專利名稱：選擇性硫酸化的蛋白質(zhì)在真細(xì)菌中的遺傳編程表達(dá)的制作方法
選擇性硫酸化的蛋白質(zhì)在真細(xì)菌中的遺傳編程表達(dá) 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求以下申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)2006年9月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序 列號(hào)60/846,519;和2006年10月28日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/855,210; 兩篇申請(qǐng)的內(nèi)容通過引用全文納入本文。對(duì)聯(lián)邦資助研發(fā)下所作發(fā)明的權(quán)利的聲明本發(fā)明在國(guó)立衛(wèi)生研究院資助號(hào)GM62159的政府支持下做出。政府對(duì)本 發(fā)明享有一定權(quán)利。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于翻譯生物化學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及制備和利用正交(orthogonal) tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶和它們的配對(duì)將非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì) 的組合物和方法。本發(fā)明還涉及用這種配對(duì)在細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法以 及用這種方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。發(fā)明背景酪氨酸硫酸化是分泌蛋白和膜結(jié)合蛋白的常見翻譯后修飾(Kehoe和 Bertozzi，酪氨酸硫酸化胞外蛋白-蛋白相互作用的調(diào)節(jié)物(Tyrosine sulfation: a modulator of extracellular protein-protein interactions) ， CTzem 5/o/ 7:R57-61 (2000))。盡管對(duì)于磺基酪氨酸生物學(xué)功能的了解程度剛剛起步，但在數(shù)種蛋白-蛋白相互作用復(fù)合物中已發(fā)現(xiàn)它。例如，酪氨酸硫酸化在趨化因子與趨化因子 受體結(jié)合中扮有決定性作用，所述趨化因子受體包括CCR2(Preobrazhensky等， "單核細(xì)胞趨化蛋白-l受體CCR2B是一種在保守胞外區(qū)N末端區(qū)域酪氨酸硫 酸化的糖蛋白"(Monocyte chemotactic protein-1 receptor CCR2B is a glycoprotein that has tyrosine sulfation in a conserved extracellular N-terminal region) ■//mm柳o/ 165:5295-5303 (2000))、 CCR5 (Farzan等，"CCR5氨基末端的酪氨酸 硫酸化有助于HIV-1進(jìn)入"(Tyrosine sulfation of the amino terminus of CCR5 facilitates HIV-1 entry) Ce〃 96:667-676 (1999))、 CXCR4 (Farzan等，"CXCR4 氨基末端翻譯后修飾在基質(zhì)衍生因子1 a結(jié)合和HIV進(jìn)入中的作用"(The role of post-translational modifications of the CXCR4 amino terminus in stromal-derived factor 1 alpha association and HIV-1 entry) ^z'o/ CTzem 277:29484-29489 (2002); Veldkamp等，"趨化因子基質(zhì)細(xì)胞起源因子 la(SDF-la/CXCL12)識(shí)別CXCR4磺基酪氨酸"(Recognition of a CXCR4 sulfotyrosine by the chemokine stromal cell-derived factor-1 alpha (SDF-lalpha/CXCLl2)) /Mo/ 359:1400-1409 (2006))和CX3CRl(Fong等， "CX3CR1酪氨酸硫酸化增強(qiáng)flk分形素(fractalkine)-誘導(dǎo)的細(xì)胞黏附" (CX3CR1 tyrosine sulfation enhances fractalkine-induced cell adhesion) / 5z'o/ Ozem 277:19418-19423 (2002))。同樣，在水流剪切力下白細(xì)胞的翻滾也需要 PSGL-1的硫酸化以進(jìn)行正確的結(jié)合和粘附(Somers等，"與SLe(X)和PSGL-1 結(jié)合的P-和E-選擇素結(jié)構(gòu)揭示的白細(xì)胞系鏈和翻滾的分子基礎(chǔ)探密"(Insights into the molecular basis of leukocyte tethering and rolling revealed by structures of P-and E國(guó)selectin bound to SLe(X) and PSGL-1) Ce〃 103:467-479 (2000))。酪氨酸 硫酸化也參與了凝血級(jí)聯(lián)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)于數(shù)種凝集因子以及天然凝血酶抑制劑 中，如水蛭分泌的抗凝蛭素(Dong等，"糖蛋白Ib-IX復(fù)合物的酪氨酸硫酸化 識(shí)別硫酸化殘基以及對(duì)配體結(jié)合的影響"(Tyrosine sulfation of the glycoprotein Ib-IX complex: identification of sulfated residues and effect on ligand binding) 33:13946-13953 (1994); Bagdy等，"蛭素"(Hirudin) M"/w& 五w矽mo/ 45:669-678 (1976))。此外，近來發(fā)現(xiàn)抗體可變環(huán)狀區(qū)的酪氨酸硫酸化 在CD4誘導(dǎo)的HIV-1抗體中負(fù)責(zé)中和活性，因此證明磺基酪氨酸增加抗體-抗 原親和力的能力(Choe等，"人抗體的酪氨酸硫酸化在識(shí)別HIV-1 gpl20的 CCR5結(jié)合區(qū)的作用"(Tyrosine sulfation of human antibodies contributes to recognition of the CCR5 binding region of HIV-1 gpl20) Ce// 114:161-170 (2003); Xiang等，"通過中和單克隆抗體模擬I型人體免疫缺陷病毒功能"(Functional mimicry of a human immunodeficiency virus type 1 coreceptor by a neutralizingmonoclonal antibody) / 79:6068-6077 (2005》。
測(cè)定硫酸化在超過60種已知的和超過2100種預(yù)測(cè)(基于小鼠蛋白序列的 研究)的含磺基酪氨酸蛋白中的功能的主要障礙是選擇性合成硫酸化蛋白的能 力(Moore，"蛋白質(zhì)酪氨酸O-硫酸化的生物學(xué)及酶學(xué)"(The biology and enzymology of protein tyrosine O-sulfation) / CTzem 278:24243-24246 (2003))。當(dāng)前的方法依賴于肽合成或體外酶硫酸化(Veldkamp等，"通過趨化 因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子la (SDF-la/CXCL12)識(shí)別CXCR4磺基酪氨酸" (Recognition of a CXCR4 sulfotyrosine by the chemokine stromal cell-derived factor-lalpha (SDF-lalpha/CXCL12)) J M / 359:1400-1409 (2006); Kirano 等，"牛膽囊收縮素-33 (CCK-33)的全合成"(Total synthesis of porcine cholecystokinin-:33 (GCK陽"))CTzew. Soc., Ozem. Gomww". 323-325 (1987); Muramatsu等，"用來自真細(xì)菌A -44的硫酸轉(zhuǎn)移酶對(duì)酪氨酸殘基進(jìn)行酶的O-硫酸化"(Enzymic O-sulfation of tyrosine residues in hirudins by sulfotransferase from Eubacterium A-44)五"r /5/oc/^w 223:243-248 (1994); Young和Kiessling ，"硫酸化肽的合成策略"(A strategy for the synthesis of sulfated peptides) C/2ew/"/^/Eng/ 41:3449-3451 (2002));然而，兩者都缺乏普遍性前者受限 于長(zhǎng)度限制以及酸性條件下磺基酪氨酸有去硫酸化的趨勢(shì)；后者受限于附加 硫酸轉(zhuǎn)移酶的可用性以及其相關(guān)識(shí)別序列的限制。
在蛋白的已知位點(diǎn)直接摻入遺傳編碼的非天然氨基酸磺基酪氨酸可克 服上述限制。直接摻入磺基酪氨酸將極大地利于研究生物學(xué)調(diào)節(jié)過程中的 硫酸化事件，并可創(chuàng)造具有顯著多樣性的硫酸化抗體和肽庫(kù)。而且，生產(chǎn) 蛋白蛭素的硫酸化形式的能力具有直接的臨床應(yīng)用，可作為改良的抗凝劑 (相對(duì)于非硫酸化形式的改良)。本領(lǐng)域需要能將非天然氨基酸磺基酪氨酸摻 入蛋白質(zhì)的新方案。
現(xiàn)己開發(fā)了在原核和真核生物中將各種非天然氨基酸體內(nèi)位點(diǎn)特異性地 摻入蛋白質(zhì)的通用方法。這些方法依賴于正交蛋白質(zhì)翻譯組分，所述組分識(shí)別 合適的選擇者密碼子(selector codon)從而能在體內(nèi)多肽翻譯期間將所需的非天 然氨基酸插入限定位置。這些方法利用識(shí)別選擇者密碼子的正交 tRNA(O-tRNA)，而相應(yīng)的特異性正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加載該O-tRNA。這些組分不與宿主生物體內(nèi)的任何內(nèi)源性tRNA、 RS、 氨基酸或密碼子交叉反應(yīng)(即，它必須是正交的)。利用這種正交tRNA-RS配對(duì) 可能遺傳編碼大量結(jié)構(gòu)各異的非天然氨基酸。
本領(lǐng)域普遍知道利用適合于制備含一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的 正交翻譯系統(tǒng)，例如產(chǎn)生正交翻譯系統(tǒng)的通用方法。例如，參見國(guó)際公布號(hào) WO 2002/086075，其名為"METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL 簡(jiǎn)A-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS(產(chǎn)生正交tRNA-氨?；?tRNA合成酶配對(duì)的方法和 組合物)"；WO 2002/085923，其名為"IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS(非天然氨基酸的體內(nèi)摻入)"；WO 2004/094593 ， 其名為"EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE(擴(kuò)展真核遺傳密碼)"；2004年7月7日提交的WO 2005/019415; 2004年7月7日提交的WO 2005/007870; 2004年7月7日提交的WO 2005/007624;和2005年10月27日提交的WO 2006/110182，其名為 "ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS(體內(nèi)摻入非天然氨基 酸的正交翻譯組分)"。這些申請(qǐng)各自通過引用全文納入本文。摻入非天然 氨基酸的正交翻譯系統(tǒng)及它們的產(chǎn)生和使用方法的其它討論還可參見 Wang和Schultz, "Expanding the Genetic Code(擴(kuò)展遺傳密碼)"，CTzem. Co畫肌fC謹(jǐn)6.) 1:1-11 (2002); Wang禾口 Schultz "Expanding the Genetic Code(擴(kuò)展遺傳密碼)"，J"genw^/e CAew/e/"A ， 44(l):34-66 (2005); Xie和Schultz， "An Expanding Genetic Code(擴(kuò)展遺傳密碼)"，M"/zo出 36(3):227-238 (2005); Xie禾口 Schultz， "Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire(將氨基酸力Q入遺傳庫(kù))"Ct^r. CAem/ca/ 9(6):548-554 (2005); Wang等，"Expanding the Genetic Code(擴(kuò)展遺傳密 碼)"，j國(guó).5—B,omo/. 35:225-249 (2006; 2006年1月
13日電子公開)；Xie禾卩Schultz， "A chemical toolkit for proteins - an expanded genetic code(蛋白質(zhì)的化學(xué)工具箱-擴(kuò)展的遺傳密碼)"，A^. i ev. Mo/. CW/5/o/.， 7(10):775-782 (2006; 2006年8月23日電子公開)。本領(lǐng)域需要開發(fā)能將非天然氨基酸磺基酪氨酸慘入蛋白質(zhì)的正交翻譯組 分，其中所述非天然氨基酸摻入在任何指定位置。縱覽下文后可明白本文描述 的本發(fā)明滿足了這些和其它需求。
發(fā)明概述
盡管酪氨酸硫酸化是多細(xì)胞真核生物中普遍的翻譯后修飾(Moore，"蛋 白酪氨酸O-硫酸化的生物學(xué)和酶學(xué)"(The biology and enzymology of protein 的翻譯后修飾，酪氨酸硫酸化進(jìn)行進(jìn)一步研究和應(yīng) 用。
本發(fā)明提供在體內(nèi)(例如在宿主細(xì)胞內(nèi))對(duì)選擇者密碼子，如琥珀終止密 碼子起反應(yīng)而將非天然氨基酸磺基酪氨酸摻入延伸中的多肽鏈的組合物和 方法。這些組合物包含不與宿主細(xì)胞翻譯機(jī)制相互作用的正交-tRNA (O-tRNA)和正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)配對(duì)。即，內(nèi)源性宿主細(xì)胞氨 ?；?tRNA合成酶不會(huì)用氨基酸(天然或非天然)加載O-tRNA(或加載水平 不明顯)。類似地，本發(fā)明提供的0-RS不以顯著或可檢測(cè)的水平用氨甚酸(天 然或非天然)加載內(nèi)源性tRNA。這些新組合物能夠產(chǎn)生含有翻譯摻入的磺 基酪氨酸的大量蛋白質(zhì)。
在一些方面，本發(fā)明提供翻譯系統(tǒng)。這些系統(tǒng)包含第一正交氨?；?-tRNA合成酶(O-RS)、第一正交tRNA (O-tRNA)和第一非天然氨基酸，即 磺基酪氨酸，其中所述第一 O-RS用所述第一非天然氨基酸磺基酪氨酸優(yōu)先 氨?；龅谝?O-tRNA。在一些方面，所述O-RS用磺基酪氨酸優(yōu)先氨酰
10化所述O-tRNA，其效率至少為包含所述O-tRNA、磺基酪氨酸以及含有SEQ ID NO: 4、 6、 8或lO所示氨基酸序列的氨酰基-tRNA合成酶的翻譯系統(tǒng) 效率的50%。
該翻譯系統(tǒng)可使用衍生自各種來源的組分。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述 第一 O-RS衍生自詹氏甲垸球菌(Me^7"ococc^ y'朋"wc/n7)氨酰基-tRNA合 成酶，例如野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶。用于該系統(tǒng)的O-RS 可包含SEQ ID NO: 4、 6、 8或10所示氨基酸序列及該序列的保守變體。 在一些實(shí)施方式中，所述O-tRNA是琥珀抑制子tRNA。在一些實(shí)施方式中， 所述O-tRNA包含SEQ ID NO:l或由其編碼。
在一些方面，翻譯系統(tǒng)還包含編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核 酸具有O-tRNA識(shí)別的至少一個(gè)選擇者密碼子。
在一些方面，翻譯系統(tǒng)包括利用第二非天然氨基酸的第二正交配對(duì)(即 第二O-RS和第二O-tRNA)，現(xiàn)在該系統(tǒng)能在多肽的不同所選位置摻入至少 兩個(gè)不同的非天然氨基酸。在這種雙重系統(tǒng)中，第二O-RS用不同于第一非 天然氨基酸的第二非天然氨基酸優(yōu)先氨酰化第二 O-tRNA，而第二 O-tRNA 識(shí)別不同于第一 O-tRNA所識(shí)別的選擇者密碼子的選擇者密碼子。
在一些實(shí)施方式中，翻譯系統(tǒng)位于宿主細(xì)胞中(包括該宿主細(xì)胞)。所用 的宿主細(xì)胞不作具體限定，只要O-RS和O-tRNA在它們的宿主細(xì)胞環(huán)境中 能保留其正交性。所述宿主細(xì)胞可以是真細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌。所述宿 主細(xì)胞可含有一種或多種編碼包括O-RS或O-tRNA在內(nèi)的翻譯系統(tǒng)組分的 多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，編碼0-RS的多核苷酸包含SEQIDNO:5、 7、 9或11所示核苷酸序列。
本發(fā)明還提供產(chǎn)生在所選位置含有一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì) 的方法。這些方法利用上述翻譯系統(tǒng)。這些方法通常始于提供含有以下組 分的翻譯系統(tǒng)的步驟(i)第一非天然氨基酸，即非天然氨基酸磺基酪氨酸； (ii)第一正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS); (iii)第一正交tRNA (O-tRNA)， 其中所述O-RS用所述非天然氨基酸優(yōu)先氨?；鯫-tRNA;和(iv)編碼 蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸含有O-tRNA識(shí)別的至少一個(gè)選擇者密碼子。 然后在所述蛋白質(zhì)的翻譯過程中該方法對(duì)選擇者密碼子起反應(yīng)而將所述非天然氨基酸慘入所述蛋白質(zhì)的所選位置，從而產(chǎn)生在所選位置含有所述非 天然氨基酸的蛋白質(zhì)。在這些方法的一些方面，所述O-RS用磺基酪氨酸優(yōu)
先氨?；鯫-tRNA，其效率至少為包含所述O-tRNA、磺基酪氨酸以及含 有SEQIDNO: 4、 6、 8或10所示氨基酸序列的氨?；?tRNA合成酶的翻 譯系統(tǒng)效率的50%。在一些方面，使用這些方法產(chǎn)生硫酸化形式的蛭素。
可利用各種試劑和步驟廣泛實(shí)施這些方法。在一些實(shí)施方式中，提供 編碼O-RS的多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，提供衍生自詹氏甲烷球菌氨酰 基-tRNA合成酶的O-RS，例如可以提供野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA 合成酶。在一些實(shí)施方式中，該提供步驟包括提供含有SEQIDNO:4、 6、 8或10所示氨基酸序列及其保守變體的O-RS。
在這些方法的一些實(shí)施方式中，提供翻譯系統(tǒng)的步驟包括通過定點(diǎn)誘 變使野生型氨?；?tRNA合成酶的氨基酸結(jié)合袋(bindingpocket)發(fā)生突變， 選擇用所述非天然氨基酸優(yōu)先氨?；鯫-tRNA的所得O-RS。所述選擇 步驟可包括定點(diǎn)誘變后從得到的氨?；?tRNA合成酶分子庫(kù)正選擇和負(fù)選 擇所述O-RS。在一些實(shí)施方式中，提供步驟提供編碼O-tRNA的多核苷酸， 例如，O-tRNA是琥珀抑制子tRNA，或者O-tRNA包含SEQ ID NO:l所示 多核苷酸或由其編碼。在這些方法中，提供步驟還包括提供含有翻譯系統(tǒng) 所用的琥珀選擇者密碼子的核酸。
還可改進(jìn)這些方法以在蛋白質(zhì)中摻入一個(gè)以上非天然氨基酸。在那些 方法中，聯(lián)用第二正交翻譯系統(tǒng)與第一翻譯系統(tǒng)，其中第二系統(tǒng)具有不同 的氨基酸和選擇者密碼子特異性。例如，提供步驟可包括提供第二 O-RS 和第二 O-tRNA，其中第二 O-RS用不同于第一非天然氨基酸的第二非天然 氨基酸優(yōu)先氨?；诙?O-tRNA，且第二 O-tRNA識(shí)別核酸中不同于第一 O-tRNA所識(shí)別的選擇者密碼子的選擇者密碼子。
還可在宿主細(xì)胞環(huán)境中實(shí)施產(chǎn)生含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的方法。在 這些情況中，提供的宿主細(xì)胞含有非天然氨基酸、O-RS、 O-tRNA和編碼 蛋白質(zhì)的含至少一個(gè)選擇者密碼子的核酸，而培養(yǎng)該宿主細(xì)胞可導(dǎo)致非天 然氨基酸的摻入。在一些實(shí)施方式中，提供步驟包括提供真細(xì)菌宿主細(xì)胞 (例如，大腸桿菌)。在一些實(shí)施方式中，提供步驟包括提供含有編碼O-RS的多核苷酸的宿主細(xì)胞。例如，編碼O-RS的多核苷酸可包含SEQ ID NO:5、 7、 9或11所示核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，通過提供細(xì)胞提取物實(shí)現(xiàn) 提供翻譯系統(tǒng)的步驟。
本發(fā)明還提供包含核酸和蛋白質(zhì)的各種組合物。除了組合物含有所述 核酸或蛋白質(zhì)外，對(duì)該組合物的性質(zhì)不作具體限制。本發(fā)明組合物可含有 任何數(shù)量、任何性質(zhì)的其它組分。
例如，本發(fā)明提供含有O-RS多肽的組合物，其中所述多肽含有SEQ ID NO: 4、 6、 8或IO所示氨基酸序列或其保守變體。在一些方面，所述保守 變體多肽用非天然氨基酸氨?；P(guān)聯(lián)(cognate)正交tRNA (O-tRNA)的效率 至少為含有該O-tRNA、該非天然氨基酸和含有SEQIDNO: 4、 6、 8或10 所示氨基酸序列的氨?；?tRNA合成酶的翻譯系統(tǒng)所觀察到的效率的50M。 本發(fā)明還提供編碼上述任何多肽的多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，這些多 核苷酸可含有SEQIDNO:5、 7、 9或11所示核苷酸序列。在一些實(shí)施方式 中，多肽在細(xì)胞中。
本發(fā)明還提供含有SEQ IDNO:5、 7、 9或11所示核苷酸序列的多核苷 酸組合物。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供含有所述多核苷酸的載體，如 表達(dá)載體。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供含有上述載體的細(xì)胞。
定義
在詳細(xì)描述本發(fā)明前，應(yīng)該知道本發(fā)明不局限于具體的生物系統(tǒng)，本
發(fā)明當(dāng)然可以有各種變化。還應(yīng)知道本文所用的術(shù)語只是為了描述具體的
實(shí)施方式，而非限制性的。除非另有明確指出，本說明書和隨附的權(quán)利要
求書中使用的單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"和"該"也包括復(fù)數(shù)對(duì)象。因
此，例如述及"一個(gè)細(xì)胞"包括兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的組合；"一個(gè)多核苷酸"
實(shí)際上包括該多核苷酸的多份拷貝。
除了此處和說明書以下其余部分所定義的，本文所用的所有技術(shù)和科 學(xué)術(shù)語都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)理解的意義相同。
正交:本文所用的術(shù)語"正交"指與某細(xì)胞或翻譯系統(tǒng)的內(nèi)源性相應(yīng)分 子相比，某分子(例如，正交tRNA(0-tRNA)和/或正交氨酰tRNA合成酶(O-RS))
13與該細(xì)胞內(nèi)源性組分起作用的效率降低，或不能與該細(xì)胞的內(nèi)源性組分起作
用。就tRNA和氨?；?tRNA合成酶而言，正交指與和內(nèi)源性tRNA合成酶起 作用的內(nèi)源性tRNA相比，正交tRNA不能與內(nèi)源性tRNA合成酶起作用或起 作用的效率降低；或者與和內(nèi)源性tRNA起作用的內(nèi)源性tRNA合成酶相比， 正交氨酰tRNA合成酶與內(nèi)源性tRNA不起作用或起作用的效率降低，所述效 率降低例如，小于20%的效率，小于10%的效率，小于5%的效率，或小于1% 的效率。正交分子缺乏細(xì)胞中功能正常的內(nèi)源性互補(bǔ)分子。例如，與內(nèi)源性 RS氨?；瘍?nèi)源性tRNA相比，細(xì)胞的任何內(nèi)源性RS氨?；?xì)胞中正交tRNA 的效率降低或者甚至為0。在另一例子中，與內(nèi)源性RS氨?；瘍?nèi)源性tRNA 相比，正交RS氨酰化感興趣細(xì)胞中任何內(nèi)源性tRNA的效率降低或者甚至為 0?？蓪⒛芘c第一正交分子起作用的第二正交分子引入細(xì)胞。例如，正交 tRNA/RS配對(duì)包括引入的互補(bǔ)組份，與對(duì)照，例如相應(yīng)的tRNA/RS內(nèi)源性配 對(duì)或活性正交配對(duì)(如酪氨酰正交tRNA/RS配對(duì))相比，它們?cè)诩?xì)胞中共同起作 用的效率是，例如45%效率、50%效率、60%效率、70%效率、75%效率、80% 效率、卯％效率、95%效率或99%效率，或更高。
IH交酪氨酰-tRNA:本文所用的正交酪氨酰-tRNA(酪氨酰-O-tRNA)是 與感興趣翻譯系統(tǒng)正交的tRNA，其中所述tRNA是(1)與天然酪氨酰 -tRNA相同或基本類似；(2)通過天然或人工誘變衍生自天然酪氨酰tRNA;
(3) 由考慮了(l)或(2)的野生型或突變型酪氨酰tRNA序列的任何方法產(chǎn)生；
(4) 與野生型或突變型酪氨酰tRNA同源；(5)與圖7中稱為酪氨酰tRNA 合成酶底物的任何示例性tRNA同源；或(6)圖7中稱為酪氨酰tRNA合成 酶底物的任何示例性tRNA的保守變體。酪氨酰tRNA可加載有氨基酸，或 處于非負(fù)載狀態(tài)。還應(yīng)知道"酪氨酰-O-tRNA"任選被關(guān)聯(lián)(cognate)合成酶 分別加載(氨酰化)除酪氨酸以外的氨基酸，例如非天然氨基酸。應(yīng)該知道， 實(shí)際上優(yōu)選利用本發(fā)明酪氨酰-O-tRNA在翻譯期間對(duì)選擇者密碼子起反應(yīng) 而基本上可將任何氨基酸(無論天然或非天然的)摻入延伸的多肽內(nèi)。
TH交酪氨酰氨基酸合成酶:本文所用的正交酪氨酰氨基酸合成酶(酪氨 酰-O-RS)是在感興趣翻譯系統(tǒng)內(nèi)用氨基酸優(yōu)先氨?；野滨?O-tRNA的 酶。酪氨酰-O-RS加載到酪氨酰-04RNA上的氨基酸可以是任何氨基酸，無論是天然的、非天然的還是人工的，并且不限于本文所述的。該合成酶 任選與天然酪氨酰氨基酸合成酶相同或同源，或者與圖7中稱為O-RS的合
成酶相同或同源。例如，所述O-RS可以是圖7的酪氨酰-O-RS的保守變體， 和/或與圖7中O-RS的序列至少有50%、 60%、 70%、 80%、卯％、 95%、 98%、 99%或以上相同。
關(guān)聯(lián)(cognate):術(shù)語"關(guān)聯(lián)"指共同起作用或彼此具有一定特異性的組分， 例如正交tRNA和正交氨?；?tRNA合成酶。這些組分也可互稱為"互補(bǔ)的"。
優(yōu)先氨?；?對(duì)于本文所用正交翻譯系統(tǒng)而言，當(dāng)某表達(dá)系統(tǒng)中O-RS使 O-tRNA帶上氨基酸的效率高于其使任何內(nèi)源性tRNA帶上氨基酸的效率時(shí)， 該O-RS"優(yōu)先氨酰化"關(guān)聯(lián)O-tRNA。即，當(dāng)翻譯系統(tǒng)中存在摩爾比大致相等 的O-tRNA與任何給定的內(nèi)源性tRNA時(shí)，O-RS加載O-tRNA的頻率高于它 加載內(nèi)源性tRNA的頻率。當(dāng)翻譯系統(tǒng)中存在等摩爾濃度的O-tRNA與內(nèi)源性 tRNA時(shí)，由O-RS加載的O-tRNA與由O-RS加載的內(nèi)源性tRNA的相對(duì)比例 優(yōu)選較高，最好導(dǎo)致O-RS僅加載或幾乎僅加載O-tRNA。當(dāng)存在等摩爾濃度 的O-tRNA與O-RS時(shí)，O-RS加載的O-tRNA與內(nèi)源性tRNA的相對(duì)比例大于 1:1，優(yōu)選至少約2:1，更優(yōu)選5:1，更優(yōu)選10:1，更優(yōu)選20:1，更優(yōu)選50:1， 更優(yōu)選75: 1，更優(yōu)選95: 1、 98: 1、 99: 1、 100: 1、 500: 1、 1,000: 1、 5,000: 1 或更高。
當(dāng)(a)與內(nèi)源性tRNA相比，O-RS優(yōu)先氨?；疧-tRNA，和(b)與O-RS 用任何天然氨基酸氨?；疧-tRNA相比，氨?；瘜?duì)非天然氨基酸特異時(shí)，稱 O-RS "優(yōu)先用非天然氨基酸氨?；疧-tRNA"。艮卩，當(dāng)包含O-RS和O-tRNA 的翻譯系統(tǒng)中存在等摩爾量的非天然和天然氨基酸時(shí)，O-RS用非天然氨基酸 加載O-tRNA的頻率高于用天然氨基酸加載的頻率。加載有非天然氨基酸的 O-tRNA與加載有天然氨基酸的O-tRNA的相對(duì)比例優(yōu)選較高。O-RS最好使 O-tRNA僅加載，或者幾乎僅加載有非天然氨基酸。當(dāng)翻譯系統(tǒng)中存在等摩爾 濃度的天然和非天然氨基酸時(shí)，使O-tRNA帶上非天然氨基酸與使O-tRNA帶 上天然氨基酸的相對(duì)比例大于1: 1，優(yōu)選至少約2:1，更優(yōu)選5:1，更優(yōu)選10: 1，更優(yōu)選20:1，更優(yōu)選50:1，更優(yōu)選75:1，更優(yōu)選95: 1、 98: 1、 99: 1、 100: 1、 500:1、 1,000:1、 5,000: 1或更高。
15選擇者密碼子:術(shù)語"選擇者密碼子"指翻譯過程中為O-tRNA所識(shí)別而
不為內(nèi)源性tRNA所識(shí)別的密碼子。O-tRNA反密碼子環(huán)識(shí)別mRNA上的選擇 者密碼子并在多肽的此位置摻入其氨基酸，例如非天然氨基酸。選擇者密碼子 可包括，例如無義密碼子，如終止密碼子(如，琥珀、赭石和乳白密碼子)；四 堿基或四堿基以上密碼子；罕用密碼子；衍生自天然或非天然堿基對(duì)的密碼子， 等等。
抑制子tRNA:抑制^JRNA是在多肽翻譯期間通常對(duì)終止密碼子起反應(yīng) 而摻入氨基酸(即，"連讀")來改變給定的翻譯系統(tǒng)中信使RNA(mRNA)閱讀 的tRNA。在一些方面，本發(fā)明的選擇者密碼子是抑制子密碼子，例如，終止 密碼子(如，琥珀、赭石和乳白密碼子)、四堿基密碼子、罕用密碼子等。
抑制活性:本文所用的術(shù)語"抑制活性"總體上指tRNA(例如，抑制^JRNA) 能翻譯連讀在其它情況中可導(dǎo)致翻譯終止或錯(cuò)譯(例如，移碼)的密碼子(例如， 作為選擇者密碼子的琥珀密碼子或四個(gè)或以上個(gè)堿基的密碼子)的能力。抑制 itRNA的抑制活性可表示為與第二抑制itRNA，或與對(duì)照系統(tǒng)，例如缺乏 O-RS的對(duì)照系統(tǒng)相比，觀察到的翻譯連讀活性的百分比。
本發(fā)明提供定量測(cè)定抑制活性的各種方法。特定O-tRNA和O-RS對(duì)感興 趣選擇者密碼子(例如，琥珀密碼子)的抑制百分比指，在感興趣的翻譯系統(tǒng)中， 在編碼表達(dá)測(cè)試標(biāo)記的核酸中含有選擇者密碼子的該給定表達(dá)測(cè)試標(biāo)記(例 如，LacZ)的活性與陽性對(duì)照構(gòu)建物相比的百分比，所述感興趣的翻譯系統(tǒng)包 含O-RS禾B O-tRNA，所述陽性對(duì)照沒有O-tRNA、 O-RS和選擇者密碼子。因 此，例如，如果在給定翻譯系統(tǒng)中觀察到不含選擇者密碼子的活性陽性對(duì)照標(biāo) 記構(gòu)建物的活性為X(其單位與所述標(biāo)記試驗(yàn)相關(guān))，則含有選擇者密碼子的測(cè) 試構(gòu)建物的抑制百分比是在與陽性對(duì)照標(biāo)記的表達(dá)基本相同的環(huán)境條件下(除 了該測(cè)試標(biāo)記構(gòu)建物在也含有O-tRNA和O-RS的翻譯系統(tǒng)中表達(dá)外)，該測(cè)試 標(biāo)記構(gòu)建物顯示的X百分比。表達(dá)該測(cè)試標(biāo)記的翻譯系統(tǒng)一般也包含O-RS和 O-tRNA識(shí)別的氨基酸。可任選通過將測(cè)試標(biāo)記與"背景"或"陰性"對(duì)照標(biāo) 記構(gòu)建物比較來校正抑制百分比的測(cè)量值，所述"背景"或"陰性"對(duì)照標(biāo)記 構(gòu)建物含有與測(cè)試標(biāo)記相同的選擇者密碼子，但其所在的系統(tǒng)不含O-tRNA、 O-RS和/或O-tRNA和/或O-RS識(shí)別的相關(guān)氨基酸。該陰性對(duì)照可用于標(biāo)準(zhǔn)化抑制百分比測(cè)定值以補(bǔ)償感興趣的翻譯系統(tǒng)中標(biāo)記的背景信號(hào)的影響。
可通過本領(lǐng)域已知的許多試驗(yàn)測(cè)定抑制效率。例如，可采用y5-半乳糖苷酶
報(bào)道試驗(yàn)，如可將衍生的lacZ質(zhì)粒(該構(gòu)建物在lacZ核酸序列中含有選擇者密 碼子)連同含有本發(fā)明的O-tRNA的質(zhì)粒引入合適生物(例如，可利用正交組分 的生物)的細(xì)胞。還可引入關(guān)聯(lián)合成酶(可以是多肽或表達(dá)時(shí)能編碼該關(guān)聯(lián)合成 酶的多核苷酸)。細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至所需密度，例如至OD6oo約為0.5，進(jìn) 行(3-半乳糖苷酶試驗(yàn)，例如用諾瓦金公司(Novagen)的BetaFluorTM p-半乳糖苷 酶試驗(yàn)試劑盒?？蓪⒁种瓢俜直扔?jì)算為樣品相對(duì)于可比較對(duì)照，例如，衍生的 lacZ構(gòu)建物的觀察值的活性百分比，該構(gòu)建物在所需位置具有相應(yīng)的有義密碼 子而非選擇者密碼子。
翻譯系統(tǒng):術(shù)語"翻譯系統(tǒng)"指將氨基酸摻入延伸中的多肽鏈(蛋白質(zhì))的 各組分。翻譯系統(tǒng)的組分可包括，例如核糖體、tRNA、合成酶、mRNA等。 本發(fā)明的O-tRNA和/或O-RS可加入體外或體內(nèi)翻譯系統(tǒng)或是其一部分，例如 存在于非真核細(xì)胞，如細(xì)菌(如大腸桿菌)中，或存在于真核細(xì)胞中，如酵母菌、 哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等。
非天然氨基酸:本文所用的術(shù)語"非天然氨基酸"指不在20種常見天然 氨基酸或硒代半胱氨酸或吡咯賴氨酸(pyrrolysine)之列的任何氨基酸，修飾的 氨基酸和/或氨基酸類似物。例如，本發(fā)明可使用非天然氨基酸磺基酪氨酸(參 見

圖1)。
衍生自:本文所用的術(shù)語"衍生自"指分離自特定分子或生物，或是用特 定分子或生物的信息制得的某組份。例如，衍生自第二多肽的多肽含有與該第 二多肽的氨基酸序列相同或基本上類似的氨基酸序列。以多肽為例，可通過， 例如天然產(chǎn)生的誘變、人工定向誘變或人工隨機(jī)誘變獲得衍生的種類。用于衍 生多肽的誘變可以是有意定向或有意隨機(jī)的，或混用兩種方法。誘變多肽以產(chǎn) 生衍生自第一(多肽)的不同多肽可以是隨機(jī)的(例如，聚合酶失真所致)，可通 過合適的篩選方法，例如本文所述的方法鑒定衍生的多肽。誘變多肽通常需要 對(duì)編碼該多肽的多核苷酸進(jìn)行操作。
正選擇或篩選標(biāo)記:本文所用的術(shù)語"正選擇或篩選標(biāo)記"指當(dāng)存在該標(biāo)
記時(shí)(例如被表達(dá)或激活等)可從不具有特征的細(xì)胞中鑒定出具有特征的細(xì)胞，
17例如具有正選擇標(biāo)記的細(xì)胞。
負(fù)選擇或篩選標(biāo)記:本文所用的術(shù)語"負(fù)選擇或篩選標(biāo)記"指當(dāng)存在該標(biāo) 記時(shí)(例如被表達(dá)或激活等)可鑒定不含有所選特性或特征的細(xì)胞(例如，與確實(shí) 具有該特性或特征的細(xì)胞相比)。
報(bào)道分子:本文所用的術(shù)語"報(bào)道分子"是指可用于鑒定和/或選擇感 興趣系統(tǒng)的靶組分的組分。例如，報(bào)道分子可以包括蛋白質(zhì)，如能賦予抗 生素抗性或敏感性的酶(如P-內(nèi)酰胺酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)等)、熒光 篩選標(biāo)記(如綠色熒光蛋白(如GFP)、 YFP、 EGFP、 RFP等)、冷光標(biāo)記(如 螢火蟲螢光素酶蛋白)、親和力篩選標(biāo)記，或者可選擇的正或負(fù)標(biāo)記基因如 lacZ、 p-gal/lacZ(P-半乳糖苷酶)、ADH(乙醇脫氫酶)、his3、 ura3、 leu2、 lys2 等。
真核生物:本文所用的術(shù)語"真核生物"指屬于真核生物界(Kingdom Eucarya)的生物。真核生物通常因其以下特征而區(qū)別于原核生物典型的多細(xì) 胞組織(但不都是多細(xì)胞，例如酵母)，存在膜限制的核與其它膜限制的細(xì)胞器， 線形遺傳物質(zhì)(S卩，線形染色體)，不存在操縱子，存在內(nèi)含子、信使(RNA)加 帽和聚-AmRNA，以及其它生物化學(xué)特征，如不同的核糖體結(jié)構(gòu)。真核生物包 括，例如動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物、昆蟲、爬行動(dòng)物、鳥等)，纖毛蟲，植物(如單子葉 植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母菌、鞭毛蟲類、微孢子蟲、原生動(dòng) 物等。
原核生物:本文所用的術(shù)語"原核生物"指屬于原核生物界(也稱為原核 生物(Procarya))的生物。原核生物通常因其以下特征而區(qū)別于真核生物單細(xì) 胞組織，通過出芽或分裂的無性生殖，缺乏膜限制的核與其它膜限制的細(xì)胞器， 環(huán)狀染色體，存在操縱子，不存在內(nèi)含子、信使(RNA)加帽和聚-AmRNA，以 及其它生物化學(xué)特征，如不同的核糖體結(jié)構(gòu)。原核生物包括真細(xì)菌和古細(xì)菌 (Archaea)(有時(shí)稱為"古細(xì)菌(Archaebacteria)")亞界。在原核生物界有時(shí)將 藍(lán)細(xì)菌(藍(lán)綠藻)與支原體分為不同類別。
細(xì)菌:本文所用的術(shù)語"細(xì)菌"和"真細(xì)菌"指不同于Mm的原核生物。 類似地，古細(xì)菌指不同于真細(xì)菌的原核生物?？筛鶕?jù)許多形態(tài)和生物化學(xué)標(biāo)準(zhǔn) 區(qū)分真細(xì)菌和古細(xì)菌。例如，可采用核糖體RNA序列、RNA聚合酶結(jié)構(gòu)的差異，內(nèi)含子的存在與否，抗生素敏感性，細(xì)胞壁肽聚糖和其它細(xì)胞壁組分的存 在與否，膜脂質(zhì)的分枝與不分枝結(jié)構(gòu)，存在/不存在組蛋白和組蛋白樣蛋白而將 某生物指定為真細(xì)菌或古細(xì)菌。
真細(xì)菌的例子包括大腸桿菌C&c/ en'c/ /a co//)、嗜熱棲熱菌(77zenm^ Aermc^/w7w力、枯草芽孢桿菌(5a"7/M w6"7&)和嗜熱脂肪芽孢桿菌(Sac/〃w
Aerwo; /2//^)等)。古細(xì)菌的例子包括詹氏甲烷球菌(M"/7a"ococc^ ya""(xyc/n7)(A^)、梅氏甲烷乂V疊球菌(Af"/wf"oyorc/"a maze/)(A/w)、嗜熱石咸甲烷 t干菌(A/e^za"o6a"en'wrw Ae/-moaw/c^ro; /2/cMm)(AfiO 、 海 S 甲院球菌 (A/e^a/70cocc船manj^/Mofe)、 甲烷嗜熱菌(A/^/wfwopyrwj1 A:fl"cZ/en')、 鹽細(xì)菌 C/7a/oZ^"en'wm)(例如沃氏富鹽菌(i/a/o/erax vo/cam7)和鹽細(xì)菌種A^ C-7)、閃爍 古生球菌C^c/wfeog/o6z^/w/g/i^s)(4/)、激烈火球菌CP"ococcws/wnVww力CP力、極 端嗜熱古菌(尸3^"ococcw5 /zor汰oy/z/,)(尸/z)、好氧火球菌(尸少ro6acw/wm aera; /n7"m)、 深?；鹎蚓?尸戸coccus fl—w')、硫磺礦硫化葉菌(5W/o/oZms soZ/flton'cus)(&)、 超嗜熱泉古菌0 "http://0/。6^ totoc/a//)、嗜熱泉生古細(xì)菌/ em/x)(JP)、 嗜酸熱原體(T7^r附o/j/a5w" ac/c/o/ /n7ww)禾口火山熱原體(77^rwop/<xsmaf
保守性變體:就翻譯組分而言，本文所用的術(shù)語"保守性變體"指某翻譯
組份，例如保守性變體O-tRNA或保守性變體O-RS，其所執(zhí)行的功能與與其 相似的基本組分(例如O-tRNA或O-RS)相類似，但與參比O-tRNA或O-RS 相比序列中有變異的。例如，O-RS或該O-RS的保守性變體可用非天然氨 基酸，例如磺基酪氨酸氨酰化關(guān)聯(lián)O-tRNA。在該例子中，所述O-RS及保 守性變體O-RS的氨基酸序列不相同。所述保守性變體在序列中可具有例如 一處變異、兩處變異、三處變異、四處變異或五處或更多處變異，只要該保守 性變體仍與關(guān)聯(lián)的相應(yīng)O-tRNA或O-RS互補(bǔ)(例如，與之起作用)。
在一些實(shí)施方式中，保守性變體O-RS與衍生其的O-RS相比，含有一 個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸取代。在一些實(shí)施方式中，保守性變體O-RS與衍生 其的O-RS相比，含有一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸取代，此外還保留了O-RS 的生物學(xué)活性；例如，保守性變體O-RS保留了衍生其的親本O-RS分子至 少10%，或者至少20%，至少30%，或至少40。/。的生物學(xué)活性。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，所述保守性變體O-RS保留了衍生其的親本O-RS分子至少 50n/。的生物學(xué)活性。保守性變體O-RS的保守性氨基酸取代可出現(xiàn)在該O-RS 的任何結(jié)構(gòu)域內(nèi)，包括氨基酸結(jié)合袋。
選擇或篩選試劑:本文所用的術(shù)語"選擇或篩選試劑"指當(dāng)存在時(shí)可從某
群體中選擇/篩選某些組分的試劑。例如，選擇或篩選試劑可以是但不限于，如 營(yíng)養(yǎng)物、抗生素、某波長(zhǎng)的光、抗體、表達(dá)的多核苷酸等。選擇試劑可因例如 濃度、強(qiáng)度等而有所不同。
起反應(yīng):本文所用的術(shù)語"起反應(yīng)"指本發(fā)明的O-tRNA識(shí)別選擇者密碼 子并介導(dǎo)與該tRNA偶聯(lián)的非天然氨基酸摻入延伸中的多肽鏈的過程。
編碼:本文所用的術(shù)語"編碼"指用多聚大分子或序列鏈中的信息來指導(dǎo)
不同于該第一分子或序列鏈的第二種分子或序列鏈產(chǎn)生的任何過程。本文所用 的該術(shù)語應(yīng)用廣泛，可用于各領(lǐng)域。在一些方面，術(shù)語"編碼"描述了半保留
DNA復(fù)制的過程，其中雙鏈DNA分子的一條鏈用作模板，借助依賴DNA的 DNA合成酶來編碼新合成的互補(bǔ)姊妹鏈。
在另一方面，術(shù)語指用一種分子的信息來指導(dǎo)產(chǎn)生化學(xué)性質(zhì)不同 于該第一分子的第二種分子的任何過程。例如，DNA分子可編碼RNA分子(例 如，包含依賴DNA的RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄過程)。RNA分子也可編碼多肽，例 如翻譯過程。當(dāng)術(shù)語"編碼"用于描述翻譯過程時(shí)，其含義也延伸至編碼氨基 酸的三聯(lián)密碼子。在一些方面，RNA分子可編碼DNA分子，例如通過包含依 賴RNA的DNA合成酶的逆轉(zhuǎn)錄過程。在另一方面，DNA分子可編碼多肽， 應(yīng)該知道該情況用"編碼"同時(shí)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。
附圖簡(jiǎn)述
圖1提供了非天然氨基酸磺基酪氨酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖2顯示了考馬斯亮藍(lán)染色的變性PAGE凝膠，展示了磺基-蛭素和磺基-蛭素的遷移。由于蛭素的非典型帶電因此無法通過分子量標(biāo)準(zhǔn)品判斷其分子 里。
圖3A和3B提供了凝血酶抑制的代表性圖示，分別在原始數(shù)據(jù)點(diǎn)上擬合 了過程曲線。在含聚乙二醇6000和HAS的Tris-HCl鹽水緩沖液中用50 熒光底物、40 pM人a-凝血酶和100 pM表達(dá)蛭素進(jìn)行酶實(shí)驗(yàn)。圖3A顯示了無 抑制(對(duì)照)、脫磺基-蛭素抑制及磺基-蛭素抑制的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化圖。圖 3B顯示對(duì)脫磺基-蛭素和磺基-蛭素的放大圖以便比較。
圖4A和4B顯示了 Z-結(jié)構(gòu)域的磺基酪氨酸依賴性表達(dá)。圖4A提供了表 達(dá)7位具有琥珀密碼子的Z-結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞的Ni-NTA純化細(xì)胞裂解物經(jīng)考馬斯 亮藍(lán)染色的變性PAGE凝膠。只有使用磺基酪氨酸補(bǔ)充培養(yǎng)基表達(dá)時(shí)產(chǎn)生全長(zhǎng) Z-結(jié)構(gòu)域。圖4B提供了 Ni-NTA純化細(xì)胞裂解物(濃縮并對(duì)水透析)正-離子線 性模式MALDI-TOF譜(用THAP基質(zhì)產(chǎn)生)，顯示了含單一磺基酪氨酸并缺少 甲硫氨酸的全長(zhǎng)Z-結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的峰。也觀察到從質(zhì)譜分析條件中導(dǎo)致硫酸基團(tuán) 丟失所對(duì)應(yīng)的峰。
圖5A、 5B和5C顯示了不同的MALDI-TOF譜。圖5A所示純磺基-蛭素 正離子線性模式MALDI-TOF譜(用THAP基質(zhì)產(chǎn)生)，顯示完整[M+H]磺基-蛭 素峰(7059 Da)和質(zhì)譜分析中硫酸基團(tuán)丟失所對(duì)應(yīng)的峰(6979 Da)。注意主峰右側(cè) 的小峰是鈉加合物。它們以22Da的間隔出現(xiàn)。圖5B所示MALDI-TOF譜(用 芥子基質(zhì)產(chǎn)生)記錄了樣品的純度。為了增強(qiáng)對(duì)可能雜質(zhì)的檢測(cè)，使用更嚴(yán)苛 的導(dǎo)致[M+H-80]峰突顯的芥子基質(zhì)。13964 Da的峰歸因于磺基-蛭素二聚化。 未觀察到其它雜質(zhì)。圖5C顯示了相關(guān)區(qū)域的放大圖，以顯示[M+H-80]和完整 磺基-蛭素峰的存在。因?yàn)槭褂昧烁鼑?yán)苛的芥子基質(zhì)，完整的磺基-蛭素是較小 的峰。主峰右側(cè)的小峰是鈉加合物。
圖6A和6B顯示了不同的MALDI-TOF譜。圖6A顯示了在磺基酪氨酸不 存在時(shí)表達(dá)對(duì)應(yīng)的未純化磺基-蛭素表達(dá)培養(yǎng)基的MALDI-TOF譜(使用芥子基 質(zhì)產(chǎn)生)。僅發(fā)現(xiàn)截短蛭素的峰；未觀察到全長(zhǎng)蛋白。圖6B顯示了在磺基酪氨 酸存在時(shí)表達(dá)對(duì)應(yīng)的未純化磺基-蛭素表達(dá)培養(yǎng)基的MALDI-TOF譜(使用芥子 基質(zhì)產(chǎn)生)，顯示了截短與全長(zhǎng)磺基-蛭素的峰比例。因?yàn)樾枰鼑?yán)苛的條件更 好地檢測(cè)粗樣品混合物，所以僅清晰觀察到磺基-蛭素的離子化形式。
圖7提供核苷酸和氨基酸序列。
發(fā)明詳述
盡管酪氨酸硫酸化是多細(xì)胞真核生物中普遍的翻譯后修飾(Moore，"蛋
21白酪氨酸O-硫酸化的生物學(xué)和酶學(xué)"(The biology and enzymology of protein tyrosine O-sulfation)， J5/o/C/zem 2003))，但其生物學(xué)功能大部分未知。部 分因?yàn)楹铣蛇x擇性硫酸化蛋白的困難。本發(fā)明提供了在細(xì)菌中通過響應(yīng)琥 珀無義密碼子TAG而遺傳編碼修飾氨基酸，從而將磺基酪氨酸摻入蛋白質(zhì) 中。而且顯示了用此策略可使以前無法通過重組方法得到的磺基蛭素在大 腸桿菌中直接表達(dá)。如本文所述，動(dòng)力學(xué)分析顯示磺基-蛭素對(duì)人凝血酶的 親和力比脫磺基-蛭素增強(qiáng)10倍以上，這個(gè)發(fā)現(xiàn)為磺基-蛭素作為抗凝劑提 供了臨床優(yōu)勢(shì)(DiNisio等，"直接凝血酶抑制劑"(DirecUhrombin inhibitors) JV五"g/JMW353:1028-1040 (2005))。這個(gè)生物合成硫酸化蛋白的通用方法 有利于對(duì)出現(xiàn)的翻譯后修飾，酪氨酸硫酸化進(jìn)行進(jìn)一步研究和應(yīng)用。
作為蛋白位點(diǎn)特異性硫酸化的一般方法，本發(fā)明描述了正交tRNA/氨 ?；?tRNA合成酶(aaRS)對(duì)的演化，以便在真核生物如大腸桿菌中響應(yīng)于琥 珀無義密碼子而有效和選擇性地將磺基酪氨酸摻入蛋白質(zhì)中。使用獨(dú)特的 抑制子tRNA/aaRS對(duì)，可直接表達(dá)蛭素的天然硫酸化形式，證明其對(duì)人凝 血酶的親和力比脫磺基-蛭素強(qiáng)10倍以上，這與此前文獻(xiàn)報(bào)道一致(Stone 和Hofsteenge，"蛭素對(duì)凝血酶抑制的動(dòng)力學(xué)"(Kinetics of the inhibition of thrombin by hirudin) Aoc/z謹(jǐn)'腳25:4622-4628 (1986》。
本發(fā)明提供能在大腸桿菌中對(duì)選擇者密碼子(例如琥珀終止密碼子TAG) 起反應(yīng)而將磺基酪氨酸(參見圖l)體內(nèi)選擇性引入蛋白質(zhì)的正交tRNA7氨酰基 -tRNA合成酶配對(duì)。本發(fā)明提供用非天然氨基酸磺基酪氨酸特異性加載相關(guān)的 正交tRNA(O-tRNA)的新正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)多肽。
在某些方面，為證明(但不是限制)本發(fā)明，本文內(nèi)容證明可將非天然氨基 酸部分摻入各種模型蛋白質(zhì)。摻入非天然氨基酸不必局限于任何特定的蛋白 質(zhì)。從本發(fā)明可以明白，將非天然氨基酸磺基酪氨酸摻入感興趣的特定蛋白質(zhì) 對(duì)于各種目的是有利的。
本文還描述了開發(fā)能在真細(xì)菌中起作用而對(duì)選擇者密碼子起反應(yīng)，從 而位點(diǎn)特異性地?fù)饺敕翘烊话被峄腔野彼?如圖1所示)的新型正交 tRNA/氨?；?tRNA合成酶配對(duì)的方法。簡(jiǎn)言之，本發(fā)明提供了在大腸桿菌 宿主細(xì)胞中用非天然氨基酸磺基酪氨酸選擇性加載抑制iRNA的詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶的新型突變體。
可利用這些開發(fā)的tRNA-合成酶配對(duì)將非天然氨基酸磺基酪氨酸位點(diǎn)特 異性地慘入蛋白質(zhì)?？赏ㄟ^工程改造編碼感興趣蛋白質(zhì)的多核苷酸序列使之含 有能發(fā)出慘入非天然氨基酸信號(hào)的選擇者密碼子，從而能將非天然氨基酸編程 摻入任何所需位置。
本文所述發(fā)明提供在真細(xì)菌，例如大腸桿菌中將非天然氨基酸磺基酪氨酸 遺傳編碼并摻入蛋白質(zhì)的正交配對(duì)，其中所述正交組分不與宿主細(xì)胞翻譯機(jī)制 的內(nèi)源性大腸桿菌組分交叉反應(yīng)，但能識(shí)別所需的非天然氨基酸并對(duì)選擇者密 碼子(例如，琥珀無義密碼子，TAG)起反應(yīng)而將其摻入蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的 正交組分包括衍生自詹氏甲垸球菌酪氨酰tRNA-合成酶的正交氨?；?tRNA合 成酶，和突變型酪氨酰tRNAojA琥珀抑制子，二者在真細(xì)菌宿主細(xì)胞中用作正 交配對(duì)。
本發(fā)明提供鑒定和產(chǎn)生其它正交tRNA-氨?；?tRNA合成酶配對(duì)，例如 O-tRNA/0-RS配對(duì)的組合物和方法，所述配對(duì)可用于將磺基酪氨酸摻入蛋白 質(zhì)。本發(fā)明的O-tRNA/0-RS配對(duì)能介導(dǎo)磺基酪氨酸摻入多核苷酸編碼的蛋白 質(zhì)，其中所述多核苷酸包含所述O-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子。所述O-tRNA 的反密碼子環(huán)識(shí)別mRNA上的選擇者密碼子，進(jìn)而將非天然氨基酸摻入多肽 中的該位點(diǎn)。本發(fā)明的正交氨?；?tRNA合成酶通常只用一種特定的非天然氨 基酸優(yōu)先氨?；?或加載)其O-tRNA。
正交tRNA/氨?；?tRNA合成酶技術(shù)
理解與正交tRNA和正交氨酰基-tRNA合成酶配對(duì)有關(guān)的活性有助于 理解本發(fā)明的新型組合物和方法。為在遺傳密碼中加入額外的非天然氨基 酸，需要含有氨酰基-tRNA合成酶和適當(dāng)tRNA的新正交配對(duì)，它們可在 宿主翻譯機(jī)制中有效起作用，但對(duì)于所述翻譯系統(tǒng)是"正交"的，這意味 著它可不依賴于翻譯系統(tǒng)的內(nèi)源性合成酶和tRNA而起作用。正交配對(duì)的所 需特征包括能解碼或識(shí)別不由任何內(nèi)源性tRNA解碼的僅一種特定密碼子(例 如選擇者密碼子)的tRNA，和只能用一種特定非天然氨基酸優(yōu)先氨?；?或"加 載")其關(guān)聯(lián)tRNA的氨?；?tRNA合成酶。內(nèi)源性合成酶通常不氨?；?O-tRNA(或氨?；?，即加載不佳)。例如，在大腸桿菌宿主系統(tǒng)中，正交配對(duì)包括不與任何內(nèi)源性tRNA(例如，大腸桿菌中有40種)交叉反應(yīng)的氨?；?tRNA 合成酶和不被任何內(nèi)源性合成酶(例如，大腸桿菌中有21種)氨?；恼?濯A。
本領(lǐng)域已知適于制備含有一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的正交翻譯 系統(tǒng)的通用原則，例如制備正交翻譯系統(tǒng)的通用方法。例如，可參見國(guó)際公開 號(hào)WO 2002/086075，名為"METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL畫tRNA SYNTHETASE PAIRS"(產(chǎn)生正交tRNA-氨?；?tRNA合成酶配對(duì)的方法和 組合物)；WO 2002/085923 ，名為"IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS "(非天然氨基酸的體內(nèi)摻入)；WO 2004/094593 ，名為"EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE" (擴(kuò)展真核遺傳密碼)；2004年7月7日提交的WO 2005/019415; 2004年7 月7日提交的WO 2005/007870; 2004年7月7日提交的WO 2005/007624; 2005年10月27日提交的WO 2006/110182，名為"ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS"(用于體內(nèi)摻入非天然氨基酸的正交翻譯組 分)和2007年3月7日提交的WO 2007/103490，名為"SYSTEMS FOR THE EXPRESSION OF ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOST CELLS(在真細(xì)菌宿主細(xì)胞中表達(dá)正交翻譯組分的 系統(tǒng))"。這些申請(qǐng)各自通過引用全文納入本文。摻入非天然氨基酸的正交 翻譯系統(tǒng)和它們的產(chǎn)生及使用方法的討論還可參見Wang和Schultz， "Expanding the Genetic Code (擴(kuò)展遺傳密碼)"，^wge冊(cè)m^e C7zem/e. 五d ， 44(l):34-66 (2005); Xie和Schultz， "An Expanding Genetic Code (擴(kuò) 展的遺傳密碼)"，M"Ws 36(3):227-238 (2005); Xie和Schultz, "Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire (將氨基酸加入遺傳庫(kù))"，C釘. Op/m'o"〖"C/zem,ca/ 5,o/ogy 9(6):548-554 (2005);禾卩Wang等，"Expanding the Genetic Code (擴(kuò)展遺4專密碼)"，Jwww. i ev. 5fowo/, S&m".，
35:225-249 (2006);這些文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用全文納入本文。正交翻譯系統(tǒng)
正交翻譯系統(tǒng)一般包括含有正交tRNA(O-tRNA)、正交氨酰tRNA合成酶 (O-RS)和非天然氨基酸的細(xì)胞(可以是原核細(xì)胞，例如大腸桿菌)，其中所述 O-RS用所述非天然氨基酸氨?；鯫-tRNA。本發(fā)明的正交配對(duì)可以包括 O-tRNA，例如抑制itRNA、移碼tRNA等和關(guān)聯(lián)O-RS。本發(fā)明的正交系統(tǒng) 通常包含處于宿主細(xì)胞環(huán)境中或無宿主細(xì)胞的O-tRNA/O-RS配對(duì)。除多組分 系統(tǒng)外，本發(fā)明還提供新型單組分，例如，新型正交氨?；?tRNA合成酶多肽 (例如，SEQIDNO:4、 6、 8或IO)和編碼那些多肽的多核苷酸(例如，SEQ ID NO:5、 7、 9或11)。
當(dāng)正交配對(duì)識(shí)別選擇者密碼子并對(duì)該選擇者密碼子起反應(yīng)而加載氨基酸 時(shí)，通常稱該正交配對(duì)"抑制"該選擇者密碼子。即，不被翻譯系統(tǒng)的(例如， 細(xì)胞的)內(nèi)源性機(jī)制識(shí)別的選擇者密碼子通常不被加載，從而阻斷了多肽產(chǎn)生， 否則可自核酸翻譯該多肽。在正交配對(duì)系統(tǒng)中，O-RS用特定的非天然氨基酸 氨?；疧-tRNA。加載的O-tRNA識(shí)別選擇者密碼子并抑制選擇者密碼子所致 的翻譯阻斷。
在一些方面，與包含本文序列表所示多核苷酸序列或由其編碼的 O-tRNA的抑制效率相比，本發(fā)明的O-tRNA識(shí)別選擇者密碼子并在關(guān)聯(lián)合 成酶存在下對(duì)選擇者密碼子起反應(yīng)而具有至少約，例如，45%、 50%、 60%、 75%、 80%或90%或更高的抑制效率。'
在一些實(shí)施方式中，聯(lián)用O-RS和O-tRNA的抑制效率是缺乏O-RS的 O-tRNA的抑制效率的約，例如5倍、10倍、15倍、20倍或25倍或更高。 在一些方面，聯(lián)用O-RS和O-tRNA的抑制效率是本文序列表所示正交合成 酶配對(duì)的抑制效率的至少約，例如35%、 40°/。、 45%、 50%、 60%、 75%、 80%或90%或更高。
宿主細(xì)胞利用O-tRNA/0-RS配對(duì)將非天然氨基酸摻入延伸中的多肽鏈， 例如經(jīng)由包含編碼感興趣多肽的多核苷酸的核酸，其中所述多核苷酸包含所述 O-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子。在某些優(yōu)選方面，細(xì)胞可包含一種或多種其它 O-tRNA/0-RS配對(duì)，其中玩述其它O-RS用不同的非天然氨基酸加載所述其它 O-tRNA。例如，O-tRNA之一可識(shí)別四堿基密碼子，其它O-tRNA可識(shí)別終止密碼子?；蛘撸鄠€(gè)不同的終止密碼子或多個(gè)不同的四堿基密碼子可用于同一 編碼核酸。
應(yīng)注意，在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞或其它翻譯系統(tǒng)中可存在多個(gè)
0-tRNA/0-RS配對(duì)，從而能將多個(gè)非天然氨基酸摻入多肽。例如，細(xì)胞還可包 含額外的不同O-tRNA/0-RS配對(duì)和第二非天然氨基酸，其中該額外的O-tRNA 識(shí)別第二選擇者密碼子，該額外的O-RS用該第二非天然氨基酸優(yōu)先氨酰化該 額外的0- tRNA。例如，包含O-tRNA/0-RS配對(duì)的細(xì)胞(其中所述O-tRNA識(shí) 別，例如琥珀選擇者密碼子)還可包含第二正交配對(duì)，其中該第二O-tRNA識(shí)別 不同的選擇者密碼子，例如乳白密碼子、四堿基密碼子等。不同的正交配對(duì)優(yōu) 選衍生自不同來源，從而有助于識(shí)別不同的選擇者密碼子。
在某些實(shí)施方式中，系統(tǒng)包含例如大腸桿菌細(xì)胞等細(xì)胞，這些細(xì)胞含有正 交tRNA(O-tRNA)、正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)、非天然氨基酸和包含編碼 感興趣多肽的多核苷酸的核酸，其中所述多核苷酸包含所述O-tRNA識(shí)別的選 擇者密碼子。翻譯系統(tǒng)還可以是無細(xì)胞系統(tǒng)，例如與本文所述O-tRNA/0-RS 配對(duì)和非天然氨基酸組合的各種市售可得"體外"轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)。
0-tRNA和/或0-RS可以是天然產(chǎn)生的，或者可以是，例如天然tRNA和 /或RS經(jīng)突變衍生，例如，通過產(chǎn)生各種生物的tRNA文庫(kù)和/或RS文庫(kù)和/ 或采用各種可用的突變方案。例如，產(chǎn)生正交tRNA/氨酰基-tRNA合成酶配對(duì) 的一種方案包括將，例如得自除宿主細(xì)胞外的來源或多個(gè)來源的異源(對(duì)宿主 細(xì)胞而言)tRNA/合成酶配對(duì)輸入宿主細(xì)胞。候選異源合成酶的特性包括，例如 不加載任何宿主細(xì)胞tRNA，候選異源tRNA的特性包括，例如不被任何宿主 細(xì)胞合成酶所氨?；?。此外，異源tRNA對(duì)于所有宿主細(xì)胞合成酶是正交的。 產(chǎn)生正交配對(duì)的第二種方案包括產(chǎn)生用于篩選和/或選擇O-tRNA或O-RS的突 變體文庫(kù)。也可聯(lián)用這些方案。
正交tRNA(O-tRNA)
本發(fā)明的正交tRNA(O-tRNA)優(yōu)選在例如體內(nèi)或體外介導(dǎo)將非天然氨 基酸摻入蛋白質(zhì)內(nèi)，所述蛋白質(zhì)由含選擇者密碼子的多核苷酸編碼，而這 種選擇者密碼子可被該O-tRNA識(shí)別。在某些實(shí)施方式中，與包含本文序
26列表中O-tRNA序列所示多核苷酸序列或由其編碼的O-tRNA相比，本發(fā)明的O-tRNA在關(guān)聯(lián)合成酶存在下，對(duì)選擇者密碼子起反應(yīng)而具有至少45%、 50%、 60%、 75%、 80%、卯％或更高的抑制效率。
可通過本領(lǐng)域己知的多種試驗(yàn)測(cè)定抑制效率。例如，可采用P半乳糖苷酶報(bào)道分子試驗(yàn)，例如，將衍生的lacZ質(zhì)粒(該構(gòu)建物在lacZ核酸序列中含有選擇者密碼子)和含有本發(fā)明O-tRNA的質(zhì)粒一起導(dǎo)入合適生物(如可利用正交組分的生物)的細(xì)胞內(nèi)。還可導(dǎo)入關(guān)聯(lián)合成酶(多肽或表達(dá)時(shí)可編碼關(guān)聯(lián)合成酶的多核苷酸)。將細(xì)胞在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)到所需密度，如OD,約0.5時(shí)，采用例如諾瓦金公司(Novagen)的BetaFluorTM P-半乳糖苷酶檢測(cè)試劑盒進(jìn)行P半乳糖苷酶試驗(yàn)。抑制百分率可以計(jì)算為樣品相對(duì)于可比較對(duì)照(如衍生的lacZ構(gòu)建物的觀察值，所述構(gòu)建物在所需位置上含有相應(yīng)的有義密碼子而不是選擇者密碼子)的活性百分?jǐn)?shù)。
本發(fā)明O-tRNA的例子見本文序列表，例如參見圖7和SEQIDNO:l。本文內(nèi)容還提供了設(shè)計(jì)其它等價(jià)O-tRNA的指導(dǎo)。在RNA分子(例如O-RSmRNA或O-tRNA分子)中，與給定序列(或?qū)幋aDNA而言反之亦然)或其互補(bǔ)序列相比，胸腺嘧啶(T)被尿嘧啶(U)取代。還可存在堿基的其它修飾以大量產(chǎn)生功能等價(jià)分子。
本發(fā)明還包括對(duì)應(yīng)于本文具體O-tRNA的O-tRNA保守性變體。例如，O-tRNA保守性變體包括功能與具體O-tRN A(例如本文序列表中的)相似的，和因合適的自身互補(bǔ)性而保留了 tRNA的L-形結(jié)構(gòu)但不具有與例如序列表或圖7所示那些(序列)相同的序列并且最好也不是野生型tRNA分子的那些分子。
含O-tRNA的組合物還可包含正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)，其中所述O-RS用非天然氨基酸優(yōu)先氨?；疧-tRNA。在某些實(shí)施方式中，含有O-tRNA的組合物還可包含(例如體外或體內(nèi))翻譯系統(tǒng)。細(xì)胞中也可存在含有編碼感興趣多肽的多核苷酸的核酸或這些物質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)的組合，其中所述多核苷酸含有O-tRNA能識(shí)別的選擇者密碼子。
產(chǎn)生正交tRNA(O-tRNA)的方法也是本發(fā)明的特征之一。通過該方法產(chǎn)生的正交tRNA(0-tRNA)也是本發(fā)明的特征之一。在本發(fā)明的某些實(shí)旅方式中，可通過構(gòu)建突變體文庫(kù)來產(chǎn)生O-tRNA。可采用本領(lǐng)域已知的各種誘變技術(shù)構(gòu)建突變體tRNA文庫(kù)。例如，可通過位點(diǎn)特異性突變、隨機(jī)位點(diǎn)突變、同源重組、DNA改組或其它遞歸誘變(recursive mutagenesis)方法、嵌合體構(gòu)建、或者這些技術(shù)的任何組合產(chǎn)生突變體tRNA，例如SEQ ID NO:1所示O-tRNA。
也可將其它突變引入特定位置，例如tRNA的所需環(huán)或區(qū)域(如反密碼子環(huán)、接納莖、D臂或環(huán)、可變環(huán)、TPC臂或環(huán)、tRNA分子的其它區(qū)域或其組合)中一個(gè)或多個(gè)非保守位置、保守位置、 一個(gè)或多個(gè)隨機(jī)位置或者二者的組合位置。tRNA中的突變通常包括使突變型tRNA文庫(kù)內(nèi)各成員的反密碼子環(huán)突變以使其能識(shí)別選擇者密碼子。該方法還可包括給O-tRNA加上額外序列。與起始材料(例如多種tRNA序歹i」)相比，O-tRNA通常提高了對(duì)所需生物的正交性，同時(shí)保留其對(duì)所需RS的親和力。
這些方法任選包括分析tRNA和/或氨?；?tRNA合成酶序列的相似性(和/或所推斷的同源性)以確定顯示與特定生物正交的潛在候選O-tRNA、0-RS和/或其配對(duì)?？衫帽绢I(lǐng)域己知和本文所述的計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行這種分析，例如可用BLAST和堆積(pileup)程序。在一個(gè)實(shí)施例中，為篩選用于大腸桿菌的可能的正交翻譯組分，可選擇與真細(xì)菌生物不顯示接近的序列相似性的合成酶和/或tRNA。
通?？赏ㄟ^，例如負(fù)選擇第一物種的細(xì)胞群以獲得O-tRNA，其中所述細(xì)胞含有多種潛在O-tRNA的某成員。負(fù)選擇可去除含有被細(xì)胞內(nèi)源性氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨?；臐撛贠-tRNA文庫(kù)某成員的細(xì)胞。這樣就可以得到第一物種細(xì)胞的正交tRNA庫(kù)。
某些實(shí)施方式在負(fù)選擇中將選擇者密碼子引入編碼負(fù)選擇標(biāo)記(例如能賦予抗生素抗性的酶如P內(nèi)酰胺酶；能得到可檢測(cè)產(chǎn)物的酶如|3半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)，所述產(chǎn)物例如是毒性產(chǎn)物，如芽孢桿菌RNA酶)的多核苷酸的非必須位置(例如，仍能產(chǎn)生功能性芽孢桿菌RNA酶)等。還任選在選擇性試劑(比如抗生素，如氨芐青霉素)存在下培養(yǎng)細(xì)胞群來進(jìn)行篩選/選擇。在一個(gè)實(shí)施方式中，選擇性試劑的濃度不同。
例如，為檢測(cè)抑制itRNA的活性，可利用基于選擇者密碼子的體內(nèi)抑制的選擇系統(tǒng)，例如將無義(如終止)或移碼突變引入編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多
核苷酸(如編碼P-內(nèi)酰胺酶的基因(W"))中。例如，構(gòu)建在某位置(如，A184)
含有選擇者密碼子的多核苷酸變體，如變體。用這些多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，
如細(xì)菌。以不能被內(nèi)源性大腸桿菌合成酶有效加載的正交tRNA為例，抗生素抗性(例如氨芐青霉素抗性)應(yīng)約為或小于未用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的抗生素抗性。如果tRNA不是正交的，或者能加載該tRNA的異源合成酶在此系統(tǒng)內(nèi)共同表達(dá)，應(yīng)可觀察到更高水平的抗生素(如氨芐青霉素)抗性。選出那些在抗生素濃度與未用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞大致相等的LB瓊脂平板上不能生長(zhǎng)的細(xì)胞，如細(xì)菌。
以毒性產(chǎn)物(如核糖核酸酶或芽孢桿菌RNA酶)為例，當(dāng)多種潛在的tRNA中的成員被內(nèi)源性宿主(如大腸桿菌)合成酶(即與宿主如大腸桿菌合成酶不是正交的)氨?；瘯r(shí)，選擇者密碼子被抑制，所產(chǎn)生的毒性多核苷酸產(chǎn)物導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而含有正交tRNA或非功能性tRNA的細(xì)胞可存活。
然后，在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)與所需生物正交的tRNA庫(kù)進(jìn)行正選擇，其中將選擇者密碼子置于正選擇標(biāo)記中(例如抗藥性基因(如p內(nèi)酰胺酶基因)編碼的標(biāo)記)。對(duì)以下細(xì)胞進(jìn)行正選擇含有編碼與該細(xì)胞正交的tRNA庫(kù)某成員的多核苷酸或包含該成員的多核苷酸、含有編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸和含有編碼關(guān)聯(lián)RS的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，第二群細(xì)胞含有不能通過負(fù)選擇除去的細(xì)胞。該多核苷酸在胞內(nèi)表達(dá)，細(xì)胞在有選擇試劑(如氨芐青霉素)存在下生長(zhǎng)。然后選擇能被共同表達(dá)的關(guān)聯(lián)合成酶氨?；约皩?duì)此選擇者密碼子起反應(yīng)而插入氨基酸的tRNA。與一種或多種含有非功能性tRNA或不能被感興趣合成酶有效識(shí)別的tRNA的細(xì)胞相比，這些細(xì)胞通常顯示抑制效率升高。含有非功能性tRNA或不能被感興趣合成酶有效識(shí)別的tRNA的細(xì)胞對(duì)該抗生素敏感。因此在兩次選擇中能保留下的tRNA是(i)不是內(nèi)源性宿主(如大腸桿菌)合成酶的底物；(ii)能被感興趣的合成酶氨酰化；以及(iii)能在翻譯過程中起作用。
因此，取決于篩選所處的環(huán)境，同一標(biāo)記可以是正或負(fù)標(biāo)記。即，如果為了篩選該標(biāo)記，則它是正標(biāo)記，但如果為了抵御該標(biāo)記則它是負(fù)標(biāo)記。
上述方法中，篩選，如正選擇、負(fù)選擇或者正負(fù)選擇的嚴(yán)格性任選包括改變選擇的嚴(yán)格性。例如，由于芽孢桿菌RNA酶是毒性極高的蛋白質(zhì)，可通過將不同數(shù)目的選擇者密碼子引入到芽孢桿菌RNA酶基因內(nèi)和/或使
用可誘導(dǎo)啟動(dòng)子來控制負(fù)選擇的嚴(yán)格性。在另一實(shí)施例中，選擇或篩選試劑的濃度(如氨芐青霉素的濃度)可以不同。在本發(fā)明的一些方面，因?yàn)樵谇皫纵喼兴杌钚暂^低，嚴(yán)格性可以不同。因此，前幾輪適用較低的嚴(yán)格性篩選標(biāo)準(zhǔn)，而后幾輪選擇適用更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)。在某些實(shí)施方式中，負(fù)選擇、正選擇或者正負(fù)選擇可重復(fù)多次。也可使用多個(gè)不同的負(fù)選擇標(biāo)記、正選擇標(biāo)記或正負(fù)選擇標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，正選擇標(biāo)記和負(fù)選擇標(biāo)記可以相同。
其他類型的選擇/篩選方法也可用于本發(fā)明以制備正交翻譯組分，如
O-tRNA、 O-RS和能對(duì)選擇者密碼子起反應(yīng)而加載非天然氨基酸的0-tRNA/0-RS配對(duì)。例如，負(fù)選擇標(biāo)記、正選擇標(biāo)記或正負(fù)選擇標(biāo)記可包括發(fā)熒光的或在合適反應(yīng)物存在下能催化發(fā)光反應(yīng)的標(biāo)記。在另一實(shí)施方式中，可通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS)或發(fā)光檢測(cè)標(biāo)記的產(chǎn)物。標(biāo)記任選可包括親和篩選標(biāo)記。也參見Francisco, J. A.等(1993)， "iVo<ii/c"ow awt/y7womyce"ce-fl"/v她t/
exfema/ wr/ace (在外表面表達(dá)功能性抗體片段的大腸桿菌的制備與熒光激活細(xì)胞分選)"，Proc Natl Acad Sci USA.， 90: 10444-8。
制備重組正交tRNA的其它方法可見，例如名為"METHODS ANDCOMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNAAMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS (制備正交tRNA-氨?；?tRNA合成酶配對(duì)的方法和組合物)"的國(guó)際申請(qǐng)
發(fā)明者C·C·劉, P·G·舒爾茨 申請(qǐng)人:斯克利普斯研究院