專利名稱：新型卡諾拉分離蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及卡諾拉(canola)分離蛋白的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)含量至少100wt％(N×6.25)的卡諾拉油籽分離蛋白，可通過2002年5月3日提交的共同待審美國專利申請第10/137,391號(WO 02/089597)中所述的方法從油籽粕制得，所述專利申請轉(zhuǎn)讓至其受讓人，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。所述方法程序包括多步驟過程用鹽溶液浸提卡諾拉油籽粕；使所得蛋白質(zhì)水溶液與殘余油籽粕分離；使用選擇性膜技術(shù)，將所述水溶液的蛋白質(zhì)濃度提高至至少約200g/L，同時保持離子強度基本不變；將所得濃縮蛋白質(zhì)溶液稀釋至冷水中，以導(dǎo)致形成蛋白質(zhì)膠束；讓蛋白質(zhì)膠束沉析形成無定形、粘稠、凝膠狀的面筋樣蛋白質(zhì)膠束團(PMM)；和從上清液中回收蛋白質(zhì)含量至少約100wt％(N×6.25)的蛋白質(zhì)膠束團。本文所用的蛋白質(zhì)含量以干重計?；厥盏腜MM可干燥。在所述方法的一個實施方案中，對PMM沉析步驟所得上清液進行加工，以從上清液中回收卡諾拉分離蛋白?？墒紫扔贸瑸V膜濃縮上清液，然后將濃縮物干燥，來實現(xiàn)這個程序。所得卡諾拉分離蛋白的蛋白質(zhì)含量至少約90wt％，優(yōu)選至少約100wt％(N×6.25)。美國專利申請第10/137,391號中所述的程序基本上是分批程序。在2002年11月19日提交的共同待審美國專利申請第10/298,678號(WO 03/043439)中，描述了制備卡諾拉分離蛋白的連續(xù)方法，所述專利申請轉(zhuǎn)讓至其受讓人，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。根據(jù)所述方法，將卡諾拉油籽粕與鹽溶液連續(xù)混合，通過管道輸送所得混合物，同時使蛋白質(zhì)從卡諾拉油籽粕中浸提出來，形成蛋白質(zhì)水溶液，將所述蛋白質(zhì)水溶液連續(xù)輸送通過選擇性膜操作，使所述蛋白質(zhì)水溶液的蛋白質(zhì)含量提高至至少約50g/L，同時保持離子強度基本不變，將所得濃縮蛋白質(zhì)溶液與冷水連續(xù)混合，以促使形成蛋白質(zhì)膠束，讓所述蛋白質(zhì)膠束連續(xù)沉析，同時連續(xù)溢出上清液，直到在沉析槽中積累了所需量的PMM。從沉析槽中回收PMM，且可加以干燥。所述PMM的蛋白質(zhì)含量至少約90wt％(N×6.25)，優(yōu)選至少約100wt％?？扇缟纤鰧σ绯龅纳锨逡哼M行加工，以從中回收卡諾拉分離蛋白。已知卡諾拉種子含有約10至約30wt％的蛋白質(zhì)，且已鑒定出幾種不同的蛋白質(zhì)成分。這些蛋白質(zhì)包括12S球蛋白(稱十字花科蛋白)、7S蛋白質(zhì)和2S儲存蛋白質(zhì)(稱油菜籽蛋白)。如2003年4月15日提交的共同待審美國專利申請第10/413,371號(WO 03/088760)中所述，上述程序包括稀釋濃蛋白質(zhì)水溶液以形成PMM和加工上清液以回收另外的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致回收到具有不同蛋白質(zhì)分布(profile)的分離物，所述專利申請轉(zhuǎn)讓至其受讓人，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。這樣，PMM衍生的卡諾拉分離蛋白的蛋白質(zhì)成分含量為約60至約98wt％的7S蛋白質(zhì)，約1至約15wt％的12S蛋白質(zhì)和0至約25wt％的2S蛋白質(zhì)。上清液衍生的卡諾拉分離蛋白的蛋白質(zhì)成分含量為約60至約95wt％的2S蛋白質(zhì)，約5至約40wt％的7S蛋白質(zhì)和0至約5wt％的12S蛋白質(zhì)。因此，PMM衍生的卡諾拉分離蛋白主要是7S蛋白質(zhì)，而上清液衍生的卡諾拉分離蛋白主要是2S蛋白質(zhì)。如在上述美國專利申請第10/413,371號中所述，2S蛋白質(zhì)的分子大小約為約14,000道爾頓，7S蛋白質(zhì)的分子量約為145,000道爾頓，12S蛋白質(zhì)的分子大小約為290,000道爾頓?？ㄖZ拉也稱油菜(rapeseed或oil seed rape)。
發(fā)明概述令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，有一種新型卡諾拉分離蛋白，其2S蛋白質(zhì)比例提高，優(yōu)選含有至少約85wt％的2S蛋白質(zhì)，而其7S蛋白質(zhì)比例下降，所述新型卡諾拉分離蛋白比起按上述美國專利申請第10/137,391號的程序制備的上清液衍生卡諾拉分離蛋白，在水溶液中顯示出更優(yōu)越的特性。本文提供的新型卡諾拉分離蛋白除在各種pH值下溶解度提高外，還能夠使軟飲料溶液的澄清度提高，從而提供澄清的蛋白質(zhì)強化軟飲料。因此，本發(fā)明的一個方面提供主要由2S卡諾拉蛋白質(zhì)組成、以干重計(d.b.)蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％(N×6.25)的卡諾拉分離蛋白，所述卡諾拉分離蛋白與主要由2S卡諾拉蛋白質(zhì)組成、得自卡諾拉蛋白質(zhì)膠束形成和沉淀所得含水上清液的卡諾拉分離蛋白相比，其2S卡諾拉蛋白質(zhì)比例提高，7S卡諾拉蛋白質(zhì)比例下降。本發(fā)明的又一個方面提供以干重計(d.b.)蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％(N×6.25)的卡諾拉分離蛋白，所述卡諾拉分離蛋白中含有至少約85wt％的2S卡諾拉蛋白質(zhì)和低于約15wt％的7S卡諾拉蛋白質(zhì)。可通過對美國專利申請第10/137,391號的程序所得的濃縮上清液進行熱處理，以降低濃縮上清液中的7S蛋白質(zhì)比例，從而提高2S蛋白質(zhì)比例，來制備所述新型卡諾拉分離蛋白。因此，本發(fā)明的另一個方面提供制備2S卡諾拉蛋白質(zhì)比例提高的卡諾拉分離蛋白的方法，所述方法包括(a)提供主要由2S蛋白質(zhì)組成的2S和7S蛋白質(zhì)水溶液，(b)對所述水溶液進行熱處理，以導(dǎo)致7S卡諾拉蛋白質(zhì)沉淀，(c)從所述水溶液中除去降解的7S蛋白質(zhì)，和(d)回收蛋白質(zhì)含量至少90wt％(N×6.25)d.b.，2S卡諾拉蛋白質(zhì)比例提高的卡諾拉分離蛋白?；蛘撸鲂滦涂ㄖZ拉分離蛋白可通過如下程序制備從卡諾拉油籽粕浸提蛋白質(zhì)后，使所得蛋白質(zhì)溶液進行第一選擇性膜步驟，所用膜的分子量截留值允許2S蛋白質(zhì)通過膜進入透過液中，而7S和12S蛋白質(zhì)則保留在截留液中。然后干燥截留液，以提供主要由7S蛋白質(zhì)組成的第一卡諾拉分離蛋白。第一選擇性膜方法步驟所得的透過液則進行第二選擇性膜步驟，所用膜的分子量截留值保留2S蛋白質(zhì)而允許低分子量污染物質(zhì)(包括鹽、酚類物質(zhì)和抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì))通過。然后干燥后一選擇性膜步驟所得的截留液，以提供主要由2S蛋白質(zhì)組成，為新型分離蛋白的第二卡諾拉分離蛋白。因此，本發(fā)明另外的一個方面提供制備卡諾拉分離蛋白的方法，所述方法包括(a)提供得自卡諾拉油籽粕，含有12S、7S和2S卡諾拉蛋白質(zhì)的卡諾拉蛋白質(zhì)水溶液，(b)使用能有效保留7S和12S卡諾拉蛋白質(zhì)在截留液中，而讓2S蛋白質(zhì)通過膜進入透過液的選擇性膜技術(shù)，提高所述水溶液的蛋白質(zhì)濃度，以提供濃縮蛋白質(zhì)溶液，(c)干燥步驟(b)所得的截留液，以提供主要由7S卡諾拉蛋白質(zhì)組成，以干重計(d.b.)蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％(N×6.25)的卡諾拉分離蛋白，(d)使用能有效保留2S卡諾拉蛋白質(zhì)在截留液中，而讓低分子量污染物質(zhì)通過膜進入透過液的選擇性膜技術(shù)，提高步驟(a)所得的透過液的濃度，和(e)干燥步驟(d)所得的截留液，以提供主要由2S卡諾拉蛋白質(zhì)組成，蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％(N×6.25)d.b.的卡諾拉分離蛋白。
附圖簡述

圖1是附加于蛋白質(zhì)膠束方法上的本發(fā)明一個實施方案的蛋白質(zhì)溶液回收方法示意圖。
發(fā)明詳述本文提供的新型卡諾拉分離蛋白其蛋白質(zhì)至少約90wt％(N×6.25)，優(yōu)選至少約100wt％，可通過分批方法、連續(xù)方法或半連續(xù)方法從卡諾拉油籽粕分離制得。本文提供的新型卡諾拉分離蛋白主要由2S蛋白質(zhì)組成，其與主要由2S蛋白質(zhì)組成、在相同的制備實驗條件下得自卡諾拉蛋白質(zhì)膠束形成和沉淀所得上清液的卡諾拉分離蛋白相比，其2S卡諾拉蛋白質(zhì)比例提高，7S卡諾拉蛋白質(zhì)比例下降。所述新型卡諾拉分離蛋白含有至少約85wt％的2S卡諾拉蛋白質(zhì)和低于約15wt％的7S卡諾拉蛋白質(zhì)，優(yōu)選至少約90wt％的2S卡諾拉蛋白質(zhì)和低于約10wt％的7S卡諾拉蛋白質(zhì)，更優(yōu)選2S蛋白質(zhì)的比例盡可能高。如上所述，這種卡諾拉分離蛋白可通過對濃縮上清液進行熱處理來獲得，這在下文中作更詳細的描述。對濃縮上清液的熱處理造成7S蛋白質(zhì)沉淀，后者可通過任何方便方法如離心從經(jīng)熱處理的上清液中除去。2S蛋白質(zhì)不受熱處理影響，因而熱處理通過降低7S蛋白質(zhì)的比例來提高2S蛋白質(zhì)的比例。所述新型卡諾拉分離蛋白可溶于pH值范圍很廣的水溶液中，其與主要由2S蛋白質(zhì)組成、在相同的制備實驗條件下得自卡諾拉蛋白質(zhì)膠束形成和沉淀所得上清液的卡諾拉分離蛋白相比，通常具有更高的溶解度。此外，所述新型卡諾拉分離蛋白在軟飲料(包括充碳酸氣軟飲料，如可市售獲得的軟飲料)中的水溶液，與從主要由2S蛋白質(zhì)組成、在相同的制備條件下得自卡諾拉蛋白質(zhì)膠束形成和沉淀所得上清液的卡諾拉分離蛋白產(chǎn)生的水溶液相比，具有更高的澄清度?？ㄖZ拉分離蛋白在水溶液(包括在軟飲料中的溶液)中的濃度可根據(jù)溶液的預(yù)定用途而改變。一般來說，蛋白質(zhì)濃度可在約0.1至約30wt％，優(yōu)選約1至約5wt％之間變化。提供卡諾拉分離蛋白的方法的起始步驟包括使卡諾拉油籽粕中的蛋白質(zhì)類物質(zhì)溶解出來。從卡諾拉油籽粕回收得到的蛋白質(zhì)類物質(zhì)可能是卡諾拉油籽中天然存在的蛋白質(zhì)，或者所述蛋白質(zhì)類物質(zhì)可能是經(jīng)遺傳操作改良但仍具有天然蛋白質(zhì)的特有疏水性質(zhì)和極性性質(zhì)的蛋白質(zhì)?？ㄖZ拉粕可以是卡諾拉油籽除去卡諾拉油后得到的任何卡諾拉粕，由于例如使用熱己烷浸出方法或者冷油擠出方法，其中含有的非變性蛋白質(zhì)水平有所變動。從卡諾拉油籽除去卡諾拉油通常是通過與本文描述的分離蛋白回收程序分開的操作過程來實現(xiàn)的。蛋白質(zhì)溶解通過使用食品級鹽溶液來實現(xiàn)最為有效，因為鹽的存在增強了可溶性蛋白質(zhì)從油籽粕中的除去。在預(yù)期卡諾拉分離蛋白作非食品用途的情況下，可使用食品級化學(xué)藥品。鹽通常是氯化鈉，但也可使用其他鹽，如氯化鉀。鹽溶液的離子強度至少約為0.05，優(yōu)選至少約為0.10，以使相當(dāng)數(shù)量的蛋白質(zhì)的溶解得以實現(xiàn)。隨著鹽溶液的離子強度不斷提高，油籽粕中的蛋白質(zhì)的溶解程度開始上升，最后達到最大值。隨后離子強度的任何提高都不會增加溶解的總蛋白質(zhì)。引起最大蛋白質(zhì)溶解程度的食品級鹽溶液離子強度所選擇的油籽粕而有所變化。考慮到隨著離子強度的提高，為沉析蛋白質(zhì)所需的稀釋程度也要更高，通常優(yōu)選采用的離子強度值小于約0.8，更優(yōu)選離子強度值為約0.1至約0.15。在分批方法中，蛋白質(zhì)的鹽溶解在至少約5℃的溫度下，優(yōu)選在最高達約35℃下實現(xiàn)，優(yōu)選同時進行攪拌，以減少溶解時間，所述時間通常為約10分鐘至約60分鐘。優(yōu)選所實現(xiàn)的溶解作用要能從油籽粕中充分浸提出盡可能多的蛋白質(zhì)，以獲得總體上較高的產(chǎn)物得率。溫度下限選定為約5℃，是因為低于此溫度時溶解作用慢得無法進行，而優(yōu)選的溫度上限選定為約35℃，是因為在分批模式下，溫度更高時所述方法會變得不經(jīng)濟。在連續(xù)方法中，從卡諾拉油籽粕浸提蛋白質(zhì)是通過適合實現(xiàn)從卡諾拉油籽粕連續(xù)浸提蛋白質(zhì)的任何方式來進行的。在一個實施方案中，卡諾拉油籽粕與食品級鹽溶液連續(xù)混合，所得混合物通過具有一定長度的管道或者導(dǎo)管輸送，輸送流速達成的停留時間足以實現(xiàn)期望依照本文所述參數(shù)進行的浸提作用。在這種連續(xù)程序中，鹽溶解步驟在最長為約10分鐘的時間內(nèi)快速完成，優(yōu)選所實現(xiàn)的溶解作用從油籽粕中充分浸提出盡可能多的蛋白質(zhì)。連續(xù)程序中的溶解過程優(yōu)選在高溫下完成，優(yōu)選至少約35℃，通常最高達約65℃。食品級鹽水溶液其pH通常約5至約6.8，優(yōu)選約5.3至約6.2，可按需使用任何合宜的酸(通常是鹽酸)或者堿(通常是氫氧化鈉)，將鹽溶液的pH調(diào)至約5至約6.8范圍的任何期望數(shù)值。在溶解步驟進行過程中，食品級鹽溶液中的油籽粕濃度可能變化很大。典型的濃度值為約5至約15％w/v。用鹽水溶液進行的蛋白質(zhì)浸提步驟具有溶解卡諾拉粕中可能存在的脂類的額外效果，這會導(dǎo)致水相中存在脂類。浸提步驟所得的蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)濃度通常為約5至約40g/L，優(yōu)選為約10至約30g/L。鹽水溶液中可含有抗氧化劑。所述抗氧化劑可以是任何合宜的抗氧化劑，如硫酸鈉或者抗壞血酸。所采用的抗氧化劑量在占溶液的約0.01至約1wt％之間變化，優(yōu)選約0.05wt％。抗氧化劑用以抑制蛋白溶液中酚類物質(zhì)的氧化?？赏ㄟ^任何便利方式，使浸提步驟所得的水相與殘余卡諾拉粕分離，例如通過采用潷析離心機，接著通過碟式離心法和/或過濾，除去殘余的粕。分離出的殘余粕可進行干燥，以便處置?？赏ㄟ^將粉狀活性炭或者其他色素吸附劑與分離出的蛋白質(zhì)水溶液混合，然后便利地通過過濾法除去吸附劑，以提供蛋白質(zhì)溶液，改善最終卡諾拉分離蛋白的顏色，使其顏色較淺，黃顏色較淡。也可使用滲析法除去色素。所述色素去除步驟可在任何合宜的條件下進行，通常在分離出的蛋白質(zhì)水溶液的環(huán)境溫度下，采用任何合適的色素吸附劑來進行。對于粉狀活性炭，用量為約0.025％至約5％w/v，優(yōu)選約0.05％至約2％w/v。在卡諾拉油籽粕含有相當(dāng)數(shù)量的脂類的情況下，如在美國專利第5,844,086號和第6,005,076號(轉(zhuǎn)讓至其受讓人，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)中所描述的，那么可將這兩個專利中描述的除油步驟實施于分離的蛋白質(zhì)水溶液和下文討論的濃縮蛋白質(zhì)水溶液。當(dāng)進行顏色改善步驟時，這個步驟可在第一除油步驟之后進行。作為用鹽水溶液浸提油籽粕的替代方案，所述浸提可只用水來進行，盡管比起鹽水溶液，只用水往往從油籽粕浸提出較少的蛋白質(zhì)。在采用這種替代方案的情況下，可將鹽以上述濃度加入到從殘余油籽粕分離出的蛋白質(zhì)溶液中，以使蛋白質(zhì)在下述濃縮步驟中保留在溶液中。當(dāng)進行第一脫脂步驟時，鹽通常是在這種操作完成后加入。另一種程序是在相對較高的pH值下，即高于約6.8，通常最高達約9.9下，用食品級鹽溶液浸提油籽粕?？赏ㄟ^使用任何合宜的食品級堿，如氫氧化鈉水溶液，將食品級鹽溶液的pH調(diào)至期望的堿性值。或者，可在相對較低的pH值下，即低于約pH 5，通常低至約pH3下，用鹽溶液浸提油籽粕。在使用這種另選方案的情況下，隨后可通過任何便利方式，使油籽粕浸提步驟所得的水相與殘余卡諾拉粕分離，例如通過采用潷析離心法，接著通過碟式離心法和/或過濾，除去殘余的粕。分離出的殘余粕可進行干燥，以便處置。然后，如上所述，將在高或者低pH浸提步驟中獲得的蛋白質(zhì)水溶液的pH調(diào)至約5至約6.8的范圍，優(yōu)選在約5.3至約6.2的范圍，接著再如下文所討論作進一步的處理。可適當(dāng)使用任何合宜的酸(如鹽酸)或者堿(如氫氧化鈉)，進行所述pH調(diào)整。取決于是要沉淀出富含7S的蛋白質(zhì)膠束團，留下上清液，以供加工形成新型卡諾拉分離蛋白，還是不要沉淀出蛋白質(zhì)膠束團，而通過二膜操作加工蛋白質(zhì)水溶液，以獲得新型卡諾拉分離蛋白，可用兩種擇一(alternative)程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)水溶液進行加工。在第一種擇一程序中，將蛋白質(zhì)水溶液濃縮，以提高溶液中的蛋白質(zhì)濃度，同時保持溶液中的離子強度基本不變。進行這種濃縮操作，通常是為了提供蛋白質(zhì)濃度為至少約50g/L，優(yōu)選至少為約200g/L，更優(yōu)選至少為約250g/L的濃縮蛋白質(zhì)溶液?？赏ㄟ^任何適合分批或者連續(xù)操作的便利方式，如通過采用任何合宜的選擇性膜技術(shù)(如超濾或者滲析)，來進行濃縮步驟，使用的膜例如中空纖維膜或者螺旋錯流膜，視不同的膜材質(zhì)及形式而定，其合適分子量截留值如約3,000至約100,000道爾頓，優(yōu)選約5,000至約10,000道爾頓，對于連續(xù)操作，確定膜的尺寸，以允許蛋白質(zhì)水溶液透過膜時能夠獲得期望的濃縮程度。然后，可使用摩爾濃度和pH與浸提溶液相同的鹽水溶液，對濃縮蛋白質(zhì)溶液進行滲析步驟。這種滲析操作可通過使用約2至約20體積的滲析溶液，優(yōu)選約5至約10體積的滲析溶液來進行。在滲析操作中，通過使透過液通過膜，使另外的污染物從蛋白質(zhì)水溶液中除去。滲析操作可進行到透過液中沒有另外相當(dāng)數(shù)量的酚類物質(zhì)和可見顏色存在為止。這種滲析操作可用濃縮步驟的相同膜來進行。但是，如需要，可用分子量截留值不同的單獨膜來進行這個滲析操作，例如視不同的膜材質(zhì)及形式而定，所述膜的分子量截斷值在約3,000至約100,000道爾頓的范圍，優(yōu)選約5,000至約10,000道爾頓的范圍。在滲析步驟的至少一部分過程中，在滲析介質(zhì)中可存在抗氧化劑。所述抗氧化劑可以是任何合宜的抗氧化劑，如亞硫酸鈉或者抗壞血酸。滲析介質(zhì)中采用的抗氧化劑的量取決于所采用的材料，可在約0.01至約1wt％的范圍變動，優(yōu)選為約0.05wt％?？寡趸瘎┯靡砸种茲饪s卡諾拉分離蛋白溶液中存在的酚類物質(zhì)的氧化。濃縮步驟和滲析步驟可在任何合宜的溫度下進行，通常為約20℃至約60℃，優(yōu)選為約20℃至約30℃，進行的時間足以實現(xiàn)期望的濃縮程度。所用的溫度和其他條件在一定程度上取決于用以進行濃縮操作的膜設(shè)備和期望的溶液蛋白質(zhì)濃度。在濃縮步驟中將蛋白質(zhì)溶液濃縮至高于約200g/L的優(yōu)選濃度，不僅將方法得率提高到高于約40％，優(yōu)選高于約80％的水平(以回收為干分離蛋白的浸提蛋白質(zhì)的比例計)，而且還降低了干燥后最終分離蛋白的鹽濃度。控制分離蛋白的鹽濃度的能力對于分離蛋白的應(yīng)用是很重要的，鹽濃度的變化會影響具體食品應(yīng)用中的功能性質(zhì)和感觀性質(zhì)。眾所周知，超濾及類似的選擇性膜技術(shù)允許低分子量物質(zhì)通過，而阻止較高分子量的物質(zhì)通過。低分子量物質(zhì)不僅包括食品級鹽的離子，也包括從原始材料中浸提出來的低分子量物料，如碳水化合物、色素和抗?fàn)I養(yǎng)因子，以及任何低分子量形式的蛋白質(zhì)。視不同的膜材質(zhì)及形式而定，通常選定膜的分子量截斷值，以保證相當(dāng)比例的蛋白質(zhì)得以保留在溶液中，同時又讓污染物通過。如美國專利第5,844,086號和第6,005,076號所描述的，如有需要，可對濃縮和任選滲析過的蛋白質(zhì)溶液進行進一步的除油操作。作為上述脫色操作的替代方案，可對濃縮和任選滲析過的蛋白質(zhì)溶液進行脫色操作。在這里，可使用粉狀活性炭以及顆粒狀活性炭(GAC)?？捎米黝伾絼┑牧硪环N材料是聚乙烯吡咯烷酮。顏色吸附劑處理步驟可在任何便利條件下進行，通常在卡諾拉蛋白質(zhì)溶液的環(huán)境溫度下進行。對于粉狀活性炭，用量可以為約0.025％至約5％w/v，優(yōu)選約0.05％至約2％w/v。當(dāng)用聚乙烯吡咯烷酮作為顏色吸附劑時，用量可以為約0.5％至約5％w/v，優(yōu)選約2％至約3％w/v?？赏ㄟ^任何便利手段，如通過過濾，將顏色吸附劑從卡諾拉蛋白質(zhì)溶液中除去。可對從任選脫色步驟獲得的濃縮和任選滲析過的蛋白質(zhì)溶液進行巴氏滅菌，以殺滅任何細菌，所述細菌可能因為保藏或者其他原因在原來的粕中早已存在，且在浸提步驟中被從粕中浸提到卡諾拉分離蛋白溶液中。這種巴氏滅菌可在任何期望的巴氏滅菌條件下進行。通常，將濃縮和任選滲析過的蛋白質(zhì)溶液加熱到約55°至約70℃的溫度，優(yōu)選約60°至約65℃，保持約10至約15分鐘，優(yōu)選約10分鐘。然后可將巴氏滅菌過的濃縮蛋白質(zhì)溶液冷卻，優(yōu)選冷卻至約25°至約40℃的溫度，以供如下所述進行進一步的處理。取決于濃縮步驟和任選的滲析步驟中所采用的溫度，以及是否進行了巴氏滅菌步驟，濃縮蛋白質(zhì)溶液可加熱至至少約20℃，最高達約60℃的溫度，優(yōu)選至約25°至約40℃，以降低濃縮蛋白質(zhì)溶液的粘度，促進隨后的稀釋步驟和膠束形成的進行。濃縮蛋白質(zhì)溶液不應(yīng)被加熱至超過一定的溫度，超過所述溫度的濃縮蛋白質(zhì)溶液用冷水稀釋時不發(fā)生膠束形成。然后，通過將濃縮步驟和任選滲析步驟、任選脫色步驟、任選巴氏滅菌步驟及任選除油步驟得到的濃縮蛋白質(zhì)溶液與為實現(xiàn)期望稀釋程度所需體積的冷水混合，對濃縮蛋白質(zhì)溶液進行稀釋，以促使膠束形成。取決于需要通過膠束途徑獲得的卡諾拉蛋白質(zhì)的比例和從上清液獲得的卡諾拉蛋白質(zhì)的比例，濃縮蛋白質(zhì)溶液的稀釋程度可有所不同。一般來說，稀釋水平越高，卡諾拉蛋白質(zhì)保留在水相中的比例也越高。當(dāng)期望通過膠束途徑提供最大比例的蛋白質(zhì)時，濃縮蛋白質(zhì)溶液稀釋約15倍或者更低，優(yōu)選稀釋約10倍或者更低。與濃縮蛋白質(zhì)溶液混合的冷水的溫度低于約15℃，通常為3℃至約15℃，優(yōu)選低于約10℃，因為在所用的稀釋倍數(shù)下，用所述較低溫度獲得的蛋白質(zhì)膠束團形式的分離蛋白的得率會提高。在分批操作中，可將各批濃縮蛋白質(zhì)溶液加入到上述期望體積的靜止冷水體中。濃縮蛋白質(zhì)溶液的稀釋和隨之發(fā)生的離子強度降低導(dǎo)致形成膠束狀不連續(xù)蛋白質(zhì)小滴形式的高度結(jié)合蛋白質(zhì)分子的云狀團塊。在分批程序中，讓蛋白質(zhì)膠束在冷水體中沉析，以形成聚集、凝聚、濃厚、無定形的粘性面筋樣蛋白質(zhì)膠束團(PMM)?？衫缤ㄟ^離心幫助沉析。這種誘導(dǎo)的沉析過程降低蛋白質(zhì)膠束團的液體含量，從而降低水分含量，從通常約70％(重量)至約95％(重量)降低到通常約50％(重量)至約80％(重量)的數(shù)值，以總膠束團的重量計。以這種方式降低膠束團的水分含量還能降低膠束團中夾雜的鹽含量，并因此降低干燥分離蛋白的鹽含量?；蛘?，可如下連續(xù)進行稀釋操作連續(xù)使?jié)饪s蛋白質(zhì)溶液輸入T形管的一個入口，同時使稀釋用水注入T形管的另一個入口，使它們在管道中混合。稀釋用水注入T形管的流速足以實現(xiàn)濃縮蛋白質(zhì)溶液的期望稀釋程度。濃縮蛋白質(zhì)溶液和稀釋用水在管道中的混合引發(fā)蛋白質(zhì)膠束的形成，將所得混合物從T形管的出口輸入到沉析槽中，沉析槽注滿時讓上清液溢出。優(yōu)選以盡量減少液體水體內(nèi)湍流的方式，將混合物注入沉析槽中的所述液體水體中。在連續(xù)程序中，讓蛋白質(zhì)膠束在沉析槽中沉析，以形成聚集、凝聚、濃厚、無定形、粘性的面筋樣蛋白質(zhì)膠束團(PMM)，所述程序繼續(xù)進行到已在沉析槽的底部積聚了期望量的PMM，此時從沉析槽中除去積聚的PMM。作為通過沉淀法沉析的替代，還可通過離心法連續(xù)分離PMM。將蛋白質(zhì)溶液濃縮至至少約200g/L的優(yōu)選蛋白質(zhì)含量和使用小于約15的稀釋倍數(shù)這兩個方法參數(shù)的組合，導(dǎo)致獲得更高的得率，且往往是相當(dāng)高的得率，所述得率就從原始粕浸提物回收到蛋白質(zhì)膠束團形式的蛋白質(zhì)而言，而且還導(dǎo)致獲得純度更高的分離蛋白，所述純度就與使用上述美國專利中描述的任何公知現(xiàn)有分離蛋白產(chǎn)生程序獲得的蛋白質(zhì)含量相比較而言。與分批方法相比，通過采用連續(xù)方法回收卡諾拉分離蛋白時，對于同樣的蛋白質(zhì)浸提水平，起始蛋白質(zhì)浸提步驟的時間顯著降低，且在浸提步驟中可使用相當(dāng)高的溫度。此外，在連續(xù)程序中，發(fā)生污染的機會比分批程序的要低，這導(dǎo)致產(chǎn)物質(zhì)量更高，且可在更緊湊的設(shè)備中進行連續(xù)過程。可例如通過將殘余水相潷析出沉析的團塊，或者通過離心法，將沉析的分離蛋白與殘余水相或者上清液分離。PMM可以以濕品形式使用，或者可通過任何便利技術(shù)，如噴霧干燥法或冷凍干燥法干燥成干品形式。干燥PMM的蛋白質(zhì)含量高，超過約90wt％蛋白質(zhì)，優(yōu)選至少約100wt％蛋白質(zhì)(以凱氏N×6.25計算)，且基本不發(fā)生變性(通過差示掃描量熱法測定)。當(dāng)按需采用美國專利第5,844,086號和第6,005,076號的程序時，從脂肪油籽粕分離得到的干燥PMM還具有較低的殘余脂肪含量，可低于約1wt％。如上述美國專利申請第10/413,371號中所描述，PMM主要由7S卡諾拉蛋白質(zhì)組成，其蛋白質(zhì)成分含量為約60至98wt％的7S蛋白質(zhì)，約1至約15wt％的12S蛋白質(zhì)和0至約25wt％的2S蛋白質(zhì)。PMM形成和沉析步驟得到的上清液含有相當(dāng)數(shù)量的不能在稀釋步驟中沉析的卡諾拉蛋白質(zhì)，因此對其進行處理，以從中回收卡諾拉分離蛋白。如上述美國專利申請第10/413,371號中所描述，得自上清液的卡諾拉分離蛋白主要由2S卡諾拉蛋白質(zhì)組成，其蛋白質(zhì)成分含量為約60至約95wt％的2S蛋白質(zhì)，約5至約40wt％的7S蛋白質(zhì)和0至約5wt％的12S蛋白質(zhì)。稀釋步驟得到的上清液在除去PMM之后進行濃縮，以提高其中的蛋白質(zhì)濃度。可通過采用任何便利選擇性膜技術(shù)(如超濾)，使用具有合適的分子量截斷值，允許低分子量物質(zhì)(包括鹽和其他從蛋白質(zhì)原始材料浸提出來的非蛋白質(zhì)低分子量物料)通過，同時又能使卡諾拉蛋白質(zhì)保留在溶液中的膜，來進行所述濃縮過程。視不同的膜材質(zhì)及形式而定，可使用分子量截斷值為約3,000至100,000道爾頓，優(yōu)選5,000至10,000道爾頓的超濾膜。用這種方式濃縮上清液還能減少為回收蛋白質(zhì)所要干燥的液體的體積。通常在上清液干燥前，先濃縮至蛋白質(zhì)濃度為至少約50g/L，優(yōu)選約100至約400g/L，更優(yōu)選約200至約300g/L。如以上對蛋白質(zhì)溶液濃縮步驟所述的，這種濃縮操作可以以分批模式進行，或者以連續(xù)操方式進行。然后，可用水對濃縮的上清液進行滲析步驟。這個滲析操作可通過使用約2至約20體積的滲析溶液，優(yōu)選約5至約10體積的滲析溶液來進行。在滲析操作中，通過使另外的污染物隨透過液通過膜而從含水上清液中除去。滲析操作可進行到透過液中沒有另外相當(dāng)數(shù)量的酚類物質(zhì)和可見顏色存在為止。這個滲析操作可用濃縮步驟的相同膜來進行。但是，如需要，可用單獨的膜來進行這個滲析操作，例如視不同的膜材質(zhì)及形式而定，所述膜的分子量截斷值在約3,000至約100,000道爾頓的范圍，優(yōu)選約5,000至約10,000道爾頓的范圍。在滲析步驟的至少一部分過程中，在滲析介質(zhì)中可存在抗氧化劑。所述抗氧化劑可以是任何合宜的抗氧化劑，如亞硫酸鈉或者抗壞血酸。滲析介質(zhì)中采用的抗氧化劑的量取決于所采用的材料，可在約0.01至約1wt％的范圍變動，優(yōu)選為約0.05wt％?？寡趸瘎┯靡砸种茲饪s卡諾拉分離蛋白溶液中存在的酚類物質(zhì)的氧化。根據(jù)本發(fā)明，對濃縮和任選滲析的上清液進行熱處理，以通過沉淀和除去7S蛋白質(zhì)來減少溶液中存在的7S蛋白質(zhì)的量，從而提高濃縮上清液中存在的卡諾拉蛋白質(zhì)中2S蛋白質(zhì)的比例。這種熱處理可用溫度和時間曲線來實現(xiàn)，所述溫度和時間曲線足以降低濃縮上清液中存在的7S蛋白質(zhì)的比例，優(yōu)選極大程度地減少7S蛋白質(zhì)的比例。一般來說，通過熱處理，上清液的7S蛋白質(zhì)含量減少至少約50wt％，優(yōu)選至少約75wt％。一般來說，熱處理可在約70°至約100℃的溫度下，優(yōu)選約75至約95°下進行約2至約30分鐘，優(yōu)選約5至約15分鐘。沉淀出的7S蛋白質(zhì)可通過任何便利方式，如離心或過濾而除去。除去降解的7S蛋白質(zhì)(如通過離心)后的濃縮熱處理上清液可通過任何便利技術(shù)，如噴霧干燥法或冷凍干燥法干燥成干品，以提供本發(fā)明的卡諾拉分離蛋白。這種新型卡諾拉分離蛋白的蛋白質(zhì)含量高，超過約90wt％蛋白質(zhì)，優(yōu)選至少約100wt％蛋白質(zhì)(以凱氏N×6.25計算)，且基本不發(fā)生變性(通過差示掃描量熱法測定)。這種新型卡諾拉分離蛋白含有高比例的2S蛋白質(zhì)，優(yōu)選占卡諾拉分離蛋白的至少90wt％，最優(yōu)選至少約95wt％。在生產(chǎn)新型卡諾拉分離蛋白的替代程序中，通過第一超濾步驟，將浸提卡諾拉油籽粕所生產(chǎn)出的蛋白質(zhì)水溶液濃縮，以提高其中的蛋白質(zhì)濃度，同時保持其離子強度基本不變，所述超濾步驟使用膜例如中空纖維膜或者螺旋錯流膜，其分子量截留值足以使7S和12S蛋白質(zhì)保留在截留液中，而讓2S蛋白質(zhì)通過膜。膜的合適分子量截留值為約3,000至約150,000道爾頓，優(yōu)選約5,000至約100,000道爾頓。對于連續(xù)操作，確定膜的尺寸，以允許蛋白質(zhì)水溶液透過膜時能夠獲得期望的濃縮程度?？蓪崿F(xiàn)所述第一超濾步驟，以將蛋白質(zhì)水溶液濃縮約4至約20倍，蛋白質(zhì)濃度達至少約50g/L，優(yōu)選至少約200g/L，更優(yōu)選至少約250g/L。然后，可使用體積摩爾濃度和pH與浸提溶液相同的鹽水溶液，使?jié)饪s蛋白質(zhì)溶液進行滲析步驟。在滲析步驟的至少一部分過程中，在滲析介質(zhì)中可存在抗氧化劑，以抑制濃縮卡諾拉分離蛋白溶液中存在的酚類物質(zhì)的氧化。所述抗氧化劑可以是任何合宜的抗氧化劑，如亞硫酸鈉或者抗壞血酸。滲析介質(zhì)中采用的抗氧化劑的量取決于所采用的材料，可在約0.01至約1wt％的范圍變動，優(yōu)選為約0.05wt％。滲析步驟可通過使用約2至約20體積的滲析溶液，優(yōu)選約5至約10體積的滲析溶液來進行。在滲析操作中，2S蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)和可見顏色成分連同其他低分子量成分一起隨透過液通過膜，從而從濃縮蛋白質(zhì)溶液中除去。滲析步驟可用濃縮步驟所用的相同膜來進行。濃縮步驟和滲析步驟可在任何合宜的溫度下進行，通常為約20℃至約60℃，優(yōu)選低于約30℃，進行的時間足以實現(xiàn)期望的濃縮和洗滌程度。所用的溫度和其他條件在一定程度上取決于用以進行濃縮操作的膜設(shè)備和期望的溶液蛋白質(zhì)濃度。第一超濾步驟中所用的膜允許相當(dāng)比例的2S蛋白質(zhì)連同其他低分子量物質(zhì)一起通過而進入透過液中，所述其他低分子量物質(zhì)包括食品級鹽的離子、碳水化合物、酚類物質(zhì)、色素和抗?fàn)I養(yǎng)因子。視不同的膜材質(zhì)及形式而定，通常選定膜的分子量截斷值，以保證相當(dāng)比例的7S和12S蛋白質(zhì)得以保留在截留液中，同時又讓2S蛋白質(zhì)和污染物通過。然后可通過任何便利技術(shù)，如噴霧干燥法或冷凍干燥法，將濃縮步驟和任選滲析步驟所得的截留液干燥成干品。干燥蛋白的蛋白質(zhì)含量高，超過約90wt％蛋白質(zhì)，優(yōu)選至少約100wt％蛋白質(zhì)(N×6.25)，且基本不發(fā)生變性(通過差示掃描量熱法測定)。所述干燥分離蛋白主要由卡諾拉7S蛋白質(zhì)組成，還含有一些12S蛋白質(zhì)和可能少量的2S蛋白質(zhì)。一般來說，所述干燥卡諾拉分離蛋白含有約60至約95wt％的7S蛋白質(zhì)約2至約15wt％的12S蛋白質(zhì)0至約30wt％的2S蛋白質(zhì)優(yōu)選所述干燥卡諾拉分離蛋白含有約70至約90wt％的7S蛋白質(zhì)約5至約10wt％的12S蛋白質(zhì)0至約20wt％的2S蛋白質(zhì)將濃縮步驟和任選滲析步驟所得的透過液在第二超濾步驟中濃縮，使用膜例如中空纖維膜或者螺旋錯流膜，其具有合適的分子量截留值，以保留2S蛋白質(zhì)，同時讓低分子量物質(zhì)(包括鹽、酚類物質(zhì)、顏色成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子)通過膜。視不同的膜材質(zhì)及形式而定，可使用分子量截留值為約3,000至約30,000道爾頓，優(yōu)選約5,000至約10,000道爾頓的超濾膜。透過液在干燥前通常先濃縮至蛋白質(zhì)濃度為至少約50g/L，優(yōu)選約100至約400g/L，更優(yōu)選約200至約300g/L。如上文對蛋白質(zhì)溶液濃縮步驟所述，這種濃縮操作可以以分批模式進行，或者在連續(xù)操作中進行。可用水使?jié)饪s透過液進行滲析步驟。在滲析步驟的至少一部分過程中，在滲析介質(zhì)中可存在抗氧化劑，以抑制濃縮透過液中的酚類物質(zhì)的氧化。所述抗氧化劑可以是任何合宜的抗氧化劑，如亞硫酸鈉或者抗壞血酸。滲析介質(zhì)中采用的抗氧化劑的量取決于所采用的材料，可在約0.01至約1wt％的范圍變動，優(yōu)選為約0.05wt％。滲析步驟可通過使用2至20體積的滲析溶液，優(yōu)選約5至約10體積的滲析溶液來進行。在滲析操作中，更多的污染物，包括酚類物質(zhì)和可見顏色成分因通過滲析膜而從濃縮透過液中除去。滲析操作可進行至不能在透過液中除去更多的酚類物質(zhì)和可見顏色成分為止。滲析步驟可用濃縮步驟所用的相同膜來進行?；蛘呖墒褂脝为毜哪?，視不同的膜材質(zhì)及形式而定，所述膜的分子量截留值在約3000至約50,000道爾頓的范圍，優(yōu)選約5,000至約10,000道爾頓?？赏ㄟ^任何便利技術(shù)，如噴霧干燥法或冷凍干燥法，將濃縮和任選滲析過的透過液干燥成干品。干燥蛋白的蛋白質(zhì)含量高，超過約90wt％蛋白質(zhì)，優(yōu)選至少約100wt％蛋白質(zhì)(N×6.25)，且基本不發(fā)生變性(通過差示掃描量熱法測定)。所述干燥卡諾拉分離蛋白主要由卡諾拉2S蛋白質(zhì)組成，還含有少量的7S蛋白質(zhì)。一般來說，所述干燥卡諾拉分離蛋白含有約85至約100wt％的2S蛋白質(zhì)0至約15wt％的7S蛋白質(zhì)優(yōu)選約90至約100wt％的2S蛋白質(zhì)0至約10wt％的7S蛋白質(zhì)如果需要，可將一部分得自第一超濾步驟的濃縮卡諾拉分離蛋白與一部分得自第二超濾步驟的濃縮透過液合并，然后通過任何便利技術(shù)干燥合并的液流，以提供合并的卡諾拉分離蛋白組合物?？蛇x定混合在一起的蛋白質(zhì)類物質(zhì)的相對比例，以提供具有所需的2S/7S/12S蛋白質(zhì)分布的所得卡諾拉分離蛋白組合物。或者，可將干燥分離蛋白以任何所需比例合并，以在混合物中提供任何所需的特定2S/7S/12S蛋白質(zhì)分布。合并的卡諾拉分離蛋白組合物其蛋白質(zhì)含量高，超過約90wt％，優(yōu)選至少約100wt％(以N×6.25計算)，且基本不發(fā)生變性(通過差示掃描量熱法測定)。用這種方式操作，可將多種卡諾拉分離蛋白回收為不同比例的干燥混合物，以得自第一超濾的卡諾拉分離蛋白和得自第二超濾的卡諾拉分離蛋白的重量計，所述比例通常為約5∶95至約95∶5(重量)，這對于根據(jù)組合物中不同比例的2S/7S/12S蛋白質(zhì)獲得不同的功能和營養(yǎng)性質(zhì)來說是合乎需要的。
優(yōu)選實施方案的描述參照圖1，圖中顯示根據(jù)本發(fā)明的一個方面提供的新型二膜方法與通過膠束途徑形成卡諾拉分離蛋白(CPI)的對比。圖中可見，得自第一超濾階段(超濾#1，可包括超濾和滲析步驟)的截留液采取兩種方式中的一種進行加工。在本發(fā)明的二膜方法中，將截留液噴霧干燥，以提供主要由7S卡諾拉蛋白質(zhì)組成的卡諾拉分離蛋白。在上述美國專利申請第10/137,321號的程序中，使截留液通過稀釋步驟，在這當(dāng)中卡諾拉分離蛋白沉淀為蛋白質(zhì)膠束團。將所得蛋白質(zhì)膠束團噴霧干燥，以提供主要由7S卡諾拉蛋白質(zhì)組成的卡諾拉分離蛋白。在本發(fā)明的二膜方法中，使得自第一超濾步驟的透過液進行第二超濾步驟(超濾#2-A，可包括超濾和滲析)。將得自第二超濾步驟的截留液噴霧干燥，以提供主要由2S蛋白質(zhì)組成的卡諾拉分離蛋白。在US 10/137,321的方法中，將沉淀蛋白質(zhì)膠束團所得的上清液進行超濾步驟(超濾#2-B，可包括超濾和滲析)。將得自所述超濾步驟的截留液噴霧干燥，以提供主要由2S蛋白質(zhì)組成的卡諾拉分離蛋白。如上所述，可對得自后一超濾步驟的截留液進行熱處理，以減少截留液中7S蛋白質(zhì)的比例，提供本發(fā)明的新型卡諾拉分離蛋白。
實施例實施例1本實施例描述根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的新型卡諾拉分離蛋白的生產(chǎn)。在環(huán)境溫度下，將‘a(chǎn)’kg卡諾拉粕加入到‘b’L 0.1 M NaCl溶液中，攪拌30分鐘，以提供蛋白質(zhì)水溶液。除去殘余的卡諾拉粕，通過離心和過濾澄清所得蛋白質(zhì)溶液，以提供‘c’L過濾的蛋白質(zhì)溶液，其蛋白質(zhì)含量為‘d’％(重量)。將‘e’L的蛋白質(zhì)浸提溶液等分試樣通過在分子量截留值為5,000道爾頓的聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)膜上濃縮，使其體積減少至‘f’L，然后在相同的膜上用‘g’L 0.1M NaCl溶液進行滲析。接著將滲析的截留液在60℃下巴氏滅菌10分鐘。所得巴氏滅菌過的濃縮蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)含量為‘h’％(重量)。在‘i’℃下，將濃縮溶液以‘j’比例稀釋到溫度為‘k’℃的冷RO水中。立即形成白色云狀物，讓其沉析。移出上層稀釋用水，從沉析槽的底部回收沉淀、粘稠的粘性團塊(PMM)，得率為過濾蛋白質(zhì)溶液的‘l’wt％。測出得自干燥PMM的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)含量為‘m’％(N×6.25)d.b.。所得制品標(biāo)示為‘n’C300。兩次試驗的參數(shù)‘a(chǎn)’至‘n’在下表I中給出表I 用分子量截留值為10,000道爾頓的聚醚砜(PES)膜，通過超濾將移出的上清液的體積減少至‘o’L，然后在相同的膜上用‘p’L水滲析濃縮液。接著將滲析的濃縮液在60℃下巴氏滅菌10分鐘。所得巴氏滅菌過的濃縮液含有‘q’％(重量)的蛋白質(zhì)。加上從上清液回收的另外蛋白質(zhì)，過濾蛋白質(zhì)溶液的總蛋白質(zhì)回收率為‘r’wt％。將巴氏滅菌過的濃縮液分成兩等份。其中一份進行噴霧干燥，形成最終制品，標(biāo)示為‘n’C200，其蛋白質(zhì)含量為‘s’％(N×6.25)d.b.。兩次試驗的參數(shù)‘n’至‘s’在下表II中給出表II 另一份巴氏滅菌過的濃縮上清液加熱至85℃保持10分鐘，然后離心除去沉淀的蛋白質(zhì)。接著將所得濃縮液噴霧干燥，形成最終制品，標(biāo)示為‘n’C200H，其蛋白質(zhì)含量為‘t’％(N×6.25)。兩次試驗的參數(shù)‘n’和‘t’在下表III中給出表III
實施例2
本實施例顯示加熱溫度和時間對從濃縮上清液生產(chǎn)出的卡諾拉分離蛋白的蛋白質(zhì)分布的影響。如實施例1所述制備的批次SA035-J14-04A的C200卡諾拉分離蛋白用反滲透純凈水制備成溶液，其蛋白質(zhì)濃度為5wt％。所述溶液是通過在室溫下用磁力攪拌棒將蛋白質(zhì)和水一起攪拌1小時來制備的。將蛋白質(zhì)溶液樣品(25ml)裝在離心管中于溫控水浴中加熱。將各樣品在75、80、85、90或95℃下的溫度下加熱10分鐘。當(dāng)樣品的內(nèi)部溫度達到所需水平±1℃內(nèi)時開始計時，在整個加熱過程中不斷攪拌各樣品。熱處理后，將各樣品8,000g離心10分鐘，通過大小排阻HPLC分析上清液的蛋白質(zhì)分布。所得結(jié)果在下表IV中給出表IV-加熱至不同溫度的各C200溶液的蛋白質(zhì)分布 從表IV中給出的結(jié)果可見，所施加的所有熱處理導(dǎo)致樣品中7S蛋白質(zhì)顯著減少。在90℃下處理導(dǎo)致7S水平最低，將溫度提高到95℃并沒有更多的降低。經(jīng)大小排阻HPLC分析確定，熱處理對2S的峰面積幾乎沒有影響。這意味著熱處理導(dǎo)致2S蛋白質(zhì)損失最低。將蛋白質(zhì)溶液樣品(80ml)在與溫度設(shè)定為90℃的循環(huán)水浴連接的夾層容器中加熱，用磁力攪拌棒混合樣品。在加熱時間為5、10和15分鐘時移取加熱溶液的等分試樣。當(dāng)測出樣品的溫度為85℃時開始計時。熱處理后，將收集的各樣品在8,000g下離心10分鐘，上清液提交分析。所得結(jié)果在下表V中給出
表V-加熱不同時間長度的各C200溶液的蛋白質(zhì)分布 從表V中給出的結(jié)果可見，任何測試時間的樣品中7S蛋白質(zhì)水平?jīng)]有顯著性差異。從本實施例得出的結(jié)果明顯可見，可采用多種加熱條件，實現(xiàn)濃縮上清液中7S蛋白質(zhì)水平的顯著下降。
實施例3
本實施例對根據(jù)實施例1生產(chǎn)的卡諾拉分離蛋白的蛋白質(zhì)分布進行評估。用大小排阻HPLC評估根據(jù)實施例1的程序生產(chǎn)的濃縮上清液和改良濃縮上清液的蛋白質(zhì)分布。噴霧干燥制品在進行HPLC分析前先以1wt％的水平溶于0.1M NaCl中。所得結(jié)果在下表VI中給出表VI 從表VI中給出的結(jié)果可見，與沒有進行這種熱處理相比，濃縮上清液的熱處理導(dǎo)致噴霧干燥的卡諾拉分離蛋白中7S蛋白質(zhì)的量顯著減少。
實施例4
本實施例對實施例1生產(chǎn)出的卡諾拉分離蛋白的溶解度進行評估。按實施例1程序生產(chǎn)出的噴霧干燥濃縮上清液(C200)和改良濃縮上清液(C200H)的溶解度，用Morr等，J.Food Sci.501715-1718的方法的修改版本進行測定。將足夠提供0.5g蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)粉末稱至燒杯中，然后加入少量的反滲透(RO)純凈水，將所得混合物攪拌至形成均勻糊狀物。然后再加入水，使體積達到約45ml。接著用磁力攪拌器慢慢攪拌燒杯中的內(nèi)容物60分鐘。在蛋白質(zhì)分散后立即測定pH，并用NaOH或HCl將pH調(diào)至適當(dāng)水平(4、5、6或7)。同時制備自然pH下的樣品。對于進行過pH調(diào)節(jié)的樣品，在60分鐘攪拌過程中測量和校正pH兩次。攪拌60分鐘后，用RO水將各樣品定容至50ml的總體積，得1％w/v的蛋白質(zhì)分散液。保留蛋白質(zhì)分散液的等分試樣，供用Leco FA28定氮儀通過Leco分析測定蛋白質(zhì)含量。將另一部分樣品在8000g下離心10分鐘。這沉淀出任何不溶物質(zhì)，得到澄清的上清液。然后通過Leco分析測定上清液的蛋白質(zhì)含量。
溶解度(％)＝(上清液蛋白質(zhì)濃度/原始分散液蛋白質(zhì)濃度)×100
所得結(jié)果在下表VII中給出表VII 從表VII中給出的結(jié)果可見，比起得自濃縮上清液(C200)的干燥分離蛋白，得自改良濃縮上清液(C200H)的干燥分離蛋白在各種pH值下明顯地更溶于水。
實施例5
本實施例對實施例1生產(chǎn)出的卡諾拉分離蛋白在軟飲料中的溶解度進行評估。按實施例1程序生產(chǎn)出的噴霧干燥濃縮上清液和改良濃縮上清液在軟飲料中的溶解度，用Morr等，J.Food Sci.501715-1718的方法的修改版本進行測定。將足夠提供1.0g蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)粉末稱至燒杯中，然后加入少量無色透明的市售充碳酸氣軟飲料，將所得混合物攪拌至形成均勻糊狀物。然后再加入水，使體積達到約45ml。接著用磁力攪拌器慢慢攪拌燒杯中的內(nèi)容物60分鐘。攪拌60分鐘后，用軟飲料將各樣品定容至50ml的總體積，得2％w/v的蛋白質(zhì)分散液。保留蛋白質(zhì)分散液的等分試樣，供通過Leco分析測定蛋白質(zhì)含量。將另一部分樣品在8000g下離心10分鐘。這沉淀出任何不溶物質(zhì)，得到澄清的上清液。然后通過Leco分析測定上清液的蛋白質(zhì)含量。
溶解度(％)＝(上清液蛋白質(zhì)濃度/原始分散液蛋白質(zhì)濃度)×100
所得結(jié)果在下表VIII中給出表VIII 從表VIII中給出的結(jié)果可見，得自改良濃縮上清液(C200H)和濃縮上清液(C200)的干燥分離蛋白在軟飲料中具有近似的溶解度。但是，從以下實施例6的結(jié)果可見，從得自改良濃縮上清液的干燥分離蛋白制備的溶液其澄清度更為優(yōu)越。
實施例6
本實施例評估實施例1生產(chǎn)出的噴霧干燥分離蛋白溶于軟飲料中所得溶液的澄清度。對得自如實施例1所述生產(chǎn)出的改良濃縮上清液和濃縮上清液的噴霧干燥分離蛋白在軟飲料中所成溶液的澄清度進行測定。所述澄清度是通過測量2％w/v蛋白質(zhì)在無色透明的市售充碳酸氣軟飲料中的溶液對600nm可見光的吸光度來評估的。吸光度讀數(shù)越低，光線透過得越好，溶液的澄清度也越好。所得結(jié)果在下表IX中給出表IX 從表IX中給出的結(jié)果可見，從得自改良濃縮上清液(C200H)的噴霧干燥分離蛋白制備的溶液，其澄清度比從得自濃縮上清液(C200)的噴霧干燥分離蛋白制備的溶液要優(yōu)越得多。
實施例7
本實施例說明用以形成本發(fā)明新型卡諾拉分離蛋白的替代性方法(圖1)。在環(huán)境溫度下，在350L浸提灌中將15kg卡諾拉油籽粕加入到含0.05wt％抗壞血酸的100L(15％w/v)0.15M氯化鈉溶液中，將所得混合物攪拌30分鐘，以提供濃度為20g/L的卡諾拉蛋白質(zhì)溶液。用帶400目袋的籃式離心機除去大體積殘余粕，分離出的大體積粕作廢物棄去。用600目袋使卡諾拉蛋白質(zhì)溶液再次通過籃式離心機除去懸浮的細微顆粒。所得卡諾拉蛋白質(zhì)溶液用帶2μm過濾墊的壓濾機進行最終過濾。在環(huán)境溫度下，用分子量截留值為100,000道爾頓的螺旋錯流聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)膜使澄清的卡諾拉蛋白質(zhì)溶液進行超濾步驟，以將含7S和12S蛋白質(zhì)的卡諾拉蛋白質(zhì)溶液濃縮至體積為4.3L，蛋白質(zhì)濃度為188g/L。超濾步驟的透過液含有2S蛋白質(zhì)以及其他低分子量物質(zhì)。然后用超濾所用的相同膜，用含0.05wt％抗壞血酸的0.15M氯化鈉水溶液，使?jié)饪s的卡諾拉蛋白質(zhì)溶液(截留液)進行滲析步驟。滲析介質(zhì)加入到截留液中的流速和透過液從膜中除去的流速相同。用5倍截留液體積的滲析介質(zhì)進行滲析。將超濾和滲析操作所得的截留液取1.25L等分試樣進行噴霧干燥，以提供主要由7S蛋白質(zhì)組成的卡諾拉分離蛋白，其蛋白質(zhì)含量為99.1wt％(N×6.25，氮的百分含量用Leco FP528定氮儀來測定)d.b.，含有18.21wt％的2S蛋白質(zhì)，74.55wt％的7S蛋白質(zhì)和7.24wt％的12S蛋白質(zhì)。用分子量截留值為5000道爾頓的螺旋錯流聚醚砜(PES)膜，將超濾和滲析操作所得的透過液進行超濾步驟，以讓2S蛋白質(zhì)保留下來，讓低分子量污染物通過膜成為廢物。在環(huán)境溫度下進行這個超濾步驟，以將第一超濾步驟所得的含2S透過液濃縮至3L，蛋白質(zhì)濃度為125g/L。然后用超濾所用的相同膜和用過濾的自來水作為滲析介質(zhì)，使?jié)饪s的卡諾拉2S蛋白質(zhì)溶液(截留液)進行滲析步驟。水加入到截留液中的流速和透過液從膜中除去的流速相同。用5倍截留液體積的滲析介質(zhì)進行滲析。將滲析步驟所得的截留液進行噴霧干燥，以提供主要由2S蛋白質(zhì)組成的卡諾拉分離蛋白，其蛋白質(zhì)含量為105.8wt％(N×6.25)d.b.，含有96.7wt％的2S蛋白質(zhì)，3.3wt％的7S蛋白質(zhì)和0.04wt％的12S蛋白質(zhì)。
實施例8
本實施例是實施例7的方法的重復(fù)，但規(guī)模更大。在環(huán)境溫度下，在10,000L浸提灌中將150kg卡諾拉油籽粕加入到含0.05wt％抗壞血酸的1000L(15％w/v)0.15M氯化鈉溶液中，將所得混合物攪拌30分鐘，以提供濃度為20.7g/L的卡諾拉蛋白質(zhì)溶液。用真空過濾帶除去大體積殘余粕，分離出的粕作廢物棄去。用碟式離心機澄清卡諾拉蛋白質(zhì)溶液，清除出的固形物作廢物棄去。所得卡諾拉蛋白質(zhì)溶液用帶2μm過濾墊的壓濾機和接著用帶0.2μm過濾墊的另一壓濾機進行最終過濾。用兩張分子量截留值為100,000道爾頓的螺旋錯流PVDF膜使澄清的卡諾拉蛋白質(zhì)溶液進行超濾步驟，以將含7S和12S蛋白質(zhì)的卡諾拉蛋白質(zhì)溶液濃縮至體積為41.1L，蛋白質(zhì)濃度為221g/L。超濾步驟出來的透過液含有2S蛋白質(zhì)以及其他低分子量物質(zhì)。將超濾操作所得的截留液取3L等分試樣進行噴霧干燥，以提供主要由7S蛋白質(zhì)組成的卡諾拉分離蛋白，其蛋白質(zhì)含量為95.1wt％(N×6.25)d.b.，含有26.86wt％的2S蛋白質(zhì)，66.22wt％的7S蛋白質(zhì)和6.92wt％的12S蛋白質(zhì)。用兩張分子量截留值為5,000道爾頓的螺旋錯流PVDF膜，將超濾操作所得的透過液進行超濾步驟，以讓2S蛋白質(zhì)保留下來，讓低分子量污染物通過膜成為廢物。在環(huán)境溫度下進行這個超濾步驟，以將第一超濾步驟所得的含2S透過液濃縮至25L，蛋白質(zhì)濃度為24.2g/L。將超濾步驟所得的截留液進行噴霧干燥，以形成非滲析的卡諾拉蛋白質(zhì)制品，其蛋白質(zhì)濃度為47.94wt％(N×6.25)d.b.，含有94.64wt％的2S蛋白質(zhì)，5.36wt％的7S蛋白質(zhì)和0wt％的12S蛋白質(zhì)。后一卡諾拉蛋白質(zhì)制品蛋白質(zhì)含量低是因為沒有進行滲析步驟以除去鹽和其他雜質(zhì)。此制品后來的臺式滲析得出的結(jié)果說明卡諾拉分離蛋白的生產(chǎn)需要經(jīng)過滲析。
實施例9
本實施例提供根據(jù)實施例7程序制備的卡諾拉分離蛋白制品與通過膠束途徑制備的卡諾拉分離蛋白制品的比較。將得自實施例7所述第一超濾步驟的截留液的34L整分試樣升溫至29.8℃，并以每體積截留液10體積水的比例倒入溫度為3.7℃的冷水中。立即形成蛋白質(zhì)膠束白色云狀物。讓膠束聚結(jié)沉析過夜。使積聚的蛋白質(zhì)膠束團與上清液分離并噴霧干燥，以提供蛋白質(zhì)含量為107.4wt％(N×6.25)d.b.的卡諾拉分離蛋白，其含有3.80wt％的2S蛋白質(zhì)，85.88wt％的7S蛋白質(zhì)和10.32wt％的12S蛋白質(zhì)。用分子量截留值為5000道爾頓的螺旋錯流PVDF膜，使得自PMM沉析步驟的上清液(365L)進行超濾步驟，讓2S蛋白質(zhì)和7S蛋白質(zhì)保留下來，而讓低分子量污染物通過膜成為廢物。在環(huán)境溫度下進行這個超濾步驟，以將上清液濃縮至22L，蛋白質(zhì)含量為89.3g/L。將濃縮上清液噴霧干燥，以提供主要由2S蛋白質(zhì)組成的卡諾拉分離蛋白，其蛋白質(zhì)含量為95.51wt％(N×6.25)d.b.，含有84.01wt％的2S蛋白質(zhì)，15.51wt％的7S蛋白質(zhì)和0.48wt％的12S蛋白質(zhì)。
本公開內(nèi)容的總結(jié)
現(xiàn)總結(jié)本公開內(nèi)容如下，本發(fā)明提供了2S蛋白質(zhì)含量提高，7S蛋白質(zhì)含量減少的新型卡諾拉分離蛋白，所述新型卡諾拉分離蛋白在生產(chǎn)澄清水溶液特別是軟飲料中有用。在本發(fā)明的范圍內(nèi)可能有各種修改方案。
權(quán)利要求
1.一種卡諾拉分離蛋白，所述卡諾拉分離蛋白主要由2S卡諾拉蛋白質(zhì)組成，以干重計(d.b.)蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％(N×6.25)，與主要由2S卡諾拉蛋白質(zhì)組成、得自卡諾拉蛋白質(zhì)膠束形成和沉淀所得含水上清液的卡諾拉分離蛋白相比，其2S卡諾拉蛋白質(zhì)比例提高，7S卡諾拉蛋白質(zhì)比例下降。
2.權(quán)利要求1的卡諾拉分離蛋白，所述卡諾拉分離蛋白得自對所述含水上清液的熱處理。
3.權(quán)利要求1的卡諾拉分離蛋白，所述卡諾拉分離蛋白得自選擇性膜程序，其中將得自卡諾拉油籽粕和含有12S、7S和2S卡諾拉蛋白質(zhì)的卡諾拉蛋白質(zhì)水溶液進行第一選擇性膜技術(shù)，所述第一選擇性膜技術(shù)選擇性地將12S和7S卡諾拉蛋白質(zhì)保留在截留液中，而讓2S蛋白質(zhì)作為透過液通過膜，使所述透過液進行第二選擇性膜技術(shù)，所述第二選擇性膜技術(shù)選擇性地保留2S卡諾拉蛋白質(zhì)，而讓低分子量污染物作為透過液通過膜，并將得自第二選擇性膜技術(shù)的截留液干燥。
4.權(quán)利要求1的卡諾拉分離蛋白，所述卡諾拉分離蛋白的蛋白質(zhì)含量為至少約100wt％(N×6.25)d.b.。
5.一種卡諾拉分離蛋白，所述卡諾拉分離蛋白其蛋白質(zhì)含量以干重計(d.b.)為至少約90wt％(N×6.25)，且所述分離蛋白中存在的卡諾拉蛋白中含有至少約85wt％的2S卡諾拉蛋白質(zhì)和低于約15wt％的7S卡諾拉蛋白質(zhì)。
6.權(quán)利要求5的卡諾拉分離蛋白，其中所述分離蛋白中存在的卡諾拉蛋白中含有至少約90wt％的2S卡諾拉蛋白質(zhì)和低于約10wt％的7S卡諾拉蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求5的卡諾拉分離蛋白，所述卡諾拉分離蛋白的蛋白質(zhì)含量為至少約100wt％(N×6.25)d.b.。
8.一種制備2S卡諾拉蛋白質(zhì)比例提高的卡諾拉分離蛋白的方法，所述方法包括(a)提供主要由2S蛋白質(zhì)組成的2S和7S蛋白質(zhì)水溶液，(b)對所述水溶液進行熱處理，使7S卡諾拉蛋白質(zhì)沉淀，(c)從所述水溶液中除去降解的7S蛋白質(zhì)，(d)回收蛋白質(zhì)含量至少約90wt％(N×6.25)d.b.、2S卡諾拉蛋白質(zhì)比例提高的卡諾拉分離蛋白。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述熱處理步驟在足以降解所述水溶液中所存在的至少約50wt％的7S卡諾拉蛋白質(zhì)的溫度和時間條件下進行。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述熱處理步驟降解所述水溶液中存在的7S卡諾拉蛋白質(zhì)的至少75wt％的7S卡諾拉蛋白質(zhì)。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述熱處理步驟通過在約75°至約95℃的溫度下加熱所述水溶液約5至約15分鐘來實現(xiàn)。
12.權(quán)利要求8的方法，其中所述2S和7S卡諾拉蛋白質(zhì)水溶液是得自卡諾拉蛋白質(zhì)膠束形成和沉淀的濃縮上清液。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述卡諾拉蛋白質(zhì)膠束形成如下實現(xiàn)(a)在至少約5℃的溫度下浸提卡諾拉油籽粕，導(dǎo)致所述卡諾拉油籽粕中的蛋白質(zhì)溶解，形成蛋白質(zhì)水溶液，(b)使所述蛋白質(zhì)水溶液與殘余油籽粕分離，(c)通過選擇性膜技術(shù)，將所述蛋白質(zhì)水溶液的濃度提高到至少約200g/L，同時保持離子強度基本不變，以提供濃縮蛋白質(zhì)溶液，(d)將所述濃縮蛋白質(zhì)溶液稀釋到溫度低于約15℃的冷水中，導(dǎo)致蛋白質(zhì)膠束形成，(e)將上清液與沉析的蛋白質(zhì)膠束團分離。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述上清液在進行所述熱處理之前先濃縮至蛋白質(zhì)濃度為約100至約400g/L。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述上清液濃縮至蛋白質(zhì)濃度為約200至約300g/L。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述濃縮步驟通過用分子量截留值為約3,000至約100,000道爾頓的膜進行超濾來實現(xiàn)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中超濾所得的所述濃縮上清液在進行所述熱處理步驟之前先進行滲析。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述滲析步驟用約2至約20體積，優(yōu)選約5至約10體積的水，用分子量截留值為約3,000至約100,000道爾頓的膜來進行。
19.權(quán)利要求8的方法，其中所述卡諾拉分離蛋白的蛋白質(zhì)含量為至少約100wt％(N×6.25)d.b.。
20.一種制備卡諾拉分離蛋白的方法，所述方法包括(a)提供得自卡諾拉油籽粕，含有12S、7S和2S卡諾拉蛋白質(zhì)的卡諾拉蛋白質(zhì)水溶液，(b)使用有效保留7S和12S卡諾拉蛋白質(zhì)在截留液中，而讓2S蛋白質(zhì)作為透過液通過膜的選擇性膜技術(shù)，提高所述水溶液的蛋白質(zhì)濃度，以提供濃縮蛋白質(zhì)溶液，(c)干燥步驟(b)所得的截留液，以提供主要由7S卡諾拉蛋白質(zhì)組成、以干重計(d.b.)蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％(N×6.25)的卡諾拉分離蛋白，(d)使用有效保留2S卡諾拉蛋白質(zhì)在截留液中，而讓低分子量污染物質(zhì)通過膜進入透過液的選擇性膜技術(shù)，提高步驟(a)所得的透過液的濃度，(e)干燥步驟(d)所得的截留液，以提供主要由2S卡諾拉蛋白質(zhì)組成、蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％(N×6.25)d.b.的卡諾拉分離蛋白。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述卡諾拉蛋白質(zhì)水溶液如下提供在至少約5℃的溫度下浸提卡諾拉油籽粕，導(dǎo)致所述卡諾拉油籽粕中的蛋白質(zhì)溶解，形成蛋白質(zhì)含量約5至約40g/L、pH約5至約6.8的蛋白質(zhì)水溶液，并將所述蛋白質(zhì)水溶液與殘余油籽粕分離。
22.權(quán)利要求21的方法，其中步驟(b)如下實現(xiàn)用分子量截留值為約30,000至約150,000道爾頓，優(yōu)選約50,000至約100,000道爾頓的超濾膜，將所述水溶液濃縮至蛋白質(zhì)含量為至少約200g/L，同時保持離子強度基本不變，以提供濃縮蛋白質(zhì)溶液。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述濃縮蛋白質(zhì)溶液用約2至約20，優(yōu)選約5至約10體積的滲析溶液進行滲析步驟。
24.權(quán)利要求23的方法，其中步驟(d)如下實現(xiàn)用分子量截留值為約3,000至約30,000道爾頓、優(yōu)選約5,000至約10,000道爾頓的膜，將透過液的濃度提高到蛋白質(zhì)濃度為約100至約400g/L，優(yōu)選約200至約300g/L，以提供截留液。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述截留液用約2至約20，優(yōu)選約5至約10體積的滲析溶液進行滲析步驟。
26.權(quán)利要求20的方法，其中至少步驟(c)和(e)生產(chǎn)出的卡諾拉分離蛋白之一具有至少約100wt％的蛋白質(zhì)含量。
27.權(quán)利要求1的卡諾拉分離蛋白的水溶液。
28.權(quán)利要求27的水溶液，所述水溶液是卡諾拉分離蛋白強化的軟飲料。
29.權(quán)利要求5的卡諾拉分離蛋白的水溶液。
30.權(quán)利要求29的水溶液，所述水溶液是卡諾拉分離蛋白強化的軟飲料。
全文摘要
一種主要由2S卡諾拉蛋白質(zhì)組成、溶解度性質(zhì)改善的新型卡諾拉分離蛋白，其2S卡諾拉蛋白質(zhì)比例提高，7S卡諾拉蛋白質(zhì)比例下降。所述新型卡諾拉分離蛋白通過對得自卡諾拉蛋白質(zhì)膠束形成和沉淀的含水上清液進行熱處理，促使7S蛋白質(zhì)沉淀并將其沉析除去來形成?；蛘咚鲂滦涂ㄖZ拉分離蛋白可得自選擇性膜程序，其中將含有12S、7S和2S卡諾拉蛋白質(zhì)的卡諾拉蛋白質(zhì)水溶液進行第一選擇性膜技術(shù)，以將12S和7S卡諾拉蛋白質(zhì)保留在截留液中，所述截留液進行干燥，以提供主要由7S卡諾拉蛋白質(zhì)組成的卡諾拉分離蛋白，所述膜技術(shù)同時讓2S卡諾拉蛋白質(zhì)作為透過液通過膜，使所述透過液進行第二選擇性膜技術(shù)，以保留2S卡諾拉蛋白質(zhì)，而讓低分子量污染物通過膜，并將后一膜技術(shù)所得的截留液干燥。
文檔編號A23L1/30GK1933738SQ200580008603
公開日2007年3月21日 申請日期2005年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月20日
發(fā)明者M·施維策爾, B·E·格林, K·I·塞加爾, R·維拉德森 申請人:伯康營養(yǎng)科學(xué)(Mb)公司