一種檢測黃曲霉素b1的膠體金免疫試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測黃曲霉素B1的膠體金免疫試劑盒包括檢測試紙；所述檢測試紙包括底板，粘合在底板上且依次搭接的樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；所述硝酸纖維膜上靠近結合墊的一側設有檢測線，硝酸纖維膜上靠近吸水墊的一側設有質控線；所述結合墊上涂有被鼠抗黃曲霉素B1單克隆抗體及單鏈核酸包被的膠體金；所述檢測線上涂有BSA-AFB1；所述質控線上涂有羊抗鼠IgG；所述單鏈核酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。該試劑盒的特點在于在標記抗體的同時，將一段單鏈核酸協(xié)同標記在膠體金表明，有效減低了非特異性吸附，減少標記抗體的用量，制成的免疫層析試劑盒，靈敏度達到0.5ng/mL。
【專利說明】一種檢測黃曲霉素BI的膠體金免疫試劑盒及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種醫(yī)療檢測產(chǎn)品及其制作方法，尤其涉及一種檢測黃曲霉素BI的膠體金免疫試劑盒及其制備方法。
【背景技術】
[0002]免疫層析法是二十世紀九十年代興起的一種基于免疫膠體顆粒的快速診斷技術，其原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維膜的某一區(qū)帶，當該干燥的硝酸纖維素膜一端接觸到樣品后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當移動至固定有抗體的區(qū)域時，樣品中相應的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結合，從而實現(xiàn)特異性的免疫診斷。
[0003]常用的免疫層析法所用的特異識別檢測物的生物大分子都是抗體，通過抗原抗體特異識別反應，標記在抗原或抗體上的免疫膠體顆粒使檢測線和質控線顯示一定的顏色，從而實現(xiàn)特異性的免疫診斷。但是該方法檢測不夠快速和靈敏，而且用抗體檢測還需要用到相應的儀器設備，操作不簡便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種制作膠體金免疫層析檢測試劑盒，通過在檢測線和質控線上顯示紅色，來實現(xiàn)在樣品中直接檢測黃曲霉素BI。
[0005]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供的技術方案為:
[0006]所述檢測黃曲霉素BI的膠體金免疫試劑盒包括檢測試紙；所述檢測試紙包括底板，粘合在底板上且依次搭接的樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；所述硝酸纖維膜上靠近結合墊的一側設有檢測線，硝酸纖維膜上靠近吸水墊的一側設有質控線；所述結合墊上涂有被鼠抗黃曲霉素BI單克隆抗體及單鏈核酸包被的膠體金；所述檢測線上涂有BSA-AFBl ;所述質控線上涂有羊抗鼠IgG ;所述單鏈核酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]優(yōu)選地，所述底板為PVC板；樣品墊和結合墊的材料為玻璃纖維；所述吸水墊為吸水濾紙。所述檢測試紙由硬質塑料卡包裝。
[0008]本發(fā)明還提供了上述試劑盒的方法，包括如下步驟:
[0009](I)用鼠抗黃曲霉素BI單克隆抗體和如SEQ ID N0.1所示的單鏈核酸包被膠體金，得包被后的膠體金溶液；
[0010](2)將包被后的膠體金溶液噴于結合墊上，烘干備用；
[0011](3)在硝酸纖維膜上檢測線位置噴點BSA-AFBl溶液；在質控線位置噴點羊抗鼠IgG溶液，烘干備用；
[0012](4)將樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊依次搭接并粘合于底板上，切成檢測試紙條，將檢測試紙條用硬質塑料卡包裝。
[0013]優(yōu)選地，步驟(I)所述膠體金直徑為13 — 40nm。步驟(I)所述用鼠抗黃曲霉素BI單克隆抗體和如SEQ ID N0.1所示的單鏈核酸包被膠體金是指先將鼠抗黃曲霉素BI單克隆抗體與如SEQ ID N0.1所示的單鏈核酸混合，得到抗體核酸混合物，然后將抗體核酸混合物加入膠體金溶液中，此時，膠體金溶液中膠體金顆粒濃度為3.5—4.5nmol/L，優(yōu)選4nmol/L,鼠抗黃曲霉素BI單克隆抗體濃度為4.5一5.5 μ g/mL,優(yōu)選5 μ g/mL,單鏈核酸濃度為8 —12 μ g/mL，優(yōu)選10 μ g/mL ;再將加入了抗體核酸混合物的膠體金溶液離心，將沉淀溶于Tris-HCL緩沖溶液，即得包被后的膠體金溶液，備用。
[0014]步驟(3)所述BSA-AFBl溶液配制方法是將濃度為2 — 4mg/mLBSA_AFBl溶于PBS緩沖液中得到BSA-AFBl濃度為0.7mg/mLBSA-AFBl溶液；所述羊抗鼠IgG溶液中羊抗鼠IgG的濃度為 0.8一1.2mg/mL,優(yōu)選 lmg/mL。
[0015]使用本試劑盒時，將待測標本加入到點樣孔，待測標本在毛細作用下沿著樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜向吸水濾紙端方向層析；檢測時，如果待測標本中的含有檢測物黃曲霉素BI，且濃度高于0.5納克/毫升，黃曲霉素BI先與結合墊上的金標抗體結合并使之復溶，復溶后的混合物繼續(xù)層析到硝酸纖維素膜上，不再和檢測線上的BSA-AFBl結合，標記金顆粒繼續(xù)向前，到達質控線區(qū)域時，與其上包被的羊抗鼠Ig G發(fā)生結合，顯現(xiàn)出膠體金的紅色線條，此為質控線；檢測時，如果待測標本中的不含有檢測物黃曲霉素BI，結合墊上的金標抗體復溶，復溶后的混合物繼續(xù)層析到硝酸纖維素膜上，和檢測線上的BSA-AFBl結合，這樣檢測線位置出現(xiàn)標記膠體金的紅色，標記金顆粒繼續(xù)向前，到達質控線區(qū)域時，與其上包被的羊抗鼠Ig G發(fā)生結合，顯現(xiàn)出膠體金的紅色線條，此為質控線；檢測時，如果待測物中黃曲霉素BI濃度低于0.5納克/毫升，黃曲霉素BI先與結合墊上的金標抗體結合并使之復溶，復溶后的混合物繼續(xù)層析到硝酸纖維素膜上，再和檢測線上的BSA-AFBl結合，這樣檢測線位置也會出現(xiàn)標記膠體金的紅色，由于免疫競爭反應，黃曲霉素BI濃度比0.5納克/毫升越低，檢測線的紅色越紅，標記金顆粒繼續(xù)向前，到達質控線區(qū)域時，與其上包被的羊抗鼠Ig G發(fā)生結合，顯現(xiàn)出膠體金的紅色線條，此為質控線。
[0016]該試劑盒的特點在于在標記抗體的同時，將一段單鏈核酸協(xié)同標記在膠體金表面，有效減低了非特異性吸附，減少標記抗體的用量，制成的免疫層析試劑盒，靈敏度達到
0.5ng/mL。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明試劑盒中檢測試紙結構示意圖；
[0018]圖2為本發(fā)明的原理示意圖；
[0019]圖3為本發(fā)明檢測過程示意圖；有檢測物:表示檢測物濃度高于最低檢測濃度，檢測線為紅色(圖中為深色)；無檢測物:表示檢測物濃度高于最低檢測濃度，檢測線位置無色(圖中為空白)；
[0020]圖4為本發(fā)明免疫層析法檢測結果判定圖，其中，T表示檢測線，C表示質控線。
[0021]圖中:1、底板；2、樣品墊；3、結合墊；4、硝酸纖維素膜；5、檢測線；6、質控線；7吸水墊。
【具體實施方式】
[0022]實施例1
[0023]參見圖1，所述檢測黃曲霉素BI的膠體金免疫試劑盒，包括檢測試紙；所述檢測試紙包括底板1，粘合在底板I上且依次搭接的樣品墊2、結合墊3、硝酸纖維素膜4和吸水墊7 ;所述硝酸纖維膜4上靠近結合墊3的一側設有檢測線5，硝酸纖維膜4上靠近吸水墊7的一側設有質控線6 ;所述結合墊3上涂有被鼠抗黃曲霉素BI單克隆抗體及單鏈核酸包被的膠體金；所述檢測線5上涂有BSA-AFBl ;所述質控線6上涂有羊抗鼠IgG ;所述單鏈核酸序列為5’ -AAAAAAAAAAAAAAA-3’ (SEQ ID N0.1)。所述底板I為PVC板；樣品墊2和結合墊3的材料為玻璃纖維；所述吸水墊7為吸水濾紙。所述檢測試紙由硬質塑料卡包裝。
[0024]試劑盒的實際使用
[0025]下面介紹本發(fā)明的使用方法，不能做為本發(fā)明的限制。
[0026]1.試劑與樣品:AFB1標準液購自SIGMA公司，大米購自超市。
[0027]2.陽性樣品制備:用0.01 M pH7.4PBS緩沖液將AFBl標準液稀釋至lmg/mL。將大米研磨成粉末狀，稱取I克放入離心管或燒杯中，加入含30% (體積比)甲醇的0.01 MpH7.4PBS緩沖液10mL，渦旋混勻5min，用小型掌上離心機4000轉/分離心5min，留取上清液。分別向8管大米提取液中加入不同體積的AFBl標準液，制成終濃度為0ng/ml、0.5ng/ml、0.75ng/ml、lng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml 的陽性樣品。
[0028]3.陰樣品制備:取8管大米提取液，不添加AFBl標準液，但添加與各管陽性樣品所加標準液體積相同的含30% (體積百分比)甲醇的PBS緩沖液。
[0029]4.分別從16管待檢樣品中吸取100 μ L液體，滴加到檢測卡的樣品孔中，IOmin后
觀察檢測結果。
[0030]5.檢測結果:重復以上實驗三次，陰性樣品檢測結果全部為陰性。陽性樣品檢測結果如表1所示:
[0031]表1:黃曲霉素BI檢測試劑盒靈敏度
[0032]
【權利要求】
1.一種檢測黃曲霉素BI的膠體金免疫試劑盒，包括檢測試紙；所述檢測試紙包括底板(1)，粘合在底板(I)上且依次搭接的樣品墊(2)、結合墊(3)、硝酸纖維素膜(4)和吸水墊(7);所述硝酸纖維膜(4)上靠近結合墊(3)的一側設有檢測線(5)，硝酸纖維膜(4)上靠近吸水墊(7)的一側設有質控線(6);其特征在于，所述結合墊(3)上涂有被鼠抗黃曲霉素BI單克隆抗體及單鏈核酸包被的膠體金；所述檢測線(5)上涂有BSA-AFBl ;所述質控線(6)上涂有羊抗鼠IgG ;所述單鏈核酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述底板(I)為PVC板；樣品墊(2)和結合墊(3)的材料為玻璃纖維；所述吸水墊(7)為吸水濾紙。
3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測試紙由硬質塑料卡包裝。
4.制備權利要求1至3任一項所述試劑盒的方法，包括如下步驟: (1)用鼠抗黃曲霉素BI單克隆抗體和如SEQID N0.1所示的單鏈核酸包被膠體金，得包被后的膠體金溶液； (2)將包被后的膠體金溶液噴于結合墊上，烘干備用； (3)在硝酸纖維膜上檢測線位置噴點BSA-AFBl溶液；在質控線位置噴點羊抗鼠IgG溶液，烘干備用； (4)將樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊依次搭接并粘合于底板上，切成檢測試紙條，將檢測試紙條用硬質塑料卡包裝。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(I)膠體金直徑為13— 40nm。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述用鼠抗黃曲霉素BI單克隆抗體和如SEQ ID N0.1所示的單鏈核酸包被膠體金是指先將鼠抗黃曲霉素BI單克隆抗體與如SEQ ID N0.1所示的單鏈核酸混合，得到抗體核酸混合物，然后將抗體核酸混合物加入膠體金溶液中，此時，膠體金溶液中膠體金顆粒濃度為3.5—4.5nmol/L,鼠抗黃曲霉素BI單克隆抗體濃度為4.5一5.5 μ g/mL,單鏈核酸濃度為8一12 μ g/mL ;再將加入了抗體核酸混合物的膠體金溶液離心，將沉淀溶于Tris-HCL緩沖溶液，即得包被后的膠體金溶液，備用。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述BSA-AFBl溶液配制方法是將濃度為2—4mg/mLBSA-AFBl溶于PBS緩沖液中得到BSA-AFBl濃度為0.7mg/mLBSA-AFBI溶液；所述羊抗鼠IgG溶液中羊抗鼠IgG的濃度為0.8—1.2mg/mL。
【文檔編號】G01N33/577GK103728452SQ201410032159
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月23日 優(yōu)先權日:2014年1月23日
【發(fā)明者】常榮山, 譚蔚泓 申請人:湖南大學