專利名稱：：雞傳染性法氏囊抗體免疫膠體金快速檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于免疫應(yīng)用領(lǐng)域，涉及動(dòng)物分子生物學(xué)、免疫學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。具體地講,本發(fā)明用于檢測(cè)雞血清中傳染性法氏囊抗體以確定被檢雞是否感染過雞傳染性法氏囊病毒或免疫過的雞體內(nèi)是否產(chǎn)生了相應(yīng)的抗體。
背景技術(shù)：
：傳染性法氏囊病(Infectiousbursaldisease，IBD)是由雞傳染性法氏囊病病毒(Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV)引起的雞和火雞的一種高度接觸性傳染病。IBDV主要影響法氏囊(bursaoffabricius，BF)B淋巴細(xì)胞的分化，導(dǎo)致不同程度的免疫抑制，從而增加對(duì)并發(fā)性或繼發(fā)性病毒和細(xì)菌感染的易感性。進(jìn)而，給養(yǎng)禽業(yè)造成很大的損失。而對(duì)雞傳染性法氏囊血清抗體的監(jiān)測(cè)和檢測(cè)仍停留在原有的經(jīng)典方法上，如瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(Agarosegelimmunodiffusion;AGID)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay;ELISA)和病毒血清微量中和試驗(yàn)等，這些方法有的耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)(如瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)需2448小時(shí)；ELISA試驗(yàn)需35小時(shí)等)，有的需要昂貴的儀器設(shè)備和繁瑣的操作步驟，只能在實(shí)驗(yàn)室完成，不便于適時(shí)和快速診斷。免疫層析(immunochromatography)是出現(xiàn)于八十年代初期的一種獨(dú)特的免疫分析方法，該方法的核心技術(shù)是以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細(xì)管作用使樣品溶液在層析條上泳動(dòng)，并同時(shí)使樣品中的待測(cè)物與層析材料上針對(duì)待測(cè)物的受體(如抗原或抗體)發(fā)生高特異性、高親和性的免疫反應(yīng)。膠體金免疫層析分析(gold-immunochromatographyassay;GICA)是應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)(OsikowiczGetal.One-stepchromatographicimmunoassayforqualitativedeterminationofchoricogonado加pininurine.ClinChem.1990,36,1586)。層析過程中，金標(biāo)記物與事先固相化于層析材料(例如硝酸纖維素膜，即NC膜)上的抗原或抗體發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)而被截留，進(jìn)一步富集，形成肉眼可見的紫紅色條帶，從而得到直觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，達(dá)到快速檢測(cè)的目的。這種方法對(duì)所使用的抗原抗體的要求較高，要求具有好的特異性和高純度。依據(jù)這種原理，已經(jīng)研制出了很多膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條。在人醫(yī)應(yīng)用方面，國(guó)內(nèi)外已在激素、傳染病病原的抗原和抗體、性病病原、細(xì)菌、寄生蟲、腫瘤標(biāo)記物、心血管病標(biāo)志物、藥物以及其他一些蛋白質(zhì)等方面應(yīng)用了金標(biāo)免疫層析試紙條。在獸醫(yī)應(yīng)用方面，例如在豬瘟、犬細(xì)小病毒病等方面也應(yīng)用了金標(biāo)免疫層析試紙條。在雞疫病診斷和檢測(cè)方面，中國(guó)發(fā)明專利(專利申請(qǐng)?zhí)?9101537.1)，公開了一種畜禽疫病快速診斷試紙條的制備及應(yīng)用，但該發(fā)明的要點(diǎn)是針對(duì)畜禽疫病病原的檢測(cè)，并未涉及對(duì)雞傳染性法氏囊抗體的診斷檢測(cè)。雞傳染性法氏囊病抗體檢測(cè)試劑盒實(shí)用新型專利申請(qǐng)(專利申請(qǐng)?zhí)?2203069.7)為ELISA方法，且未公開其采用的生物材料樣品，也沒有提交用于專利程序的生物材料樣品的保藏，本領(lǐng)域的技術(shù)人員無法實(shí)施該發(fā)明并達(dá)到該發(fā)明所示的效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷。其第一個(gè)目的是組裝一種用于檢測(cè)雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒；第二個(gè)目的是本發(fā)明的試劑盒在雞傳染性法氏囊抗體檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖見圖1所示。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的試劑盒是由盒體和包含在盒體內(nèi)的試紙卡、樣品稀釋液組成。試紙卡(結(jié)構(gòu)圖如圖2、3所示)是本發(fā)明的試劑盒的核心，由試紙條與測(cè)試卡組成。試紙條由吸收墊(4)、硝酸纖維素膜(NC膜)(3)、金標(biāo)墊(2)、樣品墊(1)依次粘貼在不吸水的支撐薄片(7)上構(gòu)成。的金標(biāo)墊(2)上包被有膠體金標(biāo)記的抗雞IgGFc單克隆抗體(分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞系BDRPDP已經(jīng)公布在本申請(qǐng)人在先授權(quán)的專利文獻(xiàn)中，專利號(hào)ZL200510011521.8，該雜交瘤細(xì)胞系的己于2005年3月17日保藏在中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCCNO:C200501);硝酸纖維素膜(3)上包被有重組VP2蛋白構(gòu)成的檢測(cè)線(T線)(5)和兔抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線(C線)(6)將試紙條裝入測(cè)試卡(8)中構(gòu)成試紙卡。對(duì)于雞傳染性法氏囊病毒抗體檢測(cè)試劑盒，重組蛋白為雞傳染性法氏囊病毒重組血清型特異性抗原(VP2蛋白)，樣品稀釋液分別為0.8%氯化鈉溶液。所述硝酸纖維素膜(NC膜)、吸收墊、金標(biāo)墊、樣品墊、不吸水的支撐薄片均購(gòu)自Millipore公司。所述親和層析柱購(gòu)自AmershamBiosciences公司。本發(fā)明所述的重組VP2蛋白是由本申請(qǐng)人:制備的大腸桿菌(^c力eric/^'aco力')BL21(DE3)plysS/pKG-VP2所表達(dá)的，包含該重組質(zhì)粒的大腸桿菌已于2007年12月20日保藏在位于中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCCN0:M2072(M。本發(fā)明的原理是選用親和層析純化的雞傳染性法氏囊病毒重組血清型特異性抗原VP2蛋白作為檢測(cè)線，抗雞IgGFc片斷單克隆抗體作為膠體金標(biāo)記的抗體，利用間接法(ShyuRH等，Colloidalgold-basedimmunochromatographicassayfordetectionofricinJToxicon2002,40(3):255-258)來檢測(cè)被檢血清中是否含有雞傳染性法氏囊抗體。檢測(cè)時(shí)，樣品中所有的雞血清IgG分子的Fc片段先和金標(biāo)記抗雞IgGFc段單克隆抗體結(jié)合，形成金標(biāo)記單克隆抗體與雞血清IgG的復(fù)合物，由于毛細(xì)管作用，反應(yīng)復(fù)合物沿NC膜向前泳動(dòng)。若樣品中有抗雞IBD的特異性抗體，到達(dá)檢測(cè)線時(shí)，遇到包被在檢測(cè)線上的重組VP2蛋白，就會(huì)形成重組VP2蛋白-抗雞IBD的特異性抗體-金標(biāo)記單克隆抗體-雞血清IgG的復(fù)合物，從而富集在檢測(cè)線上，形成特異性的紅色沉淀線；不是抗雞傳染性法氏囊的非特異性抗體形成的抗體-金標(biāo)記單克隆抗體復(fù)合物則會(huì)通過檢測(cè)線，到達(dá)質(zhì)控線時(shí)與包被在質(zhì)控線上的兔抗鼠IgG二抗結(jié)合，從而富集在質(zhì)控線上，形成紅色沉淀線，即判為陽(yáng)性結(jié)果。若樣品中不含雞傳染性法氏囊病毒抗體，反應(yīng)復(fù)合物到達(dá)檢測(cè)線時(shí)，反應(yīng)復(fù)合物就不會(huì)與包被在檢測(cè)線上的重組蛋白結(jié)合，從而越過檢測(cè)線，到達(dá)質(zhì)控線時(shí)與包被在質(zhì)控線上的兔抗鼠IgG二抗結(jié)合，從而富集在質(zhì)控線上，形成紅色沉淀線，即判為陰性結(jié)果。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之一是生物安全性髙。本發(fā)明所涉及到的表達(dá)載體pGEX-KG是分子生物學(xué)中常用的表達(dá)載體，沒有生物危險(xiǎn)性，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的表達(dá)載體pKG-VP2也沒有任何生物危險(xiǎn)性。重組大腸桿菌BL21(DE3)plysS/pKG-VP2是將表達(dá)載體pKG-VP2轉(zhuǎn)化至分子生物學(xué)中常用的大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞后經(jīng)氨芐青霉素與氯霉素抗性篩選獲得，也不具生物危險(xiǎn)性。本發(fā)明中的試紙條檢測(cè)線包被的是本發(fā)明制備的雞傳染性法氏囊病毒重組血清型特異性抗原VP2蛋白，制備過程中不涉及雞傳染性法氏囊活病毒，因此沒有雞傳染性法氏囊活病毒逃逸、擴(kuò)散的潛在危險(xiǎn)。2、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之二是生產(chǎn)成本低。本發(fā)明所提供的試劑盒所需的核心試劑是抗雞IgGFc單克隆抗體與雞傳染性法氏囊病毒重組血清型特異性抗原(VP2蛋白)?？闺uIgGFc單克隆抗體可以通過將分泌抗雞IgGFc片斷的單克隆雜交瘤細(xì)胞系(專利號(hào)ZL200510011521.8，保藏編號(hào)為CCTCCNO:C200501)注射Balb/C小鼠腹腔，誘生腹水，通過經(jīng)濟(jì)的辛酸-硫酸銨方法純化而大量獲得。VP2蛋白可以通過重組大腸桿菌BL21(DE3)plysS/pKG-VP2在體外得到大量的表達(dá)，適合大規(guī)模的生產(chǎn)。3、與己公開的用于雞傳染性法氏囊病毒抗體檢測(cè)的ELISA方法相比，本發(fā)明的試劑盒具有許多ELISA方法所不能比擬的優(yōu)點(diǎn)，如檢測(cè)快速(1015min);不需要任何特殊儀器設(shè)備，可用于現(xiàn)場(chǎng)操作；操作簡(jiǎn)便，只需一步反應(yīng)，不需由專業(yè)人員操作；檢測(cè)成本低；檢測(cè)過程中只需一種試劑(0.8%氯化鈉溶液)，對(duì)人體無危害，對(duì)環(huán)境無污染；儲(chǔ)存方便，對(duì)溫度要求不高，在4'C下有效保存期可達(dá)一年；在室溫下可保存六個(gè)月(表l)。表1本發(fā)明的試劑盒與已公開的ELISA方法的比較ELISA方法(現(xiàn)有技術(shù))本發(fā)明方法(膠體金免疫層析方法)特異性強(qiáng)，靈敏度高特異性強(qiáng)，靈敏度高檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)(24h)檢測(cè)快速(10min)需要酶標(biāo)儀等設(shè)備，不適合現(xiàn)場(chǎng)操作不需要任何特殊儀器、設(shè)備，可用于現(xiàn)場(chǎng)操作操作煩瑣，需要多步反應(yīng)，需由專業(yè)人員操作；操作簡(jiǎn)便，只需一步反應(yīng)，不需由專業(yè)人員操作；檢測(cè)成本較高檢測(cè)成本低檢測(cè)過程中需多種試劑，尤其是聯(lián)苯—胺(TMB)，有檢測(cè)過程中只需一種試劑(8%NaCl)，對(duì)人體無危害，害人體，污染環(huán)境。對(duì)環(huán)境無污染。儲(chǔ)存于4'C，室溫保存期很短。儲(chǔ)存方便，對(duì)溫度要求不高，在4'C下有效保存期可達(dá)一年；在室溫下可保存六個(gè)月。:圖l:本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖圖2:本發(fā)明試紙卡的側(cè)視圖，圖中1、樣品墊(樣品端)；2、為金標(biāo)墊；3、為硝酸纖維素膜(NC膜)；4、為吸收墊(手柄端)；5、為檢測(cè)線，即T線；6、為質(zhì)控線，即C線；7、為不吸水的支撐薄片條；8、為測(cè)試卡；9、為加樣孔。圖3:本發(fā)明試紙卡的俯視圖，圖中1、樣品墊(樣品端)；2、為金標(biāo)墊；3、為硝酸纖維素膜(NC膜)；4、為吸收墊(手柄端)；5、為檢測(cè)線，即T線；6、為質(zhì)控線，即C線；8、為測(cè)試卡；9為加樣孔。圖4:發(fā)明試紙卡結(jié)果判定示意圖，圖中&為陽(yáng)性結(jié)果++++;15性結(jié)果+++;。為陽(yáng)性結(jié)果++;d為陽(yáng)性結(jié)果+;e為陰性結(jié)果；f、g為試紙卡失效圖5:本發(fā)明涉及的VP2重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒的物理構(gòu)建圖具體實(shí)施例方式實(shí)施例1雞傳染性法氏囊病毒VP2蛋白的制備所使用的分子生物學(xué)方法參見文獻(xiàn)薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編(金冬雁，黎孟楓等譯)，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，北京科學(xué)出版社，1992年版提供的方法進(jìn)行。1、VP2基因的克隆與測(cè)序本發(fā)明所涉及的VP2基因是申請(qǐng)人根據(jù)參照GenBank收錄(AJ632141)的IBDV-STC毒株A片段cDNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增長(zhǎng)度為1.37kb的VP2基因，引物的合成由上海華諾生物科技有限公司完成，引物序列如下上游引物P1:5'-CGGATCCATGACAAACCTGCAAGAT-3'下游引物P2:5'-CCAAGCTTCACAGCTATCCTCCTTAGG-3'取適量傳染性法氏囊病毒(鄭玲燕，傳染性法氏囊病毒VP2基因的克隆、表達(dá)及ELISA抗體檢測(cè)方法的建立[D],華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006，中國(guó)知網(wǎng)，中國(guó)優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)http:〃dlib.edu.cnki.net/kns50/detail.aspxQueryID=23&CurRec=l)懸液提取RNA，按TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.2.H式劑盒說明書中提供的方法，擴(kuò)增出DNA，采用UNIQ-IO柱式DNA膠回收試劑盒(購(gòu)買自E.Z.N.AGelExtractionKit公司)回收純化RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將回收的RT-PCR產(chǎn)物直接與購(gòu)自TaKaRa公司的克隆載體pMD18-T進(jìn)行連接反應(yīng)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到試劑盒(購(gòu)自TaKaRa公司的商業(yè)試劑盒)中感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5a中，用a互補(bǔ)檢查轉(zhuǎn)化效果。挑取陽(yáng)性克隆，采用堿裂解法(薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編(金冬雁，黎孟楓等譯)，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.第二版，北京科學(xué)出版社，1992版)提取重組質(zhì)粒DNA，并對(duì)重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pMD-VP2，并送中國(guó)上海博亞生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序，然后將序列測(cè)定結(jié)果與GeneBank中的有關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性比較和分折。2、表達(dá)載體pKG-VP2的構(gòu)建pMD-VP2用HindIII和BamHI酶切后，回收1368bp左右的片段，然后將此片段與用同樣的酶酶切的AmershamBiosciences公司的表達(dá)載體pGEX-KG連接，構(gòu)建表達(dá)載體。用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化新鮮制備的DH5a感受態(tài)細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)化菌涂布氯霉素和氨芐青霉素(氯霉素25yg/mL，氨芐青霉素60ug/mL)的LB瓊脂平板37'C培養(yǎng)過夜。挑數(shù)個(gè)單菌落培養(yǎng)過夜后用堿裂解法小量制備質(zhì)粒，進(jìn)行酶切分析和PCR擴(kuò)增鑒定。將得到的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為pKG-VP2。包含該重組質(zhì)粒的大腸桿菌co//)BL21(DE3)plysS/pKG-VP2)保藏在位于中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日2007年12月20日；保藏編號(hào)CCTCCN0:M207204。對(duì)陽(yáng)性克隆用堿裂解法大量制備質(zhì)粒DNA，并分裝凍存于-20°C。重組表達(dá)質(zhì)粒pKG-VP2構(gòu)建流程如圖5所示。3、雞傳染性法氏囊病毒VP2蛋白的表達(dá)將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒pKG-VP2轉(zhuǎn)入表達(dá)用大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞^c^r!WH'aco/!'BL21(DE3)plysS(五"hen'cWflco/iBL21(DE3)plysS購(gòu)自Stratagene公司)中，涂布到含有相應(yīng)抗生素(氯霉素25yg/mL，氨芐青霉素60yg/mL)的LB平皿上，37。C培養(yǎng)1618h，長(zhǎng)出單菌落。挑取數(shù)個(gè)單菌落于加有相應(yīng)抗生素(氯霉素25ug/mL，氨節(jié)青霉素60Pg/mL)的3mLLB中培養(yǎng)過夜，進(jìn)行細(xì)菌活化。將過夜培養(yǎng)物按l:50的比例稀釋入新鮮的LB培養(yǎng)基中，37'C中振蕩培養(yǎng)(250300rpm)到OD600=0.50.8時(shí)，加入終濃度為lmmol/L異丙基硫代-e-D-半乳糖苷(IPTG)，調(diào)節(jié)搖床溫度為3(TC繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)6h。4'C條件下8,000卬m離心15min，收集細(xì)菌。細(xì)菌用0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液(即PBS,配方如下140mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HPO4，1.8mMKH2P04，pH7.2)洗滌一次后離心棄上清，沉淀用占培養(yǎng)物1/20體積添加有1/100二硫蘇糖醇(DTT)的O.OIMpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，用大超聲頭，設(shè)定功率400瓦、90個(gè)循環(huán)和破碎4秒、間隔10秒，在冰浴中超聲破碎至清亮。fC條件下12,000rpm離心15min，棄沉淀，將上清濃縮至體積為5mL,按蛋白純化柱(GlutathioneSepharoseTM4BHiTrapaffinitycolumns,AmershamBiosciences公司產(chǎn)品)說明書提供的程序進(jìn)行親和層析純化，得到純化的VP2蛋白。該蛋白可用于作為檢測(cè)雞傳染性法氏囊病毒抗體的試劑。實(shí)施例2兔抗鼠IgG抗體的制備1、Balb/C小鼠IgG的提取IgG的提取和純化按沈關(guān)心等(沈關(guān)心等，現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(第二版)[M]，湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2002)等所述方法進(jìn)行取10.0mL健康Balb/C小鼠血清與等量0.8。/。氯化鈉溶液混合后，逐滴加入飽和(NH4)2SO4溶液20.0mL，使成50%飽和度的(>^4)2804溶液。4°C靜置30min后取出；4。C下3,000r/min離心30min，棄上清，沉淀中加20.0mL0.8。/。氯化鈉溶液；待沉淀溶解后，緩慢加入10.0mL飽和(NH4)2S04溶液，使成33%飽和度的(>14)2804溶液。4'C放置30min后取出；4。C下3,000r/min離心30min。棄上清，沉淀重復(fù)進(jìn)行上述操作后，將沉淀溶于1.0mL0.8。/o氯化鈉溶液(原血清量體積的1/10)，裝入透析袋內(nèi)用0.8%氯化鈉溶液透析除鹽。用2XBaCl2溶液檢測(cè)(NH4)2S04是否已被透析完全。透析完全后，蛋白溶液用聚乙二醇(PEG)-20,000濃縮至適當(dāng)體積，4'C下12,000r/min離心10min，取上清，測(cè)定蛋白質(zhì)含量，即得到粗提的Balb/C小鼠IgG。2、Balb/C小鼠IgG的純化根據(jù)樣品的種類與容積及所選擇的層析柱來確定所選葡聚糖凝膠的種類和柱床的體積。柱床的體積按如下公式計(jì)算Vt=7ir2h(Vt—柱床的體積；兀一圓周率；r一半徑；h—柱床高)根據(jù)樣品的種類，本發(fā)明用葡聚糖凝膠(SephadexG-200)作為層析材料。純化的具體過程如下-稱取3.0gSephadexG-200倒入數(shù)倍體積的蒸餾水中混合均勻，置室溫浸泡3d，每天換蒸餾水2次，慢慢將上層含漂浮顆粒的部分倒掉后，再加入原體積的蒸餾水，凝膠浸泡好后置4'C冰箱保存?zhèn)溆?。將潔凈的層析柱垂直固定于?shí)驗(yàn)架上，加少量洗脫液(0.01moI/L,pH7.2PBS)，檢查出液管的通暢性，合格后，關(guān)閉出液口。從4。C冰箱取出浸泡好的SephadexG-200，平衡至室溫后灌裝層析柱。在裝好的層析柱凝膠上輕輕放上與柱內(nèi)徑相當(dāng)?shù)臑V紙片，O.Olmol/LpH7.2的PBS平衡過夜，在凝膠的上方留出lcm2cm高的液層，準(zhǔn)備加樣。加樣時(shí)，將凝膠上方的液層放出，待剛露出濾紙片時(shí)，立即關(guān)閉出液口。用滴管吸取樣品，在接近濾紙?zhí)幯毓鼙诹飨拢∩僭S0.8%氯化鈉溶液沖洗樣品瓶，將洗液加入，最后用洗脫液清洗管壁。打開出液口，在樣品全部進(jìn)入柱床且剛出現(xiàn)濾紙時(shí)，立即加入洗脫液，使柱床上部形成5cm10cm厚的液層。樣品上柱后，不時(shí)以20%磺基水楊酸液檢測(cè)洗出液，當(dāng)洗出液出現(xiàn)輕微乳濁反應(yīng)時(shí)，立即用已經(jīng)編號(hào)的1.5mLEP管收集洗出液，每管lmL，直至洗出液用20%磺基水楊酸檢測(cè)不出渾濁時(shí)結(jié)束收集。結(jié)束收集后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定每管流出液中蛋白質(zhì)含量，以EP管編號(hào)為橫坐標(biāo)，管內(nèi)流出液蛋白質(zhì)含量為縱坐標(biāo)繪制曲線圖，根據(jù)蛋白濃度分布收集所需溶液，裝入透析袋中，PEG-20,000濃縮至適當(dāng)體積。4'Cl2,000r/min離心10min，收集上清，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定經(jīng)過濃縮后的Balb/C小鼠IgG蛋白含量，置-20'C凍存。3、家兔的免疫及兔抗Balb/C小鼠IgG的提取與純化選取體重在2.5kg左右的成年雄性健康家兔，用1和2中制備的抗原，首次免疫用弗氏完全佐劑乳化的Balb/C小鼠IgG，免疫劑量為2mglgG/只家兔，以后各次用弗氏不完全佐劑乳化的Balb/C小鼠IgG免疫。除首免與二免間隔3周外，其余每次免疫間隔10天，且每次免疫劑量中Balb/C小鼠IgG的含量較前一次高0.8mg,每次免疫途徑全部采用皮下多點(diǎn)注射。免疫3次后，采血檢測(cè)血清效價(jià)，當(dāng)血清AGID(瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(agargelimmunodiffusion,AGID)簡(jiǎn)稱瓊擴(kuò)試驗(yàn))效價(jià)達(dá)到1:32時(shí)，再加強(qiáng)免疫1次，IO天后頸動(dòng)脈放血，分離血清，用于兔抗Balb/C小鼠IgG的提取。按照本實(shí)施例步驟1和步驟2的方法進(jìn)行兔抗Balb/C小鼠IgG的提取與純化。即可得到本發(fā)明所需高特異性、高效價(jià)的兔抗鼠IgG抗體。利用該抗體可作為本發(fā)明膠體金試紙卡的質(zhì)控線(C線)。實(shí)施例3硝酸纖維素膜的制備1包被緩沖液的配制含3。/。甲醇(體積比)的0.01MpH7.2PBS緩沖液為包被緩沖液，膜濾過，置4。C備用，有效期一周。1000ml3%甲醇的0.01MpH7.2PBS緩沖液配方NaCl8g、KC10.2g、Na2HPO4*12H2O2.9g、KH2PO40.2g、甲醇30ml，用雙蒸去離子水定容至1000ml。2硝酸纖維素膜的制備用本實(shí)施例步驟1中的包被緩沖液將VP2蛋白稀釋到600Pg/ml，調(diào)整機(jī)器，劃線為T線，即為檢測(cè)線，T線靠近金標(biāo)墊端，距金標(biāo)墊端約5mm;用包被緩沖液將兔抗鼠IgG抗體稀釋到5010(^g/ml，調(diào)整機(jī)器，劃線為C線，即為質(zhì)控線，C線靠近吸收墊，距吸收墊約3mm。兩線距離58mm，線應(yīng)細(xì)致、均勻。37。C烘干，封裝備用。實(shí)施例4膠體金、金標(biāo)記單克隆抗體的制備1、溶液的配制(1)氯金酸的配制用雙蒸去離子水溶解氯金酸，配成1%溶液(質(zhì)量體積比)，置4'C備用，有效期四個(gè)月。1000mlP/。氯金酸溶液配方10g氯金酸，雙蒸去離子水定容至1000ml。(2)1%檸檬酸三鈉的配制用雙蒸去離子水溶解擰檬酸三鈉，配成1%溶液，0.22Wn膜濾過，現(xiàn)配現(xiàn)用。100ml1%檸檬酸三鈉溶液的配方lg檸檬酸三鈉，雙蒸去離子水定容至訓(xùn)ml。(3)0.1MoI/L碳酸鉀的配制用雙蒸去離子水配制，0.22Pm膜濾過，置4'C備用，有效期四個(gè)月。1000ml0.1M碳酸鉀溶液配方13.8g碳酸鉀，雙蒸去離子水定容至1000ml。(4)2%PEG-20000的配制用雙蒸去離子水配制，0.22Wn膜濾過，置4。C備用，有效期四個(gè)月。1000ml2。/。PEG-20000溶液配方20gPEG-20000;雙蒸去離子水定容至1000ml。(5)標(biāo)記洗滌保存液的配制2%牛血清白蛋白(BSA)、0.05%疊氮鈉(NaN3)、O.OlMpH7.2PBS溶液，0.22Wri膜濾過，置4'C備用，有效期四個(gè)月。1000ml標(biāo)記洗滌保存液配方20gBSA、0.5gNaN3、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2、膠體金的制備用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%，置電爐煮沸，按每100mlO.OP/。氯金酸加入2mlP/。檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，直到液體呈亮紅色即停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)足失水。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，有效期一周。3膠體金標(biāo)記單克隆抗體的制備用0.1Mol/L碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至8.2，按810Mg抗體/ml膠體金加入抗雞IgGFc單克隆抗體，磁力攪拌器混勻30min，攪拌下加入BSA至終濃度為l%(m/V)，靜置1小時(shí)。13000rpm、4'C離心30min，棄上清，沉淀用標(biāo)記洗滌保存液洗滌兩次，用十分之一初始膠體金體積的標(biāo)記洗滌保存液將沉淀重懸，置4'C備用，有效期一周。實(shí)施例5金標(biāo)墊的制備1封閉液的配制2%牛血清白蛋白(BSA)、0.5%Tween-20、0.05%NaN3、O.OlMpH7.2PBS溶液，0.224m微孔濾膜濾過，置4。C備用，有效期四個(gè)月。1000ml封閉液配方20gBSA、0.5gNaN3、5mlTween-20、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2金標(biāo)墊的制備將金標(biāo)墊浸泡于本實(shí)施例步驟1中的封閉液中30min后，于37'C烘干。然后將制備好的金標(biāo)記抗體均勻的鋪在金標(biāo)墊上，每毫升溶液鋪20平方厘米，冷凍干燥，封裝，置4'C備用實(shí)施例6試紙條樣品墊的制備1封閉液的配制2%BSA、0.5%Tween-20、0.05%NaN3、0.01MpH7.2PBS溶液，0.22tai微孔濾膜濾過，置4。C備用，有效期四個(gè)月。1000ml封閉液配方20gBSA、0.5gNaN3、5mlTween-20、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2樣品墊的制備將樣品墊浸泡于本實(shí)施例步驟l中的封閉液中30min后，于37。C烘干，封裝，置4'C備用。實(shí)施例7試紙卡的組裝將硝酸纖維素膜、吸收墊、玻璃纖維、樣品墊按圖依次層疊起來，切成3.6mm寬的小條，然后裝入測(cè)試卡。每十個(gè)一包，加入干燥劑，真空封裝。48t:保存，有效期一年；常溫保存，有效期6個(gè)月。實(shí)施例8快速檢測(cè)雞傳染性法氏囊病毒抗體的試劑盒組成1快速檢測(cè)雞傳染性法氏囊病毒抗體的試劑盒包括①試紙卡一包(10個(gè)/包)②樣品稀釋液一瓶(10ml/瓶)2相關(guān)溶液的配制快速檢測(cè)雞傳染性法氏囊病毒抗體的試劑盒的樣品稀釋液樣品稀釋液為0.8%氯化鈉溶液。配制方法8gNaCl，加蒸餾水定容至1000ml。實(shí)施例9本發(fā)明試劑盒的使用方法-1樣品制備雞血清樣品的制備，將血清樣品用0.8%的氯化鈉溶液稀釋20倍。2檢測(cè)取出試劑盒，室溫平衡20分鐘；打開包裝袋，取出試紙卡，取100lU制備好的樣品滴入試紙卡的加樣孔中，1015分鐘內(nèi)判定結(jié)果。3結(jié)果判定如圖4所示，當(dāng)試紙卡出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線，沒有出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測(cè)線，結(jié)果判為陰性，記為"一"；當(dāng)試紙卡出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線，同時(shí)也出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測(cè)線，結(jié)果判為陽(yáng)性，記為"+";檢測(cè)線顏色深度與被檢血清中的抗體效價(jià)呈正相關(guān)，顏色越深說明被檢測(cè)樣品的抗體效價(jià)越高；檢測(cè)線顏色濃厚，與質(zhì)控線顏色一致或接近時(shí)判為++++，顏色深度介于+與++++之間時(shí)酌情判++或+++。達(dá)到+及以上的顏色深度時(shí)，判為該份被檢血清的抗體為陽(yáng)性。質(zhì)控線無條帶出現(xiàn)則判為檢測(cè)試紙卡失效。實(shí)施例10快速檢測(cè)雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒穩(wěn)定性考核設(shè)計(jì)溫度20°C、4°C設(shè)計(jì)時(shí)間0天、10天、20天、30天、2月、4月、6月、8月、10月、12月保存方法試紙卡真空封裝(貯存在4。C的冰箱內(nèi)或2(TC室溫中)考核指標(biāo)敏感性表2本發(fā)明試劑盒試紙卡穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>實(shí)施例11快速檢測(cè)雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒的制備及應(yīng)用1快速檢測(cè)雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒的制備按實(shí)施例1-9的方法制備快速檢測(cè)雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒。2快速檢測(cè)雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒的應(yīng)用2.1雞標(biāo)準(zhǔn)血清的檢測(cè)①特異性試驗(yàn)分別將雞傳染性法氏囊(IBD)陽(yáng)性血清、雞毒霉形體(MG)陽(yáng)性血清、雞新城疫(ND)陽(yáng)性血清、傳染性支氣管炎(IB)陽(yáng)性血清(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)、禽流感病毒H5、H9亞型陽(yáng)性血清、SPF雞血清(購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所)按本發(fā)明實(shí)施例9所述方法(GICA)進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果見表3。表3顯示，本發(fā)明的檢測(cè)試紙卡與雞傳染性法氏囊陽(yáng)性血清(IBD)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清試驗(yàn)后，質(zhì)控線及檢測(cè)線均出現(xiàn)明顯的紫紅色條帶；而與0.8%氯化鈉溶液(空白)、雞毒霉形體(MG)陽(yáng)性血清、雞新城疫(ND)陽(yáng)性血清、雞滑液支原體(MD)陽(yáng)性血清雞、傳染性支氣管炎(IB)陽(yáng)性血清、禽流感病毒H5、H9亞型陽(yáng)性血清、SPF雞血清。這表明本發(fā)明試紙卡特異性高，與雞的其它重要疾病抗體無任何交叉反應(yīng)。_表3本發(fā)明的試劑盒對(duì)雞標(biāo)準(zhǔn)血清檢測(cè)結(jié)果_檢測(cè)樣品0.8%SPF雞ND陽(yáng)性IB陽(yáng)性H5陽(yáng)性H9陽(yáng)性MG陽(yáng)性IBD陽(yáng)氯化血清血清血清血清血清血清性血清鈉溶_^_檢測(cè)樣品一一—一-一一+H+②敏感性試驗(yàn)將雞傳染性法氏囊(IBD)陽(yáng)性血清(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)分別進(jìn)行倍比稀釋，最終稀釋度為l:4096，各取100W稀釋好的樣品按本發(fā)明方法(GICA)進(jìn)行試驗(yàn)。同時(shí)，瓊脂擴(kuò)散法(AGID)(沈關(guān)心，周汝麟，現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(第二版)[M]，湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2002)測(cè)定雞傳染性法氏囊陽(yáng)性血清的效價(jià)(試驗(yàn)結(jié)果見表4)。結(jié)果表明，本發(fā)明檢測(cè)試紙卡法的靈敏度比瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)高128倍。表4本發(fā)明試劑盒與常規(guī)檢測(cè)方法對(duì)雞傳染性法氏囊抗體檢測(cè)的敏感性試驗(yàn)結(jié)果本發(fā)明試劑盒檢測(cè)AGID檢測(cè)雞IBD標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清1:40961:322.2送檢雞血清樣品的檢測(cè)11從湖北的新洲、江夏及潛江等地的4個(gè)雞場(chǎng)共采集216份雞血清，按本發(fā)明方法(GICA)進(jìn)行試驗(yàn)。同時(shí)瓊脂擴(kuò)散方法(AGID)測(cè)定。結(jié)果見5。表5顯示，本發(fā)明的方法檢出率56.48%(122/216)，AGID法檢出率為28.70%(62/154)，比GICA法檢出率低，是因?yàn)镚ICA法的敏感度比AGID高128倍(4096/32)，使得GICA法陽(yáng)性時(shí)而AGID法陰性，二者的符合率64.81%((54+86)/216，((AGID和GICA同為陽(yáng)性+AGID和GICA同為陰性)/總樣品數(shù))。表5本發(fā)明的試劑盒與常規(guī)方法檢測(cè)效果的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>^管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實(shí)施例進(jìn)行說明，但是不能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)或修飾，這些改動(dòng)或修飾形式同樣落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。權(quán)利要求1、一種適用于檢測(cè)雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒，它包含盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的試紙卡和樣品稀釋液，其特征在于，其中的試紙卡由試紙條與測(cè)試卡組成；試紙條由吸收墊(4)、硝酸纖維素膜(3)、金標(biāo)墊(2)、樣品墊(1)依次粘貼在不吸水的支撐薄片(7)上構(gòu)成，所述的金標(biāo)墊(2)上包被有膠體金標(biāo)記的抗雞IgGFc片段單克隆抗體；所述的硝酸纖維素膜(3)上分別包被有雞傳染性法氏囊病毒重組血清型特異VP2抗原蛋白構(gòu)成的檢測(cè)線(5)和兔抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線(6)；所述的樣品稀釋液為蒸餾水。2、權(quán)利要求1所述的試劑盒在檢測(cè)雞傳染性法氏囊抗體中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于免疫應(yīng)用領(lǐng)域，涉及動(dòng)物分子生物學(xué)、免疫學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。公開了一種分別用于快速檢測(cè)雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒。該試劑盒包含盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的試紙卡和樣品稀釋液。其中的試紙卡是由樣品墊、吸收墊、分別包被有雞傳染性法氏囊VP2重組蛋白作為檢測(cè)線和包被有抗鼠IgG作為質(zhì)控線的硝酸纖維素膜依次按吸收墊、硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊的順序粘貼在不吸水的支撐薄片上構(gòu)成。所述的試劑盒檢測(cè)相應(yīng)的抗體具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便和診斷快速的顯著優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)G01N33/577GK101196523SQ20071016910公開日2008年6月11日申請(qǐng)日期2007年12月29日優(yōu)先權(quán)日2007年12月29日發(fā)明者梅劉,張展英,張文通,張進(jìn)良,李自力,畢丁仁,政王,王喜亮,石德時(shí),肖運(yùn)才,胡思順,許青榮申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)