專利名稱:涉及等電沉淀的卡諾拉分離蛋白的制備的制作方法
涉及等電沉淀的卡諾拉分離蛋白的制備
相關(guān)申請的參考
基于35USC 119(e)，本申請要求于2005年9月21日提交的美國臨時專利申請N0.60/718, 754 的優(yōu)先權(quán)。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及從油籽粉，特別是卡諾拉油籽粉中制備分離蛋白。
發(fā)明的背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)讓給其受讓人且其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中的美國專利Nos.5，844，086和6，005，076( “Murray II ”)，描述了一種從具有顯著油脂含量的油籽粉，包括具有該含量的卡諾拉油籽粉中分離出分離蛋白的方法。該方法涉及的步驟包括從油籽粉中溶解蛋白質(zhì)類材料，該步驟也使粗粉中的油脂溶解，并從得到的蛋白質(zhì)水溶液中去除油脂。蛋白水溶液可以在脫脂的步驟之前或之后從油籽粉殘留物中分離出來。然后將經(jīng)脫脂的蛋白溶液濃縮以提高蛋白質(zhì)濃度，同時維持離子強(qiáng)度基本恒定，之后可對濃縮蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行進(jìn)一步的脫脂步驟。然后將濃縮的蛋白質(zhì)溶液稀釋，從而作為膠束形式的不連續(xù)蛋白質(zhì)滴，形成高度凝聚蛋白分子的霧狀塊。允許將蛋白質(zhì)膠束沉淀以形成凝聚、聚結(jié)、濃稠、無定型、粘性的面筋樣分離蛋白塊，稱為“蛋白膠束塊”或PMM，將其與殘留物的水相部分分離并干燥。
該分離對比具有至少約90wt%的蛋白質(zhì)含量(通過凱氏法或當(dāng)量法NX6.25測量)，基本上是未變性的(通過差示掃描量熱儀測量)，并具有低殘余油脂含量。本文使用的術(shù)語“蛋白含量”指基于干重表示的分離蛋白中的蛋白質(zhì)量。使用該方法所獲得的分離蛋白的產(chǎn)量，以作為干分離蛋白回收的從油籽粉中提取的蛋白質(zhì)的比例計，通常小于40wt%，典型地為約20wt%。
開發(fā)前述專利中描述的方法，作為對如美國專利4，208，323 (Murray IB)中所述的從各種蛋白質(zhì)原料包括油籽形成分離蛋白的方法的修改和改善，所述專利的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。在美國專利4，208，323授權(quán)的1980年，可獲得的油籽粉沒有在MurrayII專利時期的卡諾拉油籽粉的油脂污染水平，并且，因此美國專利4，208，323的方法不能根據(jù)Murray II方法而從這種加工油籽粉中生產(chǎn)出蛋白含量大于90wt%的蛋白質(zhì)類物質(zhì)。在美國專利4，208，323中沒有使用芥菜籽(卡諾拉)粉作為起始材料實施任何特定實驗的描述。
美國專利4，208, 323其自身被設(shè)計為美國專利Nos.4，169，090和4，285，862 (Murray LA)中描述方法的改進(jìn)，其通過引用結(jié)合到本文中，通過引入稀釋之前的濃縮步驟以形成PMM。使用后一個步驟可相對Murray LA方法提高大約20%的分離蛋白
的產(chǎn)量。
在2002年5月3日提交的共同待審的美國專利申請Nos.10/137，391 (美國專利申請公開N0.20030125526)和2004年6月9日提交的10/476，230 (美國專利申請公開N0.20040254353) (W002/089597)中，轉(zhuǎn)讓給其受讓人并且其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中，描述了一種包含至少約100wt%蛋白質(zhì)(NxX6.25)的高純度分離蛋白的生產(chǎn)方法。在前述美國專利申請中，分離蛋白通過下述方法制得，其中將油籽粉用食品級鹽溶液提取，如果需要，所得的蛋白溶液在用色素吸附劑初始處理后，濃縮到至少為約200g/L的蛋白含量，并將濃縮蛋白溶液稀釋于冷水中以形成蛋白膠束，允許該蛋白膠束沉淀以形成凝聚的、聚結(jié)的、濃厚無定型的、面筋樣分離蛋白塊，稱為“蛋白膠束塊”或PMM，其與殘留水相部分分離并可原樣應(yīng)用或干燥。
上述方法的一個實施方案中，如美國專利申請Nos.10/137, 391和10/476,320中的具體描述，處理得自PMM沉淀步驟的上清液，從而從濕PMM和上清液中回收包含干燥蛋白的分離蛋白。此方法可以通過最初使用超濾膜將上清液濃縮，將濃縮上清液和濕PMM混合并干燥混合物而實現(xiàn)。所得的卡諾拉分離蛋白具有高純度，至少約90wt%，優(yōu)選至少約IOOwt% 的蛋白(Nx6.25) o
在上述方法的另一個實施方案中，如美國專利申請Nos.10/137，391和10/476，230中的具體描述，處理得自PMM沉淀步驟的上清液，以變從上清液中回收蛋白。此方法可以通過最初使用超濾膜將上清液濃縮，并干燥濃縮物而實現(xiàn)。所得的卡諾拉分離蛋白具有高純度，至少約90wt%,優(yōu)選至少約IOOwt%的蛋白(Nx6.25)。
前述美國專利申請中描述的方法基本上是分批方法。在2002年11月19日提交的共同待審的美國專利申請N0.10/298,678(美國專利公開號N0.20040039174)(W003/043439)中，其轉(zhuǎn)讓給其受讓人且其公開內(nèi)容通過弓I用結(jié)合到本文中，描述了一種用于制造卡諾拉分離蛋白的連續(xù)方法。根據(jù)該申請，將卡諾拉油籽粉和鹽溶液連續(xù)混合，通過管運送混合物，同時從卡諾拉油籽粉中提取分離蛋白以形成蛋白水溶液，將卡諾拉油籽粉殘留物與蛋白水溶液連續(xù)分離，通過選擇性膜操作連續(xù)運送蛋白水溶液，以提高蛋白水溶液中的蛋白含量到至少約200g/L，同時保持離子強(qiáng)度基本恒定，將所得的濃縮蛋白溶液和冷水連續(xù)混合，從而導(dǎo)致形成蛋白質(zhì)膠束，且允許蛋白質(zhì)膠束連續(xù)沉淀，同時使上清液連續(xù)地溢出直到在沉淀槽中聚集了預(yù)期量的PMM。將PMM從沉淀槽中去除，并可進(jìn)行干燥。該P(yáng)MM具有至少約90wt% (Nx6.25)，優(yōu)選至少約IOOwt %的蛋白質(zhì)含量。
在這種方法中，卡諾拉分離蛋白通過用冷水稀釋濃縮蛋白溶液從而沉淀PMM而回收的。此外，可以從來自PMM沉淀步驟的上清液中回收更多的卡諾拉分離蛋白。
如共同待審的美國專利申請N0.11/038，086 (美國專利公開號N0.2005018112)(W02005/067729)中所描述，其轉(zhuǎn)讓給其受讓人并且其證據(jù)通過引用結(jié)合到本文中，從PMM沉淀步驟得到的上清液可以經(jīng)熱處理以使得7S和12S蛋白從上清液中沉淀。隨后從經(jīng)熱處理的上清液中回收的2S蛋白在具有各種pH值的含水介質(zhì)中具有改善的溶解性，能夠為軟飲料溶液提供改善的澄清度，從而提供澄清的蛋白強(qiáng)化軟飲料。
發(fā)明概述
目前，驚奇地發(fā)現(xiàn)，假如將濃縮卡諾拉蛋白溶液酸化，即沉淀出組成上與通過PMM途徑獲得的卡諾拉分離蛋白類似的卡諾拉分離蛋白，隨后，在分離沉淀出的卡諾拉分離蛋白后，可處理上清液 以獲得組成上與從PMM沉淀上清液獲得的卡諾拉分離蛋白類似的其它卡諾拉分離蛋白。從而該方法代表從濃縮蛋白溶液中獲得卡諾拉分離蛋白的替代方式。由等電沉淀方法所產(chǎn)生的一個好處是生產(chǎn)出的卡諾拉分離蛋白與PMM-衍生的分離蛋白相t匕，具有明顯更高的水結(jié)合能力。
在本發(fā)明另一方面的一個替代方法中，可以通過在鹽水溶液中重懸PMM并酸化所得的溶液，從而將PMM轉(zhuǎn)化成等電沉淀。PMM可以從濕團(tuán)塊或較不優(yōu)選干分離物再次懸浮。該方法生產(chǎn)出的等電沉淀卡諾拉分離蛋白與轉(zhuǎn)化成等電沉淀的PMM物質(zhì)相比，具有高得多的水結(jié)合能力。
本發(fā)明的另一方面，在濃縮步驟之前產(chǎn)生等電沉淀，并處理從等電沉淀得到的上清液以進(jìn)一步從中回收分離蛋白。
因此在本發(fā)明的一個方面，提供了一種制備分離蛋白的方法，包括(a)提取油籽粉以使得油籽粉中的蛋白溶解并形成pH為約5-約6.8的蛋白水溶液；(b)將油籽粉殘留物與蛋白水溶液分離；(c)酸化蛋白水溶液以便從中沉淀蛋白含量至少為約90wt% (Nx6.25)的分離蛋白；和(d)將上清液與沉淀的分離蛋白分離。
本發(fā)明尤其涉及卡 諾拉分離蛋白的制備。因此，本發(fā)明的另一個方面提供了一種制備卡諾拉分離蛋白的方法，包括(a)提取卡諾拉油籽粉以使卡諾拉油籽粉中的卡諾拉蛋白溶解并形成PH為約5-約6.8的蛋白水溶液；(b)將卡諾拉油籽粉殘留物與蛋白水溶液分離；(c)酸化蛋白水溶液至pH值至約3-約4以從中沉淀蛋白含量至少為約90wt%(Nx6.25)且主要由7S卡諾拉蛋白組成的卡諾拉分離蛋白；和(d)將上清液與沉淀的卡諾拉分離蛋白分離。
基于本發(fā)明的一個進(jìn)一步的方面，提供了一種制備分離蛋白的方法，其包括(a)提取油籽粉以便使油籽粉中的卡諾拉蛋白溶解并形成pH為約5-約6.8的蛋白水溶液；
(b)將油籽粉殘留物與蛋白水溶液分離；(c)通過使用選擇性膜技術(shù)提高蛋白水溶液的蛋白質(zhì)含量，同時維持離子強(qiáng)度基本恒定，從而提供濃縮的蛋白溶液；(d)將濃縮蛋白溶液稀釋到溫度低于約15°C的冷水中以在水溶液中形成膠束形式的不連續(xù)蛋白顆粒；(e)沉降蛋白膠束以形成無定型的、粘性、膠狀、面筋樣蛋白膠束塊；(f)從上清液中分離蛋白膠束塊，該蛋白膠束塊具有至少約90wt%、優(yōu)選至少約100wt% (Nx6.25)的蛋白質(zhì)含量；(g)形成蛋白質(zhì)膠束塊的水溶液；(h)酸化蛋白膠束塊的水溶液以便從中沉淀蛋白含量至少為約90wt%,優(yōu)選至少約100wt% (Nx6.25)的分離蛋白；以及(i)將上清液與沉淀的分離蛋白分離。
本文所述方法生產(chǎn)的卡諾拉分離蛋白可以用于傳統(tǒng)和新的分離蛋白應(yīng)用中，例如加工食品的蛋白強(qiáng)化、油脂乳化、焙烤制品中的成型劑(body former)和充氣產(chǎn)品中的發(fā)泡齊U。此外，可以將分離蛋白成型為蛋白纖維，用于肉類似物中，也可以作為卵白替代物或補(bǔ)充劑用于卵白作為粘合劑的食物產(chǎn)品中。從下列給出的數(shù)據(jù)中可以看出，發(fā)現(xiàn)等電沉淀卡諾拉分離蛋白作為水結(jié)合劑/增稠劑特別有用。發(fā)現(xiàn)衍生自上清液的卡諾拉分離蛋白尤其可用于酸化飲料，包括澄清的蛋白強(qiáng)化軟飲料?？ㄖZ拉分離蛋白可以用作營養(yǎng)增補(bǔ)劑。卡諾拉分離蛋白的其它用途是用于寵物食品，動物飼料和工業(yè)以及化妝品應(yīng)用和個人護(hù)理產(chǎn)品中。
本發(fā)明的一般描述
分離卡諾拉分離蛋白方法的起始步驟涉及從油籽粉，特別是卡諾拉粉中溶解蛋白質(zhì)類物質(zhì)，盡管該方法可以應(yīng)用于其它油籽粉，例如大豆、傳統(tǒng)的油菜籽、傳統(tǒng)的亞麻，Linola 、葵花和芥子油籽粉。本文更詳細(xì)的描述了關(guān)于卡諾拉油籽粉的本發(fā)明。
從卡諾拉油籽粉中回收的蛋白質(zhì)類物質(zhì)可以是卡諾拉種子中天然存在的蛋白質(zhì)，或者蛋白質(zhì)類物質(zhì)可以是經(jīng)過遺傳操作修飾但仍然具有天然蛋白的疏水和極性特征的蛋白?？ㄖZ拉油籽也通稱為油菜籽或油料油菜種子。
通過使用食品級鹽溶液最高效地實現(xiàn)蛋白質(zhì)的溶解，因為鹽的存在增強(qiáng)可溶性蛋白從油籽粉中的離開。如果打算將卡諾拉分離蛋白用作非食品用途，那么可以使用非食品級化學(xué)品。食品級鹽通常是氯化鈉，盡管可以使用其它鹽類例如氯化鉀。食品級鹽溶液具有至少約0.05，優(yōu)選至少約0.1的離子強(qiáng)度，從而能夠有效實現(xiàn)相當(dāng)量的蛋白質(zhì)溶解。當(dāng)鹽溶液的離子強(qiáng)度增加時，油籽粉中蛋白質(zhì)的溶解度最初增加，直到達(dá)到最大值。隨后離子強(qiáng)度的任何增加不增加溶解的總蛋白質(zhì)。導(dǎo)致最大蛋白質(zhì)溶解的食品級鹽溶液的離子強(qiáng)度根據(jù)所涉及的鹽和所選擇的油籽粉而變化。
食品級鹽水溶液中可存在抗氧化劑?？寡趸瘎┛梢允侨魏芜m宜的抗氧化劑，例如亞硫酸鈉或抗壞血酸。在溶解步驟中使用的抗氧化劑的量可以在約0.01-約lwt%之間變動，優(yōu)選約0.05wt%。抗氧化劑可用于抑制在蛋白質(zhì)水溶液中存在的酚類的氧化。
分批方法中，在至少約5°C，優(yōu)選最高約35°C下實現(xiàn)蛋白質(zhì)的鹽溶解，優(yōu)選伴隨攪拌以縮短溶解時間，所述溶解時間通常是約10-約60分鐘。優(yōu)選實現(xiàn)溶解以從油籽粉中提取基本最大量的蛋白質(zhì)，以提供全面的聞廣率。
選擇約5°C的溫度下限，因為低于此溫度溶解慢到無法實現(xiàn)，而選擇35°C的溫度上限是因為分批模式中在較高溫度水平下該方法變得不經(jīng)濟(jì)。
在連續(xù)方法中，從卡諾拉油籽粉中提取蛋白質(zhì)在任何可有效實現(xiàn)從卡諾拉油籽粉中連續(xù)提取蛋白質(zhì)的方式下進(jìn)行。一個實施方案中，將卡諾拉油籽粉與鹽溶液連續(xù)混合，將混合物通過管或管道傳送，其具有的長度和流速使得保留時間足以實現(xiàn)根據(jù)本文所述參數(shù)的所希望的提取。在這種連續(xù)方法中，在最多可達(dá)約10分鐘的時間內(nèi)，迅速實現(xiàn)鹽溶解步驟，優(yōu)選實現(xiàn)溶解以從卡諾拉油籽粉中提取基本最大量的蛋白質(zhì)。連續(xù)方法中的溶解優(yōu)選在升高的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選大于約35°C，通常高達(dá)約65°C或更高。
鹽水溶液和卡諾拉油籽粉具有約5-約6.8的自然pH，優(yōu)選為約5.3_約6.2的pH值。
如果需要，通過使用任何適宜的食品級酸，通常為鹽酸，或食品級堿，通常為氫氧化鈉，將食品級鹽溶液的PH調(diào)整到約5-約6.8范圍內(nèi)的任何所期望的值，用于提取步驟。當(dāng)將卡諾拉分離蛋白用于非食品用途的情況下，那么可以使用非食品級化學(xué)品。
在溶解步驟過程中食品級鹽溶液中的油籽粉的濃度可以在很大程度上變化。典型的濃度值是約5-約15% w/Vo
使用鹽水溶液的蛋白質(zhì)提取步驟具有溶解存在于卡諾拉粉中的油脂的額外效果，從而使水相中存在油脂。
提取步驟得到的蛋白質(zhì)溶液通常具有約5-約40g/L的蛋白質(zhì)濃度，優(yōu)選約10-約30g/L。
隨后可以以任何適宜的方式，例如通過使用潷析離心機(jī)，隨后通過圓盤式離心機(jī)和/或過濾器以去除粗粉殘留物，將提取步驟得到的水相與卡諾拉粉殘留物分離?？梢詫⒎蛛x出的粉殘留物干燥用于儲存。[0034]通過將粉末化活性炭或其它色素吸附劑與分離的蛋白水溶液混合，并隨后適宜地通過過濾去除吸附劑，從而提供蛋白質(zhì)溶液，可以改善最終的卡諾拉分離蛋白的顏色，從而獲得更淺且沒那么強(qiáng)的黃色。也可以在濃縮之前或之后如下所述對分離的蛋白水溶液進(jìn)行滲濾，以去除色素。
該脫色步驟可以在任何適宜的條件下進(jìn)行，通常將分離的蛋白水溶液于室溫下應(yīng)用任何適宜的色素吸附劑。對于粉末化活性炭，應(yīng)用約0.025% -約5% w/v的量，優(yōu)選約0.05% -2% w/vo
當(dāng)如前述美國專利Nos.5，844，086和6，005, 076所描述，卡諾拉油籽粉含有顯著量的油脂時，然后可以對分離的蛋白水溶液和下文討論的濃縮蛋白水溶液實施其中描述的脫脂步驟。當(dāng)實施顏色改善步驟時，該步驟可以在第一個脫脂步驟之后進(jìn)行。
作為用食品級鹽水溶液提取油籽粉的替代方式，該提取可以僅使用水完成，盡管與使用食品級鹽水溶液相比，僅利用水傾向于從油籽粉中提取出更少的蛋白質(zhì)。在應(yīng)用該替代方式的情況下， 則在上述討論的濃縮中，可以在與油籽粉分離之后將食品級鹽加入到蛋白質(zhì)溶液中，以在下述描述的濃縮步驟過程中維持溶液中的蛋白質(zhì)。當(dāng)進(jìn)行脫色步驟和/或第一油脂去除步驟的時候，食品級鹽通常在該操作完成之后加入。
隨后將蛋白質(zhì)水溶液濃縮以提高其蛋白濃度，同時維持其中離子強(qiáng)度基本恒定。進(jìn)行該濃縮通常是為了提供具有10-約300g/L之間或更高、優(yōu)選約50-約100g/L的蛋白濃度的濃縮蛋白溶液。
濃縮步驟可以與分批或連續(xù)操作相容的任何適宜方式進(jìn)行，例如通過應(yīng)用任何適宜的選擇性膜技術(shù)，例如超濾或滲濾，考慮到不同的膜材料和構(gòu)造，使用具有適宜截留分子量，例如約3000-約100000道爾頓，優(yōu)選約5000-約10000的膜，例如中空纖維膜或螺旋錯流膜，并且，對于連續(xù)操作來說，當(dāng)?shù)鞍姿芤和ㄟ^膜的時候，其尺寸允許所需程度的濃縮。
隨后可以使用與提取溶液具有相同摩爾濃度和pH的鹽水溶液，對濃縮蛋白溶液進(jìn)行滲濾步驟。該滲濾可以使用約2-約20倍體積的滲濾溶液進(jìn)行，優(yōu)選約5-約10倍體積的滲濾溶液。在滲濾操作中，通過與滲透液一起穿過膜，從蛋白水溶液中去除了更多量的雜質(zhì)。滲濾操作可進(jìn)行到在滲透液中沒有明顯更多量的酚類和肉眼可見色素?？紤]到不同膜的材料和構(gòu)造，該滲濾可使用截留分子量在約3，000-約100，000道爾頓范圍內(nèi)的膜而進(jìn)行，優(yōu)選為約5，000-約10，000道爾頓。
在滲濾步驟的至少一部分中在滲濾介質(zhì)中可存在抗氧化劑?？寡趸瘎┛梢允侨魏芜m宜的抗氧化劑例如亞硫酸鈉或抗壞血酸。在滲濾介質(zhì)中應(yīng)用的抗氧化劑的量取決于應(yīng)用的物質(zhì)，可以在約0.01-約Iwt %之間變動，優(yōu)選約0.05wt%?？寡趸瘎┛梢种茲饪s卡諾拉分離蛋白溶液中存在的酚類的氧化。
濃縮步驟和滲濾步驟可以在任何適宜的溫度下進(jìn)行，通常是約20°C -約60°C，優(yōu)選約20°C -約30°C，并且持續(xù)的時間有效實現(xiàn)所需的濃縮程度。所使用的溫度和其它條件在某些程度上取決于所使用的膜裝置，以實現(xiàn)溶液的濃縮和所期望的蛋白濃度。
眾所周知，超濾和類似的選擇性膜技術(shù)允許低分子量的組分透過，而阻止較高分子量的組分透過。低分子量組分不僅包括食品級鹽溶液的離子組分，而且包括從原料物質(zhì)中提取出來的低分子量物質(zhì)，例如碳水化合物，色素和抗?fàn)I養(yǎng)因子，以及任何低分子量形式的蛋白質(zhì)。通常，考慮到不同膜材料和構(gòu)造，選擇膜的截留分子量以確保溶液中顯著比例的蛋白質(zhì)保留，而允許雜質(zhì)透過。
如美國專利Nos.5，844，086和6，005, 076中所描述，假如需要，可以對經(jīng)濃縮和任選滲濾的蛋白溶液進(jìn)行進(jìn)一步的脫脂操作。
可以對經(jīng)濃縮和任選滲濾的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行脫色操作，作為上文描述的脫色操作的替代。本文可以使用粉末活性炭以及顆?；幕钚蕴?GAC)。另一種可以用作色素吸附劑的材料是聚乙烯吡咯烷酮。
色素吸附劑處理步驟可以在任何適宜的條件下進(jìn)行，通常在卡諾拉蛋白溶液于室溫下。對于粉末化活性炭，可以使用約0.025% -約5% w/v的量，優(yōu)選約0.05% -約2%w/v。當(dāng)使用聚乙烯吡咯烷酮用作色素吸附劑時，可以使用約0.5% -約5% w/v的量，優(yōu)選約2% -約3% w/v。可以通過任何適宜的手段，例如過濾，將色素吸附劑從卡諾拉蛋白溶液中去除。
可以對由任選脫色步驟得到的濃縮和任選滲濾的蛋白溶液進(jìn)行巴氏消毒以殺死任何細(xì)菌，這些細(xì)菌可由于貯藏或其它原因可能在最初的粉中存在，并在提取步驟中從粉中經(jīng)提取進(jìn)入卡諾拉分離蛋白溶液中。這種巴氏消毒可以在任何所期望的巴氏消毒條件下進(jìn)行。通常，將經(jīng)濃縮和任選滲濾的蛋白溶液加熱到約55°C -約70°C，優(yōu)選約60°C -約65°C的溫度，保持約10-約15分鐘，優(yōu)選約10分鐘。然后可以將經(jīng)巴氏消毒的濃縮蛋白溶液冷卻，以進(jìn)行如下述進(jìn)一步加工，優(yōu)選冷卻到約25-約40°C。
經(jīng)過濃縮和任選滲濾以及任選巴氏消毒的水溶液其最佳蛋白濃度是約5-約IOwt %，因為更高的濃度會導(dǎo)致粘性，使得難以使溶液均勻酸化和難以在酸化步驟分離沉淀的固體。該最佳蛋白濃度可以通將水相蛋白濃縮到所需濃度而實現(xiàn)，或通過首先將蛋白水溶液濃縮到更高的約 20-約25wt%或更高的濃度，然后用食品級鹽溶液將濃縮蛋白溶液稀釋到約5-約IOwt %范圍內(nèi)。
對于本文所提供的等電沉淀的形成，經(jīng)濃縮和任選滲濾以及任選巴氏消毒的蛋白溶液應(yīng)當(dāng)具有至少約ImS的電導(dǎo)率，優(yōu)選約10-約20mS。
然后使用任何適宜的酸例如鹽酸，將經(jīng)濃縮和任選滲濾和任選巴氏消毒的蛋白溶液在溫度為約10°c -約70°C、優(yōu)選約20°C -約40°C下酸化到約3.0-約4.0、優(yōu)選約3.5的PH，使得形成卡諾拉分離蛋白沉淀。從上清液中回收沉淀并可通過任何適宜的技術(shù)例如噴霧干燥、冷凍干燥或真空轉(zhuǎn)鼓干燥來干燥，以提供卡諾拉分離蛋白。衍生自卡諾拉分離蛋白的干燥等電沉淀(IP)具有至少約90twt% (Nx6.25),優(yōu)選至少約100wt%的高蛋白質(zhì)含量。
假如期望，可以對卡諾拉蛋白溶液直接進(jìn)行等電沉淀步驟而不進(jìn)行濃縮步驟。在等電沉淀步驟之前，可以對卡諾拉蛋白溶液進(jìn)行上文描述的一個或多個任選的脫色、滲濾和巴氏消毒步驟。從上清液中回收沉淀的卡諾拉分離蛋白并干燥。
由等電沉淀得到的上清液包含相當(dāng)顯著量的未在沉淀步驟中沉淀的卡諾拉蛋白，對其進(jìn)行處理以從中回收主要是2S蛋白形式的卡諾拉分離蛋白?？梢栽诔サ入姵恋砦锖髮⑺峄襟E的上清液濃縮以提高其中的蛋白質(zhì)濃度。該濃縮可以使用任何適宜的選擇性膜技術(shù)，例如超濾，使用具有適宜截留分子量的膜，允許低分子量物質(zhì)包括鹽和其它從蛋白來源材料中提取出的非蛋白類低分子量物質(zhì)透過該膜，而將卡諾拉蛋白保持在溶液中?？紤]到不同的膜的材料和構(gòu)造，可以使用截留分子量為約3，000-10，000道爾頓，優(yōu)選約5，000-約10，000道爾頓的超濾膜。這種方式的上清液濃縮也減少了回收蛋白所需要干燥的液體的量。通常在干燥之前，將上清液濃縮到蛋白含量為約100-約400g/L，優(yōu)選約200-約300g/L。如同上文對蛋白溶液濃縮步驟的描述，這種濃縮操作可以以分批模式進(jìn)行，或者以連續(xù)操作而進(jìn)行。
可以使用水作為提取溶劑對濃縮的上清液進(jìn)行滲濾步驟，以便從濃縮上清液中去除鹽和其它雜質(zhì)?？梢允褂眉s2-約20倍體積的水，優(yōu)選約5-約10倍體積的水來進(jìn)行該滲濾?？紤]到不同膜的材料和構(gòu)造，可以使用截留分子量在約3，000-約100，000道爾頓，優(yōu)選約5，000-約10，000道爾頓的膜實現(xiàn)該滲濾。
在滲濾步驟的至少一部分中，在滲濾介質(zhì)中可存在抗氧化劑?？寡趸瘎┛梢允侨魏芜m宜的抗氧化劑，例如亞硫酸鈉或抗壞血酸。在滲濾介質(zhì)中使用的抗氧化劑的量可以在約0.01-約lwt%2間變動，優(yōu)選約0.05wt%o
濃縮和任選滲濾的上清液可以通過任何適宜的技術(shù)干燥成干燥形式，例如噴霧干燥、冷凍干燥或真空轉(zhuǎn)鼓干燥，以提供其它卡諾拉分離蛋白。這種其它卡諾拉分離蛋白具有超過約90wt%,優(yōu)選至少約100wt%蛋白(以凱氏Nx6.25計)的高蛋白含量。
假如期望，可以如前述美國專利申請N0.11/038，086描述，將上清液進(jìn)行熱處理步驟，以引起存在于上清液中的7S蛋白和任何12S蛋白的沉淀，并回收具有增大的比例的2S蛋白的2S分離蛋白。
可以使用足以降低濃縮上清液中存在的7S比例，優(yōu)選以顯著程度降低7S蛋白比例的溫度和時間曲線進(jìn)行該熱處理。通常，通過熱處理將上清液中的7S蛋白含量降低至少約50wt%，優(yōu)選至少約75wt%。通常，可以在約70°C -約100°C，優(yōu)選約75°C -約95°C，持續(xù)約2-約30分鐘，優(yōu)·選約5-約15分鐘進(jìn)行熱處理。可以以任何適宜的方式例如離心或過濾去除沉淀的7S蛋白。
熱處理操作可以在上清液濃縮之前進(jìn)行，但優(yōu)選在濃縮步驟之后?？梢詫Λ@自等電沉淀步驟的上清液進(jìn)行熱處理步驟，或者可以在調(diào)整上清液的PH到較小酸值后進(jìn)行，因為7S和12S蛋白在該較小酸值下易于降解并沉淀?？梢詫⑸锨逡旱膒H調(diào)整到約5-約6.8，優(yōu)選約5.8-約6.2的pH。該pH調(diào)整可以使用任何適宜的堿化劑例如氫氧化鈉進(jìn)行。在該熱處理之后,可以將pH調(diào)整到更高的酸值，優(yōu)選在約5-約10wt%的范圍內(nèi)。
此外，對在濃縮之前或之后，和/或熱處理之前或之后，可對上清液進(jìn)行脫色操作以改善終產(chǎn)品的色澤，作為以上描述的脫色操作的替代或額外的步驟，可以使用任何適宜的色素吸附劑，例如上文描述的一定量的粉末化活性炭、顆?；钚蕴亢?或聚乙烯吡咯烷酮。
假如需要，可以將至少一部分濕的等電沉淀和至少一部分濃縮上清液合并，然后將合并的蛋白質(zhì)物料流以任何適宜的技術(shù)干燥，以便提供合并的卡諾拉分離蛋白組合物。可以選擇混合在一起的蛋白類材料的相對比例，以提供具有所期望的2S/7S/12S蛋白特征比的卡諾拉分離蛋白組合物?；蛘?，將干燥的分離蛋白以任意所期望的比例混合以在混合物中提供任何期望的2S/7S/12S蛋白分布。合并的卡諾拉分離蛋白具有超過約90wt%，優(yōu)選至少約100wt% (以凱氏Nx6.25計)的高蛋白含量。
另一個替代步驟中，當(dāng)僅將部分濃縮的上清液和僅部分等電沉淀混合，并將所得混合物干燥時，可以將濃縮上清液中的保留物如任何等電沉淀中的保留物一樣干燥。而且，也可以將干燥的等電沉淀和干燥的上清液如上文的討論以任何所期望的相對比例進(jìn)行干混。
通過這種方式的操作，可將大量的卡諾拉分離蛋白作為干燥的等電沉淀、干燥的上清液和源自等電沉淀的卡諾拉分離蛋白和源自上清液的卡諾拉分離蛋白的各種重量比例的干混合物形式回收，通常的重量比為5: 95-95: 5，這基于組合物中2S/7S/12S蛋白質(zhì)的不同比例而對實現(xiàn)不同的功能和營養(yǎng)特性是所期待的。
如前文所指出，按照前述的美國專利申請N0.10/137, 391和10/476,630的方法，通過稀釋經(jīng)濃縮和任選滲濾以及任選巴氏消毒的蛋白溶液，可從生產(chǎn)的PMM生產(chǎn)衍生自卡諾拉蛋白的等電沉淀，其具有至少約90wt% (Nx6.25),優(yōu)選至少約100wt%的蛋白含量。
優(yōu)選在室溫下，盡管也可以使用提高的溫度，將PMM，優(yōu)選濕的形式但也可為干的形式，溶解于離子強(qiáng)度至少約0.05，優(yōu)選至少約0.1的食品級鹽溶液，例如氯化鈉溶液中，以形成蛋白水溶液，通常具有約1-約30wt %或更高的蛋白濃度，優(yōu)選為約5-約IOwt %。隨后對所得的水溶液進(jìn)行上文討論的等電沉淀步驟。
如上文所討論，并如下文給出的實施例中所顯示，與PMM衍生的卡諾拉分離蛋白相比，等電沉淀的卡諾拉分離蛋白具有高得多的水結(jié)合能力。實施該方法，允許生產(chǎn)出高溶解性卡諾拉分離蛋白，其為衍生自PMM沉淀步驟的上清液的卡諾拉分離蛋白，和通過將PMM轉(zhuǎn)化為等電沉淀產(chǎn)生高持水力的卡諾拉分離蛋白。
實施例實施例1
本實施例根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案說明了卡諾拉分離蛋白的制備。
在60°C下，將150kg的市售卡諾拉油籽粉加入到1000L 0.1M的NaCl中，攪拌5分鐘以提供蛋白水溶液。
60°C下，通過在分別具有5，000和10，000道爾頓截留分子量的聚二氟乙烯(PVDF)和聚醚砜(PES)膜的超濾系統(tǒng)(UFl)上濃縮，將蛋白含量為16.8g/L的澄清卡諾拉蛋白溶液體積縮減到60L。然后在60°C下，在使用分別具有5，000和10，000道爾頓截留分子量的PVDF和PES膜的滲濾系統(tǒng)中，使用包含0.05wt%抗壞血酸的0.1M NaCl溶液，對經(jīng)超濾的卡諾拉蛋白溶液滲濾五次，至蛋白含量為174.7g/L的45L最終體積。
將4L經(jīng)濃縮和滲濾的卡諾拉蛋白溶液樣品(UFl保留物)和12L的0.1NaCl合并，以調(diào)整蛋白質(zhì)濃度到46.8%。在22°C下加入濃HCl到稀釋的溶液直至酸化卡諾拉蛋白溶液的PH為3.5，以進(jìn)行等電沉淀。
樣品變得渾濁并允許靜置15分鐘。然后將樣品以4X IL的批次在7100g下離心15分鐘以收集沉淀。從上清液中分離出收集的沉淀(IEP沉淀)并冷凍干燥。發(fā)現(xiàn)干燥沉淀(C302)具有102.43wt% (Nx6.25) d.b.的蛋白含量(蛋白的百分比數(shù)值用LECO FP 328氮測定儀測定)。
在使用具有100，000道爾頓截留分子量的PES膜的超濾系統(tǒng)(UF2)上，將離心得到的大約16L的上清液(IEP上清液)濃縮到3L。然后在滲濾系統(tǒng)上，使用具有100，000道爾頓截留分子量的PES膜和9倍體積的 水，對經(jīng)濃縮的上清液進(jìn)行滲濾，從而達(dá)到最終3.5L的體積，蛋白含量為72.lg/L。將蛋白溶液噴霧干燥。[0072]發(fā)現(xiàn)干燥蛋白(C202)具有104.05wt% (Nx6.25) d.b.的蛋白含量。
實施例2
本實施例描述了通過前述美國專利申請N0.10/137, 391的方法制備卡諾拉分離
蛋白樣品。
在601:下將“8”1^的卡諾拉粉加入到“b” L的0.1M NaCl溶液中，在5分鐘的保持時間下連續(xù)提取，以提供蛋白水溶液。去除殘留的卡諾拉粉，并通過離心和過濾澄清所得的蛋白溶液，以生產(chǎn)出“c” L具有“d” ％重量的蛋白含量的過濾蛋白溶液。
通過在使用分別具有截留分子量5，000和10，000道爾頓的PVDF和PES膜的超濾系統(tǒng)上濃縮，將“e”L等分試樣的蛋白提取溶液減少到“f”L的體積，然后用包含0.05wt%抗壞血酸的“g”L的0.1M NaCl溶液進(jìn)行滲濾。所得的濃縮蛋白溶液具有“h” ％重量的蛋白濃度。
在“i” 1:下將濃縮的溶液(減去等電沉淀去除的部分)稀釋到溫度為“k” °〇的冷RO水中。馬上形成白色渾濁，并允許其沉淀。去除上層的稀釋水，從容器下層回收沉淀的、粘稠的粘性塊(PMM)，其產(chǎn)量占過濾蛋白溶液的“I”wt%。發(fā)現(xiàn)干燥的PMM衍生蛋白具有“m” % (Nx6.25) d.b.的蛋白含量。用符號“n”(C300)表示產(chǎn)品。
下面的表I列出了參數(shù)“a”到“n”。表I
權(quán)利要求
1.一種制備卡諾拉分離蛋白的方法，其中基于干重，以氮含量乘以6.25測量，所述分尚蛋白具有至少90wt*%的蛋白含量；其特征在于: (a)提取卡諾拉油籽粉，從而使得卡諾拉油籽粉中的蛋白質(zhì)溶解，并形成PH5-6.8的卡諾拉蛋白水溶液； (b)將卡諾拉蛋白水溶液與卡諾拉油籽粉殘留物分離； (c)通過使用選擇性膜技術(shù)，將卡諾拉蛋白水溶液濃縮到20-25Wt%蛋白的濃度，同時維持離子強(qiáng)度恒定； (d)通過添加鹽水溶液，將所述卡諾拉蛋白溶液的濃度調(diào)節(jié)到5-10Wt%； (e)酸化卡諾拉蛋白水溶液至3-4的pH以從中沉淀主要由7S卡諾拉蛋白組成的卡諾拉分離蛋白；并 (f)將已沉淀的卡諾拉分離蛋白與上清液分離。
2.一種制備卡諾拉分離蛋白的方法，其中基于干重，以氮含量乘以6.25測量，所述分尚蛋白具有至少90wt*%的蛋白含量；其特征在于: (a)提取卡諾拉油籽粉，從而使得卡諾拉油籽粉中的蛋白質(zhì)溶解，并形成PH5-6.8的卡諾拉蛋白水溶液； (b)將卡諾拉蛋白水溶液與卡諾拉油籽粉殘留物分離； (c)通過使用選擇性膜技術(shù)，將卡諾拉蛋白水溶液濃縮到10-300g/L蛋白的濃度，同時維持離子強(qiáng)度恒定； (d)通過添加鹽水溶液，將所述卡`諾拉蛋白溶液的濃度調(diào)節(jié)到5-10Wt%； (e)酸化卡諾拉蛋白水溶液至3-4的pH以從中沉淀主要由7S卡諾拉蛋白組成的卡諾拉分離蛋白；并 (f)將已沉淀的卡諾拉分離蛋白與上清液分離。
3.權(quán)利要求
2的方法，其特征在于將所述卡諾拉蛋白水溶液濃縮到濃度為50-100g/L。
4.權(quán)利要求
1的方法，其特征在于使用具有至少0.05的離子強(qiáng)度以及5-6.8的pH的鹽水溶液，進(jìn)行對所述卡諾拉油籽粉的所述提取。
5.權(quán)利要求
4的方法，其特征在于所述鹽水溶液的離子強(qiáng)度為0.1-0.6，pH為5.3-6.2。
6.權(quán)利要求
1的方法，其特征在于處理所述上清液，以便從中回收蛋白含量以氮含量乘以6.25測量至少為90wt%，主要由2S卡諾拉蛋白組成的額外的卡諾拉分離蛋白。
7.權(quán)利要求
6的方法，其特征在于將所述上清液進(jìn)行熱處理，以便從上清液中沉淀7S和任何12S蛋白，并且將經(jīng)過熱處理的上清液與降解的7S/12S蛋白分離。
8.權(quán)利要求
7的方法，其特征在于在所述熱處理步驟之前濃縮所述上清液。
9.權(quán)利要求
7的方法，其特征在于在所述熱處理步驟之前，將所述上清液的pH調(diào)整到5-6.8。
10.權(quán)利要求
9的方法，其特征在于將所述上清液的pH調(diào)整到5-6.2。
11.權(quán)利要求
6-10中任一項的方法，其特征在于在將降解的7S/12S蛋白質(zhì)分離之后，將主要由2S卡諾拉蛋白組成的卡諾拉分離蛋白回收之前，和/或在所述濃縮步驟之前或之后，對所述上清液進(jìn)行脫色操作。
12.權(quán)利要求
1的方法，其特征在于進(jìn)行所述酸化步驟的所述卡諾拉蛋白水溶液的導(dǎo)電率為至少lmS。
13.權(quán)利要求
12的方法，其特征在于進(jìn)行所述酸化步驟的所述卡諾拉蛋白水溶液的導(dǎo)電率為10-20mS。
14.一種制備卡諾拉分離蛋白的方法，其中基于干重，以氮含量乘以6.25測量，所述分尚蛋白具有至少90wt*%的蛋白含量；其特征在于: (a)提取卡諾拉油籽粉，從而 使得卡諾拉油籽粉中的蛋白質(zhì)溶解，并形成PH5-6.8的卡諾拉蛋白水溶液； (b)將卡諾拉蛋白水溶液與卡諾拉油籽粉殘留物分離； (C)通過使用選擇性膜技術(shù)提高所述蛋白水溶液的蛋白濃度，同時維持離子強(qiáng)度基本恒定，從而得到濃縮的蛋白溶液； (d)將所述濃縮的蛋白溶液稀釋到溫度低于15°C的冷水中，從而在水溶液中形成膠束形式的不連續(xù)蛋白顆粒； (e)沉降蛋白膠束形成無定型、粘性、膠狀、面筋樣蛋白膠束塊； (f)將蛋白膠束塊與上清液分離，蛋白膠束塊以氮含量乘以6.25測量具有至少90wt%的蛋白含量； (g)形成蛋白膠束塊的水溶液； (h)對蛋白膠束塊的水溶液酸化到PH3-4，以便從中沉淀主要由7S卡諾拉蛋白組成的卡諾拉分離蛋白；和 (i)將上清液與沉淀的卡諾拉分離蛋白分離。
15.權(quán)利要求
14的方法，其特征在于在步驟(f)中所述蛋白膠束塊具有至少100wt%的蛋白含量。
16.權(quán)利要求
14的方法，其特征在于通過用離子強(qiáng)度至少為0.05的鹽水溶液，將蛋白膠束塊溶解而形成所述蛋白膠束塊的水溶液。
17.權(quán)利要求
16的方法，其特征在于所述鹽水溶液的離子強(qiáng)度至少為0.1。
18.權(quán)利要求
14-17中任一項的方法，其特征在于所述蛋白膠束塊的水溶液具有5-10wt%的蛋白濃度。
19.一種包含權(quán)利要求
1-18中任一項的方法產(chǎn)生的卡諾拉分離蛋白的酸化飲料。
20.權(quán)利要求
19的飲料，其是澄清的蛋白強(qiáng)化軟飲料。
專利摘要
通過等電沉淀從卡諾拉油籽粉的鹽水溶液提取物形成主要由7S卡諾拉蛋白組成的卡諾拉分離蛋白。從等電沉淀步驟的上清液中回收主要由2S卡諾拉蛋白組成的卡諾拉分離蛋白。
文檔編號A23J1/14GKCN101370390 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200680043394
公開日2013年8月21日 申請日期2006年9月21日
發(fā)明者K·I·塞加爾, R·維拉森, M·施維策爾 申請人:伯康營養(yǎng)科學(xué)(Mb)公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (5),