，F(xiàn)ALI(可從Fleischmann，sYeast,adivisionofBumsPhilpFoodInc.,USA獲得)，SUPERSTART(可從Alltech獲得)，GERTSTRAND(可從GertStrandAB，Sweden獲得)和FERMIOL(可從DSMSpecialties獲得)。葡糖淀粉酶術語"葡糖淀粉酶活性"是指葡聚糖1，4-a-葡糖普酶，它水解末端1,4-連接的a-D-葡萄糖殘基，連續(xù)從該鏈的非還原端釋放(3-D-葡萄糖，屬于酶分類EC3.2.1.3。用于本發(fā)明方法的葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列(氨基酸殘基1至561)，或與SEQIDNO:2(氨基酸殘基1至561)至少70%，優(yōu)選至少75%,或至少80%，或至少85%,或90%,或至少95%,至少96%，至少97%,至少98%或甚至至少99%相同的氨基酸序列。該葡糖淀粉酶來源于爿/2e"aro的//，其氨基酸序列可從SPTREMBL:Q12596得到，它與SEQIDNO:2所示的序列幾乎相同，除了相應于SEQIDNO:2的第97位氨基酸殘基的一個氨基酸殘基外，在數(shù)據(jù)庫序列中該殘基為絲氨酸，而在SEQIDNO:2中它是脯氨酸。數(shù)據(jù)庫序列的注解鑒定了氨基酸殘基1-18為信號肽，殘基19-579(即，561個氨基酸殘基)為成熟葡糖淀粉酶，殘基472-482作為葡糖淀粉酶結構域和包含在殘基483-579中的淀粉結合結構域之間的接頭。在一個實施方案中葡糖淀粉酶以0.001至10AGU/gDS，優(yōu)選從0.01至5AGU/gDS,例如大約O.l，0.3，0.5,l或2AGU/gDS,特別是0.1至0.5AGU/gDS或0.02-20AGU/gDS，優(yōu)選0.1-10AGU/gDS的量加入。a-淀粉酶在一個優(yōu)選的實施方案中，可在本發(fā)明方法中加入a-淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明的a-淀粉酶可以是任何來源。優(yōu)選是真菌或細菌來源的a-淀粉酶。在一個優(yōu)選的實施方案中，a-淀粉酶是酸性a-淀粉酶，例如真菌酸性a-淀粉酶或細菌酸性a-淀粉酶。術語"酸性a-淀粉酶"是指以有效量加入的a-淀粉酶(E.C.3.2丄l)在pH從3至7,優(yōu)選從3.5至6,或更優(yōu)選從4-5的范圍內(nèi)具有最佳活性。細菌a-淀粉酶#4居本發(fā)明，細菌a-淀粉酶可來源于芽孢桿菌屬(Ba"7/M)。在一個優(yōu)選的實施方案中，芽孢桿菌屬a-淀粉酶來源于地衣型芽孢桿菌(及/z'c/em/or冊:)，解淀粉芽孢桿菌(及amy/0/f々Me7^c/era),枯草芽孑包桿菌(5.w6"fc)或嗜熱脂肪芽孢桿菌WearoAermop/n7MS)的菌4朱，但是也可以來源于其它芽孢桿菌屬。涉及的a淀粉酶的具體例子包括SEQIDNO:5所示的地衣型芽孢桿菌a-淀粉酶(BLA)，SEQIDNO:6所示的解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶(BAN)，和SEQIDNO:7所示的嗜熱脂肪芽孢桿菌CBflc/〃wWearaAermc^/n'/w)a-淀粉酶(BSG)。在本發(fā)明的一個實施方案中，a-淀粉酶是與本申請SEQIDNO:5,6，或7或WO99/19467中的SEQIDNO:1,2或3所示的任一序列具有至少60%，優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少80%,甚至更優(yōu)選至少90%,例如至少95%,至少96%,至少97%，至少98%或至少99%相同性的相同程度的酶。芽孢桿菌屬a-淀粉酶也可以是變異體和/或雜合體，特別是在WO96/23873,WO96/23874,WO97/41213,WO99/19467,WO00/60059,和WO02/10355(所有文件在此引用以供參考)任一文件中所述的一種。具體涉及的a-淀粉酶變異體在美國專利號6,093,562,6,187,576,和6,297,038(在此引用以供參考)中公開且包括在WO1996/023873，參見例如，第20頁，第1-10行(在此引用以供參考)中公開的具有雙缺失的嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶(BSGa-淀粉酶)變異體，優(yōu)選與WO99/19467(在此引用以供參考)中公開的SEQIDNO:7所述的野生型BSGa-淀粉酶氨基酸序列相比相應于缺失(181-182)的變異體。甚至更優(yōu)選的是芽孢桿菌屬a-淀粉酶，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶，它與本申請SEQIDNO:7和在WO99/19467中公開的SEQIDNO:3所述的野生型BSGa-淀粉酶氨基酸序列相比具有相應于缺失(181-182)的雙缺失且還包含N193F取代(也表示為1181*+G182*+N193F)。a-淀粉酶也可以是麥芽a-淀粉酶。"麥芽a-淀粉酶，，(葡聚糖1，4-a-麥芽水解酶，E.C3.2丄133)能夠?qū)⒅辨湹矸酆椭ф湹矸鬯獬蒩-構型的麥芽糖。嗜熱脂肪芽孢桿菌菌抹NCIB11837的麥芽oc-淀粉酶可從丹麥NovozymesA/S以商品買到。麥芽a-淀粉酶在美國專利號4,598,048,4,604,355和6,162,628中描述，在此引用以供參考。細菌雜合a-淀粉酶具體涉及的雜合a-淀粉酶包含地衣型芽孢桿菌a-淀粉酶445個C-末端氨基酸殘基(SEQIDNO:5所示)和解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶的37個N-末端氨基酸殘基(SEQIDNO:6所示)，且具有下列取代的一個或多個，特別是所有取代12G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用地衣型芽孢桿菌編號)。還優(yōu)選具有一個或多個下列突變(或在其它芽孢桿菌屬oc-淀4分酶主鏈上的相應突變)的變異體H154Y，A181T,N190F，A209V和Q264S和/或位置176和179之間的兩個殘基缺失，優(yōu)選缺失E178和G179(使用WO99/19467中SEQIDNO:5的編號)。細菌a-淀粉酶以本領域熟知的量加入。當以KNU單位測量時(在下文"材料和方法"部分描述)，a-淀粉酶活性優(yōu)選以0.5-5,000NU/gDS的量，以1-500NU/gDS的量，或更優(yōu)選以5-1,000NU/gDS，例如10-100NU/gDS的量存在。真菌a-淀粉酶真菌酸性a-淀粉酶包括來源于曲霉屬(^^^^//^)菌抹的酸性01-淀粉酶，例如米曲霉(^5perg/〃wswjzae)和黑曲霉(J印erg7'〃wsm'ger)a-淀4分酶。優(yōu)選的酸性真菌a-淀粉酶是Fungamyl-樣a-淀粉酶，優(yōu)選來源于米曲霉菌林。在本說明書中，術語"Fungamyl-樣a-淀粉酶"是指與WO96/23874中SEQIDNO:10所示或本申請SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的成熟部分表現(xiàn)出高相同性，即超過70%，超過75%,超過80%,超過85%，超過90%,超過95%，超過96%,超過97%,超過98%，超過99%或甚至100%相同的a-淀4分酶。另一優(yōu)選的酸性a-淀粉酶來源于黑曲霉菌林。在一個優(yōu)選的實施方案中，酸性真菌oc-淀粉酶是在Swiss-prot/TeEMBL數(shù)據(jù)庫中以原始登錄號P56271作為"AMYA—ASPNG"公開且在WO89/01969(實施例3)中有更詳細描述的黑曲霉的淀粉酶。酸性黑曲霉酸性a-淀粉酶也如SEQIDNO:3所示。還包含與SEQIDNO:3具有至少70%相同性，例如至少80%或甚至至少卯％相同性，例如至少95%，96%，97%,98%,或至少99%相同性的所述酸性真菌淀粉酶的變異體。商業(yè)上可獲得的來源于黑曲霉的酸性真菌a-淀粉酶是SP288(可從丹麥NovozymesA/S獲得)。真菌酸性oc-淀粉酶也可以是含有糖結合模塊(module)(CBM)和a-淀粉酶催化結構域的野生型酶(即，非雜合體)，或其變異體。在一個實施方案中，野生型酸性a-淀粉酶來源于A^erg///zAawac/z/菌抹，特別是SEQIDNO:31所示的a-淀粉酶。還包含與SEQIDNO:31具有至少70%相同性，例如至少1380%或甚至至少90%相同性，例如至少95%，至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%相同性的所迷真菌酸性淀粉酶的變異體。真菌雜合體a-淀粉酶在一個優(yōu)選的實施方案中，真菌酸性a-淀粉酶是雜合體a-淀粉酶。真菌雜合體a-淀粉酶的優(yōu)選例子包括在PCT/US2004/020499(Novozymes)中公開的酶，在此引用以供參考。雜合體a-淀粉酶可包含a-淀粉酶催化結構域(CD)和糖結合模塊(CBM)和任選的接頭。本文提及的雜合體酶或遺傳修飾的野生型酶包括含有與包含糖結合模塊(CBM)的氨基酸序列連接(即，共價結合)的a-淀粉酶(EC3.2丄1)的氨基酸序列的種類。含有CBM的雜合體酶，及其制備和純化的詳細說明是本領域已知的[參見，例如WO卯/00609,WO94/24158和WO95/16782，以及Greenwood等，BiotechnologyandBioengineering44(1994)第1295-1305頁]。它們可以通過例如，將至少含有使用或不用接頭連接到編碼目的酶的DNA序列上的編碼糖結合模塊的DNA片斷的DNA構建體轉化進宿主細胞，并培養(yǎng)該轉化的宿主細胞以表達融合基因來制備。所得的重組產(chǎn)物(雜合體酶)-本領域通常稱為"融合蛋白"-可用下列通式描述A-CBM-MR陽X在該通式中，A-CBM是至少含有糖結合模塊(CBM)本身的N-末端或C-末端區(qū)氨基酸序列。MR是中間區(qū)("接頭")，且X是由編碼酶(或其它蛋白質(zhì))的DNA序列編碼的多肽的氨基酸殘基序列，它與CBM連接。組件A可以不存在(因此A-CBM為CBM本身，即除了組成CBM的氨基酸殘基外不含其它氨基酸殘基)或者可以是一個或多個氨基酸殘基的序列(充當CBM本身的末端延伸)。接頭(MR)可以是鍵，或者含有大約2到大約100個碳原子，特別是2到40個碳原子的短連接基團。然而，MR優(yōu)選是從大約2到大約100個氨基酸殘基的序列，更優(yōu)選從2到40個氨基酸殘基，例如從2到15個氨基酸殘基的序列。組件(moiety)X可組成整個雜合體酶的N-末端或者C-末端區(qū)。從上文所述顯而易見的是在所述類型的雜合體酶中CBM可位于雜合體酶的C-末端，N-末端或內(nèi)部。接頭序列可任選的接頭序列可以是任何合適的接頭序列。在優(yōu)選的實施方案中，接頭序列來源于A/ze/^W訴//葡糖淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶或A^wac/nYa-淀粉酶，例如選自黑曲霉葡糖淀粉酶接頭TGGTTTTATPTGSGSVTSTSKTTATASKTSTSTSSTSA(SEQIDNO:8)，AAawac/n7a-淀粉酶接頭TTTTTTAAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSS(SEQIDNO:9)，A/2e/Za葡糖淀粉酶接頭GATSPGGSSGS(SEQIDNO:10)，和PEPT接頭PEPTPEPT(SEQIDNO:ll)的接頭序列。在另一優(yōu)選的實施方案中，雜合體酶具有的接頭序列與SEQIDNO:8，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10,或SEQIDNO:11所示的氨基酸序列在不超過10個位置，不超過9個位置，不超過8個位置，不超過7個位置，不超過6個位置，不超過5個位置，不超過4個位置，不超過3個位置，不超過2個位置，或甚至不超過1個位置上有區(qū)別。糖結合模塊糖結合模塊(CBM),或通常稱為糖結合域(CBD),是優(yōu)先與多糖或寡糖(糖類)，通常(但不是必須唯一地)與其不溶于水(包括結晶)的形式結合的多肽氨基酸序列。來源于淀粉降解酶的CBMs通常稱為淀粉結合模塊或SBMs(存在于某些淀粉降解酶，例如某些葡糖淀粉酶，或諸如環(huán)糊精葡聚糖轉移酶的酶中，或a-淀粉酶中的CBMs)。同樣，CBMs的其它亞類可包含，例如，纖維素結合模塊(纖維素降解酶的CBMs),幾丁質(zhì)結合模塊(一般存在于幾丁質(zhì)酶中的CBMs)，木聚糖結合模塊(一般存在于木聚糖酶中的CBMs)，甘露聚糖結合模塊(一般存在于甘露聚糖酶中的CBMs)。SBMs通常稱為SBDs(淀粉結合域)。CBMs作為由2個或多個多肽氨基酸序列區(qū)組成的大型多肽或蛋白質(zhì)的完整(integral)部分被發(fā)現(xiàn)，特別是在一般包含含有底物水解活性位點的催化模塊和結合所述糖類底物的糖類結合模塊(CBM)的水解性酶(水解酶)中。該酶可包含一個以上的催化模塊和1個，2個或3個CBMs,且任選還包含一個或多個連接CBM(s)與催化模塊的多肽氨基酸序列區(qū)，后一類型的區(qū)域通常稱為"接頭"。含有CBM的水解酶的例子(其中一些已經(jīng)在上文中提到)有纖維素酶，木聚糖酶，甘露聚糖酶，阿拉伯糖呋喃糖苷酶，乙酰酯酶和幾丁質(zhì)酶。CBMs已經(jīng)在藻類中發(fā)現(xiàn)，例如在紅藻A^p/y;ra非水解性多糖結合蛋白的形式發(fā)現(xiàn)。在存在CBMs的蛋白質(zhì)/多肽(例如，酶，一般是水解酶)中，CBM可位于N或C末端或在內(nèi)部位置。組成CBM本身的多肽或蛋白質(zhì)(例如，水解酶)的該部分一般由超過大約30個且低于大約250個的氨基酸殘基組成。"家族20的糖類結合模塊"或CBM-20模塊在本發(fā)明上下文中定義為與Joergensen等(1997)在Biotechnol丄ett19:1027-1031的圖1中公開的多肽的糖類結合模塊(CBM)具有至少45%相同性的大約100個氨基酸的序列。CBM包含該多肽的最后102個氨基酸，即從氨基酸582到氨基酸683的子序列。本說明書中使用的糖苷水解酶家族的編號按照Coutinho,P.M.&Henrissat,B.(1999)C4Z_y-Car6o/y^/rafe-^"/ve五wz戸esserver,見URL:afmb.cnrs-mrs.fr/cazy/CAZY/index.html或任選Coutinho,P.M.&Henrissat,B.1999;"纖維素酶和其它糖類活性酶的模塊結構綜合數(shù)據(jù)庫研究"的概念。參見"Gew"/cs'歷oc/ze/m.Wry朋d五co/ogyo/Ce〃w/o化Z)eg/W加.o"，，,K.Ohmiya,K.Hayashi，K.Sakka,Y.Kobayashi,S.Karita禾口T.Kimura編，UniPublishersCo.，Tokyo，第15-23頁，和Boume，Y.&Henrissat,B.2001:糖苷水解酶和糖基轉移酶家族和功能4莫塊，Cw廳eWQp/m'o"z>所o/ogv11:593-600。適用于本發(fā)明上下文的包含CBM的酶的例子是a-淀粉酶，麥芽a-淀粉酶，纖維素酶，木聚糖酶，甘露聚糖酶，阿拉伯糖呋喃糖苷酶，乙酰酯酶和幾丁質(zhì)酶。與本發(fā)明相關的感興趣的其它CBMs包括來自葡糖淀粉酶(EC3.2丄3)或來自CGTases(EC2.4.1.19)的CBMs。來源于真菌，細菌或植物來源的CBMs—般適用于本發(fā)明上下文。優(yōu)選的是真菌來源的CBMs,更優(yōu)選來自曲霉屬種類，芽孢桿菌屬種類，克雷白氏桿菌屬種類(K/eZwW/asp,),或根霉菌屬種類(i/n'zopwsp.)。與此相關，適合于分離相關基因的技術是本領域熟知的。本發(fā)明優(yōu)選的是糖結合模塊家族20的CBMs。適合于本發(fā)明的糖結合模塊家族20的CBMs可來源于泡盛曲霉G^pwg"/wmwmon')(SWISSPROTQ12537),Aperg/〃ws^wac/n7(SWISSPROTP23176),黑曲霉(SWISSPROTP04064)，米曲霉0S『/SS尸i(9rP36914)的葡糖淀粉酶，來源于A;ergz7/wfewac/2//(EMBL:#AB008370),構巢曲霉(y^/erg"/iwmWw/a""(NCBIAAF17100.1)的a-淀粉酶，來源于蠟樣芽孢桿菌(^^〃wcerew力的(3-淀粉酶(SWISSPROTP36924),或來源于環(huán)狀芽孢桿菌(5ac/〃wsc^cw/a"力的CGTases(SWISSPROTP43379)。優(yōu)選的是來源于Apergz'〃wAawac/^'a-淀粉酶(EMBL:弁AB008370)的CBM以及與A^wg/〃wAawac/Ya-淀4分酶(EMBL^AB008370)的CBM具有至少50%，至少60%，至少70%,至少80%,至少卯％,至少95，至少96%，至少97%,至少98%或甚至至少99%相同性的CBMs,即與SEQIDNO:12的氨基酸序列具有至少50%，60%,70%，80%，95%,96%，97%，98%或甚至至少99%相同性的CBM。本發(fā)明還優(yōu)選具有SEQIDNO:14(Bac"/w/Zavo^enni^CBM),SEQIDNO:15(芽孢桿菌屬種類的CBM),和SEQIDNO:1604/ca/z;p/7/cBa"7/wsCBM)所示的氨基酸序列并在國際申請PCT/DK2004/000456中分別作為SEQIDNO:1，SEQIDNO:2和SEQIDNO:3公開的糖結合才莫塊家族20的CBMs。其它優(yōu)選的CBMs包4舌來自//ormocom'ssp.,例^口來自//orwocom'srew'wae(Syn.Creosote真菌或Jmorp/zoAecams7'"ae)的葡糖淀粉酶CBMs,例如SWISSPROT:003045(SEQIDNO:17)的CBM，來自￡e""m//asp.,例如來自Ze""艦/aWo^fey(香菇)的CBM，例如SPTREMBL:Q9P4C5(SEQIDNO:18)的CBM,來自鏈孑包零屬種類(7Vez/ra^on3sp.)，例^口來自7Vew,as^on3cnxwa的CBM,例如SWISSPROT:P14804(SEQIDNO:19)的CBM，來自7^/"ra/wjce51sp.，仿H口來自T^/aromyces^Kwoc/z/amjv^/o/fifes的CBM,仿H口NN005220(SEQIDNO:20)的CBM,來自Geasm"/zz'asp.，例如來自Geas/m說/aqy/z'"c/ra^ora的CBM，例如NN48286(SEQIDNO:21)的CBM,來自Scor,cwsp.，例如來自Scon.ass戸gz'謂的CBM，例如NN007096(SEQIDNO:22)的CBM,來自五wpem'"'〃z'wmsp.，"f列長口來自五w/em'c/〃/wm/wdw/g7'/的CBM,例如NN005968(SEQIDNO:23)的CBM，來自曲霉屬種類，例如來自A;erg"/w力pom'c^的CBM,例如NN001136(SEQIDNO:24)的CBM，來自青霉屬種類(戶ew'c;'〃&msp.),例3口來自尸ew'c/〃/wmcf.mf'C2ym"/b7的CBM，例如NN48691(SEQIDNO:25)的CBM，來自Mzl青霉屬種類的CBM，例如NN48690(SEQIDNO:26)的CBM,來自r/7"a"c^/20msp.的CBM，例如NN48711(SEQIDNO:27)的CBM,和來自//"w/co/asp.,例如來自//wm'co/agn."a^ewzo^fea的CBM,例如SPTREMBL:Q12623(SEQIDNO:28)的CBM。最優(yōu)選的CBMs包括來自曲霉屬種類，例如來自黑曲霉的葡糖淀粉酶的CBMs，例如SEQIDNO:29,和來自sp.,例如來自j歸a的CBMs，例如SEQIDNO:30。優(yōu)選的雜合體酶包含與SEQIDNO:13，SEQIDNO:1410,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,SEQIDNO:18,SEQIDNO:19,SEQIDNO:20,SEQIDNO:21，SEQIDNO:22,SEQIDNO:23，SEQIDNO:24，SEQIDNO:25,SEQIDNO:26，SEQIDNO:27，SEQIDNO:28,SEQIDNO:29或SEQIDNO:30所示的任一氨基酸序列具有至少50%，至少60%,至少70%,至少80%,至少90%，至少95%,至少96%,至少97%,至少98%或甚至至少99%相同性的CBM序列。在另一優(yōu)選的實施方案中，CBM序列具有與SEQIDNO:13，SEQIDNO:1410，SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,SEQIDNO:18，SEQIDNO:19，SEQIDNO:20,SEQIDNO:21,SEQIDNO:22,SEQIDNO:23，SEQIDNO:24，SEQIDNO:25,SEQIDNO:26,SEQIDNO:27,SEQIDNO:28,SEQIDNO:29或SEQIDNO:30所示的氨基酸序列在不超過10個氨基酸位置，不超過9個位置，不超過8個位置，不超過7個位置，不超過6個位置，不超過5個位置，不超過4個位置，不超過3個位置，不超過2個位置，或甚至不超過1個位置上有區(qū)別的氨基酸序列。在最優(yōu)選的實施方案中，該雜合體酶包含來自于葡糖淀粉酶，例如來自于美國專利號4,727,026所述的Aro//w7AHU9627葡糖淀粉酶的CBM。其它合適的糖結合模塊家族20的CBMs可參見URL:afmb.cnrs-mrs.fr/cazY/CAZY/index.html)。一旦鑒定了編碼底物結合(糖結合)區(qū)的核苷酸序列，不論是cDNA還是染色體DNA,隨后可用各種方式對其進行操作以便將它融合到編碼目的酶的DNA序列上。然后將編碼糖結合氨基酸序列的DNA片斷和編碼目的酶的DNA使用或不用接頭連接。然后可用各種方法操作所得的連接DNA以冗成表達。雜合體中的催化結構域適合于用作本發(fā)明上下文中使用的CBM/淀粉酶雜合體類型基礎的a-淀粉酶(特別是酸性a-淀粉酶)包括真菌來源的酶。優(yōu)選的例子是上文在"真菌a-淀粉酶"部分所述的酶，它包括.SEQIDNO:3所示的來源于黑曲霉的或SEQIDNO:4所示的米曲霉的酸性a-淀粉酶。甚至更優(yōu)選這樣的實施方案，其中該雜合體酶包含來源于米曲霉酸性a-淀粉酶(FungamylTM，SEQIDNO:4)的oc-淀粉酶序列，和/或來源于Afewflc/7/z'a-淀粉酶(SEQIDNO:9)或A葡糖淀4分酶(SEQIDNO:10)的接頭序列，和/或來源于Ay^wc/z"a-淀粉酶(SEQIDNO:13)或A葡糖淀粉酶(SEQIDNO:30)的CBM。還優(yōu)選這樣的實施方案，其中該雜合體酶包含具有SEQIDNO:3所示序列的來源于黑曲霉酸性a-淀粉酶(SP288)催化模塊的a-淀粉酶序列，和/或來源于AytawacWa-淀粉酶(SEQIDNO:9)或A葡糖淀粉酶(SEQIDNO:10)的接頭序列，和/或來源于A/tavrac/^'a-淀粉酶(SEQIDNO:12)，Ara//w'/葡糖淀粉酶(SEQIDNO:30)或黑曲霉葡糖淀粉酶(SEQIDNO:29)的CBM。在特別優(yōu)選的實施方案中，該雜合體酶包含具有SEQIDNO:3所示序列的黑曲霉酸性a-淀粉酶(SP288)催化模塊和AA:awac/7"a-淀粉酶接頭(SEQIDNO:9)和CBM(SEQIDNO:12)。在一個具體實施方案中，該雜合體酵是SEQIDNO:33(黑曲霉酸性a-淀粉酶催化結構域-A^w"c/2//cc-淀粉酶接頭-黑曲霉葡糖淀粉酶CBM)，SEQIDNO:35(黑曲霉酸性a-淀粉酶催化結構域-A^wac/"a-淀粉酶接頭-A葡糖淀粉酶CBM)，或SEQIDNO:37(米曲霉酸性a-淀粉酶催化結構域-A^wac/z〃a-淀粉酶接頭-Aa-淀粉酶CBM)，或SEQIDNO:39(黑曲霉酸性a-淀粉酶催化結構域-A葡糖淀粉酶接頭-A葡糖淀粉酶CBM),或SEQIDNO:41(米曲霉酸性a-淀粉酶催化結構域-A葡糖淀粉酶接頭-A葡糖淀粉酶CBM)所示氨基酸序列的成熟部分或由黑曲霉酸性a-淀粉酶催化結構域(SEQIDNO:3)-A^wac/z"a-淀粉酶接頭(SEQIDNO:9)-AAravrac/^'a-淀粉酶CBM(SEQIDNO:13)組成的雜合體或與任一前述氛基酸序列具有至少50%，至少60%,至少70%,至少80%,或甚至至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%相同性的氨基酸序列的雜合體酶。在另一優(yōu)選的實施方案中，該雜合體酶具有與SEQIDNO:33(黑曲霉酸性a-淀粉酶催化結構域-A^wac/z"a-淀粉酶接頭-黑曲霉葡糖淀粉酶CBM)，SEQIDNO:35(黑曲霉酸性a-淀粉酶催化結構域-Az^w"c/^a-淀粉酶接頭-A葡糖淀粉酶CBM)，SEQIDNO:37(米曲霉酸性a-淀粉酶催4匕結構i或-AAawac/z"a-淀4分酶4妄頭-Afewac/z"a-淀4分酶CBM)，或SEQIDNO:39(黑曲霉酸性a-淀粉酶催化結構域-A葡糖淀粉酶接頭-A葡糖淀粉酶CBM)或SEQIDNO:41(米曲霉酸性a-淀粉酶催化結構域-ATO訴//葡糖淀粉酶接頭-A葡糖淀粉酶CBM)所示的氨基酸序列或由黑曲霉酸性a-淀粉酶催化結構域(SEQIDNO:3)-A^wac/n7a-淀粉酶接頭(SEQIDNO:9)-Abwac/z"a-淀粉酶CBM(SEQIDNO:13)組成的雜合體在不超過10個氨基酸位置，不超過9個位置，不超過8個位置，不超過7個位置，不超過6個位置，不超過5個位置，不超過4個位置，不超過3個位置，不超過2個位置，或甚至不超過1個位置上有區(qū)別的氨基酸序列。商品a-淀粉酶產(chǎn)品優(yōu)選的含有a-淀粉酶的商品組合物包括MYCOLASE，來自DSM(GistBrocades),BAN,TERMAMYLSG，F(xiàn)UNGAMYL,LIQUOZYMEX和SANTMSUPER,SANTMEXTRAL(NovozymesA/S)和CLARASEL-40,000,DEX-LO,SPEYMEFRED，SPEZYMEAA,和SPEZYMEDELTAAA(GenencorInt.),和以商品名SP288銷售的酸性真菌a-淀粉酶(可從NovozymesA/S,Denmark獲得)。根據(jù)本發(fā)明，酸性cc-淀粉酶可按O.l至10AFAU/gDS，優(yōu)選0.10至5AFAU/gDS，特別是0.3至2AFAU/gDS的量加入。葡糖淀粉酶和酸性a-淀粉酶的組合即使根據(jù)本發(fā)明酸性a-淀粉酶的存在不是指令性的，酸性a-淀粉酶和葡糖淀粉酶的活性以0.3到5.0AFAU/AGU之間的比率存在。更優(yōu)選的是酸性a-淀粉酶活性與葡糖淀粉酶活性之間的比率為至少0.35，至少0.40，至少0.50,至少0,60，至少0.7,至少0.8，至少0.9,至少1.0，至少l.l,至少1.2，至少1.3,至少1.4，至少1.5,至少1.6，至少1.7,至少1.8，至少1.85，或甚至至少1.9AFAU/AGU。然而，酸性a-淀粉酶活性與葡糖淀粉酶活性之間的比率優(yōu)選應低于4.5,低于4.0，低于3.5,低于3.0,低于2.5,或甚至低于2.25AFAU/AGU。以AUU/AGI表示，酸性oc-淀粉酶與葡糖淀粉酶的活性優(yōu)選以0.4到6.5AUU/AGI之間的比率存在。更優(yōu)選的是，酸性a-淀粉酶活性與葡糖淀粉酶活性之間的比率為至少0.45,至少0.50，至少0.60,至少0.7，至少0.8，至少0.9,至少1.0，至少1.1,至少1.2,至少1.3，至少1.4，至少1.5，至少1.6,至少1.7，至少1.8，至少1.9,至少2.0,至少2.1，至少2.2，至少2.3，至少2.4，或甚至至少2.5AUU/AGI。然而，酸性a-淀粉酶活性與葡糖淀粉酶活性之間的比率優(yōu)選低于6.0,低于5.5，低于4.5,低于4,0'低于3.5，或甚至低于3.0AUU/AGI。蛋白酶根據(jù)本發(fā)明的方法，在糖化和/或發(fā)酵期間可存在蛋白酶。在一個優(yōu)選的實施方案中，蛋白酶是微生物來源，優(yōu)選是真菌或細菌來源的酸性蛋白酶。合適的蛋白酶包括微生物蛋白酶，例如真菌和細菌蛋白酶。優(yōu)選的蛋白酶是酸性蛋白酶，即，其特征在于在低于pH7的酸性條件下具有水解蛋白質(zhì)的能力的蛋白酶。包含的酸性真菌蛋白酶包括來自曲霉屬，白霉屬(Mwcor)，根霉菌屬(i/z/zopM力,念i朱菌屬(Ca"(iz'(i(3),Cor/o/ws，五"(ic^/z,a，￡>7//zowo//7^*a，7rpex,青霉屬，Sc/era^wand球擬酵母屬(7brw/o/wz'力的真菌蛋白酶。特別包含的蛋白酶來源于黑曲霉(參見，例如，Koaze等,(1964)，Agr.Biol.Chem.Japan,28，216)，爿，廠g,〃w柳'to/(參見，例如，Yoshida,(1954)J.Agr,Chem.Soc.Japan,28,66),泡盛曲霉(Hayashida等，(1977)Agric.Biol.Chem.，42(5),927-933)，Ay;wg"/^acw/ea^s(WO95/02044),或米曲霉，例如pepA蛋白酶；和來自彬'小毛霉菌(Mwcor;us/〃^)或Mwcorm/e/zez'的酸性蛋白酶。還包含中性或堿性蛋白酶，例如來自芽孢桿菌屬菌抹的蛋白酶。本發(fā)明包含的具體蛋白酶來源于解淀粉芽孢桿菌且具有可從SwissprotasAccessionNo.P06832獲得的^歹l)。i￡包*與可從SwissprotasAccessionNo.P06832獲得的氨基酸序列具有至少卯％相同性，例如至少92%,至少95%,至少96%,至少97%，至少98%，或特別是至少99%相同性的蛋白酶。還包含與WO2003/048353中以SEQ.ID.NO:l公開的氨基酸序列具有至少90%相同性，例如至少92%,至少95%，至少96%,至少97%,至少98%,或特別是至少99%相同性的蛋白酶。還包含木瓜蛋白酶樣蛋白酶，例如E.C.3.4.22.*內(nèi)的蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)，例如EC3A22.2(木瓜蛋白酶)，EC3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)(chymopapain),EC3.4.22.7(蘿摩蛋白酶)(asclepain)，EC3.4.22.14(actinidain)，EC3.4.22.15(組織蛋白酶L)(cathepsinL),EC3.4.22.25(甘氨?；鶅?nèi)肽酶)和EC3.4.22.30(caricain)。蛋白酶可按0.1-1000AU/kgdm,優(yōu)選1-100AU/kgDS且最優(yōu)選5-25AU/kgDS的量加入。其它成份在糖化和/或發(fā)酵期間可存在其它成份以提高本發(fā)明方法的效率。例如營養(yǎng)素(例如，發(fā)酵生物的微量營養(yǎng)素)，抗生素，鹽(例如，鋅或鎂鹽)，其它酶，例如植酸酶，纖維素酶，半纖維素酶，外切和內(nèi)切葡聚糖酶，和木聚糖酶。發(fā)酵產(chǎn)物的回收可任選在發(fā)酵后回收諸如乙醇的發(fā)酵產(chǎn)物?？赏ㄟ^例如，蒸餾的任何常規(guī)方式進行回收。圍，因為這些實施方案試圖用于舉例說明本發(fā)明的一些方面。任何等價的實施方案都打算包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實上，除了本文所示和描述的那些外，對本發(fā)明的各種修改對于本領域的技術人員而言從上面的描述將是顯而易見的。該修改也落入所提交的權利要求書的范圍內(nèi)。如有沖突，將核對本說明書，包括定義。本文引用了各種參考文獻，其公開內(nèi)容以其整體引入以供參考。材料和方法葡糖淀粉酶*來源于A/ze//a的葡糖淀粉酶以SEQIDNO:2公開且可從NovozymesA/S獲得。*來源于黑曲霉的葡糖淀粉酶在Boel等，(1984),EMBOJ.3(5)第1097-1102頁中公開且可從NovozymesA/S獲得。的葡糖淀粉酶在WO99/28448中公開且可從NovozymesA/S獲得。*酸性真菌a-淀粉酶來源于黑曲霉，由黑曲霉酸性a-淀粉酶催化結構域(SEQIDNO:3)，As;ergz'〃wAawac/zz7a-淀粉酶接頭(SEQIDNO:9)—A;erg/〃ws^wac///a-淀粉酶CBM(SEQIDNO:13)組成。酵母RedStar，可從RedStar/Lesaffre，USA獲得。同源性/相同性在本發(fā)明上下文中，"同源性"是指兩個氨基酸序列之間的相同性程度。同源性可用本領域已知的計算機程序合適地測定，例如在GCG程序包中提供的GAP(WisconsinPackage,Version8的程序手冊，1994年8月，遺傳學計算機組，575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711)(Needleman,S.B.和Wunsch，C.D.,(1970)，JournalofMolecularBiology,48,443-453)。使用下列設定值用于多肽序列比較GAP產(chǎn)生罰分3.0和GAP延伸罰分O.l。oc-淀粉酶活性(KNU)可使用馬鈴薯淀粉作為底物測定淀粉分解活性。該方法基于酶對修飾的馬鈴薯淀粉的分解，且通過將淀粉/酶溶液的樣品與碘溶液混合進行反應。最初形成黑藍色，但在淀粉分解期間，藍色變?nèi)跚抑饾u變成紅褐色，將它與有色玻璃標準進行比較。一個KiloNovoa淀粉酶單位(KNU)定義為在標準條件(即，在37°C+/-0.05;0.0003MCa2+;和pH5.6)下糊化(dextrinizes)5260mg干淀4分底物MerckAmylum溶液的酶量。更詳細地描述該分析方法的文件EB-SM-0009.02/01可向NovozymesA/S,Denmark要求獲得，該文件在此引用以供參考。23200580008578.0說明書第19/26頁*來源于A/ze//a200580008578.0說明書第19/26頁*來源于A/ze//a的葡糖淀粉酶以SEQIDNO:2公開且可從NovozymesA/S獲得。*來源于黑曲霉的葡糖淀粉酶在Boel等，(1984),EMBOJ.3(5)第1097-1102頁中公開且可從NovozymesA/S獲得。的葡糖淀粉酶在WO99/28448中公開且可從NovozymesA/S獲得。*酸性真菌a-淀粉酶來源于黑曲霉，由黑曲霉酸性a-淀粉酶催化結構域(SEQIDNO:3)，As;ergz'〃wAawac/zz7a-淀粉酶接頭(SEQIDNO:9)—A;erg/〃ws^wac///a-淀粉酶CBM(SEQIDNO:13)組成。酵母RedStar，可從RedStar/Lesaffre，USA獲得。同源性/相同性在本發(fā)明上下文中，"同源性"是指兩個氨基酸序列之間的相同性程度。同源性可用本領域已知的計算機程序合適地測定，例如在GCG程序包中提供的GAP(WisconsinPackage,Version8的程序手冊，1994年8月，遺傳學計算機組，575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711)(Needleman,S.B.和Wunsch，C.D.,(1970)，JournalofMolecularBiology,48,443-453)。使用下列設定值用于多肽序列比較GAP產(chǎn)生罰分3.0和GAP延伸罰分O.l。oc-淀粉酶活性(KNU)可使用馬鈴薯淀粉作為底物測定淀粉分解活性。該方法基于酶對修飾的馬鈴薯酸性a-淀粉酶活性根據(jù)本發(fā)明使用時，任何酸性a-淀粉酶的活性可用AFAU(酸性真菌a-淀粉酶單位)測量。作為選擇，酸性a-淀粉酶的活性可用AAU(酸性a-淀粉酶單位)測量。酸性a-淀粉酶單位(AAU)酸性oc-淀粉酶活性可用AAU(酸性a-淀粉酶單位)測量，它是一個絕對方法。一個酸性淀粉酶單位(AAU)是在標準條件下每小時將1g淀粉(100%干物質(zhì))轉化成在與等于一個顏色參照的已知強度的碘溶液反應后在620nm下具有透光性(transmission)的產(chǎn)物的酶量。標準條件/反應條件底物溶解淀粉，濃度大約20gDS/L.緩沖液檸檬酸鹽，大約0.13M,pH=4.2石典溶液40.176g碘化鉀+0.088g碘/L城市水15°-20°dH(德國硬度)pH:4.2溫育溫度30oC反應時間11分鐘波長620nm酶濃度0.13-0.19AAU/mL酶作用范圍0.13-0.19AAU/mL淀粉應是Lintner淀粉，它是稀薄的煮沸淀粉，在實驗室用作比色指示劑。Lintner淀粉通過用稀鹽酸處理天然淀粉獲得，使其保留遇碘呈藍色的能力。詳細情況參見歐洲專利號140410,其說明書在此引用以供參考。酸性a-淀粉酶活性(AFAU)酸性a-淀粉酶活性以AFAU(酸性真菌oc-淀粉酶單位)測定，它相對于酶標準進行測定。1FAU定義為在下述標準條件下每小時降解5.260mg淀粉干物質(zhì)的酶量。酸性a-淀粉酶，內(nèi)切-a-淀粉酶(l,4-a-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)水解淀粉分子內(nèi)部區(qū)域的a-l,4-糖苷鍵形成具有不同鏈長的糊精和寡糖。與碘形成的顏色強度與淀粉的濃度成正比。淀粉酶活性使用反向比色法測定，因為在特定分析條件下淀粉濃度下降。a-淀粉酶淀粉+碘->糊精+寡糖X=590nm40。，pH2.5藍色/紫羅蘭色1=23秒脫色標準條件/反應條件底物可溶性淀粉，大約0.17g/L緩沖液檸檬酸鹽，大約0.03M硪(I2):0.03g/LCaCl2:1.85mMpH:2.50±0.05溫育溫度40。C反應時間23秒波長590nm酶濃度0.025AFAU/mL酶作用范圍.-0,01-0.04AFAU/mL更詳細地描述該分析方法的文件EB-SM-0259.02/01可向NovozymesA/S,Denmark要求獲得，該文件在此引用以供參考。葡糖淀粉酶活性葡糖淀粉酶活性以AGI單位或淀粉葡糖苷酶單位(AGU)測定。葡糖淀粉酶活性(AGD葡糖淀粉酶(相當于淀粉葡糖苷酶)將淀粉轉化成葡萄糖。這里通過葡萄糖氧化酶方法測定葡萄糖的量用于活性測定。該方法在"美國谷類化學家協(xié)會批準的方法"，第76-ll部分，用葡萄糖氧化酶隨后測量葡萄糖的淀粉-葡糖淀粉酶方法，VoU-2AACC,美國谷類化學家協(xié)會，(2000)，ISBN:1-891127-12-8中描述。一個葡糖淀粉酶單位(AGI)是在該方法的標準條件下每分鐘形成1微摩爾葡萄糖的酶量。標準條件/反應條件底物可溶性淀粉，濃度大約16g干物質(zhì)/L.緩沖液醋酸鹽，大約0.04M，pH=4.3pH:4.3溫育溫度60°C反應時間15分鐘終止反應力卩NaOH至濃度大約0.2g/L(pH~9)酶濃度0.15-0.55AAU/mL.淀粉應是Lintner淀粉，它是稀薄的煮沸淀粉，在實驗室用作比色指示劑。Lintner淀粉通過用稀鹽酸處理天然淀粉獲得，使其保留遇碘呈藍色的能力。葡糖淀粉酶活性(AGU)Novo葡糖淀粉酶單位(AGU)定義為在標準條件37。C，pH4.3，底物麥芽糖23.2mM，緩沖液乙酸鹽0.1M,反應時間5分鐘的標準條件下每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶量。可使用自動分析器系統(tǒng)。將變旋酶加入葡萄糖脫氫酶試劑中使得存在的任何a-D-葡萄糖轉變成P-D-葡萄糖。在上述反應中葡萄糖脫氫酶與(3-D-葡萄糖特異性反應，使用光度計在340nm下測定形成的NADH作為原始葡萄糖濃度的測量值。AMG溫育底物麥芽糖23.2mM緩沖液乙酸鹽0.1MpH:4.30±0.05溫育溫度37QC士1反應時間5分鐘酶作用范圍0.5-4.0AGU/mL顏色反應GlucDH:430U/L變旋酶9U/LNAD:0.21mM緩沖液磷酸鹽0.12M;0.15MNaClpH:7.60±0.05溫育溫度37。C±1反應時間5分鐘波長340腦更詳細地描述該分析方法的文件(EB-SM-0131.02/01)可向NovozymesA/S,Denmark要求獲得，該文件在此引用以供參考。蛋白水解活性(AU)可用變性血紅蛋白作為底物測定蛋白水解活性。在測定蛋白水解活性的Anson-血紅蛋白方法中消化變性血紅蛋白，未消化的血紅蛋白用三氯乙酸(TCA)沉淀。TCA可溶性產(chǎn)物的量用苯酚試劑測定，它與酪氨酸和色氨酸產(chǎn)生藍色。一個Anson單位(AU)定義為在標準條件(即，25。C,pH7.5和10分鐘反應時間)下以這樣的起始速率消化血紅蛋白的酶量，該速率使得每分鐘釋放的TCA可溶性產(chǎn)物量與苯酚試劑產(chǎn)生與1毫克當量(milliequivalent)酪氨酸相同的顏色。更"i,纟田i也4苗述該分才斤方法的文4牛AF4/5可向NovozymesA/S,Denmark要求獲得，該文件在此引用以供參考。實施例1在"一步法"燃料乙醇發(fā)酵中評估A/2e/^ro訴z7葡糖淀粉酶通過小批量發(fā)酵評價葡糖淀粉酶與黑曲霉葡糖淀粉酶和r"/aram少CM葡糖淀粉酶的相對效率。將大約380g磨細的玉米(在小規(guī)模錘頭磨中磨碎并過1.65mm篩)加入大約620g自來水中。向該混合物中添加3mL1g/L青霉素。用40。/。H2S04將該漿料的pH調(diào)節(jié)到5.0。以一式三份測定千固形物(DS)水平為大約32%。將大約5g該漿料加入15mL試管中。每種酶進行兩個劑量的劑量-反應。所用的劑量為0.3和0.6nmol/gDS。每種處理進行6份試驗。確定劑量后，向試管中接種在玉米糊(mash)上生長了22.5小時的0.04mL/g酵母繁殖物(RedStaryeast)的玉米糊。試管用帶有小針孔的螺旋蓋蓋上以允許氣體釋放并在稱量前簡單渦旋并在32°C下培養(yǎng)。進行70小時發(fā)酵并通過稱量該試管測定乙醇產(chǎn)量。稱量前簡單渦旋試管。實驗結果如表l所示。從表1可見，使用A/zWa葡糖淀粉酶與野生型黑曲霉和ra/aromyc^eme^om'/葡糖淀粉酶的產(chǎn)量相比每克DS的乙醇產(chǎn)量明顯更高。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實施例2在"一步法"糖化中評價^/zg/^m訴z7葡糖淀粉酶與酸性真菌oc-淀粉酶的組合將分別用y^/ze/^葡糖淀粉酶單獨和與真菌酸性a-淀粉酶活性(黑曲霉酸性a-淀粉酶與A;e^/〃z^fewac/z//a-淀粉酶淀粉結合域的雜合體)組合在一步法糖化后的葡萄糖濃度與在相同條件和相同劑量水平下用黑曲霉葡糖淀粉酶單獨和與相同真菌酸性a-淀粉酶的組合進行比較。除了不加入酵母和使用的緩沖液控制pH為4.5外，通過與實施例1使用的小規(guī)模發(fā)酵非常相似的小規(guī)模糖化進行該評價。筒單地說，194g磨細的玉米與306g37mMNaOAc,0.025%疊氮化鈉，20mMCaCl2,pH4.5混合產(chǎn)生大約35%DS的漿料。將該漿料的pH用40%H2S04調(diào)節(jié)到4.5(調(diào)節(jié)前的起始pH為大約4.9)。使得該漿料水合，同時在室溫下攪拌1小時。每次反應向20mL小瓶中加入大約5g該漿料。然后在確定劑量(dosing)前將含有玉米漿料的小瓶在32。C下預培養(yǎng)1小時。定量每個小瓶的合適酶量，蓋上蓋并立即渦旋。根據(jù)每瓶中玉米漿料的精確重量確定實際劑量。每個反應以一式三份進行。小瓶在32。C下溫育。4小時后渦旋各小瓶且通過加入50微升40%H2S04終止反應并準備HPLC分析。HPLC準備由離心，和過濾通過0.45微米濾膜組成。等待HPLC分析的樣品在4。C下貯存。表2顯示了糖化4小時后的葡萄糖濃度處理0.263mg/gDS黑曲霉葡糖淀粉酶0.263mg/gDS黑曲霉葡糖淀粉酶十0.034mg/gDS帶有爿5perg/〃wsA:a麗c/2"oc-淀粉酶接頭和CBM的黑曲霉酸性ot-淀粉酶0.263mg/gDS葡糖淀粉酶0.263mg/gDSJAe/Zflro的"葡糖淀粉酶+0.034mg/gDS帶有爿5/e，'〃wAa麗cM294小時葡萄糖(g/L)33.240.445.6a-淀粉酶接頭和CBM的黑曲霉酸性a-淀粉酶糖化后獲得的葡萄糖水平與通過酵母屬酵母發(fā)酵時獲得的乙醇發(fā)酵產(chǎn)量相關。因此，上述結果表明ra拆"葡糖淀粉酶單獨和與真菌酸性a-淀粉酶組合在相同條件下比黑曲霉葡糖淀粉酶單獨和與真菌酸性a-淀粉酶的組合效果更好。權利要求1.從磨細的含淀粉材料生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括(a)用具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列的葡糖淀粉酶，或者與其具有至少70％同一性的葡糖淀粉酶在低于所述含淀粉材料的起始糊化溫度的溫度下糖化磨細的含淀粉材料，(b)使用發(fā)酵生物發(fā)酵。2.權利要求1的方法，其中該方法進行1到250小時的時間，優(yōu)選25到190小時，更優(yōu)選30到180小時，更優(yōu)選40到170小時，甚至更優(yōu)選50到160小時，還更優(yōu)選60到150小時,甚至還更優(yōu)選70到140小時，且最優(yōu)選從80到130小時。3.權利要求1或2的方法，其中該方法在3到7之間，優(yōu)選從3.5到6,或更優(yōu)選4-5的pH范圍內(nèi)進行。4.權利要求1至3任一項的方法，其中干固形物含量(DS)位于20-55wt,%,優(yōu)選25-40wt.-%，更優(yōu)選30-35wt,。/。的范圍內(nèi)。5.權利要求l-4任一項的方法，其中糖化和發(fā)酵期間糖濃度保持在低于大約3wt.。/。的水平。6.權利要求1-5任一項的方法，其中在步驟(a)之前制備包含水和磨細的含淀粉材料的漿料。7.權利要求1-6任一項的方法，其中該磨細的含淀粉材料通過將含淀粉材料磨細成0.1-0.5mm的顆粒大小來制備。8.權利要求1-7任一項的方法，其中該磨細的含淀粉材料是通過干或濕磨獲得的顆粒淀粉。9.權利要求1-8中任一項的方法，其中該磨細的含淀;盼材料是整體谷物。10.權利要求1-9任一項的方法，其中同時進行糖化。11.權利要求10的方法，其中發(fā)酵期間的溫度在28。C到36。C之間，例如在29。C到35°C之間，例如在30°C到34°C之間，例如大約32°C。12.權利要求1-3任一項的方法，其中該葡糖淀粉酶來源于A/ze/z'a13.權利要求1-13中任一項的方法，其中該葡糖淀粉酶以0.001到10AGU/gDS，優(yōu)選從0.01到5AGU/gDS,特別是0.1到0.5AGU/gDS的量存在。14.權利要求1-13任一項的方法，其中存在酸性a-淀粉酶。15.權利要求14的方法，其中該酸性a-淀粉酶是真菌a-淀粉酶，優(yōu)選來源于曲霉屬的菌抹，特別是黑曲霉，米曲霉或泡盛曲霉。16.權利要求15的方法，其中該酸性a-淀粉酶是與SEQIDNO:4具有至少70°/。，優(yōu)選至少75%，80%，85%或至少90%,例如至少95%，至少97%，至少98%，或至少99。/。同一性的氨基酸序列的酸性a-淀粉酶。17.權利要求14-16中任一項的方法，其中該真菌酸性a-淀粉酶是包含oc-淀粉酶催化結構域(CD)和糖結合模塊(CBM)和任選的接頭或野生型真菌酸性a-淀粉酶催化結構域(CD)和糖結合模塊(CBM)和任選的接頭的雜合體酶。18.權利要求17的方法，其中該CBM來源于A/^rg/Z/wsfewac/z//a-淀粉酶，A/ze//a葡糖淀粉酶，或黑曲霉葡糖淀粉酶。19.權利要求17或18的方法，其中該CBM來源于A/ze/z'ara//^葡糖淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶或AAmracto'a-淀粉酶。20.權利要求14的方法，其中該酸性a-淀粉酶是酸性細菌a-淀粉酶。21.權利要求20的方法，其中該酸性a-淀粉酶來源于地衣型芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌的菌林。22.權利要求21的方法，其中該酸性細菌a-淀粉酶來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的菌抹，與SEQIDNO:7所述的野生型氨基酸序列相比具有突變I181*+G182*，優(yōu)選1181*+G182*,+N193F。23.權利要求20的方法，其中該細菌a-淀粉酶是包含SEQIDNO:5所示的地衣型芽孢桿菌a-淀粉酶445個C-末端氨基酸殘基和SEQIDNO:6所示的解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶的37個N-末端氨基酸殘基且具有取代(使用SEQIDNO:5編號)的雜合體a-淀粉酶。24.權利要求20的方法，其中該細菌a-淀粉酶是具有SEQIDNO:5所示的氨基酸序列且具有突變H156Y，A181T,N190F,A209V，Q264S，和/或位置176和179之間的兩個殘基缺失，優(yōu)選缺失E178和G179的a-淀粉酶。25.權利要求14-24中任一項的方法，其中酸性a-淀粉酶以0.1到10AFAU/gDS,優(yōu)選0.10到5AFAU/gDS，特別是0.3到2AFAU/gDS的量存在。26.根據(jù)權利要求14-25任一項的方法，其中酸性a-淀粉酶和葡糖淀粉酶以0.1到10AGU/AFAU，優(yōu)選0.30到5AFAU/AGU，特別是0.5到3AFAU/AGU之間的比率加入。27.權利要求1-26任一項的方法，其中該發(fā)酵產(chǎn)物在發(fā)酵后回收。28.權利要求1-27任一項的方法，其中該發(fā)酵產(chǎn)物是醇，優(yōu)選乙醇，特別是燃料乙醇，飲用乙醇和/或工業(yè)乙醇。29.權利要求1-28任一項的方法，其中該方法在蛋白酶，優(yōu)選酸性蛋白酶，優(yōu)選真菌酸性蛋白酶存在下進行。30.權利要求l-29任一項的方法，其中該含淀粉材料從塊莖，根，莖，果實，種子或整體谷物獲得。31權利要求1-30任一項的方法，其中該含淀粉材料從玉米，穗軸(cobs),小麥，大麥，黑麥，milo，西米，木薯，木薯粉(manioc),木薯淀粉，高梁，稻或馬鈴薯獲得。32.權利要求1-31任一項的方法，其中該含淀粉材料從谷類獲得。33.根據(jù)權利要求1-32任一項的方法，其中步驟(a)期間的溫度從30。C到75。C,優(yōu)選在45到60。C之間。全文摘要本發(fā)明涉及從磨細的含淀粉材料生產(chǎn)諸如乙醇的發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括(a)用具有SEQIDNo2所示的氨基酸序列的葡糖淀粉酶，或者與其至少70％相同的葡糖淀粉酶在低于所述含淀粉材料的起始糊化溫度的溫度下糖化磨細的含淀粉材料，(b)使用發(fā)酵生物發(fā)酵。文檔編號C12N9/24GK101517072SQ200580008578公開日2009年8月26日申請日期2005年1月14日優(yōu)先權日2004年1月16日發(fā)明者亨里克·比斯加德-弗朗曾,凱文·S·溫格,埃里克·阿蘭申請人:諾維信北美公司;諾維信公司