專利名稱:芥花籽蛋白質(zhì)的生產(chǎn)的制作方法
芥花籽蛋白質(zhì)的生產(chǎn)
相關(guān)串請的參照
依據(jù)35 USC 119(e)，本申請要求2005年7月I日提交的U.S.臨時專利申請No. 60/695, 535 的優(yōu)先權(quán)。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及用于制備基本上無芥花桿(canola)7S和12S蛋白質(zhì)的芥花桿2S蛋白質(zhì)的新方法。
發(fā)明背景
·[0005]可以從芥花籽油種子粉形成芥花籽蛋白質(zhì)分離物。2002年5月3日提交的共同未決美國專利申請No. 10/137，391 (US專利申請公開號20030125526A1)，2004年6月9日提交的10/476，230 (US專利申請公開號20040254353A1)和相應(yīng)的PCT公開No. W002/089597,都轉(zhuǎn)讓于本受讓人并在此將其公開內(nèi)容引入作為參考，其描述了從芥花籽油種子粉制備芥花籽蛋白質(zhì)分離物的方法，該分離物具有至少100wt%蛋白質(zhì)含量(NX6. 25)。該方法涉及多步驟過程，包括使用鹽溶液提取芥花籽油種子粉，分離所得到的含水蛋白質(zhì)溶液和殘余的油種子粉，使用選擇性膜技術(shù)將水溶液的蛋白質(zhì)濃度提高至至少約200g/L同時保持離子強(qiáng)度基本不變，將所得到的濃縮蛋白質(zhì)溶液稀釋至冷卻水中來形成蛋白質(zhì)膠束，使蛋白質(zhì)膠束沉淀來形成無定形、粘性、膠狀谷蛋白質(zhì)樣蛋白質(zhì)膠束團(tuán)(PMM)，并從上清液中收集具有至少約100wt%蛋白質(zhì)含量的蛋白質(zhì)膠束團(tuán)，如通過凱氏氮(NX6. 25)所測定的。如在此所用的，基于干重來測定蛋白質(zhì)含量。可以將回收的PMM干燥。
在上述方法的一個實(shí)施方案中，處理來自PMM沉淀步驟的上清液來回收蛋白質(zhì)分離物，該分離物包括來自濕PMM和上清液的干燥蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^最初使用超濾膜濃縮上清液，混合濃縮的上清液和濕PMM并干燥混合物來實(shí)現(xiàn)該方法。所得到的芥花籽蛋白質(zhì)分離物具有至少約90被％蛋白質(zhì)的高純度(NX6. 25)，優(yōu)選至少約IOOwt % (NX6. 25)。
在上述方法的另一個實(shí)施方案中，處理來自PMM沉淀步驟的上清液來回收來自上清液的蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^最初使用超濾膜濃縮上清液并干燥濃縮物來實(shí)現(xiàn)該方法。所得到的芥花籽蛋白質(zhì)分離物具有至少約90wt%蛋白質(zhì)的高純度(NX6. 25)，優(yōu)選至少約IOOwt % (NX 6. 25)。
上述US專利申請中所述的方法實(shí)質(zhì)上是間歇法。2002年11月19日提交的共同未決美國專利申請No. 10/298, 678 (US專利公開No. 20040039174A1)和相應(yīng)公開的國際申請NO.W003/043439，轉(zhuǎn)讓于本受讓人并在此將其公開內(nèi)容引入作為參考，描述了制備芥花籽蛋白質(zhì)分離物的連續(xù)方法。根據(jù)其，將芥花籽油種子粉與鹽溶液連續(xù)混合，通過管道傳送混合物，同時從芥花籽油種子粉中提取蛋白質(zhì)來形成含水蛋白質(zhì)溶液，將含水蛋白質(zhì)溶液與殘余的芥花籽油種子粉連續(xù)分離，將含水蛋白質(zhì)溶液連續(xù)傳送通過選擇性膜操作，以將含水蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)濃度提高至至少約200g/L，同時保持離子強(qiáng)度基本不變，將所得到的濃縮蛋白質(zhì)溶液與冷卻水連續(xù)混合來形成蛋白質(zhì)膠束，并使蛋白質(zhì)膠束連續(xù)沉淀，同時使上清液連續(xù)溢出，直至沉淀罐中累積所需量的PMM。從沉淀罐中取出PMM并可以將其干燥。PMM具有至少約90wt %蛋白質(zhì)含量，通過凱氏氮所測定(NX 6. 25)，優(yōu)選至少約IOOwt %(NX 6. 25)。
如上述US專利申請No. 10/137, 391和10/471，230中所述的，可以處理溢出的上清液，以從其回收芥花籽蛋白質(zhì)分離物。
已知芥花籽種子含有約10至約3(^丨％的蛋白質(zhì)，并且已經(jīng)鑒定了幾種不同的蛋白質(zhì)成分。通過不同的沉降系數(shù)(S)來區(qū)分這些蛋白質(zhì)。這些已知并鑒定的蛋白質(zhì)包括12S球蛋白質(zhì),稱為cruciferin,和2S儲存蛋白質(zhì),稱為napin。
芥花籽也稱為油菜籽或油菜(oil seed rape)。
2003年8月25日提交的共同未決美國專利申請No. 10/413，371 (US專利申請公開No. 20040034204)和2003年4月15日提交的10/510，766，以及相應(yīng)公開的PCT公開NO.W003/08876，轉(zhuǎn)讓于本受讓人并在此將其公開內(nèi)容引入作為參考，描述了 PMM芥花籽蛋白質(zhì)分離物和源自上清液的芥花籽蛋白質(zhì)分離物的組成。源自上清液的芥花籽蛋白質(zhì)分離物主要由2S蛋白質(zhì)構(gòu)成，含有較少量的7S蛋白質(zhì)和痕量的12S蛋白質(zhì)。2S蛋白質(zhì)是低分·子量白蛋白。產(chǎn)生的PMM主要由7S蛋白質(zhì)構(gòu)成，2S蛋白質(zhì)和12S蛋白質(zhì)是相對少量的成分。7S和12S蛋白質(zhì)是較高分子量的球蛋白質(zhì)，7S分子是12S蛋白質(zhì)分子的一半。
如在此所述的，源自上清液的芥花籽蛋白質(zhì)分離物呈現(xiàn)出如下的蛋白質(zhì)分布
約60至約95% wt%的2S蛋白質(zhì)，
約5至約40wt%的7S蛋白質(zhì)，和
O至約5wt%的12S蛋白質(zhì),優(yōu)選
約70至約95wt%的2S蛋白質(zhì)，
約5至約30wt%的7S蛋白質(zhì)，和
O至約2界七％的12S蛋白質(zhì)。
PMM芥花籽蛋白質(zhì)分離物呈現(xiàn)出如下的蛋白質(zhì)分布
約60至約98界七％的7S蛋白質(zhì)，
約I至約15界七％的12S蛋白質(zhì)，和
O至約25wt%的2S蛋白質(zhì),優(yōu)選
約88至約98界七％的7S蛋白質(zhì)，
約I至約IOwt%的12S蛋白質(zhì)，和
O至約6wt %的2S蛋白質(zhì)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)源自上清液的主要由2S蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物對于某些應(yīng)用呈現(xiàn)出比源自PMM的主要由7S蛋白質(zhì)構(gòu)成的蛋白質(zhì)分離物更好的功能特性。在在先申請中描述的方法中，為了產(chǎn)生源自上清液的芥花籽蛋白質(zhì)分離物，需要依次進(jìn)行PMM形成并提供上清液的步驟，以有效地分離芥花籽蛋白質(zhì)。
2005年7月21日提交的U. S.專利申請No. 11/038，086 (U. S.專利申請公開NO.US2005-0181112A1)，轉(zhuǎn)讓于本受讓人并在此將其公開內(nèi)容引入作為參考(W02005/067729)，描述了一種方法，其中將來自PMM沉淀的上清液在膜處理后進(jìn)行熱處理來沉淀7S蛋白質(zhì)并留下富含2S蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液。可以將剩余的溶液噴霧干燥。
具有最小比例7S和12S蛋白質(zhì)的2S蛋白質(zhì)證明了在酸性pH值的溶解性超過未處理的2S蛋白質(zhì)并能夠提供提高的溶液清澈度以及用于軟飲料時，提供了清澈的蛋白質(zhì)強(qiáng)化飲料。
發(fā)明概述
已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，如果在升高的溫度而不是在相對環(huán)境溫度實(shí)現(xiàn)芥花籽油種子粉的提取，那么2S蛋白質(zhì)的提取優(yōu)先于7S和12S蛋白質(zhì)并且所得到提取溶液中的芥花籽蛋白質(zhì)主要由2S蛋白質(zhì)構(gòu)成，然后可以從提取溶液以相對純的形式獲得2S蛋白質(zhì)。
盡管不希望受到任何理論的束縛，但是認(rèn)為在升高的提取溫度優(yōu)先于7S和/或12S蛋白質(zhì)而選擇性提取2S芥花籽蛋白質(zhì)的能力是由于芥花籽油種子粉中的7S和12S蛋白質(zhì)在提取步驟過程中的降解和沉淀。
因此，在本發(fā)明的一個方面中，提供了生產(chǎn)主要由2S芥花籽蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物的方法，其包括用鹽水溶液在升高的溫度提取芥花籽油種子粉，優(yōu)先于7S和12S蛋白質(zhì)從芥花籽油種子粉中優(yōu)先提取2S蛋白質(zhì)并獲得主要含有2S蛋白質(zhì)的芥花籽油蛋白質(zhì)提取溶液，從殘余的芥花籽油種子粉中分離出芥花籽蛋白質(zhì)提取溶液，并從芥花·籽蛋白質(zhì)提取溶液中回收具有至少約90wt% (NX6. 25)蛋白質(zhì)含量并主要由2S芥花籽蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物。
進(jìn)一步令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的再一方面，如果以兩個階段來實(shí)現(xiàn)芥花籽油種子粉提取，使用水實(shí)現(xiàn)第一個提取和使用鹽水溶液實(shí)現(xiàn)第二個提取，從第一個提取步驟獲得主要是7S蛋白質(zhì)的含水芥花籽蛋白質(zhì)溶液，從第二個提取步驟獲得主要是2S蛋白質(zhì)的含水芥花桿蛋白質(zhì)提取溶液。
最初用水的芥花籽油種子粉的提取步驟溶解了顯著部分的7S和12S蛋白質(zhì)，較少部分的2S蛋白質(zhì)和大部分的可溶性雜質(zhì)。用鹽水溶液的第二個提取，形成含有大部分2S蛋白質(zhì)，少量7S和12S蛋白質(zhì)以及低濃度可溶性雜質(zhì)的芥花籽蛋白質(zhì)水溶液。
根據(jù)上述U. S.專利申請No. 11/038, 086中所述的方法，將鹽水芥花籽蛋白質(zhì)提取物濃縮，滲濾(diafilter)來降低鹽含量,然后熱處理來沉淀剩余的7S和12S蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了制備主要由2S芥花籽蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物的方法，其包括用水提取芥花籽油種子粉，優(yōu)先于2S蛋白質(zhì)來優(yōu)先提取7S和12S芥花籽蛋白質(zhì)和可溶性雜質(zhì)，形成第一個芥花籽蛋白質(zhì)提取溶液，將第一個芥花籽蛋白質(zhì)提取溶液與殘余的油種子粉分離，用鹽水溶液提取殘余的油種子粉來溶解殘余油種子粉的2S，7S和12S蛋白質(zhì)，形成第二個芥花籽蛋白質(zhì)提取溶液，并從第二個芥花籽蛋白質(zhì)提取溶液回收具有至少約90wt% (NX6. 25)蛋白質(zhì)含量并主要由2S蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物。
進(jìn)一步令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，可以根據(jù)上述U. S.專利申請No. 11/038，586的方法將上述U. S.專利申請No. 10/137，391中所述的濃縮步驟獲得的濃縮芥花籽蛋白質(zhì)溶液熱處理來沉淀其中所含的大部分7S和12S蛋白質(zhì)，留下基本上由2S蛋白質(zhì)構(gòu)成的濃縮芥花籽蛋白質(zhì)水溶液。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了生產(chǎn)主要由2S芥花籽蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物的方法，其包括用鹽水溶液提取芥花籽油種子粉，以從芥花籽油種子粉中提取芥花籽蛋白質(zhì)和獲得芥花籽蛋白質(zhì)溶液，將芥花籽蛋白質(zhì)溶液與殘余的油種子粉分離，濃縮所述的芥花籽蛋白質(zhì)溶液，作為滯留物來提供濃縮的蛋白質(zhì)溶液，熱處理濃縮的蛋白質(zhì)溶液，以優(yōu)先于2S芥花籽蛋白質(zhì)從濃縮的芥花籽蛋白質(zhì)溶液選擇性地沉淀7S和12S芥花籽蛋白質(zhì)，形成主要含有2S芥花籽蛋白質(zhì)的熱處理過的芥花籽蛋白質(zhì)溶液，將熱處理過的芥花籽蛋白質(zhì)溶液與沉淀的蛋白質(zhì)分離，并從分離的熱處理過的芥花籽蛋白質(zhì)溶液回收具有至少約90wt% (NX6. 25)蛋白質(zhì)含量和主要由2S芥花籽蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物。
進(jìn)一步令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，可以根據(jù)上述U. S.專利申請No. 11/038, 586的方法將按照上述U. S.專利申請No. 10/137, 391的方法通過芥花籽油種子粉的鹽提取獲得的芥花籽蛋白質(zhì)水溶液熱處理，來沉淀其中所含的大部分7S和12S蛋白質(zhì)，留下基本上由2S蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花桿蛋白質(zhì)水溶液。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了生產(chǎn)主要由2S芥花籽蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物的方法，其包括用鹽水溶液提取芥花籽油種子粉，以從芥花籽油種子粉中提取芥花籽蛋白質(zhì)和獲得芥花籽蛋白質(zhì)溶液，將芥花籽蛋白質(zhì)溶液與殘余的油種子粉分離，熱處理濃縮的蛋白質(zhì)溶液，優(yōu)先于2S芥花籽蛋白質(zhì)從芥花籽蛋白質(zhì)溶液選擇性地沉淀7S和12S芥花籽蛋白質(zhì)，形成主要含有2S芥花籽蛋白質(zhì)的熱處理過的芥花籽蛋白質(zhì)溶液，將熱處理過的芥花籽蛋白質(zhì)溶液與沉淀的蛋白質(zhì)分離，并從分離的熱處理過的芥花籽蛋白質(zhì)溶液回·收具有至少約90wt% (NX6. 25)蛋白質(zhì)含量和主要由2S芥花籽蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物。
本發(fā)明的方法能夠獲得主要由2S芥花籽蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物，不需要使用PMM沉淀分級步驟，因此很大程度上簡化了程序并且能夠更經(jīng)濟(jì)地獲得主要為2S蛋白質(zhì)的芥花籽蛋白質(zhì)分離物。
根據(jù)在此的方法產(chǎn)生的芥花籽蛋白質(zhì)分離物可以用于蛋白質(zhì)分離物的適宜應(yīng)用中，如加工食品的蛋白質(zhì)強(qiáng)化，油的乳化，焙烤商品中的成形劑(body former)和截留氣體的產(chǎn)品中的發(fā)泡劑。此外，芥花籽蛋白質(zhì)分離物可以形成蛋白質(zhì)纖維，用于肉類似物中，可以用作蛋清替代物或?qū)⒌扒逵米髡澈蟿┑氖称分械脑隽縿?extender)。芥花籽蛋白質(zhì)分離物可以用作營養(yǎng)補(bǔ)充劑。芥花籽蛋白質(zhì)分離物的其他用途是在蛋白質(zhì)強(qiáng)化飲料，寵物食品，動物飼料以及工業(yè)和化妝品應(yīng)用和個人護(hù)理產(chǎn)品中。
發(fā)明總述
如上所述，本發(fā)明提供了生產(chǎn)主要由2S蛋白質(zhì)構(gòu)成的基本上無7S和12S蛋白質(zhì)的芥花籽蛋白質(zhì)溶液的方法的四個方面。
(a)利用高溫提取芥花籽油種子粉的方面
根據(jù)本發(fā)明的這個方面，提供芥花籽蛋白質(zhì)分離物方法的最初步驟包括從芥花籽油種子粉溶解蛋白質(zhì)材料。從芥花籽種子粉回收的蛋白質(zhì)材料可以是芥花籽種子中天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)材料可以是通過基因操作修飾但具有天然蛋白質(zhì)特征性疏水和極性特征的蛋白質(zhì)。芥花籽粉可以是從含有不同水平的非變性蛋白質(zhì)的芥花籽油種子除去芥花籽油得到的任何芥花籽粉，例如，從熱己烷提取或冷油壓榨方法獲得。通常作為與在此所述的蛋白質(zhì)分離物回收步驟分開的操作來實(shí)現(xiàn)從芥花籽油種子除去芥花籽油。
在本發(fā)明的一個方面中，使用食品級鹽溶液來最有效地實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)溶解，因為鹽的存在提高了從油種子粉中除去可溶性蛋白質(zhì)。在打算將芥花籽蛋白質(zhì)分離物用于非食品用途的情況中，可以使用非食品級的化學(xué)物質(zhì)。鹽通常是氯化鈉，盡管可以使用其他鹽，如氯化鉀。鹽溶液具有至少約O. 05的離子強(qiáng)度，優(yōu)選至少約O. 10，至多約O. 2，以能夠溶解待實(shí)現(xiàn)的顯著含量的蛋白質(zhì)。隨著鹽溶液的離子強(qiáng)度的提高，油種子粉中蛋白質(zhì)的溶解程度開始提聞，直至獲得最大值。任何隨后的尚子強(qiáng)度的提聞并不提聞溶解的總蛋白質(zhì)。引起最大蛋白質(zhì)溶解的食品級鹽溶液的離子強(qiáng)度根據(jù)所涉及的鹽和選擇的芥花籽油種子粉而改變。
在本發(fā)明的這個方面中，在升高的溫度實(shí)現(xiàn)芥花籽油種子粉的提取，通常在約70°至約100°C的溫度，優(yōu)選約80°至約95°C，來引起2S芥花籽蛋白質(zhì)從油種子粉優(yōu)先提取至蛋白質(zhì)提取溶液中，優(yōu)先于7S和12S蛋白質(zhì)。
食品級鹽水溶液通常具有約5至約6. 8的pH，優(yōu)選約5. 3至約6. 2。可以按照需要，使用任何適宜的酸，通常是鹽酸，或堿，通常是氫氧化鈉，將鹽溶液的PH調(diào)節(jié)至約5至約
6.8范圍內(nèi)的任何所需值，用于提取步驟中。溶解步驟過程中食品級鹽溶液中芥花籽油種子粉的濃度可以在很寬的范圍內(nèi)變化。通常的濃度值為約5%至約15% w/vo
從提取步驟獲得的蛋白質(zhì)溶液通常具有約I至約40g/L的蛋白質(zhì)濃度，優(yōu)選約10至約20g/L。
蛋白質(zhì)溶液通常具有如下的芥花籽蛋白質(zhì)分布
約80至約IOOwt% 2S蛋白質(zhì)，
O至約10wt% 7S蛋白質(zhì)，和
O 至約 IOwt% 12S 蛋白質(zhì)；
優(yōu)選約85至約IOOwt% 2S蛋白質(zhì)，
O至約15wt% 7S蛋白質(zhì)，和
O至約5wt% 12S蛋白質(zhì)。
鹽水溶液可以含有抗氧化劑?？寡趸瘎┛梢允侨魏芜m宜抗氧化劑，如亞硫酸鈉或抗壞血酸。所用的抗氧化劑量可以為溶液的約O. 01至約Iwt%，優(yōu)選約O. 05wt%?？寡趸瘎┯脕硪种频鞍踪|(zhì)溶液中酚的氧化。
然后可以以任何適宜的方式從殘余的芥花籽粉分離提取步驟獲得的水相，如通過使用沉降式離心機(jī)，接著碟式離心和/或過濾來除去殘余的粉?？梢詫⒎蛛x的殘余粉干燥，用于處置。
可以依據(jù)淺色和不那么強(qiáng)的黃色來改善最終芥花籽蛋白質(zhì)分離物的顏色，通過將粉末狀活性碳或其他色素吸附劑與分離的蛋白質(zhì)水溶液混合，并隨后除去吸附劑，適宜地通過過濾，來提供蛋白質(zhì)溶液。滲濾也可以用來除去色素。
可以在任何適宜條件下進(jìn)行這樣的除色步驟，通常在分離蛋白質(zhì)水溶液的環(huán)境溫度下，使用任何合適的色素吸附劑。對于粉末狀的活性碳，使用約O. 025%至約5% w/v的量，優(yōu)選約O. 05%至約2% w/v ο
在芥花籽種子粉含有顯著含量脂肪的情況中，如US專利No. 5，844，086和6，005, 076 (其轉(zhuǎn)讓于本受讓人并將其公開內(nèi)容在此弓I入作為參考)中所述，然后可以對分離的蛋白質(zhì)水溶液和如下討論的濃縮的蛋白質(zhì)水溶液進(jìn)行其中所述的脫脂步驟。當(dāng)進(jìn)行改善顏色的步驟時，可以在第一個脫脂步驟后進(jìn)行該步驟。
處理蛋白質(zhì)提取水溶液以從其回收芥花籽蛋白質(zhì)分離物。其中產(chǎn)生的芥花籽蛋白質(zhì)分離物具有至少約90wt %的蛋白質(zhì)含量(NX 6. 25)，優(yōu)選至少約IOOwt %，且主要由2S蛋白質(zhì)構(gòu)成。
在這樣的處理中，可以將蛋白質(zhì)提取溶液濃縮來提高其蛋白質(zhì)濃度?？梢允褂萌魏芜m宜的選擇性膜技術(shù)，如超濾，來進(jìn)行這樣的濃縮，使用具有合適截留分子量的膜，允許低分子量物質(zhì)，包括鹽以及從蛋白質(zhì)源材料提取出來的其他非蛋白質(zhì)低分子量材料通過膜，而將芥花籽蛋白質(zhì)保留在溶液中。鑒于不同的膜材料和構(gòu)型，可以使用具有約3，000至100, 000道爾頓截留分子量的超濾膜，優(yōu)選約5，000至約10，000道爾頓。以這種方式濃縮蛋白質(zhì)提取溶液還可以降低回收蛋白質(zhì)需要干燥的液體體積。通常將蛋白質(zhì)提取溶液濃縮至至少約50g/L的蛋白質(zhì)濃度,優(yōu)選約100至約400g/L,更優(yōu)選約200至約300g/L?？梢?以間歇式處理模式或以連續(xù)操作來進(jìn)行這樣的濃縮操作。
如所公知的，超濾和相似的選擇性膜技術(shù)允許低分子量物質(zhì)通過而阻止較高分子量的物質(zhì)通過。低分子量物質(zhì)不僅包括食品級鹽的離子物質(zhì)，而且包括從源材料提取出來的低分子量材料，如碳水化合物，色素和抗?fàn)I養(yǎng)因子。鑒于不同的膜材料和構(gòu)型，通常選擇膜的截留分子量來確保相當(dāng)大部分的蛋白質(zhì)保留在溶液中，而允許雜質(zhì)通過。
然后可以將濃縮的蛋白質(zhì)提取溶液進(jìn)行使用水的滲濾步驟。可以使用約2至約20體積滲濾溶液，優(yōu)選約5至約10體積滲濾溶液，來進(jìn)行這樣的滲濾。在滲濾操作中，可以通過滲透物穿過膜，從蛋白質(zhì)提取水溶液中除去更多含量的雜質(zhì)。可以進(jìn)行滲濾操作直至沒有更多顯著量的酚和可見的顏色存在于滲透物中。可以使用用于濃縮步驟的相同膜來進(jìn)行這樣的滲濾。然而，如果需要，鑒于不同的膜材料和構(gòu)型，可以使用分開的膜來進(jìn)行滲濾，如具有約3，000至約100，000道爾頓范圍內(nèi)截留分子量的膜，優(yōu)選約5，000至約10，000道爾頓。
在滲濾步驟的至少部分過程中，滲濾介質(zhì)中可以存在抗氧化劑?？寡趸瘎┛梢允侨魏芜m宜的抗氧化劑，如亞硫酸鈉或抗壞血酸。滲濾介質(zhì)中所用的抗氧化劑量取決于所用的材料并可以為約O. 01至約Iwt優(yōu)選約O. 05wt%?？寡趸瘎┯脕硪种茲饪s的蛋白質(zhì)提取溶液中存在的酚類的氧化。
可以在任何適宜的溫度進(jìn)行濃縮步驟和滲濾步驟，通常約20°至約60°C，優(yōu)選約20至約30°C，并持續(xù)實(shí)現(xiàn)所需濃縮程度的時間段。所用的溫度和其他條件一定程度上取決于用于實(shí)現(xiàn)濃縮的膜設(shè)備和所需的溶液蛋白質(zhì)濃度。
如果需要，可以將濃縮并任選滲濾的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行進(jìn)一步的脫脂操作，如US專利 No. 5，844，086 和 6，005，076 中所述的。
可以將濃縮并任選滲濾的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行作為上述除色操作的可替換方案的除色操作。在此可以使用粉末狀的活性碳以及顆粒狀的活性碳(GAC)?？梢杂米黝伾絼┑牧硪环N材料是聚乙烯吡咯烷酮。
可以在任何適宜條件下進(jìn)行顏色吸附劑處理步驟，通常在芥花籽蛋白質(zhì)溶液的環(huán)境溫度。對于粉末狀的活性碳，可以使用約O. 025%至約5% w/v的量，優(yōu)選約O. 05%至約2% w/v。在使用聚乙烯吡咯烷酮作為顏色吸附劑的情況下，可以使用約O. 5%至約5% w/V，優(yōu)選約2%至約3% w/v。可以通過任何適宜方法，如通過過濾，從芥花籽蛋白質(zhì)溶液中除去顏色吸附劑。
如果需要，可以將濃縮并任選滲濾的蛋白質(zhì)水溶液進(jìn)行熱處理步驟來降低溶液中存在的7S和12S蛋白質(zhì)含量?？梢允褂米阋越档腿芤褐写嬖诘?S和12S比例的溫度和時間分布來進(jìn)行這樣的熱處理，優(yōu)選將7S和12S蛋白質(zhì)的比例降低顯著的程度。通常，通過熱處理將溶液中7S和12S蛋白質(zhì)含量降低至少約50wt%，優(yōu)選至少約75wt%。通常，可以在約70°至約100°C的溫度進(jìn)行熱處理，優(yōu)選約75至約95°C，持續(xù)約2至約30分鐘，優(yōu)選約5至約15分鐘。可以以任何適宜方式，如通過離心或過濾，除去并回收沉淀的7S和12S蛋白質(zhì)。
可以通過任何適宜技術(shù)，如噴霧干燥或冷凍干燥，將濃縮并任選滲濾和任選熱處理的蛋白質(zhì)水溶液干燥至干的形式來提供干燥的芥花籽蛋白質(zhì)分離物，其主要由2S芥花籽蛋白質(zhì)構(gòu)成并具有至少約90wt%蛋白質(zhì)含量(NX6. 25),優(yōu)選至少100wt%。
(b)利用多次提取芥花籽油種子粉的方面
提供芥花籽蛋白質(zhì)分離物方法的最初步驟包括從芥花籽油種子粉溶解蛋白質(zhì)材料。從芥花籽種子粉回收的蛋白質(zhì)材料可以是芥花籽種子中天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)材料可以是通過基因操作修飾但具有天然蛋白質(zhì)特征性疏水和極性特征的蛋白質(zhì)。芥花籽·粉可以是從含有不同水平的非變性蛋白質(zhì)的芥花籽油種子除去芥花籽油得到的任何芥花籽粉，例如，從熱己烷提取或冷油壓榨方法獲得。通常作為與在此所述的蛋白質(zhì)分離物回收步驟分開的操作來實(shí)現(xiàn)從芥花籽油種子除去芥花籽油。
以多個步驟來進(jìn)行本發(fā)明這方面中的蛋白質(zhì)溶解。在第一個步驟中，使用水作為提取介質(zhì)，其優(yōu)先從芥花籽油種子粉提取7S和12S芥花籽蛋白質(zhì)并優(yōu)先于2S芥花籽蛋白質(zhì)和大小相當(dāng)比例的可溶性雜質(zhì)。可以作為芥花籽油種子粉的單次水提取或芥花籽油種子粉的多次水提取來進(jìn)行水提取步驟，如約2至約25次提取，優(yōu)選約2至約4次提取。
可以以任何所需的方式來處理7S和12S蛋白質(zhì)的水溶液來回收7S和12S蛋白質(zhì)作為芥花籽蛋白質(zhì)分離物。例如，加入鹽水后，可以將蛋白質(zhì)水溶液進(jìn)行濃縮和膠束形成步驟，如上述U.S.專利申請no. 10/137, 391中所述的。
在約10°至約70°C的溫度進(jìn)行使用水提取芥花籽油種子粉，優(yōu)選約55°C至約65°C。溶解步驟過程中水中芥花籽油種子粉的濃度可以廣泛改變。通常的濃度值為約5至約 15% w/v ο
從水提取步驟獲得的蛋白質(zhì)溶液通常具有約10至約40g/L的蛋白質(zhì)濃度，優(yōu)選約10 至約 25g/L。
在溶解的第二個步驟中，用鹽水溶液提取來自水提取的殘余芥花籽油種子粉，獲得芥花籽蛋白質(zhì)提取水溶液，其含有大部分2S芥花籽蛋白質(zhì)，少量的7S和12S芥花籽蛋白質(zhì)以及低含量的雜質(zhì)。鹽通常是氯化鈉，盡管可以使用其他鹽，如氯化鈉。通常使用食品級鹽溶液，但在打算將芥花籽蛋白質(zhì)分離物用于非食品用途的情況中，可以使用非食品級化學(xué)物質(zhì)。
溶解的第二個步驟中使用的鹽水溶液通常具有至少約O. 05的離子強(qiáng)度，優(yōu)選至少約O. 1，通常至多約O. 5。
食品級鹽水溶液通常具有約5至約6. 8的pH，優(yōu)選約5. 3至約6. 2，可以按照需要，使用任何適宜的酸，通常是鹽酸，或堿，通常是氫氧化鈉，將鹽溶液的PH調(diào)節(jié)至約5至約6. 8范圍內(nèi)的任何所需值，用于提取步驟中。
用食品級鹽溶液提取上述芥花籽油種子粉通常在約5°C至約65°C的溫度進(jìn)行，優(yōu)選約20°C至約30°C。溶解步驟過程中食品級鹽溶液中芥花籽油種子粉的濃度可以廣泛改變，通常約5至約15% w/v ο
從鹽水提取步驟獲得的蛋白質(zhì)溶液通常具有約I至約40g/L的蛋白質(zhì)濃度，優(yōu)選約5至約20g/L。
從油種子粉的鹽水溶解得到的蛋白質(zhì)水溶液通常具有如下的芥花籽蛋白質(zhì)分布
約80 至約 IOOwt % 2S 蛋白，
O至約IOwt% 7S蛋白，和
O 至約 IOwt % 12S 蛋白；
優(yōu)選約85至約IOOwt% 2S蛋白，
O至約15wt% 7S蛋白，和
O 至約 5wt% 12S 蛋白。
鹽水溶液中可以含有抗氧化劑。抗氧化劑可以是任何適宜的抗氧化劑，如亞硫酸鈉或抗壞血酸。所用的抗氧化劑量可以為溶液的約O. 01至約Iwt%，優(yōu)選約O. 05wt%?？寡趸瘎┯脕硪种频鞍踪|(zhì)溶液中酚類的氧化。
然后可以以任何適宜的方式從殘余的芥花籽粉分離提取步驟獲得的水相，如通過使用沉降式離心機(jī)，接著碟式離心和/或過濾來除去殘余的粉?？梢詫⒎蛛x的殘余的粉干燥，用于處置。
可以依據(jù)淺色和不那么強(qiáng)烈的黃色來改善最終芥花籽蛋白質(zhì)分離物的顏色，通過將粉末狀活性碳或其他色素吸附劑與分離的蛋白質(zhì)水溶液混合，并隨后除去吸附劑，通常通過過濾，來提供蛋白質(zhì)溶液。滲濾也可以用來除去色素。
可以在任何適宜條件下進(jìn)行這樣的除色步驟，通常在分離蛋白質(zhì)水溶液的環(huán)境溫度下，使用任何合適的色素吸附劑。對于粉末狀的活性碳，使用約O. 025%至約5% w/v的量，優(yōu)選約O. 05%至約2% w/v ο
可以處理芥花籽蛋白質(zhì)水溶液來回收具有至少約90wt% (NX6. 25)蛋白質(zhì)濃度，優(yōu)選至少約IOOwt %，并主要由2S蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物。
在這樣的處理中，可以將蛋白質(zhì)提取溶液濃縮來提高其蛋白質(zhì)濃度?？梢允褂萌魏芜m宜的選擇性膜技術(shù)，如超濾，來進(jìn)行這樣的濃縮，使用具有合適截留分子量的膜，允許低分子量物質(zhì)，包括鹽以及從蛋白質(zhì)源材料提取出來的其他非蛋白質(zhì)低分子量材料通過膜，而將芥花籽蛋白質(zhì)保留在溶液中。鑒于不同的膜材料和構(gòu)型，可以使用具有約3，000至100, 000道爾頓截留分子量的超濾膜，優(yōu)選約5，000至約10，000道爾頓。以這種方式濃縮蛋白質(zhì)提取溶液還可以降低回收蛋白質(zhì)需要干燥的液體體積。通常將蛋白質(zhì)提取溶液濃縮至至少約50g/L的蛋白質(zhì)濃度,優(yōu)選約100至約400g/L,更優(yōu)選約200至約300g/L。可以以間歇式處理模式或以連續(xù)操作來進(jìn)行這樣的濃縮操作。
然后可以將濃縮的蛋白質(zhì)提取溶液進(jìn)行使用水的滲濾步驟?？梢允褂眉s2至約20體積滲濾溶液，優(yōu)選約5至約10體積滲濾溶液，來進(jìn)行這樣的滲濾。在滲濾操作中，可以通過滲透物穿過膜，從蛋白質(zhì)提取水溶液中除去更多含量的雜質(zhì)?？梢赃M(jìn)行滲濾操作直至沒有更多顯著量的酚和可見的顏色存在于滲透物中?？梢允褂糜糜跐饪s步驟的相同膜來進(jìn)行這樣的滲濾。然而，如果需要，鑒于不同的膜材料和構(gòu)型，可以使用分開的膜來進(jìn)行滲濾，如具有約3，OOO至約100，000道爾頓范圍內(nèi)截留分子量的膜，優(yōu)選約5，000至約10，000道爾頓。
在滲濾步驟的至少部分過程中，滲濾介質(zhì)中可以存在抗氧化劑?？寡趸瘎┛梢允侨魏芜m宜的抗氧化劑，如亞硫酸鈉或抗壞血酸。滲濾介質(zhì)中所用的抗氧化劑量取決于所用的材料并可以為約O. 01至約Iwt優(yōu)選約O. 05wt%?？寡趸瘎┯脕硪种茲饪s的蛋白質(zhì)提取溶液中存在的酚類的氧化。
可以在任何適宜的溫度進(jìn)行濃縮步驟和滲濾步驟，通常約20°至約60°C，優(yōu)選約20至約30°C，并持續(xù)實(shí)現(xiàn)所需濃縮程度的時間段。所用的溫度和其他條件一定程度上取決于用于實(shí)現(xiàn)濃縮的膜設(shè)備和所需的溶液蛋白質(zhì)濃度。
如果需要，可以將濃縮并任選滲濾的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行進(jìn)一步的脫脂操作，如US專利 No. 5，844，086 和 6，005，076 中所述的。
·[0104]如果需要，可以將濃縮并任選滲濾的蛋白質(zhì)水溶液進(jìn)行熱處理步驟來降低溶液中存在的7S和12S蛋白質(zhì)含量?？梢允褂米阋越档腿芤褐写嬖诘?S和12S比例的溫度和時間分布來進(jìn)行這樣的熱處理，優(yōu)選將7S蛋白質(zhì)的比例降低顯著的程度。通常，通過熱處理將溶液中7S蛋白質(zhì)含量降低至少約50wt%，優(yōu)選至少約75wt%。通常，可以在約70°至約100°C的溫度進(jìn)行熱處理，優(yōu)選約75至約95°C，持續(xù)約2至約30分鐘，優(yōu)選約5至約15分鐘?？梢砸匀魏芜m宜方式，如通過離心或過濾，除去并回收沉淀的7S和12S蛋白質(zhì)。
可以通過任何適宜技術(shù)，如噴霧干燥或冷凍干燥，將濃縮并任選滲濾和任選熱處理的蛋白質(zhì)水溶液干燥至干的形式來提供干燥的芥花籽蛋白質(zhì)分離物，其主要由2S芥花籽蛋白質(zhì)構(gòu)成并具有至少約90wt%蛋白質(zhì)含量,優(yōu)選至少約IOOwt%。
(C)利用超濾滯留物熱處理的方面
提供芥花籽蛋白質(zhì)分離物方法的最初步驟包括從芥花籽油種子粉溶解蛋白質(zhì)材料。從芥花籽種子粉回收的蛋白質(zhì)材料可以是芥花籽種子中天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)材料可以是通過基因操作修飾但具有天然蛋白質(zhì)特征性疏水和極性特征的蛋白質(zhì)。芥花籽粉可以是從含有不同水平的非變性蛋白質(zhì)的芥花籽油種子除去芥花籽油得到的任何芥花籽粉，例如，從熱己烷提取或冷油壓榨方法獲得。通常作為與在此所述的蛋白質(zhì)分離物回收步驟分開的操作來實(shí)現(xiàn)從芥花籽油種子除去芥花籽油。
使用食品級鹽溶液能最有效地實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)溶解，因為鹽的存在提高了從油種子粉中除去可溶性蛋白質(zhì)。在打算將芥花籽蛋白質(zhì)分離物用于非食品用途的情況中，可以使用非食品級的化學(xué)物質(zhì)。鹽通常是氯化鈉，盡管可以使用其他鹽，如氯化鉀。鹽溶液具有至少約O. 05的離子強(qiáng)度，優(yōu)選至少約O. 10，至多約O. 2，以能夠溶解待實(shí)現(xiàn)的顯著含量的蛋白質(zhì)。隨著鹽溶液的離子強(qiáng)度提高，油種子粉中蛋白質(zhì)的溶解程度開始提高，直至獲得最大值。任何隨后的離子強(qiáng)度的提高并不提高溶解的總蛋白質(zhì)。引起最大蛋白質(zhì)溶解的食品級鹽溶液的離子強(qiáng)度根據(jù)所涉及的鹽和選擇的油種子粉而改變。
在間歇式生產(chǎn)中，在至少約5°C并優(yōu)選至多約35°C的溫度進(jìn)行蛋白質(zhì)的鹽溶解，優(yōu)選伴有攪拌以降低溶解時間，通常為約10至約60分鐘。優(yōu)選進(jìn)行溶解來充分地從油種子粉中提取盡可能多的蛋白質(zhì)，以便提供全面的高產(chǎn)量。
選擇約5°C的溫度下限，是因為低于該溫度，溶解將不切實(shí)際地慢，而選擇約35°C的優(yōu)選溫度上限，是因為在間歇式處理方式中在更高的溫度水平，工藝將變得不經(jīng)濟(jì)。[0111]在連續(xù)生產(chǎn)中，以任何從芥花籽油種子粉進(jìn)行連續(xù)提取蛋白質(zhì)相適應(yīng)的方式進(jìn)行從芥花籽油種子粉提取蛋白質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，將芥花籽油種子粉與鹽溶液連續(xù)混合，并將混合物通過管道或?qū)Ч軅魉停鶕?jù)在此所述的參數(shù)，管道或?qū)Ч艿拈L度和流速使得能持續(xù)足以進(jìn)行所需提取的停留時間。在這樣的連續(xù)方法中，在至多約10分鐘的時間內(nèi)，快速進(jìn)行鹽溶解步驟，優(yōu)選進(jìn)行溶解以從芥花籽油種子粉充分地提取盡可能多的蛋白質(zhì)。連續(xù)方法中的溶解優(yōu)選在升高的溫度進(jìn)行，優(yōu)選高于約35°c，通常至多約65°C。
鹽水溶液和芥花籽油種子粉具有約5至約6. 8的天然pH，優(yōu)選約5. 3至約6. 2的pH值。
可以按照需要，使用任何適宜的酸，通常是鹽酸，或堿，通常是氫氧化鈉，將鹽溶液的PH調(diào)節(jié)至約5至約6. 8范圍內(nèi)的任何所需值，用于提取步驟中。在打算將芥花籽蛋白質(zhì)分離物用于非食品用途的情況中，那么可以使用非食品級化學(xué)物質(zhì)。
溶解步驟過程中鹽溶液中油種子粉的濃度可以廣泛改變。通常的濃度值為約5至 約 15% w/v ο
使用鹽水溶液的蛋白質(zhì)提取步驟具有溶解芥花籽粉中可以存在的脂肪的附加作用，然后其使得脂肪存在于水相中。
從提取步驟獲得的蛋白質(zhì)溶液通常具有約5至約40g/L的蛋白質(zhì)濃度，優(yōu)選約10至約30g/L。
然后可以以任何適宜的方式從殘余的芥花籽粉分離提取步驟獲得的水相，如通過使用沉降式離心，接著碟式離心和/或過濾來除去殘余的粉?？梢詫⒎蛛x的殘余的粉干燥，用于處置。
可以依據(jù)淺色和不那么強(qiáng)烈的黃色來改善最終芥花籽蛋白質(zhì)分離物的顏色，通過將粉末狀活性碳或其他色素吸附劑與分離的蛋白質(zhì)水溶液混合，并隨后除去吸附劑，通常通過過濾，來提供蛋白質(zhì)溶液。如下所述，在濃縮之前或之后，分離的蛋白質(zhì)水溶液的滲濾也可以用來除去色素。
可以在任何適宜條件下進(jìn)行這樣的除色步驟，通常在分離蛋白質(zhì)水溶液的環(huán)境溫度下，使用任何合適的色素吸附劑。對于粉末狀的活性碳，使用約O. 025%至約5% w/v的量，優(yōu)選約O. 05%至約2% w/v ο
在芥花籽種子粉含有顯著含量脂肪的情況中，如US專利No. 5，844，086和6，005, 076 (其轉(zhuǎn)讓于本受讓人并將其公開內(nèi)容在此弓I入作為參考)中所述，然后可以對分離的蛋白質(zhì)水溶液和如下討論的濃縮的蛋白質(zhì)水溶液進(jìn)行其中所述的脫脂步驟。當(dāng)進(jìn)行改善顏色的步驟時，可以在第一個脫脂步驟后進(jìn)行該步驟。
作為用鹽水溶液提取油種子粉的可替換方案，可以單獨(dú)使用水進(jìn)行這樣的提取，盡管單獨(dú)使用水趨于從油種子粉中提取出比鹽水溶液少的蛋白質(zhì)。在使用這樣的可替換方案的情況中，在上述的濃縮中，那么可以在與殘余的油種子粉分離后將鹽加入蛋白質(zhì)溶液中，以便在以下所述濃縮步驟過程中將蛋白質(zhì)維持于溶液中。當(dāng)進(jìn)行除色和/或第一個脫脂步驟時，通常在完成這樣的操作后加入鹽。
將蛋白質(zhì)提取溶液濃縮來提高其蛋白質(zhì)濃度?？梢允褂萌魏芜m宜的選擇性膜技術(shù)，如超濾，來進(jìn)行這樣的濃縮，使用具有合適截留分子量的膜，允許低分子量物質(zhì)，包括鹽以及從蛋白質(zhì)源材料提取出來的其他非蛋白質(zhì)低分子量材料通過膜，而將芥花籽蛋白質(zhì)保留在溶液中。鑒于不同的膜材料和構(gòu)型，可以使用具有約3，OOO至100，OOO道爾頓截留分子量的超濾膜，優(yōu)選約5，000至約10，000道爾頓。以這種方式濃縮蛋白質(zhì)提取溶液還可以降低回收蛋白質(zhì)需要干燥的液體體積。通常將蛋白質(zhì)提取溶液濃縮至至少約50g/L的蛋白質(zhì)濃度，優(yōu)選約100至約400g/L，更優(yōu)選約200至約300g/L?？梢砸蚤g歇式處理模式或以連續(xù)操作來進(jìn)行這樣的濃縮操作。
然后可以將濃縮的蛋白質(zhì)提取溶液進(jìn)行使用水的滲濾步驟?？梢允褂眉s2至約20體積滲濾溶液，優(yōu)選約5至約10體積滲濾溶液，來進(jìn)行這樣的滲濾。在滲濾操作中，可以通過滲透物穿過膜，從蛋白質(zhì)提取水溶液中除去更多含量的雜質(zhì)。可以進(jìn)行滲濾操作直至沒有更多顯著量的酚和可見的顏色存在于滲透物中?？梢允褂糜糜跐饪s步驟的相同膜來進(jìn)行這樣的滲濾。然而，如果需要，鑒于不同的膜材料和構(gòu)型，可以使用分開的膜來進(jìn)行滲濾，如具有約3，000至約100，000道爾頓范圍內(nèi)截留分子量的膜，優(yōu)選約5，000至約10，000道爾頓。
在滲濾步驟的至少部分過程中，滲濾介質(zhì)中可以存在抗氧化劑?？寡趸瘎┛梢允侨魏芜m宜的抗氧化劑，如亞硫酸鈉或抗壞血酸。滲濾介質(zhì)中所用的抗氧化劑量取決于所用的材料并可以為約O. 01至約Iwt優(yōu)選約O. 05wt%?？寡趸瘎┯脕硪种茲饪s的蛋白質(zhì)提取溶液中存在的酚類的氧化。
可以在任何適宜的溫度進(jìn)行濃縮步驟和滲濾步驟，通常約20°至約60°C，優(yōu)選約20至約30°C，并持續(xù)實(shí)現(xiàn)所需濃縮程度的時間段。所用的溫度和其他條件一定程度上取決于用于實(shí)現(xiàn)濃縮的膜設(shè)備和所需的溶液蛋白質(zhì)濃度。
如果需要，可以將濃縮并任選滲濾的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行進(jìn)一步的脫脂操作，如US專利 No. 5，844，086 和 6，005，076 中所述的。
在本發(fā)明的這個方面中，可以將超濾和任選滲濾的芥花籽蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行熱處理來沉淀其中的7S和12S蛋白質(zhì)并留下王要由2S蛋白質(zhì)構(gòu)成的介花桿蛋白質(zhì)溶液?？梢栽凇ど鲜鯱. S.專利申請No. 11/038, 086中所述條件下進(jìn)行這樣的熱處理。
可以使用足以降低濃縮溶液中存在的7S和12S比例的溫度和時間分布來進(jìn)行這樣的熱處理，優(yōu)選將7S和12S蛋白質(zhì)的比例降低顯著的程度。通常，通過熱處理將溶液中7S和12S蛋白質(zhì)含量降低至少約50wt%，優(yōu)選至少約75wt%。通常，可以在約70°至約IOO0C的溫度進(jìn)行熱處理，優(yōu)選約75至約95°C，持續(xù)約2至約30分鐘，優(yōu)選約5至約15分鐘。可以以任何適宜方式，如通過離心或過濾，除去并回收沉淀的7S和12S蛋白質(zhì)。
然后可以處理所得到的芥花籽蛋白質(zhì)溶液來回收主要是2S的芥花籽蛋白質(zhì)分離物。
在除去(如通過離心)沉淀的7S和12S蛋白質(zhì)后，可以通過任何適宜技術(shù)，如噴霧干燥或冷凍干燥，將濃縮的熱處理過的上清液干燥至干的形式，來提供主要由2S芥花籽蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物。這樣的芥花籽蛋白質(zhì)分離物具有高蛋白質(zhì)含量，超過約90wt%,優(yōu)選至少約IOOwt%蛋白質(zhì)(按照凱氏NX6. 25計算的)并且基本上是未變性的(如通過差示掃描量熱法測定的)。
(d)利用芥花籽蛋白質(zhì)水溶液熱處理的方面
提供芥花籽蛋白質(zhì)分離物方法的最初步驟包括從芥花籽油種子粉溶解蛋白質(zhì)材料。從芥花籽種子粉回收的蛋白質(zhì)材料可以是芥花籽種子中天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)材料可以是通過基因操作修飾但具有天然蛋白質(zhì)特征性疏水和極性特征的蛋白質(zhì)。芥花籽粉可以是從含有不同水平的非變性蛋白質(zhì)的芥花籽油種子除去芥花籽油得到的任何芥花籽粉，例如，從熱己烷提取或冷油壓榨方法獲得。通常作為與在此所述的蛋白質(zhì)分離物回收步驟分開的操作來實(shí)現(xiàn)從芥花籽油種子除去芥花籽油。
使用食品級鹽溶液能最有效地實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)溶解，因為鹽的存在提高了從油種子粉中除去可溶性蛋白質(zhì)。在打算將芥花籽蛋白質(zhì)分離物用于非食品用途的情況中，可以使用非食品級的化學(xué)物質(zhì)。鹽通常是氯化鈉，盡管可以使用其他鹽，如氯化鉀。鹽溶液具有至少約O. 05的離子強(qiáng)度，優(yōu)選至少約O. 10，至多約O. 2，以能夠溶解待實(shí)現(xiàn)的顯著含量的蛋白質(zhì)。隨著鹽溶液的離子強(qiáng)度提高，油種子粉中蛋白質(zhì)的溶解程度開始提高，直至獲得最大值。任何隨后的離子強(qiáng)度的提高并不提高溶解的總蛋白質(zhì)。引起最大蛋白質(zhì)溶解的食品級鹽溶液的離子強(qiáng)度根據(jù)所涉及的鹽和選擇的油種子粉而改變。
在間歇式生產(chǎn)中，在至少約5°C并優(yōu)選至多約35°C的溫度進(jìn)行蛋白質(zhì)的鹽溶解，優(yōu)選伴有攪拌來降低溶解時間，通常為約10至約60分鐘。優(yōu)選進(jìn)行溶解來充分地從油種·子粉中提取盡可能多的蛋白質(zhì)，以便提供全面的高產(chǎn)量。
選擇約5°C的溫度下限，是因為低于該溫度，溶解將不切實(shí)際地慢，而選擇約35°C的優(yōu)選溫度上限，是因為在間歇式處理方式中在更高的溫度水平，處理將變得不經(jīng)濟(jì)。
在連續(xù)生產(chǎn)中，以任何從芥花籽油種子粉進(jìn)行連續(xù)提取蛋白質(zhì)相適應(yīng)的方式進(jìn)行從芥花籽油種子粉提取蛋白質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，將芥花籽油種子粉與鹽溶液連續(xù)混合，并將混合物通過管道或?qū)Ч軅魉?，根?jù)在此所述的參數(shù)，管道或?qū)Ч艿拈L度和流速使得能持續(xù)足以進(jìn)行所需提取的停留時間。在這樣的連續(xù)方法中，在至多約10分鐘的時間內(nèi)，快速進(jìn)行鹽溶解步驟，優(yōu)選進(jìn)行溶解以從芥花籽油種子粉充分地提取盡可能多的蛋白質(zhì)。連續(xù)方法中的溶解優(yōu)選在升高的溫度進(jìn)行，優(yōu)選高于約35°c，通常至多約65°C。
鹽水溶液和芥花籽油種子粉具有約5至約6. 8的天然pH，優(yōu)選約5. 3至約6. 2的pH值。
可以按照需要，使用任何適宜的酸，通常是鹽酸，或堿，通常是氫氧化鈉，將鹽溶液的PH調(diào)節(jié)至約5至約6. 8范圍內(nèi)的任何所需值，用于提取步驟中。在打算將芥花籽蛋白質(zhì)分離物用于非食品用途的情況中，那么可以使用非食品級化學(xué)物質(zhì)。
溶解步驟過程中鹽溶液中油種子粉的濃度可以廣泛改變。通常的濃度值為約5至約 15% w/v ο
使用鹽水溶液的蛋白質(zhì)提取步驟具有溶解芥花籽粉中可能存在的脂肪的附加作用，然后其使得脂肪存在于水相中。
從提取步驟獲得的蛋白質(zhì)溶液通常具有約5至約40g/L的蛋白質(zhì)濃度，優(yōu)選約10至約30g/L。
然后可以以任何適宜的方式從殘余的芥花籽粉分離提取步驟獲得的水相，如通過使用沉降式離心，接著碟式離心和/或過濾來除去殘余的粉?？梢詫⒎蛛x的殘余的粉干燥，用于處置。
可以依據(jù)淺色和不那么強(qiáng)烈的黃色來改善最終芥花籽蛋白質(zhì)分離物的顏色，通過將粉末狀活性碳或其他色素吸附劑與分離的蛋白質(zhì)水溶液混合，并隨后除去吸附劑，通常通過過濾，來提供蛋白質(zhì)溶液。如下所述，在濃縮之前或之后，分離的蛋白質(zhì)水溶液的滲濾也可以用來除去色素。
可以在任何適宜條件下進(jìn)行這樣的除色步驟，通常在分離蛋白質(zhì)水溶液的環(huán)境溫度下，使用任何合適的色素吸附劑。對于粉末狀的活性碳，使用約O. 025%至約5% w/v的量，優(yōu)選約O. 05%至約2% w/v ο
在芥花籽種子粉含有顯著含量脂肪的情況中，如US專利No. 5，844，086和6，005, 076 (其轉(zhuǎn)讓于本受讓人并將其公開內(nèi)容在此弓I入作為參考)中所述，然后可以對分離的蛋白質(zhì)水溶液和如下討論的濃縮的蛋白質(zhì)水溶液進(jìn)行其中所述的脫脂步驟。當(dāng)進(jìn)行改善顏色的步驟時，可以在第一個脫脂步驟后進(jìn)行該步驟。
作為用鹽水溶液提取油種子粉的可替換方案，可以單獨(dú)使用水進(jìn)行這樣的提取，盡管單獨(dú)使用水趨于從油種子粉中提取出比鹽水溶液少的蛋白質(zhì)。在使用這樣的可替換方案的情況中，在上述的濃縮中，那么可以在與殘余的油種子粉分離后將鹽加入蛋白質(zhì)溶液中，以便在以下所述濃縮步驟過程中將蛋白質(zhì)維持于溶液中。當(dāng)進(jìn)行除色和/或第一個脫脂步驟時，通常在完成這樣的操作后加入鹽。
根據(jù)本發(fā)明的這個方面，將芥花籽蛋白質(zhì)水溶液熱處理來沉淀其中的7S和12S蛋白質(zhì)并留下其中介花桿蛋白質(zhì)王要由2S蛋白質(zhì)構(gòu)成的介花桿蛋白質(zhì)溶液?？梢栽谏鲜鯱. S.專利申請No. 11/038, 086中所述條件下進(jìn)行這樣的熱處理。
可以使用足以降低濃縮溶液中存在的7S和12S比例的溫度和時間分布來進(jìn)行這樣的熱處理，優(yōu)選將7S和12S蛋白質(zhì)的比例降低顯著的程度。通常，通過熱處理將溶液中7S和12S蛋白質(zhì)含量降低至少約50wt%，優(yōu)選至少約75wt%。通常，可以在約70°至約IOO0C的溫度進(jìn)行熱處理，優(yōu)選約75至約95°C，持續(xù)約2至約30分鐘，優(yōu)選約5至約15分鐘?？梢砸匀魏芜m宜方式，如通過離心或過濾，除去并回收沉淀的7S和12S蛋白質(zhì)。
在除去(如通過離心)沉淀的7S和12S蛋白質(zhì)后，可以通過任何適宜技術(shù)，如噴霧干燥或冷凍干燥，將熱處理過的芥花籽蛋白質(zhì)溶液干燥至干的形式，來提供主要由2S芥花籽蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物。
或者，可以將熱處理過的芥花籽蛋白質(zhì)溶液在干燥之前進(jìn)行以上關(guān)于方面(a)所述的濃縮，滲濾和脫色步驟。
芥花籽蛋白質(zhì)分離物具有高蛋白質(zhì)含量，超過約90wt%,優(yōu)選至少約100界1:%蛋白質(zhì)(按照凱氏NX6. 25計算的)并且基本上是未變性的(如通過差示掃描量熱法測定的)。
在此提供的芥花籽蛋白質(zhì)分離物含有高比例的2S蛋白質(zhì)，優(yōu)選分離物中芥花籽蛋白質(zhì)的至少約90wt%,更優(yōu)選至少約95wt%,并且基本上無7S和12S蛋白質(zhì)。
實(shí)施例
實(shí)施例I :
該實(shí)施例說明了從芥花籽油種子粉提取蛋白質(zhì)的升高的溫度對提取溶液中芥花籽蛋白質(zhì)分布的影響。
將15g真空除溶劑的芥花籽油種子粉樣品(37. 15%蛋白質(zhì))各自加入85°C溫度的 150ml 反滲透(RO)水，O. IM NaCl 水溶液，O. 15M NaCl 水溶液，O. 2M NaCl 水溶液，O. 25MNaCl水溶液和O. 5M NaCl水溶液樣品中。將混合物攪拌5分鐘，同時使用攪拌器/加熱板來維持溫度。[0157]將提取物在10，OOOrpm離心10分鐘，然后通過25 μ m有凹槽的濾紙進(jìn)行過濾。將濾液通過O. 45 μ m針筒過濾器進(jìn)一步過濾。
分析濾過的提取物的蛋白質(zhì)含量(使用LECO FP528測氮儀)，顏色和蛋白質(zhì)分布(使用分析 HPLC SEC BioSep 2000 和 S3000 柱)。
使用通過O. IM NaCl溶液在環(huán)境溫度的提取重復(fù)實(shí)驗，作為對照和用于比較目的。獲得的結(jié)果列于以下的表I和表2中
表I :85°C的粉提取物與環(huán)境溫度提取物的比較
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)主要由2S芥花籽蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物的方法，其特征在于 用具有至少O. 05的離子強(qiáng)度和5至6. 8的pH的鹽水溶液在80°C至95°C的升高的溫度提取芥花籽油種子粉，以優(yōu)先于7S和12S蛋白質(zhì)優(yōu)先從芥花籽油種子粉提取2S蛋白質(zhì)，并獲得主要含有2S蛋白質(zhì)的芥花籽蛋白質(zhì)提取溶液， 將芥花籽蛋白質(zhì)提取溶液與殘余的芥花籽油種子粉分離，和 從芥花籽蛋白質(zhì)提取溶液回收具有通過凱氏氮x6. 25測定的至少90wt%蛋白質(zhì)含量并且主要由2S芥花籽蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物。
2.權(quán)利要求
I中所述的方法，特征在于所述鹽水溶液具有至少O.10的離子強(qiáng)度，和5. 3 至 6. 2 的 pH。
3.權(quán)利要求
I或2中所述的方法，其特征在于所述芥花籽蛋白質(zhì)提取溶液具有如下的芥花籽蛋白質(zhì)分布 80至100wt% 2S蛋白質(zhì)， O至10wt% 7S蛋白質(zhì)，和 O至約IOwt% 12S蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求
I或2中所述的方法，其特征在于所述芥花籽蛋白質(zhì)分布為 85至100wt% 2S蛋白質(zhì)， O至15wt% 7S蛋白質(zhì)，和 O至5wt% 12S蛋白質(zhì)。
5.制備主要由2S芥花籽蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物的方法，其特征在于 用10°C至70°C的溫度的水提取芥花籽油種子粉，以優(yōu)先于2S蛋白質(zhì)優(yōu)先提取7S和12S芥花籽蛋白質(zhì)以及可溶性雜質(zhì)，以形成第一個芥花籽蛋白質(zhì)提取溶液， 將第一個芥花籽蛋白質(zhì)提取溶液與殘余的油種子粉分離， 用5°C至65°C的溫度的具有至少O. 05的離子強(qiáng)度和5至6. 8的pH的鹽水溶液提取殘余的油種子粉來溶解來自殘余油種子粉的2S，7S和12S蛋白質(zhì)，以形成第二個芥花籽蛋白質(zhì)提取溶液，和 從第二個芥花籽蛋白質(zhì)提取溶液回收具有通過凱氏氮x6. 25測定的至少90wt%蛋白質(zhì)含量并且主要由2S芥花籽蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物。
6.權(quán)利要求
5中所述的方法，其特征在于用55°C至65°C的溫度的水提取所述芥花籽油種子粉。
7.權(quán)利要求
5或6中所述的方法，其特征在于從第一個芥花籽蛋白質(zhì)提取溶液回收7S和12S芥花籽蛋白質(zhì)作為芥花籽蛋白質(zhì)分離物。
8.權(quán)利要求
5或6中所述的方法，其特征在于以2至25次水提取來進(jìn)行所述的水提取。
9.權(quán)利要求
8中所述的方法，其特征在于所述提取的次數(shù)為2至4次提取。
10.權(quán)利要求
5或6中所述的方法，其特征在于用20°C至30°C的溫度并且離子強(qiáng)度至少O. 10的鹽水溶液提取所述芥花籽油種子粉。
11.權(quán)利要求
10中所述的方法，其特征在于所述鹽水溶液具有5.3至6. 2的pH。
12.權(quán)利要求
5或6中所述的方法，其特征在于所述第二個芥花籽蛋白質(zhì)提取溶液具有如下的芥花籽蛋白質(zhì)分布80至100wt% 2S蛋白質(zhì)， O至10wt% 7S蛋白質(zhì)，和 O至10wt% 12S蛋白質(zhì)。
13.權(quán)利要求
12中所述的方法，其特征在于所述芥花籽蛋白質(zhì)分布為 85至100wt% 2S蛋白質(zhì) O至15wt% 7S蛋白質(zhì)，和 O至5wt% 12S蛋白質(zhì)。
14.權(quán)利要求
I或5中所述的方法，其特征在于通過濃縮芥花籽蛋白質(zhì)提取溶液或第二芥花籽蛋白質(zhì)溶液至至少50g/L的濃度并干燥所得到的濃縮芥花籽蛋白質(zhì)提取物水溶液，進(jìn)行所述的回收步驟，用于回收主要由2S芥花籽蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物。
15.權(quán)利要求
14中所述的方法，其特征在于將所述芥花籽蛋白質(zhì)提取物水溶液濃縮至100g/L至400g/L的蛋白質(zhì)濃度。
16.權(quán)利要求
15中所述的方法，其特征在于所述蛋白質(zhì)濃度為200g/L至300g/L。
17.權(quán)利要求
15中所述的方法，其特征在于使用2至20體積的滲濾介質(zhì)將濃縮過的含水芥花籽蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行滲濾。
18.權(quán)利要求
17中所述的方法，其特征在于所述滲濾是使用5至10體積滲濾介質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的。
19.權(quán)利要求
17中所述的方法，其特征在于在至少部分滲濾步驟過程中存在抗氧化劑。
20.權(quán)利要求
15至19任一項中所述的方法，其特征在于在所述干燥步驟之前，將濃縮的芥花籽蛋白質(zhì)提取水溶液進(jìn)行熱處理步驟，在70°C至100°C的溫度持續(xù)2至30分鐘，從而通過從溶液中沉淀出來將所述溶液中的7S和12S蛋白質(zhì)比例降低至少50wt%。
21.權(quán)利要求
20中所述的方法，其特征在于所述熱處理步驟在75°C至95°C的溫度進(jìn)行5至15分鐘，從而通過從溶液中沉淀出來將存在的7S和12S蛋白質(zhì)比例降低至少75wt%。
22.生產(chǎn)主要由2S芥花籽蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物的方法，其特征在于 用具有至少O. 05的離子強(qiáng)度和5至6. 8的pH的鹽水溶液提取芥花籽油種子粉，從芥花籽油種子粉提取芥花籽蛋白質(zhì)并獲得芥花籽蛋白質(zhì)溶液， 將芥花籽蛋白質(zhì)溶液與殘余的油種子粉分離， 任選濃縮所述的芥花籽蛋白質(zhì)溶液來提供濃縮的蛋白質(zhì)溶液作為截留物， 熱處理芥花籽蛋白質(zhì)溶液或任選濃縮的蛋白質(zhì)溶液，在70°C至100°C的溫度持續(xù)2至30分鐘，以優(yōu)先于2S芥花籽蛋白質(zhì)，從芥花籽蛋白質(zhì)溶液或任選濃縮的芥花籽蛋白質(zhì)溶液選擇性地沉淀7S和12S芥花籽蛋白質(zhì)并將7S和12S蛋白質(zhì)含量降低至少50wt%，形成主要含有2S芥花籽蛋白質(zhì)的熱處理過的芥花籽蛋白質(zhì)溶液， 將熱處理過的芥花籽蛋白質(zhì)溶液與沉淀的蛋白質(zhì)分離，和 從分離的熱處理過的芥花籽蛋白質(zhì)溶液回收具有通過凱氏氮x6. 25測定的至少90wt%蛋白質(zhì)含量并且主要由2S芥花籽蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物。
23.權(quán)利要求
22中所述的方法，其特征在于在75°C至95°C的溫度進(jìn)行所述的熱處理步驟，持續(xù)5至15分鐘，將7S和12S蛋白質(zhì)含量降低至少75wt%。
24.權(quán)利要求
22或23中所述的方法，其特征在于所述鹽水溶液具有至少O.10的離子強(qiáng)度，和5. 3至6. 2的pH。
25.權(quán)利要求
1，5或22中所述的方法，其特征在于主要由2S蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物具有至少10(^1%的蛋白質(zhì)含量。
26.權(quán)利要求
1，5或22中所述的方法，其特征在于所述主要由2S蛋白質(zhì)構(gòu)成的芥花籽蛋白質(zhì)分離物含有存在的芥花籽蛋白質(zhì)的至少90界七％的2S蛋白質(zhì)。
27.權(quán)利要求
26中所述的方法，其特征在于所述芥花籽蛋白質(zhì)分離物含有存在的芥花籽蛋白質(zhì)的至少95界七％的2S蛋白質(zhì)。
專利摘要
制備了具有至少約90wt％(N×6.25)，優(yōu)選至少約100wt％蛋白質(zhì)含量和主要由2S蛋白質(zhì)構(gòu)成并且基本上無7S和12S蛋白質(zhì)的芥花籽蛋白質(zhì)分離物。在一個方面中，用蛋白質(zhì)水溶液在升高的溫度提取芥花籽油種子粉，從粉中優(yōu)先提取2S蛋白質(zhì)來產(chǎn)生主要含有2S蛋白質(zhì)的芥花籽蛋白質(zhì)溶液。作為分離物回收2S芥花籽蛋白質(zhì)。在另一個方面中，最初用水提取芥花籽油種子粉，優(yōu)先提取7S和12S蛋白質(zhì)，接著用鹽水溶液提取芥花籽油種子粉，從粉中提取出2S蛋白質(zhì)。從鹽水提取物中回收2S芥花籽蛋白質(zhì)分離物。在另一個方面中，用鹽水溶液提取芥花籽油種子粉，從粉中提取2S，7S和12S蛋白質(zhì)。在升高的溫度熱處理蛋白質(zhì)提取物水溶液來沉淀7S和12S蛋白質(zhì)并留下可以從其回收分離物的2S蛋白質(zhì)溶液。在再一個方面中，在熱處理之前將蛋白質(zhì)水溶液濃縮。
文檔編號A23J1/14GKCN101272697 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200680031625
公開日2013年1月23日 申請日期2006年6月30日
發(fā)明者B·戈斯內(nèi)爾, K·I·塞加爾, M·施維策爾 申請人:伯康營養(yǎng)科學(xué)(Mb)公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (4), 非專利引用 (1),