專利名稱：：雞新城疫抗體免疫膠體金快速檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于免疫應(yīng)用領(lǐng)域，涉及動(dòng)物分子生物學(xué)、免疫學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。具體的講，本發(fā)明屬于一種雞傳染病抗體快速檢測(cè)試劑盒，用于雞血清中雞新城疫抗體的檢測(cè)，以確定被檢雞是否感染過(guò)雞新城疫病毒或免疫過(guò)的雞體內(nèi)是否產(chǎn)生了相應(yīng)的抗體。
背景技術(shù)：
：新城疫(Newcastledisease,ND)又名為雞瘟、亞洲雞瘟等，是目前危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的主要禽類傳染病之一，主要侵害雞、火雞，其它禽類和野禽類，引起呼吸道感染及免疫抑制，多年來(lái)一直在各類禽群中廣泛存在，雖然各有疫苗進(jìn)行免疫接種，但免疫雞群仍頻頻發(fā)病，致使病情延綿不絕，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)內(nèi)絕大多數(shù)雞場(chǎng)在進(jìn)行了新城疫疫苗的免疫后，進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)的很少，主要是因?yàn)闆]有簡(jiǎn)便快捷的方法。針對(duì)雞新城疫的監(jiān)測(cè)和檢測(cè)仍停留在原有的經(jīng)典方法上，如瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(Agarosegelimmunodiffusion;AGID)、血凝抑制試驗(yàn)(Hemagglutinationinhibition;HI)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay;ELISA)、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)(Neuraminidaseinhibitortest;NIT)、病毒中和試驗(yàn)(VirusNeutralizationTest;VNT)等，這些方法有的耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)(如瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)需2448小時(shí)；血凝抑制試驗(yàn)需23小時(shí)；ELISA試驗(yàn)需35小時(shí)等)，有的需要昂貴的儀器設(shè)備和繁瑣的操作步驟，較高的技術(shù)操作人員，只能在實(shí)驗(yàn)室完成，不便于適時(shí)和快速診斷。免疫層析(immunochromatography)是出現(xiàn)于八十年代初期的一種獨(dú)特的免疫分析方法，該方法的核心技術(shù)是以條狀纖維層析材料為固相，通過(guò)毛細(xì)管作用使樣品溶液在層析條上泳動(dòng)，并同時(shí)使樣品中的待測(cè)物與層析材料上針對(duì)待測(cè)物的受體(如抗原或抗體)發(fā)生高特異性、高親和性的免疫反應(yīng)。膠體金免疫層析分析(gold-immunochromatographyassay;GICA)是應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)(OsikowiczGetal.One-stepchromatographicimmunoassayforqualitativedeterminationofchoricogonadotropininurine.ClinChem.1990,36,1586)。層析過(guò)程中，金標(biāo)記物與事先固相化于層析材料(例如硝酸纖維素膜，即NC膜)上的抗原或抗體(檢測(cè)線)發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)而被截留，進(jìn)一步富集，形成肉眼可見的紫紅色條帶，從而得到直觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，達(dá)到快速檢測(cè)的目的。這種方法對(duì)所使用的抗原抗體的要求較高，要求具有好的特異性和高純度。依據(jù)這種原理，已經(jīng)研制出了很多膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條。在人醫(yī)應(yīng)用方面，國(guó)內(nèi)外已在激素、傳染病病原的抗原和抗體、性病病原、細(xì)菌、寄生蟲、腫瘤標(biāo)記物、心血管病標(biāo)志物、藥物以及其他一些蛋白質(zhì)等方面應(yīng)用了金標(biāo)免疫層析試紙條。在獸醫(yī)應(yīng)用方面，例如在豬瘟、犬細(xì)小病毒病等方面也應(yīng)用了金標(biāo)免疫層析試紙條。在雞疫病診斷和檢測(cè)方面，中國(guó)發(fā)明專利(專利號(hào)ZL99101537.1)，公開了一種畜禽疫病快速診斷試紙條的制備及應(yīng)用，但該發(fā)明的要點(diǎn)是針對(duì)畜禽疫病病原的檢測(cè)，并未涉及對(duì)雞新城疫抗體的檢測(cè)。新城疫抗體半定量快速檢測(cè)金標(biāo)試紙條制造方法專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)?00610042408.0)，是采用膠體金標(biāo)記新城疫病毒作為金標(biāo)墊，新城疫病毒作為檢測(cè)線，該方法一些弊端病毒的純化不易標(biāo)準(zhǔn)化，而且，容易散毒，生物安全性較差；其特異性、靈敏度也不易控制，批間、批內(nèi)差異也較大，很難標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，且未公開其采用的生物材料樣品，也沒有提交用于專利程序的生物材料樣品的保藏，本領(lǐng)域的技術(shù)人員無(wú)法實(shí)施該發(fā)明并達(dá)到該發(fā)明所示的效果。而本發(fā)明采用的原理與專利申請(qǐng)200610042408.0不同，我們采用膠體金標(biāo)記抗雞IgG的Fc段單抗作為金標(biāo)墊，基因工程方法表達(dá)的蛋白作為檢測(cè)線，這樣具有一些明顯的優(yōu)點(diǎn)特異性較好、靈敏度較高，批間差異也較小，不存在散毒的問(wèn)題，生物安全性好，生產(chǎn)也很容易標(biāo)準(zhǔn)化(表1)。表1本發(fā)明的試劑盒與專利申請(qǐng)200610042408.0的比較<table>complextableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷。其第一個(gè)目的是組裝一種用于檢測(cè)雞新城疫抗體的試劑盒；第二個(gè)目的是本發(fā)明的試劑盒在雞新城疫抗體檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖見圖1所示。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的試劑盒是由盒體和包含在盒體內(nèi)的試紙卡、樣品稀釋液組成。試紙卡(結(jié)構(gòu)圖如圖2、3所示)是本發(fā)明的試劑盒的核心，由試紙條與測(cè)試卡組成。試紙條由吸收墊(4)、硝酸纖維素膜(3)、金標(biāo)墊(2)、樣品墊(1)的依次粘貼在不吸水的支撐薄片(7)上構(gòu)成。金標(biāo)墊(2)上包被有膠體金標(biāo)記的抗雞IgGFc單克隆抗體(分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞系BDRPDP專利號(hào)ZL200510011521.8，保藏編號(hào)為CCTCCNO:C200501);硝酸纖維素膜(NC膜)(3)上分別包被有重組雞新城疫病毒重組血凝素神經(jīng)氨酸酶HN蛋白，構(gòu)成的檢測(cè)線(T線)(5)和兔抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線(C線)(6);將試紙條裝入測(cè)試卡(8)中構(gòu)成試紙卡。樣品稀釋液為0.8%氯化鈉溶液。所述硝酸纖維素膜(NC膜)、吸收墊、金標(biāo)墊、樣品墊、不吸水的支撐薄片均購(gòu)自Millipore公司。所述親和層析柱購(gòu)自AmershamBiosciences公司。包含重組質(zhì)粒pKG-6p-l-HN的大腸桿菌(&c/^n'cWaco/z')BL21/pKG-6p-l-HN已于2007年12月20日保藏在位于中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207205。本發(fā)明的原理是分別選用親和層析純化的雞新城疫病毒重組血凝素(HN)蛋白，作為檢測(cè)線，抗雞IgGFc片斷單克隆抗體作為膠體金標(biāo)記的抗體，利用間接法(ShyuRH等，Colloidalgold-basedimmunochromatographicassayfordetectionofricinJToxicon2002,40(3):255-258)來(lái)檢測(cè)被檢材料中是否含有雞新城疫抗體。檢測(cè)時(shí)，樣品中所有的雞IgG分子的Fc片段先和金標(biāo)記抗雞IgGFc段單克隆抗體結(jié)合，由于毛細(xì)管作用，反應(yīng)復(fù)合物沿包被膜向前泳動(dòng)，若樣品中有抗雞新城疫的特異性抗體，到達(dá)檢測(cè)線時(shí)，遇到包被在硝酸纖維素膜上的重組蛋白，就會(huì)形成重組蛋白-抗體-金標(biāo)記單克隆抗體復(fù)合物，從而富集在檢測(cè)線上，形成特異性的紅色沉淀線；若不是抗雞新城疫的特異性抗體形成的抗體-金標(biāo)記單克隆抗體復(fù)合物則會(huì)直接通過(guò)檢測(cè)線，富集在質(zhì)控線上，形成紅色沉淀線，即判為陽(yáng)性結(jié)果。若樣品中不含雞新城疫病毒抗體，反應(yīng)復(fù)合物到達(dá)檢測(cè)線時(shí)，遇到捕獲抗原就不會(huì)形成重組蛋白-抗體-金標(biāo)記單克隆抗體復(fù)合物，反應(yīng)復(fù)合物通過(guò)檢測(cè)線，富集在質(zhì)控線上，形成紅色沉淀線，即判為陰性結(jié)果。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之一是生物安全性高。本發(fā)明所涉及到的表達(dá)載體pGEX-KG是分子生物學(xué)中常用的表達(dá)載體，沒有生物危險(xiǎn)性，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的表達(dá)載體pKG-6p-l-HN也沒有任何生物危險(xiǎn)性。重組大腸桿菌BL21/pKG-6p-l-HN是將表達(dá)載體pKG-6p-l-HN轉(zhuǎn)化至分子生物學(xué)中常用的大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞后經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選獲得，也不具生物危險(xiǎn)性。本發(fā)明中的試紙條檢測(cè)線包被的是本發(fā)明制備的雞新城疫病毒重組非結(jié)構(gòu)蛋白，制備過(guò)程中不涉及雞新城疫活病毒，因此沒有雞新城疫活病毒逃逸、擴(kuò)散的潛在危險(xiǎn)。2、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之二是生產(chǎn)成本低。本發(fā)明所提供的雞新城疫抗體檢測(cè)試劑盒所需的核心試劑是抗雞IgGFc單克隆抗體與雞新城疫病毒重組血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN蛋白)?？闺uIgGFc單克隆抗體可以通過(guò)將分泌抗雞IgGFc片斷的單克隆雜交瘤細(xì)胞系(專利號(hào):ZL200510011521.8，保藏編號(hào)為CCTCCNO:C200501)注射Balb/C小鼠腹腔，誘生腹水，通過(guò)經(jīng)濟(jì)的辛酸-硫酸銨方法純化而大量獲得。HN蛋白可以通過(guò)重組大腸桿菌BL21/pKG-6p-l-HN在體外得到大量的表達(dá)，適合大規(guī)模的生產(chǎn)。3、與已公開的用于雞新城疫抗體檢測(cè)的其他方法相比，本發(fā)明的試劑盒具有許多其他方法所不能比擬的優(yōu)點(diǎn)，如檢測(cè)快速(1015min);不需要任何特殊儀器、設(shè)備，可用于現(xiàn)場(chǎng)操作；操作簡(jiǎn)便，只需一步反應(yīng)，不需由專業(yè)人員操作；檢測(cè)成本低；檢測(cè)過(guò)程中只需一種試劑(0.8。/。NaCl溶液)，對(duì)人體無(wú)危害，對(duì)環(huán)境無(wú)污染；儲(chǔ)存方便，對(duì)溫度要求不高，在4。C下有效保存期可達(dá)一年；在室溫下可保存六個(gè)月。圖1:本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖圖2:本發(fā)明試紙卡的側(cè)視圖，圖中-1樣品墊(樣品端)；2為金標(biāo)墊；3為硝酸纖維素膜(NC膜)；4為吸收墊(手柄端);5為檢測(cè)線，即T線；6為質(zhì)控線，即C線；7為不吸水的支撐薄片條；8為測(cè)試卡;9為加樣孔。圖3:本發(fā)明試紙卡的俯視圖，圖中1樣品墊(樣品端)；2為金標(biāo)墊；3為硝酸纖維素膜(NC膜)；4為吸收墊(手柄端);5為檢測(cè)線，即T線；6為質(zhì)控線，即C線；8為測(cè)試卡；9為加樣孔。圖4:發(fā)明試紙卡結(jié)果判定示意圖，圖中&為陽(yáng)性結(jié)果++++;13性結(jié)果+++;0為陽(yáng)性結(jié)果++;d為陽(yáng)性結(jié)果+;e為陰性結(jié)果;f、g為試紙卡失效圖5:本發(fā)明涉及的HN重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒的物理構(gòu)建圖具體實(shí)施方式實(shí)施例l雞新城疫病毒HN蛋白的制備所使用的分子生物學(xué)方法參見文獻(xiàn)薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編(金冬雁，黎孟楓等譯)，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，北京科學(xué)出版社，1992中提供的方法進(jìn)行。1、HN基因的克隆與測(cè)序本發(fā)明所涉及的HN基因是申請(qǐng)人根據(jù)GenBank收錄的NDVLaSota系HN基因序列自己克隆得到的，該序列與己知序列有98%的同源性。HN基因的克隆與測(cè)序具體方法是:用雞新城疫(NDV)Losota系毒株，從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所購(gòu)買，或者參照參考文獻(xiàn)孫淑娜，新城疫病毒F基因和HN基因的克隆表達(dá)及其ELISA抗體檢測(cè)方法的初步建立[D]，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006，中國(guó)知網(wǎng)，中國(guó)優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)，http:〃dlib.edu.cnki.net/kns50/detail.aspxQueryID=23&CurRec=l。尿囊腔接種于9-11日齡健康雞胚，棄24小時(shí)前死胚，收集24-96小時(shí)的雞胚尿囊液；4'C條件下4，000rpm離心30min，取上清；4。C條件下30,000rpm離心60min濃縮病毒。用pH7.2的PBS(DEPC處理水配制)溶解沉淀，分裝后-70'C保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank收錄的NDVLaSota系HN基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增HN基因。引物序列如下上游引物P1:5'-ATAGGATCCGGGGCTAGCACACTTA陽(yáng)3';下游引物P2:5'-AGCCTCGAGCTAGCCAGACTTGGCT-3'。Pl位于啟動(dòng)子上游，加有5fl附iZ/位點(diǎn)，P2包含有終止密碼子，加入了，o/位點(diǎn)，兩酶切位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出。兩引物之間包含有缺失胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)序列的HN基因閱讀框架。取適量病毒懸液提取RNA，按TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.2.1說(shuō)明書中提供的方法，擴(kuò)增出DNA，采用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(E.Z.N.AGelExtractionKit)回收純化RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將回收的RT-PCR產(chǎn)物直接與購(gòu)自TaKaRa公司的克隆載體pMD18-T進(jìn)行連接反應(yīng)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到試劑盒(購(gòu)自TaKaRa公司的商業(yè)試劑盒)中感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5a中，用a互補(bǔ)檢査轉(zhuǎn)化效果。挑取陽(yáng)性克隆，采用堿裂解法(薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編(金冬雁等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.第二版，北京科學(xué)出版社，1992版)提取重組質(zhì)粒DNA，并對(duì)重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pMD-HN，并送中國(guó)上海博亞生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序，然后將序列測(cè)定結(jié)果與GeneBank中的有關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性比較和分折。2、表達(dá)載體pKG-6P-l-HN的構(gòu)建pMD-HN用BamHI和XhoI酶切后，回收1.6kb左右的片段，然后將此片段與用同樣的酶酶切的AmershamBiosciences公司的表達(dá)載體pGEX-6P-l-HN連接，構(gòu)建表達(dá)載體。重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化新鮮制備的DH5a感受態(tài)細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)化菌涂布氨芐青霉素(氨芐青霉素60)ig/mL)的LB瓊脂平板37'C培養(yǎng)過(guò)夜。挑數(shù)個(gè)單菌落培養(yǎng)過(guò)夜后用堿裂解法小量制備質(zhì)粒，進(jìn)行酶切分析和PCR擴(kuò)增鑒定。將得到的陽(yáng)性克隆命名為pKG-6P-l-HN(包含該質(zhì)粒的大腸桿菌于2007年12月20日保藏在中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207205)。對(duì)陽(yáng)性克隆用堿裂解法(薩姆布魯克J，弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T主編(金冬雁等譯)，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，北京科學(xué)出版社，1992)大量制備質(zhì)粒DNA，并分裝凍存于-20。C。重組表達(dá)質(zhì)粒pKG-6P-l-HN構(gòu)建流程如圖5所示3、雞新城疫病毒HN蛋白的表達(dá)將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒pKG-6P-l-HN轉(zhuǎn)入表達(dá)用大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞^c/^z'c/n'"co/!'BL21(DE3)(Esc/im'cWaco/z'BL21(DE3)購(gòu)自Stratagene公司)中，涂布到含有抗生素(氨芐青霉素6(Hig/mL)的LB平皿上，37。C培養(yǎng)1012h，長(zhǎng)出單菌落，挑取數(shù)個(gè)單菌落于加有抗生素(氨芐青霉素60ng/mL)的3mLLB中培養(yǎng)過(guò)夜，進(jìn)行細(xì)菌活化。將過(guò)夜培養(yǎng)物按比例1:50(V/V)稀釋入新鮮的LB培養(yǎng)基中，37'C中振蕩培養(yǎng)(250~300rpm)至i」OD600=0.60.8時(shí)，加入終濃度為lmmol/L異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)，繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)4h。4。C條件下8,000rpm離心15min，收集細(xì)菌。細(xì)菌用0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS配方140mMNaCl，2.7mMKC1，10mMNa2HP04，1.8mMKH2P04，pH7.2)洗滌一次后離心，反復(fù)快速凍融34次，用適量緩沖液STE(配方100.0mmol/LNaCl，10.0mmol/LTris-Cl,1.0mmol/LEDTApH8.0)重懸。用大超聲頭，設(shè)定功率400瓦、20個(gè)循環(huán)和破碎5秒、間隔10秒，在冰浴中超聲破碎。4。C條件下12,000rpm離心15min，棄沉淀，將上清用O.OIMpH7.2PBS充分透析后，濃縮至體積為5mL，按蛋白純化柱(GlutathioneSepharose4BHiTrapaffinitycolumns,AmershamBiosciences公司產(chǎn)品)說(shuō)明書提供的程序進(jìn)行親和層析純化，得到純化的HN蛋白。該蛋白可用于制備檢測(cè)雞新城疫病毒抗體的試劑。實(shí)施例2兔抗鼠IgG抗體的制備1、Balb/C小鼠IgG的提取IgG的提取和純化按沈關(guān)心等(沈關(guān)心等，現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(第二版)[M]，湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2002)等所述方法進(jìn)行取IO.OmL健康Balb/C小鼠血清與等量0.8%氯化鈉溶液混合后，逐滴加入飽和(NH4)2SO4溶液20.0mL，使成50%飽和度的(NH4)2S04溶液。4。C靜置30min后取出；4。C下3,000r/min離心30min，棄上清，沉淀中加20.0mL0.8。/o氯化鈉溶液；待沉淀溶解后，緩慢加入10.0mL飽和(NH4)2S04溶液，使成33。/。飽和度的(NH4)2S(V溶液。4。C放置30min后取出；4"C下3，000r/min離心30min。棄上清，沉淀重復(fù)進(jìn)行上述操作后，將沉淀溶于1.0mL0.8。/。氯化鈉溶液(原血清量體積的1/10)，裝入透析袋內(nèi)用0.8%氯化鈉溶液透析除鹽。用2XBaCl2溶液檢測(cè)(NH4)2S04是否已被透析完全。透析完全后，蛋白溶液用聚乙二醇(PEG)-20,000濃縮至適當(dāng)體積，fC下12，000r/min離心10min，取上清，測(cè)定蛋白質(zhì)含量，即得到粗提的Balb/C小鼠IgG。2、Balb/C小鼠IgG的純化根據(jù)樣品的種類與容積及所選擇的層析柱來(lái)確定所選葡聚糖凝膠的種類和柱床的體積。柱床的體積按如下公式計(jì)算<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage8</formula>(Vt—柱床的體積；兀一圓周率；r一半徑；h—柱床高)根據(jù)樣品的種類，本發(fā)明用葡聚糖凝膠(SephadexG-200)作為層析材料。純化的具體過(guò)程如下稱取3.0gSephadexG-200倒入數(shù)倍體積的蒸餾水中混合均勻，置室溫浸泡3d，每天換蒸餾水2次，慢慢將上層含漂浮顆粒的部分倒掉后，再加入原體積的蒸餾水，凝膠浸泡好后置4'C冰箱保存?zhèn)溆?。將潔凈的層析柱垂直固定于?shí)驗(yàn)架上，加少量洗脫液(0.01mol/L,pH7.2PBS)，檢查出液管的通暢性，合格后，關(guān)閉出液口。從4'C冰箱取出浸泡好的SephadexG-200，平衡至室溫后灌裝層析柱。在裝好的層析柱凝膠上輕輕放上與柱內(nèi)徑相當(dāng)?shù)臑V紙片，0.01mol/L的磷酸緩沖液(艮卩PBS，配方如下140mMNaCl，2.7mMKC1，10mMNa2HP04，1.8mMKH2P04,pH7.2)平衡過(guò)夜，在凝膠的上方留出lcm2cm高的液層，準(zhǔn)備加樣。加樣時(shí)，將凝膠上方的液層放出，待剛露出濾紙片時(shí)，立即關(guān)閉出液口。用滴管吸取樣品，在接近濾紙?zhí)幯毓鼙诹飨?，取少許0.8。/。氯化鈉溶液沖洗樣品瓶，將洗液加入，最后用洗脫液清洗管壁。打開出液口，在樣品全部進(jìn)入柱床且剛出現(xiàn)濾紙時(shí)，立即加入洗脫液，使柱床上部形成5cm10cm厚的液層。樣品上柱后，不時(shí)以20%磺基水楊酸液檢測(cè)洗出液，當(dāng)洗出液出現(xiàn)輕微乳濁反應(yīng)時(shí)，立即用已經(jīng)編號(hào)的1.5mLEP管收集洗出液，每管lmL，直至洗出液用20%磺基水楊酸檢測(cè)不出渾濁時(shí)結(jié)束收集。結(jié)束收集后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定每管流出液中蛋白質(zhì)含量，以EP管編號(hào)為橫坐標(biāo)，管內(nèi)流出液蛋白質(zhì)含量為縱坐標(biāo)繪制曲線圖，根據(jù)蛋白濃度分布收集所需溶液，裝入透析袋中，PEG-20,000濃縮至適當(dāng)體積。4。Cl2,000r/min離心10min，收集上清，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定經(jīng)過(guò)濃縮后的Balb/C小鼠IgG蛋白含量，置-2(TC凍存。3、家兔的免疫及兔抗Balb/C小鼠IgG的提取與純化選取體重在2.5kg左右的成年雄性健康家兔，用1和2中制備的抗原，首次免疫用弗氏完全佐劑乳化的Balb/C小鼠IgG，免疫劑量為2mglgG/只家兔，以后各次用弗氏不完全佐劑乳化的Balb/C小鼠IgG免疫。除首免與二免間隔3周外，其余每次免疫間隔10天，且每次免疫劑量中Balb/C小鼠IgG的含量較前一次高0.8mg,每次免疫途徑全部采用皮下多點(diǎn)注射。免疫3次后，采血檢測(cè)血清效價(jià)，當(dāng)血清AGID(瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(agargelimmunodiffusion,AGID)簡(jiǎn)稱瓊擴(kuò)試驗(yàn))效價(jià)達(dá)到1:32時(shí)，再加強(qiáng)免疫1次，IO天后頸動(dòng)脈放血，分離血清，用于兔抗Balb/C小鼠IgG的提取。按照1和2的方法進(jìn)行兔抗Balb/C小鼠IgG的提取與純化。即可得到本發(fā)明所需高特異性、高效價(jià)的兔抗鼠IgG抗體。利用該抗體可作為本發(fā)明膠體金試紙卡的質(zhì)控線(C線)。實(shí)施例3硝酸纖維素膜的制備1包被緩沖液的配制含3y。甲醇的0.01MpH7.2PB緩沖液為包被緩沖液，0.22p膜濾過(guò)，置4'C備用，有效期一周。1000ml3n/。甲醇的0.(UMpH7.2PB緩沖液配方KC10.2g、Na2HP(V12H202.9g、KH2PO40.2g、甲醇30ml,雙蒸去離子水定容至1000ml。2硝酸纖維素膜的制備用包被緩沖液將HN蛋白稀釋到50100ng/ml，調(diào)整機(jī)器，劃線為T線，即為檢測(cè)線(T線)靠近金標(biāo)墊端，距金標(biāo)墊端約5mm;用包被緩沖液將兔抗鼠IgG抗體稀釋到50100嗎/ml，調(diào)整機(jī)器，劃線為C線，即為質(zhì)控線，C線靠近吸收墊，距吸收墊約3mm。兩線距離58mm，線應(yīng)細(xì)致、均勻。37t:烘干，封裝備用。實(shí)施例4膠體金、金標(biāo)記單克隆抗體的制備1、溶液的配制(1)氯金酸的配制用雙蒸去離子水溶解氯金酸，配成1%溶液，置4'C備用，有效期四個(gè)月。1000ml1%氯金酸溶液配方10g氯金酸；雙蒸去離子水定容至1000ml。(2)1%檸檬酸三鈉的配制用雙蒸去離子水溶解檸檬酸三鈉，配成l。/。溶液，0.22nm膜濾過(guò)，現(xiàn)配現(xiàn)用。(3)0.1Mol/L碳酸鉀的配制用雙蒸去離子水配制，0.22pm膜濾過(guò)，置4匸備用，有效期四個(gè)月。1000ml0.1Mol/L碳酸鉀溶液配方13.8g碳酸鉀；雙蒸去離子水定容至1000ml。(4)2。/。PEG-20000的配制用雙蒸去離子水配制，0.22^m膜濾過(guò)，置4。C備用，有效期四個(gè)月。1000ml2。/oPEG-20000溶液配方20gPEG-20000;雙蒸去離子水定容至1000ml。(5)標(biāo)記洗滌保存液的配制2%牛血清白蛋白(BSA)、0.05%疊氮鈉(NaN3)、0.01MpH7.2PBS溶液，0.22pm膜濾過(guò)，置4。C備用，有效期四個(gè)月。1000ml標(biāo)記洗滌保存液配方20gBSA、0.5gNaN3、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2、膠體金的制備用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01°/。，置電爐煮沸，按每100ml0.01。/。氯金酸加入2mll。/。檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，直到液體呈亮紅色即停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)足失水。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無(wú)沉淀和漂浮物，有效期一周。3、膠體金標(biāo)記單克隆抗體的制備-用0.1M碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至8.2，按810嗎抗體/ml膠體金加入抗雞IgGFc段單克隆抗體，磁力攪拌器混勻30min，攪拌下加入BSA至終濃度為1%，靜置1小時(shí)。13000rpm、4'C離心30min，棄上清，沉淀用標(biāo)記洗滌保存液洗滌兩次，用十分之一初始膠體金體積的標(biāo)記洗滌保存液將沉淀重懸，置4'C備用，有效期一周。實(shí)施例5金標(biāo)墊的制備1封閉液的配制2%牛血清白蛋白(BSA)、l%Tween-20、2.5%蔗糖、0.05%NaN3、0.01MpH7.2PB溶液，0.22pm微孔濾膜濾過(guò)，置(C備用，有效期四個(gè)月。1000ml封閉液配方20gBSA、0.5gNaN3、10mlTween-20、25g蔗糖、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2金標(biāo)墊的制備將金標(biāo)墊浸泡于封閉液中30min后，于37'C烘干。然后將制備好的金標(biāo)記抗體均勻的鋪在金標(biāo)墊上，每毫升溶液鋪20平方厘米，冷凍干燥，封裝，置4'C備用。實(shí)施例6試紙條樣品墊的制備1封閉液的配制2%BSA、0.5%Tween-20、2.5%蔗糖、0.05%NaN3、0.01MpH7.2PBS溶液，0.22nm微孔濾膜濾過(guò)，置4'C備用，有效期四個(gè)月。1000ml封閉液配方20gBSA、0.5gNaN3,5mlTween-20、2.5g蔗糖、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2樣品墊的制備將樣品墊浸泡于封閉液中30min后，于37'C烘干，封裝，置4"C備用。實(shí)施例7試紙卡的組裝將硝酸纖維素膜、吸收墊、玻璃纖維、樣品墊按圖依次層疊起來(lái)，切成3.6mm寬的小條，然后裝入測(cè)試卡。每十個(gè)一包，加入干燥劑，真空封裝。48'C保存，有效期一年；常溫保存，有效期6個(gè)月。實(shí)施例81快速檢測(cè)雞新城疫病毒抗體的試劑盒包括①試紙卡一包(10個(gè)/包)②樣品稀釋液一瓶(10ml/瓶)2相關(guān)溶液的配制快速檢測(cè)雞新城疫病毒抗體的試劑盒的樣品稀釋液樣品稀釋液為0.8%NaCl溶液。配制方法8gNaCl，加蒸餾水定容至lOOOml。實(shí)施例9本發(fā)明試劑盒的使用方法1、樣品制備雞血清樣品的制備，將血清樣品用0.8。/。的氯化鈉溶液稀釋20倍。2、檢測(cè)取出試劑盒，室溫平衡20分鐘；打開包裝袋，取出試紙卡，取100^1制備好的樣品滴入試紙卡的加樣孔中，1015分鐘內(nèi)判定結(jié)果。3、結(jié)果判定如圖4所示，當(dāng)試紙卡出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線，沒有出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測(cè)線，結(jié)果判為陰性，記為"一"；當(dāng)試紙卡出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線，同時(shí)也出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測(cè)線，結(jié)果判為陽(yáng)性，記為"+";檢測(cè)線顏色深度與被檢血清中的抗體效價(jià)呈正相關(guān)，顏色越深說(shuō)明被檢測(cè)樣品的抗體效價(jià)越高；檢測(cè)線顏色濃厚，與質(zhì)控線顏色一致或接近時(shí)判為++++，顏色深度介于+與++++之間時(shí)酌情判++或+++。達(dá)到+及以上的顏色深度時(shí)，判為該份被檢血清的抗體為陽(yáng)性。質(zhì)控線無(wú)條帶出現(xiàn)則判為檢測(cè)試紙卡失效。實(shí)施例10快速檢測(cè)雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒穩(wěn)定性考核設(shè)計(jì)溫度20°C、4°C設(shè)計(jì)時(shí)間0天、10天、20天、30天、2月、4月、6月、8月、10月、12月保存方法試紙卡真空封裝(貯存在4"C的冰箱內(nèi)或2(TC室溫中)考核指標(biāo)敏感性表2本發(fā)明試劑盒試紙卡穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例11快速檢測(cè)雞新城疫抗體的試劑盒的制備及應(yīng)用1、快速檢測(cè)雞新城疫抗體的試劑盒的制備按實(shí)施例1-9的方法制備快速檢測(cè)雞新城疫抗體的試劑盒。2、快速檢測(cè)雞新城疫抗體的試劑盒的應(yīng)用2.1雞標(biāo)準(zhǔn)血清的檢測(cè)①特異性試驗(yàn)分別將雞新城疫(ND)陽(yáng)性血清、雞傳染性支氣管炎(IB)陽(yáng)性血清、雞傳染性法氏囊(IBD)陽(yáng)性血清(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)、雞禽流感病毒H5、H7、H9亞型陽(yáng)性血清(購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所)按本發(fā)明實(shí)施例9所述方法(GICA)進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果見表3。表3顯示，本發(fā)明檢測(cè)試紙卡(GICA)與雞新城疫(ND)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清試驗(yàn)后質(zhì)控線及檢測(cè)線均出現(xiàn)明顯的紫紅色條帶；而與蒸餾水(空白)、SPF雞陰性血清、禽流感病毒H5、H7、H9亞型，雞傳染性法氏囊(IBD)、雞傳染性支氣管炎病毒(IB)等陽(yáng)性血清試驗(yàn)后，檢測(cè)線不出現(xiàn)紫紅色條帶，質(zhì)控線出現(xiàn)明顯紫紅色條帶。這表明本發(fā)明試紙卡特異性高，與雞的其他呼吸道疫病病毒抗體無(wú)任何交叉反應(yīng)。表3本發(fā)明的試劑盒對(duì)雞標(biāo)準(zhǔn)血清檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>②敏感性試驗(yàn)將雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清(購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所)用常規(guī)血凝抑制(HI)沈關(guān)心,周汝麟.現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(第二版)[M]，湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2002檢測(cè)其血凝抑制價(jià)為l:512，進(jìn)行倍比稀釋。取IOO[xl稀釋好的樣品按本發(fā)明方法(GICA)進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清稀釋至l:512時(shí)試紙卡仍判定為陽(yáng)性。試驗(yàn)結(jié)果見表4。結(jié)果表明，本發(fā)明檢測(cè)試紙卡法的靈敏度與血凝抑制法的效果相當(dāng)。表4本發(fā)明試劑盒與常規(guī)檢測(cè)方法對(duì)雞新城疫抗體檢測(cè)的敏感性試驗(yàn)結(jié)果GICA檢測(cè)HI檢測(cè)雞ND標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清1:5121:5122.2送檢雞血清樣品的檢測(cè)從湖北、河南等地的3個(gè)雞場(chǎng)共采集150份雞血清，按本發(fā)明方法(GICA)進(jìn)行試驗(yàn)。同時(shí)，用常規(guī)血凝抑制(HI)測(cè)定效價(jià)(結(jié)果見5)。表5顯示，本發(fā)明方法(GICA)檢出率為84.7。/。(127/150)，HI法為87.3%(131/150)，二者符合率為97.33%((127+19)/150，(HI和GICA同為陽(yáng)性+HI和GICA同為陰性)/總樣品數(shù))。表5本發(fā)明的試劑盒與常規(guī)方法檢測(cè)效果的比較陽(yáng)性陰性陽(yáng)性率本發(fā)明的方法(GICA)1272384.7%血凝抑制(HI)1311987.3%盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，但是不能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)或修飾，這些改動(dòng)或修飾形式同樣落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。權(quán)利要求1、一種適用于檢測(cè)雞新城疫抗體的試劑盒，它包含盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的試紙卡和樣品稀釋液。其特征在于，其中的試紙卡由試紙條與測(cè)試卡組成；試紙條由吸收墊(4)、硝酸纖維素膜(3)、金標(biāo)墊(2)、樣品墊(1)依次粘貼在不吸水的支撐薄片(7)上構(gòu)成。所述的金標(biāo)墊(2)上包被有膠體金標(biāo)記的抗雞IgGFc片段單克隆抗體；所述的硝酸纖維素膜(3)上分別包被有雞新城疫病毒重組血凝素HN蛋白構(gòu)成的檢測(cè)線(5)和兔抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線(6)；所述的樣品稀釋液為0.8％氯化鈉溶液。2、權(quán)利要求l中所述的試劑盒在檢測(cè)雞新城疫抗體中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于免疫應(yīng)用領(lǐng)域，涉及動(dòng)物分子生物學(xué)、免疫學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。公開了一種用于快速檢測(cè)雞新城疫抗體的試劑盒。該試劑盒包含盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的試紙卡和樣品稀釋液。其中的試紙卡是由樣品墊、吸收墊、分別包被有雞新城疫HN重組蛋白作為檢測(cè)線和包被有抗鼠IgG作為質(zhì)控線的硝酸纖維素膜依次按吸收墊、硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊的順序粘貼在不吸水的支撐薄片上構(gòu)成。所述試劑盒檢測(cè)相應(yīng)的抗體具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便和診斷快速的顯著優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)G01N33/577GK101196522SQ20071016910公開日2008年6月11日申請(qǐng)日期2007年12月29日優(yōu)先權(quán)日2007年12月29日發(fā)明者梅劉,張展英,張文通,張進(jìn)良,李自力,畢丁仁,政王,王喜亮,石德時(shí),肖運(yùn)才,胡思順,許青榮申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)