專利名稱：沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物蛋白的生物活性檢測方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物活性檢測和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物蛋白的生物活性檢測方法及其應(yīng)用，特別是涉及沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物蛋白的抗氧化和清除自由基活性的檢測方法及其在制備具有抗氧化和清除自由基功能藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
沙門氏菌鞭毛蛋白(Flagellin)衍生物是將沙門氏菌鞭毛蛋白的結(jié)構(gòu)進行改造的產(chǎn)物，它是包括沙門氏菌鞭毛蛋白自N端第1-176位氨基酸殘基和第402-505位氨基酸殘基的融合蛋白，可以含有或者不含有包括Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽在內(nèi)的穿膜肽，沙門氏菌鞭毛蛋·白自N端第1-176位氨基酸殘基和第402-505位氨基酸殘基可通過柔性連接肽連接。美國 Cleveland BioLabs 公司率先制備得到((Burdelya LG, Krivokrysenko VI, et al. Anagonist of toll-like receptor5has radioprotective activity in mouse and primatemodels. Science2008, 320 (5873) :226-230)，命名為 CBLB502 蛋白，申請人在參考 CBLB502蛋白的制備路線基礎(chǔ)上進行了部分結(jié)構(gòu)的改造，完成了沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物的制備，命名為CZLC331。經(jīng)比較，CBLB502和CZLC331兩者之間存在微小的序列差異，主要是使用不同的原核表達載體制備時為了提高表達效率和純化方便而將個別氨基酸進行了微小調(diào)整，兩者在功能上基本上是一致的。目前已發(fā)現(xiàn)沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin的衍生物蛋白具有多種生物活性，例如CBLB502蛋白具有抗放射活性和抗腫瘤活性，CBLB502在放射損傷小鼠模型中對造血系統(tǒng)及胃腸道系統(tǒng)均表現(xiàn)出較顯著的保護作用，能夠延長高劑量(劑量為14-17Gy) Y射線照射后小鼠的生存時間，提高低劑量(劑量為10-13Gy) Y射線照射小鼠的生存率(BurdelyaLG,Krivokrysenko VI,et al. An agonist of toll-like receptor5has radioprotectiveactivity in mouse and primate models. Science2008，320 (5873) : 226-230)，這些生物活性的研究成果表明沙門氏菌鞭毛蛋白(Flagellin)衍生物具有重要的工業(yè)生產(chǎn)價值。Burdelya等在該文獻中還公開了 CBLB502蛋白的制備方法,可以通過此方法獲得原核表達的CBLB502蛋白，進一步為沙門氏菌鞭毛蛋白(Flage 11 in )衍生物的工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。然而，工業(yè)生產(chǎn)需要有相應(yīng)的質(zhì)量標準和質(zhì)檢體系支持，而目前對沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的檢測和控制，停留在蛋白的免疫活性(蛋白印跡檢測)和蛋白含量的檢測，而針對沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性，尤其是抗氧化和清除自由基活性，目前尚無相應(yīng)的活性研究報告和合適的檢測方法報道。自由基是機體正常代謝的中間產(chǎn)物(包括但不限于超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等)。自由基在機體內(nèi)具有很強的氧化反應(yīng)能力，同時過量的自由基卻又易于在機體內(nèi)與各種生物大分子發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致細胞和組織氧化損傷。機體內(nèi)過多的自由基是許多疾病產(chǎn)生的重要原因，因此清除過量自由基已成為防治多種疾病的重要方式。生理狀態(tài)下，人體內(nèi)自由基處于產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡中，而此平衡主要依靠機體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)進行維持。機體內(nèi)過多的自由基是產(chǎn)生氧化應(yīng)激的重要因素，也是致病的重要原因，如免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、腫瘤等，因此清除體內(nèi)過多的自由基或防止過多自由基的產(chǎn)生已成為預(yù)防免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要途徑。目前，還沒有沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白CBLB502具有抗氧化和清除自由基活性的報道。由此，本發(fā)明的發(fā)明人在蛋白水平上對沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性(尤其是抗氧化和清除自由基活性)進行系列深入研究，并將研究成果轉(zhuǎn)化為沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白生產(chǎn)的質(zhì)量標準和質(zhì)檢方法，對于后續(xù)工業(yè)生產(chǎn)中的質(zhì)控要求具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度較高的從蛋白水平直接檢測沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白生物活性的方法。本發(fā)明所提供的沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性檢測方法， 是通過沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的抗氧化和清除自由基能力進行體現(xiàn)，以沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白總的抗氧化活性、清除ABTS自由基動力學和清除DPPH自由基的活性作為檢測指標。具體而言，沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性檢測方法，主要是針對該蛋白總的抗氧化活性進行檢測，使用ABTS法進行檢測，可包括以下步驟沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性檢測方法，是通過沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的抗氧化和清除自由基能力進行體現(xiàn)，以沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白總的抗氧化活性、清除自由基動力學和TODH自由基的活性作為檢測指標，可包括以下步驟I)將待檢沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白配制成設(shè)定濃度的樣品溶液；2)檢測樣品溶液抗氧化和清除自由基的能力；3)計算出檢測數(shù)據(jù)并與沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性標準數(shù)據(jù)比較，得出檢測結(jié)果；所述沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白包括但不限于命名為CBLB502和CZLC331的蛋白。所述檢測方法中，針對沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白總的抗氧化活性進行檢測，用ABTS法進行檢測，包括以下步驟I)制作標準曲線按照ABTS檢測方法制作ABTS濃度與吸光度A735的標準曲線；2)將待測沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白樣品配成lmg/mL的樣品溶液；3)根據(jù)標準曲線，按照樣品的A735值計算樣品與Trolox標準溶液的等摩爾濃度，計算出樣品的總抗氧化能力。具體來講，所述ABTS法進行檢測可包括以下過程I)樣品檢測①將IOmM Trolox 標準溶液稀釋成 0,0. 05,0. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8 和 I. OmM ;用雙
蒸水把待測樣品沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白配制成lmg/mL溶液；
②取200 μ I ABTS工作液(ABTS與氧化劑K2S2O8按7mM 28mM終濃度配制)，空白對照為 ο μ I雙蒸水或PBS，標準曲線檢測分別加入10 μ I各個濃度的Trolox標準溶液，樣品檢測加入10 μ I沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白溶液，輕輕混勻，室溫孵育2_6
分鐘后測定A735 ；③根據(jù)測定的空白對照和標準溶液的A735值，繪制出橫坐標為溶液濃度、縱坐標為A735值的標準曲線，根據(jù)標準曲線和樣品的A735值計算樣品與Trolox標準溶液的等摩爾濃度，進而用下述方法計算出樣品的總抗氧化活性；2)計算樣品總的抗氧化活性總抗氧化活性的表示方式在采用Trolox作為標準品進行抗氧化能力檢測時，樣品的抗氧化能力用Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity (Trolox等效的抗氧化能力，TEAC)來表示，計算公式為TEAC = Trolox等效摩爾濃度/樣品濃度(mol/g)，TEAC值 即為總的抗氧化活性。設(shè)定所述沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白總的抗氧化活性為>O. 05Torlox mmol/g為沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白具有總的抗氧化活性的標準。所述檢測方法中，針對沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白清除ABTS自由基動力學活性進行檢測，可包括以下步驟I)待測樣品溶液準備將待測沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白樣品配成O. ImM的樣品溶液；2)沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白動態(tài)清除ABTS自由基活性檢測(I)試劑配制①將ABTS與氧化劑K2S2O8按7mM 28mM終濃度配制成ABTS工作母液后，室溫避光存放12-16小時；②將工作母液用PBS或80%乙醇稀釋50，62. 5，125，250，375倍成ABTS工作液；(2)測定樣品的吸收峰向Eppendorf管中分別加入不同稀釋倍數(shù)的ABTS工作液O. 98mL和O. 02mL蛋白(O. ImM)溶液，空白對照組中加入O. 02mL雙蒸水，然后迅速用美國Varian公司的Cary50UV-VIS測定340nm和415nm的吸光度，測定時間為Os (未加入樣品前)和30s，記錄不同稀釋倍數(shù)的ABTS工作液中各個時間點的吸光值(A34tl和A415)；(3)計算清除自由基動力學的最大反應(yīng)速率通過吸光值A(chǔ)34tl (或A415)與物質(zhì)的量濃度M換算的標準公式(M = A34tl (或A415) /ε 340 (或ε 4is))計算得到反應(yīng)后的物質(zhì)的量濃度M(mol/L),其中，ε 340=4· 8X IO4(mol/LrW，ε415 = 3. 6X IO4 (mol/L)'nr1)。該蛋白清除ABTS自由基的動力學參數(shù)為最大反應(yīng)速率Vmax，可通過通用的Hill方程計算不同稀釋倍數(shù)的ABTS工作液在反應(yīng)后自由基的濃度M得到。設(shè)定所述沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白具有清除ABTS自由基動力學的標準為2 μ M的沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白清除ABTS自由基最大反應(yīng)速率>0. 3 μ M · s、所述檢測方法中，針對沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白清除DPPH自由基的活性進行檢測，可包括以下步驟I)將待測沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白樣品配成10、25、50、75、100、125 μ g/mL的樣品溶液；用分析純級的甲醇將將DPPH溶解成O. ImM的DPPH自由基溶液；2)六個離心管分別標號，加入等體積470 μ I的DPPH自由基溶液，然后分別依次加入上述不同濃度的沙門氏菌鞭毛蛋白Fl age 11 in衍生物蛋白溶液,室溫下反應(yīng)5min后于517nm處測定其吸光度，其值分別為空白對照Atl、和樣品A1 ；3)計算清除羥自由基活性按下式計算DPPH自由基清除率DPPH 清除比率=(1-A/Ao) X100%o設(shè)定所述沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白對DPPH自由基清除率>1. 5%·為沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白具有清除羥自由基活性的標準。本發(fā)明另一方面在于提供所述方法在對沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白在蛋白生物活性的跟蹤，沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白生產(chǎn)制備、儲存、運輸過程中沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的活性確認，以及含有沙門氏菌鞭毛蛋白Flagel I in衍生物蛋白的生物制品的活性檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明還一方面在于提供包括CBLB502蛋白和CZLC331蛋白在內(nèi)的沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白在制備具有抗氧化和清除自由基功能藥物中的應(yīng)用，所述具有抗氧化和清除自由基功能的藥物包括治療氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的多種免疫系統(tǒng)疾病的候選藥物，治療氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的免疫系統(tǒng)疾病中的藥物，治療氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的多種免疫系統(tǒng)疾病等弓I起機體自由基增加的相關(guān)疾病的藥物，還包括它們的醫(yī)藥產(chǎn)品。本發(fā)明提出了包括CBLB502、CZLC331等在內(nèi)的鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性檢測方法及其用途，該檢測方法包括1)將待檢鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白配制成設(shè)定濃度的樣品溶液；2)檢測樣品溶液抗氧化和清除自由基的能力，以該蛋白總的抗氧化活性、該蛋白清除自由基動力學以及該蛋白對DPPH自由基的清除率作為檢測指標；3)計算出檢測數(shù)據(jù)并與該蛋白的生物活性標準數(shù)據(jù)比較，得出檢測結(jié)果。本發(fā)明的檢測方法穩(wěn)定，具有測定結(jié)果可靠、檢測數(shù)據(jù)重復(fù)性較高等優(yōu)點，測定的結(jié)果能較好地反映鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的抗氧化和清除自由基的生物活性，并且在對鞭毛蛋白Flagellin衍生物本身以及含有鞭毛蛋白Flagellin衍生物的生物制品的活性跟蹤方面具有廣泛用途，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。


圖I為沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物CZLC331蛋白的296個氨基酸序列和331個氨基酸序列的序列比對結(jié)果圖2為沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物CZLC331蛋白總的抗氧化活性的檢測
結(jié)果圖3為沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物CZLC331蛋白對ABTS自由基清除的動力學圖4為沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物CZLC331蛋白對DPPH自由基清除結(jié)果
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種靈敏度較高的從蛋白水平直接檢測沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物生物活性的方法。本發(fā)明中，沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物包括已有文獻記載的CBLB502等蛋白，申請人制備的CZLC331蛋白以及其它類似結(jié)構(gòu)的蛋白，下文中統(tǒng)稱“蛋白”或“該蛋白”。本發(fā)明所提供的沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性檢測方法，是通過該蛋白的抗氧化、清除自由基和清除自由基的動力學特征進行體現(xiàn)，以該蛋白總的抗氧化活性、清除ABTS自由基動力學和清除DPPH自由基的活性作為檢測指標，可包括以下步驟I)將待檢的蛋白配制成設(shè)定濃度的樣品溶液；2)檢測樣品溶液抗氧化和清除自由基的能力；3)計算出檢測數(shù)據(jù)并與該蛋白的生物活性標準數(shù)據(jù)比較，得出檢測結(jié)果。第一方面，蛋白的生物活性檢測方法中，針對其總的抗氧化活性進行檢測，用ABTS法進行檢測。ABTS法測定總抗氧化能力的原理ABTS(2，2，-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6_sulfonic acid,中文為2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)在適當?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS+，在抗氧化物存在時ABTS+的產(chǎn)生會被抑制，在735nm測定ABTS+的吸光度即可測定并計算出樣品的總抗氧化能力。TioIox (奎諾二甲基丙烯酸酯)是一種維生素E的類似物，具有和維生素E相近的抗氧化能力，用作其它抗氧化物總抗氧化能力的參考。例如，TioIox的總抗氧化能力為I，相同濃度情況下，其它物質(zhì)的抗氧化能力用其抗氧化能力和Trolox相比的倍數(shù)來表示。因此針對該蛋白總的抗氧化活性用ABTS法進行檢測可包括以下步驟I)制作標準曲線按照ABTS檢測方法制作ABTS濃度與吸光度A735的標準曲線；2)將待測蛋白樣品配成lmg/mL的樣品溶液；3)根據(jù)標準曲線，按照樣品的A735值計算樣品與Trolox標準溶液的等摩爾濃度，進而計算出樣品的總抗氧化能力。其中，步驟I)和2)用于樣品的測定，可按以下過程操作①將IOmM Trolox 標準溶液稀釋成 0,0. 05,0. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8 和 I. OmM ;用雙
蒸水把待測樣品蛋白配制成lmg/mL溶液；②取200 μ I ABTS工作液(配方將ABTS與氧化劑K2S2O8按7mM 28mM終濃度配制成ABTS工作母液后，室溫避光存放12-16小時，將工作母液用PBS或80%乙醇稀釋125倍成ABTS工作液)，空白對照為10 μ I雙蒸水或PBS，標準曲線檢測分別加入10 μ I各個濃度的Trolox標準溶液，樣品檢測加入10 μ I蛋白溶液，輕輕混勻，室溫孵育2-6分鐘后測定A ·
λ735 ③根據(jù)測定的空白對照和標準溶液的A735值，繪制出橫坐標為溶液濃度、縱坐標為A735值的標準曲線，根據(jù)標準曲線和樣品的A735值計算樣品與Trolox標準溶液的等摩爾濃度。進而用步驟3)的下述過程計算出樣品的總抗氧化活性①總抗氧化活性的表示方式在采用Trolox作為標準品進行抗氧化能力檢測時，樣品的抗氧化能力可以用 Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity (Trolox 等效的抗氧化能力，TEAC)來表示，對于具有抗氧化活性的蛋白或抗氧化劑樣品，如樣品的濃度為O. 15mg/mL，測定獲得的摩爾濃度和O. 3mM Trolox相同，則樣品的抗氧化活性為
O.3mM/0. 15mg/mL=2mmol/g,即計算公式為TEAC = Trolox等效摩爾濃度/樣品濃度(mol/g);②按上述公式計算，TEAC值即為樣品總的抗氧化活性。第二方面，該蛋白的生物活性檢測方法中，針對其對ABTS自由基清除的動力學， 可包括以下步驟I)待測樣品溶液準備將待測的蛋白樣品配成O. ImM的樣品溶液；2)蛋白動態(tài)清除ABTS自由基活性檢測(I)試劑配制①將ABTS與氧化劑K2S2O8按7mM 28mM終濃度配制成ABTS工作母液后，室溫避光存放12-16小時；②將工作母液用PBS或80%乙醇稀釋50、62· 5,125,250,375倍成ABTS工作液；(2)測定樣品的吸收峰向Eppendorf管(微量離心管)中分別加入不同稀釋倍數(shù)的ABTS工作液O. 98mL和O. 02mL蛋白(O. ImM)溶液，空白對照組中加入O. 02mL雙蒸水，然后迅速用美國Varian公司的Cary50UV-VIS測定340nm和415nm的吸光度，測定時間為Os (未加入樣品前)和30s，記錄不同稀釋倍數(shù)的ABTS工作液中各個時間點的吸光值(A34tl為反應(yīng)產(chǎn)物吸收峰值和A415為自由基吸收峰值);(3)計算清除自由基動力學的最大反應(yīng)速率通過吸光值與物質(zhì)濃度換算的標準公式ε 34(l=4. 8 X IO4IT1Cnr1和ε 415=3. 6 X IO4M-1CnT1計算得到反應(yīng)后的濃度(濃度=A340 (或A415) / ε 340 (或ε 415))，式中，ε 340和ε 415表示340nm和415nm處的吸光度,M表示物質(zhì)的量濃度(mol/L), cm表示厘米。該蛋白清除ABTS自由基的動力學參數(shù)(最大反應(yīng)速率Vmax通過Hill方程計算不同稀釋倍數(shù)的ABTS工作液在反應(yīng)后自由基的濃度得到出)，計算得到的反應(yīng)速率即為待測樣品清除ABTS自由基動力學活性的數(shù)值。第三方面，該蛋白的生物活性檢測方法中，針對其清除DPPH自由基的活性進行檢測，可包括以下步驟I)待測樣品溶液準備將待測的蛋白樣品配成10、25、50、75、100、125μ g/mL的樣品溶液，用分析純級的甲醇將將DPPH溶解成O. ImM的DPPH自由基溶液；2)六個離心管分別標號，加入等體積470 μ I的DPPH自由基溶液，然后分別依次加入上述不同濃度的蛋白溶液，室溫下反應(yīng)5min后于517nm處測定其吸光度，其值分別為空白對照Atl和樣品A1 ；3)計算清除羥自由基活性按下式計算DPPH自由基清除率DPPH 清除比率=(1-A/Ao) X 100%
以上三種檢測方法中，將該蛋白總的抗氧化活性>0. 05Trolox mmol/g作為產(chǎn)品具有總的抗氧化活性的指標；以2 μ M的該蛋白清除ABTS自由基最大反應(yīng)速率>0. 3 μ M · s—1作為產(chǎn)品清除ABTS自由基動力學活性的指標；3 μ g/mL的該蛋白清除DPPH自由基的比率>1.5%作為產(chǎn)品具有DPPH自由基清除活性的指標。對于被檢測的蛋白產(chǎn)品，可以選用其中的任意一項作為檢測指標，只要有一項檢測指標達標的產(chǎn)品即可認為其具有清除自由基活性，作為合格產(chǎn)品，并可進一步用于制備具有清除自由基功能的藥物的活性成分。上述沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物CZLC331蛋白的生物活性檢測方法在對該蛋白生物活性的跟蹤，蛋白生產(chǎn)制備、儲存、運輸過程中對該蛋白的活性確認，含有該蛋白的生物制品的活性檢測，以及在建立該蛋白質(zhì)量標準和質(zhì)檢體系中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。經(jīng)本發(fā)明證實,沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白具有抗氧化和清除自由基功能，因而可以其為活性成份制備具有抗氧化和清除自由基功能的藥物。所述沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白優(yōu)選為通過生物工程發(fā)酵得到的CZLC331蛋白。 所述具有抗氧化和清除自由基功能的藥物包括治療氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的多種免疫系統(tǒng)疾病的候選藥物，治療氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的免疫系統(tǒng)疾病中的藥物，治療氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的多種免疫系統(tǒng)疾病等引起機體自由基增加的相關(guān)疾病的藥物，還包括它們的醫(yī)藥產(chǎn)品。本發(fā)明用實施例來進一步從清除自由基能力角度對沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白生物活性進行檢測來說明本發(fā)明，以下實施例以發(fā)明人制備的CZLC331蛋白為例進行說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于下述實施例。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例I、沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物CZLC331蛋白的制備I、構(gòu)建沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白的原核表達載體pET28b-Tat-CZLC331I)沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白編碼基因的人工合成沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白的編碼基因是通過柔性臂將沙門氏菌鞭毛蛋白的編碼序列自5’端第1-528位堿基和自5’端第1206-1515位堿基連接得到的(分別對應(yīng)沙門氏菌鞭毛蛋白自N端第1-176位氨基酸殘基和第402-505位氨基酸殘基)，其核苷酸序列如序列表中序列I所不，長度為891bp (為編碼CZLC331蛋白的核心蛋白序列)，蛋白序列如序列表中序列2所示(由296個氨基酸組成，為CZLC331蛋白的核心蛋白序列)，由北京博邁德科技發(fā)展有限公司公司合成。合成基因的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明獲得了 891bp的目的基因，與預(yù)期結(jié)果相符。2)重組表達載體pET28b-Tat_CZLC331的構(gòu)建a) PCR擴增沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白編碼基因采用常規(guī)PCR的方法擴增出891bp的沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白編碼基因，50 μ I PCR反應(yīng)體系為質(zhì)粒模板(攜帶沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白編碼基因的克隆載體PGH-CZLC3 31，構(gòu)建方法為將化學法合成的CZLC3 31蛋白編碼基因插入克隆載體PGH (購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司)的SmaI酶切位點獲得)O. 5 μ 1，ΙΟΧ ΝΤΡδμ Ι,ΙΟΧΕχ Taq緩沖液5 μ 1，上、下游引物(上游引物序列為5’ -CGCGGGATCCATGGCTCAGGTTATCA-3’，下游引物序列為
5，-CCGCTCGAGTGCGTCGTCTCTGTCTTG-3，)各 0· 5 μ I，Ex Taq 酶 0· 25 μ I，ddH2038. 25 μ I ；PCR 反應(yīng)條件為先 95°C 4 分鐘；然后 95°C 45 秒，56°C 30 秒，72°C 45 秒，共30個循環(huán)；最后72 °C 7分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果表明經(jīng)擴增獲得了 891bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符，回收并純化該目的片段。b)限制性內(nèi)切酶分別酶切目的基因CZLC331和pET28b_Tat載體分別對沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白編碼基因和pET28b_Tat載體(構(gòu)建方法見下面)用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I雙酶切，然后在16°C采用T4DNA連接酶連接過夜并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a中。pET28b_Tat載體構(gòu)建方法為首先通過化學合成的方法合成含有酶切位點為NcoI (上游)和NdeI (下游)的雙鏈TAT核心序列，然后采用限制性內(nèi)切酶NcoI和NdeI雙酶切TAT核心片段和載體pET28b，回收目的片段后經(jīng)T4DNA連接酶連接及酶切鑒定，最后送英駿公司直接測序確證含有TAT核心片段的原核表達載體pET28b-Tat構(gòu)建正確，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，長度為996bp，編碼蛋白序列如序列表中序列4所示(序列3長度為996bp的DNA序列的編碼蛋白序列，由331個氨基酸·組成，即CZLC331蛋白的氨基酸序列，CZLC331因此命名)，不含TAT核心片段的CZLC331蛋白序列(序列2)和含TAT核心片段的CZLC331蛋白序列(序列4)的序列比對結(jié)果如圖I所示，相對于序列2而言，序列4的氨基端增加了 TAT穿膜肽序列，羧基端增加了 6個組氨酸和個別氨基酸。c)鑒定將培養(yǎng)后生長出的克隆分別通過限制性內(nèi)切酶酶切及測序鑒定，獲得序列及插入位置均正確的原核表達載體，命名為pET28b-Tat-CZLC331。2、轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌及菌體復(fù)蘇將步驟I構(gòu)建正確的原核表達載體pET28b-Tat-CZLC331轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)并涂布至LB平皿，待長出克隆，各組分別挑取一個克隆接種到5mL含有Kana+(終濃度100 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，37°C、220rpm搖菌約16小時，待菌體完全復(fù)蘇。3、原核表達載體pET28b-Tat_CZLC331的誘導(dǎo)表達將復(fù)蘇的菌液稀釋至0D600=0. 8，然后吸取5mL菌液接種到150mL含有Kana+(終濃度100 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，37 °C、220rpm搖菌約4-5小時后測定0D600，待0D600=0. 6-1. O時迅速加入誘導(dǎo)劑IPTG (終濃度ImM)，并于30°C、220rpm誘導(dǎo)表達8小時。4、沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白樣品的制備上述誘導(dǎo)表達菌液于4°C、12000rpm離心10分鐘以收集菌體，采用20mM磷酸鈉緩沖液稀釋樣品后超聲破碎，制備CZLC331蛋白樣品，留取上清液待分離純化。5.沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白的分離、純化將步驟4制備的上清液采用初始緩沖液(20mM Na3P04+0. 5M NaCl, pH7. 4)平衡后直接上樣至平衡好的HisTrap HP5mL柱(購自GE公司)，然后采用4_5個柱體積的上述緩沖液沖洗柱子至洗脫峰基線，最后采用洗脫緩沖液(20mM Na3P04+0. 5M NaCl+0. 5M咪唑，pH7. 4)洗脫蛋白樣品，脫鹽后得到沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物，命名為CZLC331蛋白，純度達95%以上。經(jīng)鑒定，其氨基酸序列與沙門氏菌鞭毛蛋白自N端第1-176位氨基酸殘基和第402-505位氨基酸殘基相同。實施例2、沙門氏菌鞭毛蛋白Flagel I in衍生物CZLC331蛋白總的抗氧化活性檢測
用ABTS法進行檢測，可包括以下步驟I、試劑配制(1)CZLC331蛋白樣品溶液制備在按實施例I方法已制備的CZLC331蛋白樣品基礎(chǔ)上，用雙蒸水將CZLC331蛋白配制成lmg/mL樣品溶液。(2)對照品維生素C(Vc)、還原型谷胱甘肽(GSH)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)溶液的制備同CZLC331蛋白制備,稱取對照品IOmg,用雙蒸水將其配制成lmg/mL的對照品溶液。2、總的抗氧化活性檢測①將ABTS與氧化劑K2S2O8按7mM 28mM終濃度配制成ABTS工作母液后，室溫避光存放12-16小時；②將工作母液用PBS或80%乙醇稀釋125倍成ABTS工作液；③將IOmM Trolox 標準溶液稀釋成 0,0. 05,0. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8 和 I. OmM ;用雙蒸水把待測樣品CZLC331蛋白、Vc、GSH和NAC配制成lmg/mL溶液；④取 200 μ I ABTS 工作液；⑤空白對照中加入10 μ I雙蒸水或PBS，標準曲線檢測加入10 μ I各種濃度的Trolox標準溶液，樣品檢測加入10 μ I各種濃度的樣品，輕輕混勻。⑥室溫孵育2-6分鐘后測定A735。⑦根據(jù)測定標準溶液得到的A735值，繪制出橫坐標為溶液濃度、縱坐標為A735值的標準曲線；⑧根據(jù)標準曲線，按照樣品的A735值計算樣品與Trolox標準溶液的等摩爾濃度，進而計算出樣品的總抗氧化能力。⑨總抗氧化能力的表示方式在采用Trolox作為標準品進行抗氧化能力檢測時，樣品的抗氧化能力可以用Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC)來表示。對于具有抗氧化活性的蛋白或抗氧化劑，如樣品的濃度為O. 15mg/mL，測定獲得的摩爾濃度和O. 3mM Trolox相同，貝U樣品的抗氧化能力為O. 3mM/0. 15mg/mL=2mmol/g,即計算公式為TEAC = Trolox等效摩爾濃度/樣品濃度(mol/g)。⑩按同樣方法進行對照品的檢測與計算。檢測結(jié)果參見圖2，結(jié)果顯示，CZLC331蛋白具有一定的抗氧化活性，lmg/mL樣品溶液總的抗氧化活性>0. 0951Trolox mmol/g。實施例3、沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物CZLC331蛋白對ABTS自由基清除的動力學測定CZLC331蛋白對ABTS自由基清除的動力學，具體方法可包括以下步驟I)待測樣品溶液準備將待測CZLC331蛋白樣品配成O. ImM的樣品溶液；2)CZLC331蛋白動態(tài)清除ABTS自由基活性檢測(I)試劑配制①將ABTS與氧化劑K2S2O8按7mM 28mM終濃度配制成ABTS工作母液后，室溫避光存放12-16小時；②將工作母液用PBS或80%乙醇稀釋50、62. 5,125,250,375倍成ABTS工作液；(2)測定樣品的吸收峰
向Eppendorf管(微量離心管)中分別加入不同稀釋倍數(shù)的ABTS工作液O. 98mL和O. 02mL蛋白(O. ImM)溶液，空白對照組中加入O. 02mL雙蒸水，然后迅速用美國Varian公司的Cary50UV-VIS測定340nm和415nm的吸光度，測定時間為Os (未加入樣品前)和30s，記錄不同稀釋倍數(shù)的ABTS工作液中各個時間點的吸光值(A34tl和A415)；(3)計算清除自由基動力學的最大反應(yīng)速率通過吸光值A(chǔ)34tl (或A415)與物質(zhì)的量濃度M換算的標準公式(M = A34tl (或A415) /ε 340 (或ε 4is))計算得到反應(yīng)后的物質(zhì)的量濃度M(mol/L),其中，ε 340=4· 8X IO4(mol/Lr1CnT1, ε415=3· 6 X IO4(In0VLr1cnT1)tj該蛋白清除ABTS自由基的動力學參數(shù)為最大反應(yīng)速率Vmax，可通過通用的Hill方程計算不同稀釋倍數(shù)的ABTS工作液在反應(yīng)后自由基的濃度M得到。檢測結(jié)果參見圖3，表明在CZLC331蛋白濃度不變的情況下，隨著ABTS自由基濃 度不斷增加，ABTS自由基消耗速率也在不斷增加。通過該圖數(shù)據(jù)利用Hill方程計算得出ABTS自由基清除的最大反應(yīng)速率，結(jié)果為O. 3665 μ M/s,反映出CZLC331蛋白在測定濃度范圍內(nèi)對自由基有較強的清除能力。實施例4、沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物CZLC331蛋白清除DPPH自由基活性檢測采用DPPH比色法對CZLC331蛋白清除羥自由基的活性進行測定，DPPH溶解在甲醇溶液中，通過檢測517nm吸收峰的濃度可得到CZLC331蛋白對DPPH自由基的清除作用，具體可包括以下步驟I)將待測CZLC331蛋白樣品配成10、25、50、75、100、125 μ g/mL的樣品溶液，以Vc,NAC (N-乙酰半胱氨酸)和GSH (還原型谷胱甘肽)為對照；用分析純級的甲醇將將DPPH溶解成O. ImM的DPPH自由基溶液；2)六個離心管分別標號，加入等體積470 μ I的DPPH自由基溶液，然后分別依次加入上述不同濃度的CZLC331蛋白溶液，室溫下反應(yīng)5min后于517nm處測定其吸光度，其值分別為Atl (空白對照)、和仏(樣品)；3)計算清除羥自由基活性按下式計算DPPH自由基清除率DPPH 清除比率=(1-A/Ao) X 100%檢測結(jié)果參見圖4，結(jié)果表明，在3 μ g/mL終濃度下，CZLC331蛋白清除DPPH自由基的活性為2. 35%，但與Ne、NAC和GSH相比較，其清除能力稍弱。實施例5、不同批次CZLC331蛋白產(chǎn)品的生物活性檢測I)樣品準備針對不同批次的CZLC331蛋白產(chǎn)品，用雙蒸水將CZLC331蛋白產(chǎn)品配制成3mg/mL的濃度，后續(xù)根據(jù)需求進行不同濃度的稀釋(參見表I);2)所需試劑及儀器試劑所用試劑參照實施例2-4中的方法進行配制；儀器具有檢測使用波段的紫外分光光度計，如Cary50UV_VIS ；3)檢測操作過程參照實施例2-4的具體操作步驟進行測定；4)結(jié)果及評價標準表I不同批次CZLC331蛋白產(chǎn)品的生物活性檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性檢測方法，是通過沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的抗氧化和清除自由基能力進行體現(xiàn)，以沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白總的抗氧化活性、清除自由基動力學和I3DDH自由基的活性作為檢測指標，可包括以下步驟 1)將待檢沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白配制成設(shè)定濃度的樣品溶液； 2)檢測樣品溶液抗氧化和清除自由基的能力； 3)計算出檢測數(shù)據(jù)并與沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性標準數(shù)據(jù)比較，得出檢測結(jié)果； 所述沙門氏菌鞭毛蛋白Flagel I in衍生物蛋白包括但不限于命名為CBLB502和CZLC331的蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測方法，其特征在于其中，針對沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白總的抗氧化活性進行檢測，用ABTS法進行檢測，包括以下步驟 1)制作標準曲線按照ABTS檢測方法制作ABTS濃度與吸光度A735的標準曲線； 2)將待測沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白樣品配成lmg/mL的樣品溶液； 3)根據(jù)標準曲線，按照樣品的A735值計算樣品與Trolox標準溶液的等摩爾濃度，計算出樣品的總抗氧化能力。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于具體來講，所述ABTS法進行檢測可包括以下過程 1)樣品檢測 ①將IOmMTrolox標準溶液稀釋成0,0. 05,0. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8和I. OmM ;用雙蒸水把待測樣品沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白配制成lmg/mL溶液； ②取200μ I ABTS工作液(ABTS與氧化劑K2S2O8按7mM 28mM終濃度配制)，空白對照為10 μ I雙蒸水或PBS，標準曲線檢測分別加入10 μ I各個濃度的Trolox標準溶液，樣品檢測加入10 μ I沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白溶液，輕輕混勻，室溫孵育2_6分鐘后測定A735 ； ③根據(jù)測定的空白對照和標準溶液的A735值，繪制出橫坐標為溶液濃度、縱坐標為A735值的標準曲線，根據(jù)標準曲線和樣品的A735值計算樣品與Trolox標準溶液的等摩爾濃度，進而用下述方法計算出樣品的總抗氧化活性； 2)計算樣品總的抗氧化活性 總抗氧化活性的表示方式在采用Trolox作為標準品進行抗氧化能力檢測時，樣品的抗氧化能力用Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity (Trolox等效的抗氧化能力，TEAC)來表示，計算公式為TEAC = Trolox等效摩爾濃度/樣品濃度(mol/g)，TEAC值即為總的抗氧化活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的檢測方法，其特征在于所述沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白總的抗氧化活性為> O. 05Torlox mmol/g為沙門氏菌鞭毛蛋白Flagel I in衍生物蛋白具有總的抗氧化活性的標準。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測方法，其特征在于其中，針對沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白清除ABTS自由基動力學活性進行檢測，可包括以下步驟 I)待測樣品溶液準備將待測沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白樣品配成O. ImM的樣品溶液； 2)沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白動態(tài)清除ABTS自由基活性檢測 (1)試劑配制 ①將ABTS與氧化劑K2S2O8按7mM28mM終濃度配制成ABTS工作母液后，室溫避光存放12-16小時; ②將工作母液用PBS或80%乙醇稀釋50，62.5，125，250，375倍成ABTS工作液； (2)測定樣品的吸收峰 向Eppendorf管中分別加入不同稀釋倍數(shù)的ABTS工作液O. 98mL和O. 02mL蛋白(O. ImM)溶液，空白對照組中加入0.02mL雙蒸水，然后迅速用美國Varian公司的Cary50UV-VIS測定340nm和415nm的吸光度，測定時間為Os (未加入樣品前)和30s，記錄不同稀釋倍數(shù)的ABTS工作液中各個時間點的吸光值(A34tl和A415)； (3)計算清除自由基動力學的最大反應(yīng)速率 通過吸光值A(chǔ)34tl (或A415)與物質(zhì)的量濃度M換算的標準公式(M = A34tl (或A415)/ ε 34(| (或ε 4 5))計算得到反應(yīng)后的物質(zhì)的量濃度M(mol/L),其中，ε 34(l=4. 8X IO4 (mol/L)_1cm_1,ε 415=3. 6X IO4(In0VLr1cnT1)tj該蛋白清除ABTS自由基的動力學參數(shù)為最大反應(yīng)速率Vmax，可通過通用的Hill方程計算不同稀釋倍數(shù)的ABTS工作液在反應(yīng)后自由基的濃度M得到。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于所述沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白具有清除ABTS自由基動力學的標準為2 μ M的沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白清除ABTS自由基最大反應(yīng)速率>0. 3μΜ· s'
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測方法，其特征在于其中，針對沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白清除DPPH自由基的活性進行檢測，可包括以下步驟 1)將待測沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白樣品配成10、25、50、75、100、125 μ g/mL的樣品溶液；用分析純級的甲醇將將DPPH溶解成O. ImM的DPPH自由基溶液； 2)六個離心管分別標號，加入等體積470μ I的DPPH自由基溶液，然后分別依次加入上述不同濃度的沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白溶液,室溫下反應(yīng)5min后于517nm處測定其吸光度，其值分別為空白對照Atl、和樣品A1 ； 3)計算清除羥自由基活性按下式計算DPPH自由基清除率 DPPH 清除比率=(I-A1A0) X 100%。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于所述沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白對DPPH自由基清除率>1. 5%為沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白具有清除羥自由基活性的標準。
9.權(quán)利要求1-8任一項所述方法在對沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白在蛋白生物活性的跟蹤，沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白生產(chǎn)制備、儲存、運輸過程中沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的活性確認，以及含有沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物制品的活性檢測中的應(yīng)用。
10.包括CBLB502蛋白和CZLC331蛋白在內(nèi)的沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白在制備具有抗氧化和清除自由基功能藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述具有抗氧化和清除自由基功能的藥物包括治療氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的多種免疫系統(tǒng)疾病的候選藥物，治療氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的免疫系統(tǒng)疾病中的藥物，治療氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的多種免疫系統(tǒng)疾病等引起機體自由基 增加的相關(guān)疾病的藥物，還包括它們的醫(yī)藥產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性檢測方法及其用途，是通過沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的抗氧化和清除自由基能力進行體現(xiàn)，以沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白總的抗氧化活性、清除自由基動力學和PDDH自由基的活性作為檢測指標。本發(fā)明的檢測方法穩(wěn)定，具有測定結(jié)果可靠、檢測數(shù)據(jù)重復(fù)性較高等優(yōu)點，測定的結(jié)果能較好地反映沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白蛋白的抗氧化和清除自由基的生物活性，并且在對沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白本身以及含有沙門氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物制品的活性跟蹤方面具有廣泛用途，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號G01N21/31GK102866119SQ20121023278
公開日2013年1月9日 申請日期2012年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月5日
發(fā)明者張成崗, 李偉光, 吳永紅, 李軍懷, 高艷, 李志慧 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所, 蘇州科景生物醫(yī)藥科技有限公司