膠體金法丙型肝炎病毒(hcv)快速診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種膠體金法丙型肝炎病毒(HCV)快速診斷試劑盒及其制備方法。在支撐板上分別固定了上樣墊、膠體金標(biāo)記的鼠抗人抗體以及吸附在硝酸纖維膜上的含HCV多抗原的陽性檢測(cè)線、吸附在硝酸纖維膜上的含羊抗鼠的陰性檢測(cè)線，該試劑盒上的陽性線采用HCV多抗原按一定比例配伍的方法，具有檢測(cè)靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)單、成本低廉以及快速易普及的特點(diǎn)，最重要的是可以有效篩選現(xiàn)在市售檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的假陰性特點(diǎn)。
【專利說明】膠體金法丙型肝炎病毒(HCV)快速診斷試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及丙型肝炎病毒的檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]丙型肝炎病毒(HCV)在1989年由美國Choo等人第一次從受感染的黑猩猩血液中分離出來，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球估計(jì)約有1.7億人被HCV感染，我國約有四千萬左右。丙型肝炎慢性轉(zhuǎn)化率為50% -75%，其中約有20%可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化、肝纖維化、肝癌，嚴(yán)重危害人類健康。然而到目前為止，世界上仍沒有疫苗問世，也無有效地治療方法，臨床普遍運(yùn)用的聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林的方法對(duì)相當(dāng)一部分人是無效的，由于HCV的復(fù)雜性，因此可能在短時(shí)間難有有效地疫苗問世，預(yù)防感染可能是有效的方法。HCV的傳播途經(jīng)主要是通過血源傳播，其中包括輸血后感染和使用血液制品引起的感染，約占輸血后肝炎的70%。因此從血源預(yù)防對(duì)于減少輸血引起的感染將是一個(gè)重要的手段。
[0003]酶聯(lián)免疫法(ELISA) HCV抗體診斷時(shí)目前常用的HCV檢測(cè)方法，到目前為止已經(jīng)發(fā)展到了第三代，在國內(nèi)普遍采用HCV的core、NS3、NS4和NS5抗原混合包被進(jìn)行檢測(cè)，在國外增加入了 E抗原的配伍使用。ELISA法檢測(cè)有很多不足之處，比如檢測(cè)時(shí)間長、穩(wěn)定性相對(duì)較低，需要專業(yè)的技術(shù)人員操作以及重要的靈敏度和特異性問題，需要對(duì)其進(jìn)一步改進(jìn)，另外現(xiàn)在市售的ELISA法基本都是采用間接法檢測(cè)，采用雙抗原法可能更好的解決其靈敏度和特異性問題，但是由于抗原標(biāo)記影響抗原的一些問題，因此到目前為止，還沒有成功的檢測(cè)試劑盒出售。
[0004]免疫層析膠體金法是新型的免疫學(xué)檢測(cè)方法，它具有檢測(cè)方便、快速、穩(wěn)定性對(duì)檢測(cè)人員要求不高的優(yōu)點(diǎn)，越來越受到研究者的關(guān)注，然而不足的可能是其靈敏度比ELISA法稍低，且開發(fā)難度大、對(duì)抗體、抗原要求純度和穩(wěn)定性要求更高。
[0005]到目前為止，國內(nèi)外雖有部分公司研制開發(fā)了膠體金法HCV抗體診斷試劑盒，由于E抗原容易變性等問題，大多公司還是沒有將E抗原運(yùn)用到檢測(cè)中，這對(duì)于一部分假陰性的檢測(cè)是非常不利的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測(cè)丙型肝炎病毒的試劑盒。
[0007]本發(fā)明的目的就是針對(duì)市場(chǎng)現(xiàn)有產(chǎn)品中存在的缺陷，提供了一種快速定型檢測(cè)血液或血漿中HCV抗體檢測(cè)膠體金法檢測(cè)試劑盒，為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:膠體金法HCV抗體檢測(cè)試劑盒，包括了在無紡布或玻璃纖維包被的溶有膠體金標(biāo)記的鼠抗人抗體，陽性檢測(cè)線上硝酸纖維膜包被的是按一定比列配伍的HCV抗原，包括core、El、E2、NS3、NS4、NS5六個(gè)蛋白，陰性檢測(cè)線上硝酸纖維膜包被的是羊抗鼠抗體。
[0008]以上所用的鼠抗人抗體和羊抗鼠抗體為無色透明液體，濃度為2mg/ml，用SDS-PAGE檢測(cè)僅有一條帶，純度大于95% ；
[0009]所用的HCV混合抗原為無色透明液體，混合抗原包括HCV的core，EI，E2，NS3，NS4，NS5等6個(gè)抗原，混合前的單抗原通過高壓液相層析檢測(cè)僅有一個(gè)主峰，SDS-PAGE檢測(cè)一條帶，純度大于95% ；
[0010]HCV混合抗原用碳酸鹽緩沖液和終濃度為3%的BSA混合液將core、El、E2、NS3、NS4、NS5按照15: 7: 3: 12: 10: 9的比例進(jìn)行配伍；
[0011]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供膠體金法HCV抗體檢測(cè)試劑盒的制備方法，具體的實(shí)施方法如下。
【具體實(shí)施方式】
[0012]1.主要材料
[0013]1.1 試劑:
[0014]一定比例配伍的HCV core, El，E2，NS3, NS4, NS5等抗原皆為基因工程重組表達(dá)純化抗原，為自產(chǎn)(具體生產(chǎn)方法見下面方法)；鼠抗人抗體和羊抗鼠抗體為北京康為世紀(jì)公司生物有限公司產(chǎn)品；氯金酸為sigma公司產(chǎn)品；硝酸纖維膜為美國PALL公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)為Roche公司產(chǎn)品；其他試劑全部為分析純，購自國藥集團(tuán)。
[0015]1.2臨床血清:在醫(yī)院或血站收集的600份血清，檢測(cè)出的HCV陽性400份，陰性200 份。
[0016]1.3現(xiàn)有市場(chǎng)產(chǎn)品:HCV檢測(cè)試劑盒分別為科華的酶聯(lián)免疫法(立可讀)試劑盒和廈門波生生物HCV抗體膠體金法檢測(cè)試劑盒。
[0017]2.方法:
[0018]2.1膠體金墊的制備:
[0019]通過還原法制備40nm-50nm左右的膠體金溶液，顏色變得鮮紅清亮后分別三份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，第一份用0.1moVLK2CO3調(diào)PH為8.0，第二份調(diào)PH為8.5，第三份調(diào)PH為9.0。然后在溶液中分別加入lmg、l.5mg、2.0mg鼠抗人抗體,緩慢逐滴加入,繼續(xù)攪拌35分鐘后,再加入終濃度為3%的BSA和終濃度為I %的TWEEN20繼續(xù)攪拌10分鐘，然后4°C，12000rpm離心45分鐘，小心吸取上清棄去；用膠體金溶液重新定容至100ml，按Iml溶液鋪30cm2的比例均勻鋪在玻璃纖維或無紡布上，置于干燥間，37°C，濕度25%條件下干燥3小時(shí)，制成膠體金墊。
[0020]2.2樣品墊的處理:
[0021]將玻璃纖維或無紡布浸泡于50ml 0.01mol/L PH = 7.4的磷酸鹽緩沖液中(含終濃度3% BSA, 0.05%的TWEEN20)中I小時(shí)，37°C烘干，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0022]2.3HCV多抗原制備、配伍和包被；
[0023]2.3.1抗原制備
[0024]HCV抗原的生產(chǎn)過程:通過PCR擴(kuò)增技術(shù)，分別將HCV core、El、E2、NS3、NS4、NS5 基因的序列(具體序列見 GenBank 數(shù)據(jù)庫，http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/EU234065)構(gòu)建到pET-his載體(來自Addgene網(wǎng)站)中，然后轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)細(xì)菌，在IPTG誘導(dǎo)作用下，進(jìn)行蛋白表達(dá)；表達(dá)的蛋白通過GE公司的Ni柱子進(jìn)行純化，純化的蛋白經(jīng)過高效液相色譜(HPLC)和SDS-PAGE分析顯示純化的蛋白純度達(dá)到95%以上，可作為凍干粉保存。
[0025]2.3.2配伍和包被[0026]用碳酸鹽緩沖液和終濃度為3 %的BSA混合液將core: El: E2: NS3: NS4: NS5 按照 15: 7: 3: 12: 10: 9 的比例將配伍好的HCV El、E2、NS3、NS4, core、NS5 混合抗原稀釋到 0.5mg/ml、lmg/ml 和 1.5mg/ml，用點(diǎn)膜機(jī)將包被液劃到硝酸纖維膜上，37°C干燥4小時(shí)，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0027]用磷酸鹽緩沖液和終濃度為3%的BSA混合液將羊抗鼠抗體稀釋到2mg/ml，用點(diǎn)膜機(jī)將包被液劃到硝酸纖維膜上，37°C干燥4小時(shí)，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0028]2.4切割裝配:
[0029]將上樣墊、膠體金標(biāo)記的鼠抗人抗體結(jié)合物墊、帶有HCV抗原和羊抗鼠的硝酸纖維膜、吸樣墊裝配成反應(yīng)板，用切條機(jī)切成4mm試劑條，進(jìn)行裝卡后，裝入鋁箔袋制成成品。
[0030]2.5檢測(cè)方法和結(jié)果判斷:
[0031]取50ul-100ul左右待測(cè)血液或血漿滴在上樣墊上，反應(yīng)大約25分鐘左右，根據(jù)顏色反應(yīng)用肉眼直接觀測(cè)結(jié)果，如果在陽性和陰性都出現(xiàn)帶，則證明樣品有HCV感染或攜帶有HCV，如果只在陰性處有紅色帶，則說明樣品可能無HCV感染。
[0032]2.6最佳參數(shù)確定實(shí)驗(yàn):
[0033]將上訴包被的不同劑量抗原抗體組合配對(duì)，利用國家HCV抗體國家參考品(膠體金類)進(jìn)行測(cè)試分析，確定最近組合參數(shù)值。
[0034]2.7臨床血清效果檢測(cè)
[0035]分別用本試劑盒、上?？迫A公司生產(chǎn)的HCV ELISA(立可讀)檢測(cè)試劑盒和廈門波生生物生產(chǎn)的HCV抗體膠體金法檢測(cè)試劑盒對(duì)醫(yī)院或血站取得的300血清。
[0036]3 結(jié)果
[0037]3.1參數(shù)確定:
[0038]根據(jù)最后檢測(cè)結(jié)果顯示，試劑紙最近標(biāo)記PH約為9.0 ;鼠抗人膠體金標(biāo)記抗體最佳量1.5mg/100ml膠體金溶液,按比列配伍的HCV混合抗原的最佳標(biāo)記量為lmg/ml,羊抗鼠抗體為2mg/ml，最佳的膠體金工作液為PH為9.0的含0.01 %的氯金酸和I %檸檬酸鈉水溶液，并加入了 3% BSA和1% TWEEN20，檢定最佳時(shí)間為15-30分鐘。
[0039]3.2血清檢測(cè)分析
[0040]結(jié)果顯示，科華公司ELISA試劑盒300份血清中檢出145份陽性⑴，155份陰性(-)，波生HCV抗體膠體金試劑盒檢出130份陽性，170份陰性(含三份±)，而本試劑盒共檢出151份陽性和149份陰性，總結(jié)如下表:
【權(quán)利要求】
1.一種膠體金法膠體金法丙型肝炎病毒(HCV)快速診斷試劑盒，包括了在無紡布或玻璃纖維包被的溶有膠體金標(biāo)記的鼠抗人抗體，陽性檢測(cè)線上硝酸纖維膜包被的是按一定比列配伍的HCV抗原，包括core、El、E2、NS3、NS4、NS5六個(gè)蛋白，陰性檢測(cè)線上硝酸纖維膜包被的是羊抗鼠抗體。
2.如權(quán)利要求1所述膠體金法膠體金法丙型肝炎病毒(HCV)快速診斷試劑盒，其特征在于，陽性檢測(cè)線上硝酸纖維膜包被的是按一定比列配伍的HCV抗原，包括core、EU E2、NS3、NS4、NS5六個(gè)蛋白，按照15: 7: 3: 12: 10: 9的比例進(jìn)行配伍。
3.如權(quán)利要求1所述膠體金法膠體金法丙型肝炎病毒(HCV)快速診斷試劑盒，其特征在于，在無紡布或玻璃纖維包被的溶有膠體金標(biāo)記的鼠抗人抗體，其濃度為濃度為2mg/ml。
4.如權(quán)利要求1所述膠體金法膠體金法丙型肝炎病毒(HCV)快速診斷試劑盒，其特征在于，陰性檢測(cè)線上硝酸纖維膜包被的是羊抗鼠抗體，其濃度為2mg/ml。
5.如權(quán)利要求2所述膠體金法膠體金法丙型肝炎病毒(HCV)快速診斷試劑盒，其特征在于,將HCV core、E1、E2、NS3、NS4、NS5六個(gè)基因構(gòu)建在pET_hi s載體中，轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)細(xì)菌，在IPTG誘導(dǎo)作用下，進(jìn)行蛋白表達(dá)，蛋白進(jìn)過Ni柱子進(jìn)行純化。
6.如權(quán)利要求2所述膠體金法膠體金法丙型肝炎病毒(HCV)快速診斷試劑盒，其特征在于，HCV core、El、E2、NS3、NS4、NS5 六個(gè)基因序列分別是 SEQ ID N0.1-N0.6。
7.一種膠體金法HCV抗體檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括下列步驟: a、膠體金墊的制備； b、樣品墊的處理； C、HCV多抗原制備、配伍和包被； d、切割裝配。
【文檔編號(hào)】G01N33/576GK103575884SQ201210259659
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月25日
【發(fā)明者】韓濤, 高博, 孫偉, 李永濤, 謝勝華, 劉寶君 申請(qǐng)人:上海紐卓生物科技有限公司