專利名稱：Dna陣列與單核苷酸多態(tài)性的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及DNA陣列與單核苷酸多態(tài)性的檢測方法。進一步詳細講，本發(fā)明涉及能夠更加正確地檢測出單核苷酸多態(tài)性的DNA陣列，和使用了該DNA陣列的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法。

背景技術：
隨著迎來后基因組時代，對正確、高效，進而低成本檢測核苷酸序列中的堿基種類的新技術提出了要求。例如，SNP(Single Nucleotide Polymorphism單核苷酸多態(tài)性)是以約0.1％(約1000個堿基中有1個)的比例存在于人類基因組的頻率最高的多態(tài)性。即，所說的單核苷酸多態(tài)性的意思是，通過基因組基因的單個堿基置換為其他堿基，例如與野生型是G-C堿基對的情況相對，在多態(tài)型中變?yōu)锳-T堿基對的狀態(tài)。另外，存在著二倍體染色體的各自的等位基因為多態(tài)型的情況(純合多態(tài)型)，以及一方為野生型、另一方為多態(tài)型的情況(雜合多態(tài)型)。
這樣的單個堿基的突變有時會導致例如密碼子突變引起的突變氨基酸的合成(錯義突變)、或終止密碼子的生成引起的不完全蛋白質的合成(無義突變)。所以，SNP的有無與各種疾病也有關這一情況逐漸變得明確(例如與肺癌有關的p53基因的SNP非專利文獻1)，以診斷或遺傳治療方法等為目的正確判定SNP的有無(SNP分型)也變得越來越重要。另外，SNP也是探索與疾病罹患性或藥物反應性有關的基因時的有用的多態(tài)性標記，并作為定制治療(テ一ラ一メイド醫(yī)療)的重要的基因信息引起了關注。
作為SNP分型的方法，已知“利用雜交效率的方法”、“利用酶識別效率的方法”、“利用電技術的方法”等，特別是利用雜交效率的方法，對其在DNA陣列(例如參考專利文獻1-4，非專利文獻2、3)方面的適用進行了各種研究，例如非專利文獻4中報告了使用DNA陣列的BRCA1基因SNP的檢測例子。
但是，該SNP檢測用的DNA陣列為，例如，與目的基因的野生型序列互補的第1探針點和與該基因的單核苷酸多態(tài)性序列互補的第2探針點排布于固相基體上。這樣，在進行SNP檢測時，使通過使用熒光標記引物的PCR擴增等手段制備的目的基因cDNA與該DNA陣列接觸。目的基因為野生型時，該標記cDNA與第1探針雜交，只從第1探針點得到熒光信號(純合野生型)。另一方面，目的基因的雙方的等位基因均為SNP時，只從第2探針點得到熒光信號(純合SNP)；一方的等位基因為SNP時，從第1探針點和第2探針點的雙方得到同等程度的熒光信號(雜合SNP)。
專利文獻1美國專利第5,474,796號說明書
專利文獻2美國專利第5,605,662號說明書
專利文獻3國際公開第95/251116號小冊子
專利文獻4國際公開第95/35505號小冊子
非專利文獻1Biros et al.Neoplasma 48(5)407-11，2001
非專利文獻2Schena，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9310614-10619，1996
非專利文獻3Heller，R.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.942150-2155，1997
非專利文獻4Hacia JG et al.Nat.Genet.14441-447，1996

發(fā)明內容
在使用DNA陣列的SNP檢測中，以各自探針點的熒光信號作為指標，區(qū)別野生型、純合SNP、雜合SNP是并不容易的。即，各自來源于野生型基因和多態(tài)型基因的標記cDNA只有一個堿基不同。所以，野生型cDNA的大多數(shù)與與其完全互補的野生型探針(第1探針)雜交，但是一部分還與單個堿基不同的第2探針雜交。同樣地，多態(tài)型cDNA也有一部分與第1探針雜交。因此，利用DNA陣列的SNP檢測是通過比較第1探針點和第2探針點各自的熒光信號而進行的，但是也有兩者的信號強度的比較很困難的情況，其結果存在著進行了錯誤SNP判定的不良情況。
因此，本申請的發(fā)明的課題是提供能夠使SNP檢測更加正確的DNA陣列和使用該DNA陣列的SNP檢測方法。
進一步本申請的發(fā)明的課題是提供，在使用DNA陣列檢測SNP時，確定能夠使檢測更加正確的探針長度的方法，和具有利用該方法確定的特定長度的探針的DNA陣列。
本申請的發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，對于每個作為SNP檢測對象的被檢基因來說，可以得到正確判定SNP形態(tài)的最適標記信號的探針長度是不同的，從而完成了本發(fā)明。
本申請中，作為解決所述課題的第1發(fā)明，提供了用于檢測基因單核苷酸多態(tài)性的DNA陣列，其特征為，在固相基體上具有與基因多核苷酸雜交的序列部分是與基因第1多態(tài)型正確互補的1個以上的探針構成的第1探針點群、以及相同序列部分是與基因第2多態(tài)型正確互補的1個以上的探針構成的第2探針點群，其中，各自構成第1探針點群和第2探針點群的探針點為，每個探針點上的探針的長度不同。
該第1發(fā)明的DNA陣列中，優(yōu)選的方式為，第1探針點群和第2探針點群各自由2～10個探針點構成。
另外，該第1發(fā)明的優(yōu)選的方式為，所述方式中2～10的探針點是按照其探針長度的順序排布的。
本申請中，作為第2發(fā)明提供了，至少含有所述第1發(fā)明的DNA陣列的、用于檢測基因單核苷酸多態(tài)性的試劑盒(kit)。
本申請中，作為第3發(fā)明提供了，使用所述第1發(fā)明的DNA陣列檢測基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征為，包括以下的步驟 (a)由被檢基因制備標記多核苷酸的步驟； (b)使標記多核苷酸與帶有探針的固相基體接觸的步驟； (c)對由與DNA陣列上探針雜交的標記多核苷酸得到的信號進行測定的步驟。
該第3發(fā)明的方法中，進一步優(yōu)選的方式為，將所述步驟(c)中測定的，所述第1探針點群和所述第2探針點群的各自的信號進行比較。
本申請中，作為第4發(fā)明提供了，使用所述第1發(fā)明的DNA陣列，確定用于檢測基因單核苷酸多態(tài)性的適宜的探針長度的方法，其特征為，把滿足以下步驟 (a)由被檢基因制備標記多核苷酸的步驟； (b)使標記多核苷酸與DNA陣列接觸的步驟； (c)測定DNA陣列上的各探針結合的標記多核苷酸的標記信號，和以下標準 (i)當被檢基因為純合第1多態(tài)型時，可在第1探針點群觀察到標記信號， (ii)當被檢基因為純合第2多態(tài)型時，可在第2探針點群觀察到標記信號， (iii)當被檢基因為雜合多態(tài)型時，可在第1探針點群和第2探針點群觀察到同等程度的標記信號， 的探針點的探針長度確定為用于檢測其基因單核苷酸多態(tài)性的適宜的探針長度。
進一步，本申請中，作為第5發(fā)明提供了用于檢測基因單核苷酸多態(tài)性的DNA陣列，其特征為，在固相基體上具有與基因多核苷酸雜交的序列部分是與基因第1多態(tài)型正確互補的1個以上的探針構成的第1探針點、以及相同序列部分是與基因第2多態(tài)型正確互補的1個以上的探針構成的第2探針點，構成第1及第2探針點的探針長度是用所述第4發(fā)明的方法確定的長度。
第1發(fā)明的DNA陣列，具有能夠對各種單核苷酸多態(tài)性更加正確地進行雜交的由各種探針長度構成的探針點。所以，利用使用了該第1發(fā)明的DNA陣列的第3發(fā)明的方法，能夠進行更加正確的SNP檢測。
另外，利用第4發(fā)明的方法，對于作為SNP檢測對象的每個基因，確定適宜的探針長度。接著，利用該方法，提供了含有由適于各基因的探針長度構成的探針點的第5發(fā)明的DNA陣列。
這里，在本申請的發(fā)明中，所說的“單核苷酸多態(tài)性”是指例如具有與基因數(shù)據(jù)庫等中登記的基因序列不同的單個堿基突變的情況。所以，數(shù)據(jù)庫等中登記的基因序列不一定就意味著是野生型(正常型)，另外，具有單個堿基突變的基因也不一定就是突變基因。但是，對于已知的單個堿基突變與疾病有關的基因，可以將“野生型”定義為“正常型”，將單核苷酸多態(tài)性定義為“突變型”。所以，本申請的發(fā)明中所說的基因“第1多態(tài)型”和“第2多態(tài)型”，基本上不是意味著“野生型”和“突變型”，而是定義為以下說明中的，第1多態(tài)型是數(shù)據(jù)庫等中登記的基因序列的形態(tài)，第2多態(tài)型是第1多態(tài)型序列中的單個堿基被其它堿基取代而成的形態(tài)。
本申請的發(fā)明中所說的“基因多核苷酸”，具體是指作為SNP檢測對象的基因的基因組DNA、由基因組DNA轉錄得到的mRNA、或由mRNA合成的cDNA。另外，該多核苷酸為多個核苷酸，優(yōu)選30以上，更優(yōu)選50以上的核苷酸結合形成的分子。
本申請的各發(fā)明的具體構成，在發(fā)明的實施方式說明或實施例中進行了詳細說明。另外，本發(fā)明中的用語或概念，除特別規(guī)定外，均為在本技術領域中通常使用的范圍內。進一步，實施本發(fā)明所使用的各種技術，除特別明示其出處的技術外，均為本領域技術人員基于公知文獻等就能夠容易且確切實施的。例如，基因工程學及分子生物學技術記載于Sambrook and Maniatis，in Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York，1989；Ausubel，F(xiàn).M.et al，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York，N.Y，1995等中。



圖1為表示本發(fā)明的DNA陣列的構成例的模式圖。
圖2為表示本發(fā)明的DNA陣列的其它構成例的模式圖。
圖3為表示使用本發(fā)明的DNA陣列，檢測基因GNB3的SNP的例子的熒光圖象。
圖4為表示使用本發(fā)明的DNA陣列，檢測基因MTHFR的SNP的例子的熒光圖象。
圖5為表示使用本發(fā)明的DNA陣列，檢測基因CYP 2C19-2及CYP2C19-3各自的SNP的例子的熒光圖象。

具體實施例方式 第1發(fā)明的DNA陣列，在固相基體上具有1個以上的探針構成的第1探針點群和同樣由1個以上的探針構成的第2探針點群。構成第1探針點群的各探針為，與作為分析對象的基因多核苷酸雜交的序列部分是與相同基因的第1多態(tài)型正確互補；構成第2探針點群的各探針為，與相同基因多核苷酸雜交的序列部分是與相同基因的第2多態(tài)型正確互補。其中，各自構成第1探針點群和第2探針點群的探針點，由各自長度不同的探針構成。
進一步具體講，所說的“探針點”是，1個以上，優(yōu)選103～1013個相同探針(相同序列、相同長度的探針)的集團與其它探針點分離存在的區(qū)域。所說的“探針點群”的意思是，相同序列、且不同長度的探針構成的探針點的集團。該集團的一個優(yōu)選的方式為，由2～10探針點構成的集團。另外，這些探針點的優(yōu)選的方式為，將構成它們的探針按照長度的順序成列排布。以下，有時將這樣成列排布的探針點群記載為“探針點列”。進一步，第1探針點列和第2探針點列也可以是，由相同探針長度構成的探針點彼此相對。
圖1為第1發(fā)明的DNA陣列的構成例。該第1圖的例子中，第1探針點(黑圈)的列和，第2探針點(白圈)的列，各自由8個探針點構成。另外，各探針點為，各自含有的探針按照長→短的順序成列排布成第1～8段。即，分別構成第1段的第1探針點列和第2探針點列探針為n個核苷酸(nmer)，從以下第2段點的探針開始，依次為n-1mer，n-2mer，n-3mer，n-4mer，n-5mer，n-6mer，n-7mer。這時的“n”為10～100左右，優(yōu)選20～50左右。
“長度的順序”可以是長→短的順序，也可以是短→長的順序。另外，探針長度的不同可以是每差1個堿基的差別，或者也可以是每差2或3個堿基的差別。進一步，該圖1的例子中的第1探針點列和第2探針點列各自的點是縱向(由上至下)排布的，但也可以橫向(由右至左)排布。
又進一步，也可以使相同探針(相同序列、相同長度的探針)構成的探針點2～5個左右成列排布。例如，圖2為，第1探針點列和第2探針點列的各段中，相同探針構成的3個探針點各自并排排布。即，由于相同探針構成的多個探針點的存在，可以排除各個探針點中包含的探針數(shù)有若干變動帶來的影響。
第1發(fā)明的DNA陣列為，除排布了如上的探針點群(優(yōu)選探針點列)外，可以與通常的DNA陣列同樣地制作。作為DNA陣列的制作方法，已知在固相載體表面直接合成捕獲探針的方法(在片法(on-chip法))和將預先制作的探針固定在固相載體表面的方法，本發(fā)明的DNA陣列優(yōu)選使用后一方法進行制作。將預先制作的探針固定在固相載體表面時，合成引入了官能基的探針，將探針點附到進行了表面處理的固相載體表面上，使其共價結合(例如，Lamture，J.B.et al.Nucl.Acids Res.222121-2125，1994；Guo，Z.et al.Nucl.Acids Res.225456-5465，1994)。一般地，捕獲探針是經(jīng)由間隔基或交聯(lián)劑共價結合到進行了表面處理的固相基體上。還已知使聚丙烯酰胺凝膠微片整齊排列在玻璃表面，使探針共價結合于此的方法(Yershov，G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 944913，1996)，或者在披覆了聚L-賴氨酸的固相基體上結合探針的方法(特開2001-186880號公報)也是已知的。另外，還已知在二氧化硅微陣列上制作微小電極的陣列，在電極上設置含有鏈抗生物素蛋白的瓊脂糖浸透層作為反應部位，通過使該部位成正電荷而固定生物素化探針，控制該部位的電荷，以高速嚴格地進行雜交的方法(Sosnowski，R.G.et al.Proc.Natl.Aead.Sci.USA 941119-1123，1997)。本發(fā)明的DNA陣列，可以利用以上的任一種方法制作。另外，使探針滴落在固相基體表面上進行點樣時，可以采用點樣針(ピン)方式(例如美國專利第5,807,5223號)進行，但是由于特開2001-116750號公報或特開2001-186881號公報中公開的噴墨方式可以形成均一的一定形狀的點，因此是優(yōu)選的。另外，該噴墨方式中，由于可以使各個探針點中包含的探針數(shù)相同，因此可以通過探針長度的不同正確測定雜交的不同。進一步，進行如特開2001-186880號公報中公開的反復點樣，或者使用由WO 03/038089 A1號小冊子中公開的組成構成的探針溶液(含有保濕性物質的溶液)，由于可以形成優(yōu)選的點因此是推薦的。
點樣后，經(jīng)過冷卻，對點賦予水分(在濕度～80％左右保持一定時間)，由燒成干燥進行固化處理等，將各點固定在固相基體上，就可以完成DNA陣列。
其中，DNA陣列的固相基體，除通常的DNA陣列中使用的玻璃(載玻片)外，還可以使用塑料、硅樹脂、陶瓷等。
第2發(fā)明為，單核苷酸多態(tài)性檢測用試劑盒，其特征為，包括所述的DNA陣列。該試劑盒，例如可以由DNA陣列、引物、PCR緩沖液、dNTP、MgCl2、Taq DNA聚合酶等構成。
第3發(fā)明的方法為，使用所述第1發(fā)明的DNA陣列檢測基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征為，必須包括以下步驟 (a)由被檢基因制備標記多核苷酸的步驟； (b)使標記多核苷酸與帶有探針的固相基體接觸的步驟； (c)對由與DNA陣列上探針雜交的標記多核苷酸得到的信號進行測定的步驟。
步驟(a)的被檢基因為已知存在SNP的基因，標記多核苷酸為，例如可以使用現(xiàn)存的SNP數(shù)據(jù)庫(例如http://SNP.ims.u-tokyo.ac.jp/index_ja.html)等中公開的引物組，作為從被檢者分離的基因組基因或tRNA起始的PCR產物(cDNA)來制備。該PCR擴增時，引入標記引物(例如菁系有機色素；結合了Cy3、Cy5等的引物)，制成標記多核苷酸。
步驟(b)中，使目的核苷酸序列與DNA陣列接觸，使其與DNA陣列的探針雜交。雜交可以通過將分注在96孔或384孔塑料盤上的標記多核苷酸水性液點附于DNA陣列上來實施。點附量可以是1～100nl左右。雜交優(yōu)選在室溫～70℃的溫度范圍、1～20小時的時間范圍內實施。雜交結束后，使用表面活性劑和緩沖液的混合溶液進行清洗，除去未反應的標記多核苷酸。作為表面活性劑，優(yōu)選使用十二烷基硫酸鈉(SDS)。作為緩沖液，可以使用檸檬酸緩沖液、磷酸緩沖液、硼酸緩沖液、tris緩沖液、兩性離子緩沖液等，優(yōu)選使用檸檬酸緩沖液。
步驟(c)中，測定從探針雜交的標記多核苷酸得到的信號。接著，由得到的信號，例如如下檢測SNP。
首先，以20,000作為得到的信號的截斷值，算出第1探針點群和第2探針點群的至少任一方的信號在20,000以上的部分的第1探針點群和第2探針點群的信號比(第1/第2)， (1)信號比＞5時，判定被檢基因為純合第1多態(tài)型； (2)信號比＜0.2時，判定被檢基因為純合第2多態(tài)型； (3)進一步，信號比為0.2以上5以下時，判定被檢基因為雜合多態(tài)型。
作為進一步的其它判定方法，使用圖1例示的DNA陣列的情況下，在構成第1探針點列的8個點上全部觀察到信號，在構成第2探針點列的4個點上觀察到信號時，符合所述(1)，判定該被檢基因為純合多態(tài)型?；蛘吡硗?，即使是在從第1探針點列和第2探針點列各自得到相同數(shù)量的信號點的情況下，當?shù)?探針點列的信號點的信號強度的總和比第2探針點列多時，也符合所述(1)，判定該被檢基因為純合第1多態(tài)型。
另外，所述(3)的判定基準也可以是，信號點的數(shù)量相同，使各自的信號強度的總和為30％以下，優(yōu)選20％以下，更優(yōu)選10％以下的情況。
即，與以前的方法中，比較單一的第1探針點和第2探針點的信號強度的多寡相對，該第3發(fā)明的方法中，從各自由多個點構成的探針點群中測定到更多發(fā)出信號的點數(shù)，將其進行比較。因此，能夠以比以前方法高得多的高精度檢測SNP。
其中，第3發(fā)明的標記多核苷酸的制備或雜交程序等，例如記載于特開2001-095574號公報等很多專利文獻、非專利文獻中，可以適當采用這些文獻記載的方法進行。
第4發(fā)明的方法為，使用所述第1發(fā)明的DNA陣列，確定用于檢測各基因單核苷酸多態(tài)性的適宜的探針長度的方法。具體地，按照所述第3發(fā)明的方法檢測SNP時的最適探針長度，也就是能夠最正確地反映各自單核苷酸多態(tài)性的探針長度，即為在該第4發(fā)明中確定的探針長度。所以，從利用以檢測被檢者SNP為目的的第3發(fā)明的方法得到的數(shù)據(jù)，可以得到適宜的探針長度。
接著，提供了第5發(fā)明的DNA陣列，其針對各基因分別具有由適宜探針長度構成的探針點。該第5發(fā)明的DNA陣列為，針對一個被檢基因，分別具有“一個”第1探針點和第2探針點。構成各自探針點的探針為，用于檢測其基因的SNP的最適長度。所以，該第5發(fā)明的DNA陣列可以具有，比第1發(fā)明的DNA陣列多得多的以基因SNP檢測為對象的探針點，而且SNP的檢測規(guī)則與第1發(fā)明的DNA陣列在實質上是相同的。
實施例 以下，列舉實施例對于本發(fā)明進行進一步詳細具體的說明，但本發(fā)明不被以下的例子限定。
實施例1 (1)DNA陣列的制作 以各自相差1堿基的長度，分別合成與基因GNB3、MTHFR的各自多核苷酸(cDNA)雜交的序列部分與各自基因的第1多態(tài)型正確互補的第1探針，以及相同序列部分與第2多態(tài)型正確互補的第2探針。各探針的堿基序列為，基因GNB3用的第1探針(GNB3C-01～08)為SEQ ID No.1-8，第2探針(GNB3T-01～08)為SEQ ID No.9-16，基因MTHFR用的第1探針(MTHFRC-01～08)為SEQ ID No.17-24，第2探針(MTHFRT-01～08)為SEQ ID No.25-32。另外，SEQ ID Nos.1-32的各堿基序列的5′端上連結有堿基序列“TTTTT”。
用氨基修飾這些探針的5′，在寡DNA固定化用環(huán)氧玻璃基板上，以每1點200pL的量點樣50pmol/μL的溶液。另外，第1探針點列和第2探針點列的構成為，如圖2所示，將相同探針構成的探針點并排排布各3個。
點樣后，在42℃、且相對濕度50％的條件下孵育一夜。接下來，于室溫用0.2％的SDS水溶液清洗2分鐘，進一步于室溫用滅菌水清洗2次，每次1分鐘。最后，在50℃的滅菌水中孵育20分鐘后，在離心機中進行1000rpm×5分鐘的離心，干燥。
(2)標記多核苷酸的制備 從基因型明確的被檢者血液中提取的DNA作為模板，在以下的PCR條件下進行擴增，制備標記多核苷酸。
·引物15pmol(5′末端Cy3標記) ·引物25pmol ·×10緩沖液2.5μl ·2mM dNTP2.5μl ·25mM MgCl22.5μl ·Taq DNA聚合酶1U ·提取DNA溶液20ng 擴增條件 94℃/5分種 94℃/30秒、60℃/30秒、72℃/30秒(35個循環(huán)) 72℃/2分種 (3)雜交 將所述(2)中制備的標記多核苷酸與0.3N NaOH(終濃度)混合，變性為單鏈后，添加200mM檸檬酸-磷酸緩沖液(pH6.0)、2％SDS、750mMNaCl、0.1％NaN3(均為終濃度)，混合，制成樣品。
接著，將雜交樣品滴在所述(1)中制作的DNA陣列上，蓋上蓋玻片，在55℃且相對濕度100％的潮濕箱(モイスチヤ一チヤンバ一)內孵育一夜。反應后，取下蓋玻片，于55℃在預先加溫至55℃的2×SSC、1％SDS水溶液中浸漬20分鐘。接著，在50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.025％Tween20水溶液中浸漬15分鐘后，在離心機中以1000rpm離心5分鐘，干燥。
(4)信號測定 利用Scan Array(Packard BioScience社制)，以激光功率100％、光電倍增100％測定熒光圖象。得到的熒光圖像如圖3、4所示。另外，利用GenePixPro(Axon社制)將得到的圖像信號數(shù)值化(表1-3)。
以20,000作為得到的信號的截斷值，算出第1探針點和第2探針點的至少任一方的信號在20,000以上的部分的第1探針點和第2探針點的熒光信號比(第1/第2)。熒光信號比＞5時判定為純合第1多態(tài)型，＜0.2時判定為純合第2多態(tài)型，在0.2以上5以下時判定為雜合多態(tài)型，可以確認其與事實一致。
表1 表2 表3 實施例2 與實施例1同樣地，進行了基因CYP 2C19-2和CYP 2C19-3各自的基因多態(tài)性的檢測試驗。各探針的堿基序列為，基因CYP 2C19-2用的第1探針(CYP 2C19-2-G-01～05)為SEQ ID No.33-37，第2探針(CYP 2C19-2-A-06～010)為SEQ ID No.38-42，基因CYP 2C19-3的第1探針(CYP 2C19-3-G-01～05)為SEQ ID No.43-47，第2探針(CYP 2C19-3-A-06～010)為SEQ IDNo.48-52。另外，SEQ ID Nos.33-52的各堿基序列的5′端連結有堿基序列“TTTTT”。
與實施例(1)同樣地，將這些探針固定在環(huán)氧玻璃基體上，制成DNA微陣列。其中，基因CYP 2C19-2和CYP 2C19-3各自的微陣列構成如圖5的左欄中所示。即，CYP 2C19-2用陣列中，①～⑤為第1探針點列，⑥～⑩為第2探針點列。另外，CYP 2C19-3用陣列中，～為第1探針點列，

～

為第2探針點列。
標記多核苷酸的制備、雜交、信號測定各自與實施例1同樣地進行。
得到的熒光圖像如圖5所示。另外，將得到的圖像信號進行數(shù)值化的結果如表4(CYP 2C19-2)和表5(CYP 2C19-3)中所示。與實施例1同樣地，算出熒光信號比(第1/第2)，熒光信號比＞5時判定為純合第1多態(tài)型，＜0.2時判定為純合第2多態(tài)型，在0.2以上5以下時判定為雜合多態(tài)型，可以確認其與事實一致。
表4 表5
工業(yè)上應用的可能性 如所述的詳細說明，本申請的發(fā)明涉及能夠更加正確地檢測SNP的DNA陣列，以及使用該DNA陣列進行正確的SNP檢測的方法。另外，本申請的發(fā)明涉及針對作為SNP檢測對象的基因的適宜的探針長度的確定方法，以及具有由利用該方法確定的探針長度構成的探針的DNA陣列。根據(jù)這些發(fā)明，能夠探索與疾病罹患性或藥物反應性有關的基因，或者正確且重現(xiàn)性良好地檢測出作為用于定制治療的重要基因信息的SNP。
序列表
<110>東洋紡織株式會社
日本礙子株式會社
<120>DNA微陣列與單核苷酸多態(tài)性的檢測方法
<130>05-F-013PCT
<150>JP2004-81034
<151>2004-03-19
<160>52
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>1
GGCATCACGT CCGTGGCCTT CTCCC25
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>2
GCATCACGTC CGTGGCCTTC TCCC 24
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>3
GCATCACGTC CGTGGCCTTC TCC 23
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>4
CATCACGTCC GTGGCCTTCT CC 22
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>5
CATCACGTCC GTGGCCTTCT C21
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>6
ATCACGTCCG TGGCCTTCTC 20
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>7
ATCACGTCCG TGGCCTTCT 19
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>8
TCACGTCCGT GGCCTTCT18
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>9
GGCATCACGT CTGTGGCCTT CTCCC25
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>10
GCATCACGTC TGTGGCCTTC TCCC 24
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>11
GCATCACGTC TGTGGCCTTC TCC 23
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>12
CATCACGTCT GTGGCCTTCT CC 22
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>13
CATCACGTCT GTGGCCTTCT C21
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>14
ATCACGTCTG TGGCCTTCTC 20
<210>15
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>15
ATCACGTCTG TGGCCTTCT 19
<210>16
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>16
TCACGTCTGT GGCCTTCT18
<210>17
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>17
GTCTGCGGGA GCCGATTTCA TCATC25
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>18
GTCTGCGGGA GCCGATTTCA TCAT 24
<210>19
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>19
TCTGCGGGAG CCGATTTCAT CAT 23
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>20
TCTGCGGGAG CCGATTTCAT CA 22
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>21
CTGCGGGAGC CGATTTCATC A21
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>22
CTGCGGGAGC CGATTTCATC 20
<210>23
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>23
TGCGGGAGCC GATTTCATC 19
<210>24
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>24
TGCGGGAGCC GATTTCAT18
<210>25
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>25
GTCTGCGGGA GTCGATTTCA TCATC25
<210>26
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>26
GTCTGCGGGA GTCGATTTCA TCAT 24
<210>27
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>27
TCTGCGGGAG TCGATTTCAT CAT 23
<210>28
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>28
TCTGCGGGAG TCGATTTCAT CA 22
<210>29
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>29
CTGCGGGAGT CGATTTCATC A21
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>30
CTGCGGGAGT CGATTTCATC 20
<210>31
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>31
TGCGGGAGTC GATTTCATC 19
<210>32
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>32
TGCGGGAGTC GATTTCAT18
<210>33
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>33
TTTTTTTGAT TATTTCCCGG GAACCCATAA CA32
<210>34
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>34
TTTTTTGATT ATTTCCCGGG AACCCATAAC A 31
<210>35
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>35
TTTTTTGATT ATTTCCCGGG AACCCATAAC 30
<210>36
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>36
TTTTTGATTA TTTCCCGGGA ACCCATAAC29
<210>37
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>37
TTTTTGATTA TTTCCCGGGA ACCCATAA 28
<210>38
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>38
TTTTTATTGA TTATTTCCCA GGAACCCATA ACAAA 35
<210>39
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>39
TTTTTATTGA TTATTTCCCA GGAACCCATA ACAA 34
<210>40
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>40
TTTTTTTGAT TATTTCCCAG GAACCCATAA CAA 33
<210>41
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>41
TTTTTTTGAT TATTTCCCAG GAACCCATAA CA32
<210>42
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>42
TTTTTTGATT ATTTCCCAGG AACCCATAAC A 31
<210>43
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>43
TTTTTATCAG GATTGTAAGC ACCCCCTGGA TCCA 34
<210>44
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>44
TTTTTTCAGG ATTGTAAGCA CCCCCTGGAT CCA 33
<210>45
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>45
TTTTTCAGGA TTGTAAGCAC CCCCTGGATC CA32
<210>46
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>46
TTTTTAGGAT TGTAAGCACC CCCTGGATCC A 31
<210>47
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>47
TTTTTGGATT GTAAGCACCC CCTGGATCCA 30
<210>48
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>48
TTTTTCATCA GGATTGTAAG CACCCCCTGA ATCCA 35
<210>49
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>49
TTTTTATCAG GATTGTAAGC ACCCCCTGAA TCCA 34
<210>50
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>50
TTTTTTCAGG ATTGTAAGCA CCCCCTGAAT CCA 33
<210>51
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>51
TTTTTCAGGA TTGTAAGCAC CCCCTGAATC CA32
<210>52
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸
<400>52
TTTTTAGGAT TGTAAGCACC CCCTGAATCC A 3權利要求
1.用于檢測基因單核苷酸多態(tài)性的DNA陣列，其特征為，在固相基體上具有與基因多核苷酸雜交的序列部分是與基因第1多態(tài)型正確互補的1個以上的探針構成的第1探針點群、以及相同序列部分是與基因第2多態(tài)型正確互補的1個以上的探針構成的第2探針點群，其中，各自構成第1探針點群和第2探針點群的探針點為，每個探針點上的探針的長度不同。
2.根據(jù)權利要求1所述的DNA陣列，其中，第1探針點群和第2探針點群各自由2～10個探針點構成。
3.根據(jù)權利要求2所述的DNA陣列，其中，2～10的探針點是按照其探針長度的順序排布的。
4.用于檢測基因單核苷酸多態(tài)性的試劑盒，其特征為，至少含有權利要求1至3的任一項所述的DNA陣列。
5.使用權利要求1至3的任一項所述的DNA陣列檢測基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征為，包括以下的步驟
(a)由被檢基因制備標記多核苷酸的步驟；
(b)使標記多核苷酸與帶有探針的固相基體接觸的步驟；
(c)對由與DNA陣列上探針雜交的標記多核苷酸得到的信號進行測定的步驟。
6.根據(jù)權利要求5所述的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其中，將所述步驟(c)中測定的，所述第1探針點群和所述第2探針點的各自的信號進行比較。
7.使用權利要求1至3的任一項所述的DNA陣列，確定用于檢測基因單核苷酸多態(tài)性的適宜的探針長度的方法，其特征為，把滿足以下步驟
(a)由被檢基因制備標記多核苷酸的步驟；
(b)使標記多核苷酸與DNA陣列接觸的步驟；
(c)測定DNA陣列上的各探針結合的標記多核苷酸的標記信號，和以下標準
(i)當被檢基因為純合第1多態(tài)型時，可在第1探針點群觀察到標記信號，
ii)當被檢基因為純合第2多態(tài)型時，可在第2探針點群觀察到標記信號，
(iii)當被檢基因為雜合多態(tài)型時，可在第1探針點群和第2探針點觀察到同等程度的標記信號，
的探針點的探針長度確定為用于檢測其基因單核苷酸多態(tài)性的適宜的探針長度。
8.用于檢測基因單核苷酸多態(tài)性的DNA陣列，其特征為，在固相基體上具有與基因多核苷酸雜交的序列部分是與基因第1多態(tài)型正確互補的1個以上的探針構成的第1探針點、以及相同序列部分是與基因第2多態(tài)型正確互補的1個以上的探針構成的第2探針點，其中，構成第1及第2探針點的探針長度是用權利要求7所述的方法確定的長度。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于檢測基因單核苷酸多態(tài)性的DNA陣列，其在固相基體上具有與基因多核苷酸雜交的序列部分是與基因第1多態(tài)型正確互補的1個以上的探針構成的第1探針點群、以及相同序列部分是與基因第2多態(tài)型正確互補的1個以上的探針構成的第2探針點群，其中，各自構成第1探針點群和第2探針點群的探針點為，每個探針點上的探針的長度不同。該DNA陣列能夠更加正確地進行SNP檢測。
文檔編號C12Q1/68GK1969044SQ20058000855
公開日2007年5月23日 申請日期2005年3月18日 優(yōu)先權日2004年3月19日
發(fā)明者川瀨三雄, 吉田安子, 山田和成, 寶田裕, 橋本幸藏 申請人:東洋紡織株式會社, 日本礙子株式會社