專(zhuān)利名稱(chēng)：一種重組細(xì)菌鞭毛蛋白衍生多肽的制備和活性鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種生物工程產(chǎn)品的生產(chǎn)方法和活性鑒定方法，具體涉及利用PCR方法構(gòu)建重組細(xì)菌鞭毛蛋白衍生多肽及其表達(dá)、分離和純化的制備方法及其生物學(xué)活性的鑒定方法。
背景技術(shù)：
研究表明電離輻射主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡造成多器官損傷，例如骨髓造血干細(xì)胞和腸道上皮細(xì)胞等敏感細(xì)胞，在電離輻射后發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。如果能在機(jī)體受到 電離輻射之前或之后短時(shí)間內(nèi)，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞尤其是造血干祖細(xì)胞和胃腸道上皮細(xì)胞的抗凋亡能力，必然會(huì)增強(qiáng)機(jī)體對(duì)福射的抵抗性(GudkovAV, et al. Radioprotection smartgames with death. J Clin Invest, 2010，120 :2270-2273)。有研究發(fā)現(xiàn)TLR5 (Toll Like Receptor 5)受體的特異性配體-沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白及功能同源衍生物CBLB502(含有鞭毛蛋白主要功能結(jié)構(gòu)域的重組蛋白，我們稱(chēng)之為輻抗肽)可以和細(xì)胞表面的TLR5結(jié)合并激活NF-κ B信號(hào)通路，在不引發(fā)急性炎癥反應(yīng)的情況下，減輕射線引起的腸道上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞凋亡，保護(hù)細(xì)胞免受輻射損傷并促進(jìn)組織再生，而并沒(méi)有降低腫瘤的福射敏感性(Burdelya LG, et al. An agonist oftoll-like receptor 5has radioprotective activity in mouse and primate models.Science，2008，320 :226-230)。Toll樣受體家族是一類(lèi)參與病原微生物引起的先天免疫的蛋白家族。TLRs屬于模式識(shí)別受體，通過(guò)病原相關(guān)分子模式(Pathogen-Associated Molecular Pattern,PAMP)，特異地識(shí)別病原微生物進(jìn)化中保守的抗原分子，如脂多糖(LPS)、肽聚糖、酵母多糖以及病原微生物的核酸等，從而有效監(jiān)測(cè)病原微生物的入侵以及誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)(Kumar H,et al. Toll-like receptors and innate immunity. BBRC,2009,388 :621-625)。此外，TLRs信號(hào)激活能夠抑制骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分化及促進(jìn)MSC細(xì)胞增殖，多個(gè)TLR家族成員可以活化影響多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)(Pevsner-Fischer M, et al. Toll-like receptorsand their ligands control mesenchymal stem cell functions. Blood，2007，109 1422—1432 ;Rooban T,Elizabeth J,Umadevi KR,et al. Sociodemographic correlates ofmale chewable smokeless tobacco users in India a preliminary report of analysisof National Family Health Survey,2005-2006. Indian J Cancer，2010，47Suppl I:91-100)。上述這些研究表明，TLR信號(hào)通路不僅在病原微生物引起的先天免疫方面發(fā)揮作用，在細(xì)胞增殖分化、腫瘤生長(zhǎng)等多個(gè)方面也發(fā)揮重要作用。TLR5是TLR家族中的成員之一，在胃腸道上皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞及骨髓等組織細(xì)胞高表達(dá)，研究表明鞭毛蛋白以TLR5依賴方式活化MyD88分子，進(jìn)一步激活NF-κ B信號(hào)通路，調(diào)節(jié)腸道細(xì)胞分泌IL-8、TNF-a、IL-Ia等細(xì)胞因子，參與微生物引起的免疫反應(yīng)(Wang Y, et al. Activation of nuclear factor kappaBIn vivo selectively protects the murine small intestine against ionizingradiation-induced damage. Cancer Res, 2004,64 :6240-6246)。Lyudmila 等人則進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)鞭毛蛋白衍生物-輻抗肽以TLR5依賴方式有效地預(yù)防電離輻射引起的小鼠造血細(xì)胞、腸道上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，照射前對(duì)小鼠皮下注射輻抗肽蛋白，能夠有效預(yù)防致死劑量Y射線引起的急性放射病，其30天存活率由全部死亡提高到90%以上；對(duì)于超致死劑量照射，提前注射輻抗肽同樣能將其平均生存時(shí)間由7天延長(zhǎng)到12天；在靈長(zhǎng)類(lèi)恒河猴身上也表現(xiàn)出類(lèi)似的福射保護(hù)效果(Burdelya LG, et al. An agonist oftoll-like receptor 5has radioprotective activity in mouse and primate models.Science，2008，320 :226-230)。經(jīng)多個(gè)照射劑量對(duì)比，輻抗肽的防護(hù)效果明顯好于已有的細(xì)胞因子、WR2721等福射防護(hù)劑。Kumar等人和Jarchum等人的研究表明，鞭毛蛋白不僅對(duì)電離輻射小鼠具有保護(hù)作用，對(duì)化學(xué)毒物(DSS)處理、細(xì)菌和輪狀病毒感染小鼠均具有保護(hù)作用，并發(fā)現(xiàn)這種保護(hù)作用與鞭毛蛋白保護(hù)腸道上皮細(xì)胞凋亡有直接關(guān)系(Vijay-Kumar M,et al. Flagellin treatment protects against chemicals, bacteria, viruses, and radiation. J Tmmunol,2008,180 :8280-8284 ;Jarchum I, et al. Toll-likereceptor_5stimulation protects mice from acute Clostridium difficile colitis.Infect Immun,2011)。Jones等人的研究發(fā)現(xiàn),鞭毛蛋白保護(hù)電離福射誘發(fā)腸道上皮細(xì)胞凋亡與 MKP-7 (mitogen-activated protein kinase phosphatase-7)分子直接相關(guān)。這些特點(diǎn)使得鞭毛蛋白衍生物輻抗肽有可能倍開(kāi)發(fā)成為極具實(shí)用價(jià)值的抗輻射保護(hù)藥物。研究還表明，輻抗肽在腫瘤的放療和化療過(guò)程中對(duì)正常細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用而不影響放化療效果利用B16黑色素瘤和NIH3T3肉瘤的裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，鞭毛蛋白及其衍生物輻抗肽不僅沒(méi)有增強(qiáng)腫瘤組織對(duì)放射治療的抵抗性，而且加快了腫瘤組織的體積縮小，并提高照射后負(fù)瘤小鼠的存活率。Lucia S等進(jìn)一步利用結(jié)腸癌DLD-I細(xì)胞進(jìn)行了體內(nèi)研究，發(fā)現(xiàn)在腫瘤周?chē)⑸浔廾鞍准せ頣LR5，能明顯促進(jìn)腫瘤組織的壞死，抑制腫瘤生長(zhǎng)，這種抑制作用是TLR5受體依賴的，與鞭毛蛋白能夠促進(jìn)腫瘤組織的中性粒細(xì)胞侵潤(rùn)和相關(guān)的免疫因子的產(chǎn)生相關(guān)(Rhee SH, et al. Toll-like receptor 5engagementmodulates tumor development and growth in a mouse xenograft model of human coloncancer. Gastroenterology, 2008,135 :518-528)。Galli 等人研究發(fā)現(xiàn)鞭毛蛋白以 NF-κ B依賴方式誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞系分泌多種炎性因子，引起白細(xì)胞聚集(GalliR, et al. TLR stimulation of prostate tumor cells induces chemokine—mediatedrecruitment of specific immune cell types. J Immunol, 2010,184 :6658-6669) 0Zeng H等研究發(fā)現(xiàn)，在NF- κ B信號(hào)通路被阻斷的情況下,鞭毛蛋白能夠激活Caspase 8和Caspase9，同時(shí)能夠誘導(dǎo)T84細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡(Zeng H, et al. Flagellin/TLR5responses inepithelia reveal intertwined activation of inflammatory and apoptotic pathways.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2006, 290 :G96_G108)。這些研究表明鞭毛蛋白抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)一方面可能與調(diào)節(jié)炎性因子和免疫相關(guān)，另一方面可能與直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用原核細(xì)胞，通過(guò)基因工程技術(shù)、體外復(fù)性技術(shù)和層析技術(shù)建立一種可以工業(yè)化生產(chǎn)的輻抗肽的制備方法，并提供了一種可用于體外檢測(cè)輻抗肽活性的細(xì)胞系的建立方法，同時(shí)也提供了一種體外檢測(cè)輻抗肽活性的方法。本發(fā)明的主要內(nèi)容是在獲得細(xì)菌鞭毛蛋白衍生多肽-輻抗肽cDNA的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了輻抗肽的原核表達(dá)載體，此表達(dá)載體為溫度誘導(dǎo)型表達(dá)載體，將此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得了表達(dá)輻抗肽的基因工程菌。利用此基因工程菌建立了一套工程菌誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體的分離和裂解、蛋白質(zhì)的體外復(fù)性和純化工藝。利用此工藝可以生產(chǎn)大量的輻抗肽蛋白。在獲得輻抗肽蛋白之后，應(yīng)用DNA轉(zhuǎn)染和抗生素篩選技術(shù)在293T細(xì)胞中建立了穩(wěn)定表達(dá)NF- κ B報(bào)告基因的穩(wěn)定報(bào)告細(xì)胞系，以獲得的輻抗肽蛋白刺激該細(xì)胞后，NF- κ B轉(zhuǎn)錄活性被明顯激活，并與輻抗肽的劑量有明顯的量效關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明公開(kāi)了一種輻抗肽蛋白的活性鑒定方法。本發(fā)明已利用PCR方法擴(kuò)增并連接出沙門(mén)氏桿菌(Salmonella enterica)鞭毛蛋白的cDNA，經(jīng)測(cè)序，其擴(kuò)增的序列如圖I.通過(guò)限制性酶切后將次cDNA連接到用同樣雙酶切的PBV220溫度誘導(dǎo)型表達(dá)載體中，構(gòu)建pBV220-FKT重組表達(dá)載體(見(jiàn)圖2)，然后用此載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，在氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆，并建立工程菌 種子庫(kù)。取工程菌在30°C條件下培養(yǎng)至菌體密度0D_ = O. 3 O. 8，優(yōu)選O. 6，升高溫度到42°C誘導(dǎo)輻抗肽基因的表達(dá),誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為3 8小時(shí),優(yōu)選5小時(shí),在優(yōu)選表達(dá)條件下，表達(dá)的輻抗肽蛋白占菌體總蛋白的比例大于50%，實(shí)現(xiàn)了輻抗肽蛋白的高效表達(dá)。表達(dá)到輻抗肽蛋白以無(wú)活性的包涵體形式存在，需要經(jīng)過(guò)體外復(fù)性工藝才能獲得有活性的形式。通過(guò)離心方法收集誘導(dǎo)表達(dá)后的輻抗肽工程菌，并通過(guò)超聲破碎方法將菌體破碎，在通過(guò)3000RPM離心10分鐘將破碎后的菌體分為上清和沉淀部分。棄掉上清部分，保留沉淀部分，沉淀部分即為粗制包涵體。用各種不同的緩沖液充分洗滌粗制包涵體，然后再通過(guò)離心方法回收沉淀，即包涵體。將包涵體在含8M尿素的20mM Tris-HCl (pH 6.8)于4°C攪拌裂解過(guò)夜，然后離心回收上清，上清主要為處于變性狀態(tài)的輻抗肽包涵體。上清用20mM Tris-HCl (pH 6. 8)稀釋至尿素終濃度為2M，隨后進(jìn)行DEAE陰離子交換柱上復(fù)性。將上述尿素溶液的包涵體溶液上樣于用2M尿素20mM Tris-HCl (pH 6.8)平衡后的DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱，上樣完畢后，用2M尿素20mMTris-HCl (pH 6. 8)平衡2 3個(gè)柱體積，再用20mM Tris-HCl (pH 6. 8)平衡至基線平穩(wěn)。以 2M 尿素 20mM Tris-HCl (pH 6. 8)以 O 20% IM NaCl 梯度洗脫 60min，流速 10ml/min，然后再由20 100% IM NaCl梯度洗脫30min，收集各洗脫峰，還原型SDS-PAGE電泳檢測(cè)目標(biāo)蛋白洗脫情況，目的蛋白主要出現(xiàn)在低鹽洗脫組分中。隨后，將初純化所得目標(biāo)峰洗脫液用注射用水稀釋5倍(用IM Tris-HCI pH 6. 8調(diào)節(jié)其電導(dǎo)與平衡液相同)后上樣于另一個(gè)用 20mMTriS-HC1 (pH 6. 8)平衡的 DEAE-Sepharose Fast Flow 層析柱，上樣結(jié)束后用 20mMTris-HCl (pH 6. 8)平衡 2 個(gè)柱體積，至基線平穩(wěn)，以 10% IM NaCl/20mM Tris-HCl (pH 6. 8)洗脫 30min，流速為 5ml/min，然后以 100% IM NaCl/20mM Tris-HCl (pH 6.8)洗脫 IOmin,流速10ml/min。收集各洗脫峰，還原型SDS-PAGE電泳檢測(cè)目標(biāo)蛋白洗脫情況，目的蛋白主要出現(xiàn)在低鹽洗脫組分中，蛋白質(zhì)純度大于95%，純化后的輻抗肽蛋白具有圖8所示的氨基酸序列，在非還原型的聚丙烯酰胺凝膠電泳中表現(xiàn)為31KD的條帶。利用上述方法制備的輻抗肽蛋白具有激活細(xì)胞NF-κ B信號(hào)通路的作用。本發(fā)明還公開(kāi)了應(yīng)用NF-kB報(bào)告細(xì)胞系體外鑒定輻抗肽生物學(xué)活性的方法。將NF-kB報(bào)告基因應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞中，應(yīng)用潮霉素B進(jìn)行篩選，并最終篩選出對(duì)陽(yáng)性對(duì)照TNF-α和輻抗肽具有良好反應(yīng)的穩(wěn)定細(xì)胞系。輻抗肽體外活性檢測(cè)是在培養(yǎng)的NF-kB報(bào)告細(xì)胞系中加入不同濃度的?？闺模?小時(shí)后檢測(cè)突光素酶報(bào)告基因的表達(dá)并確定?？闺牡幕钚?。


圖I為輻抗肽的cDNA序列；圖2為輻抗肽的基因全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定結(jié)果；M DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2 :輻抗肽基因擴(kuò)增產(chǎn)物圖3為溫度敏感型表達(dá)載體PBV220-FKT的構(gòu)建過(guò)程示意圖
輻抗肽原核表達(dá)載體構(gòu)建示意圖；圖4為pBV220-FKT表達(dá)質(zhì)粒酶切圖譜輻抗肽原核表達(dá)載體表達(dá)載體的酶切產(chǎn)物電泳鑒定圖譜。其中左側(cè)核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 marker ;右側(cè)核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)DL15000 Marker ；I. DL15000 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；2· pBV220_FKT/Sal I 單酶切；3. pBV220-FKT/Sma I 單酶切；4·未切的 pBV220_FKT 圖5為pBV220-FKT在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果 PBV220-FKT誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；
I.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.未誘導(dǎo)全菌；3.誘導(dǎo)后全菌 圖6為DEAE Fast Flow陰離子交換樹(shù)脂色譜圖 輻抗肽蛋白DEAE層析純化圖譜；
I:收集峰I ;2 :目標(biāo)蛋白峰；3 :收集峰3 ；4 :鹽洗脫峰；5 :堿洗脫峰 圖7為純化后的輻抗肽蛋白；
M :預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1_3 :為不同批次的輻抗肽純化后的產(chǎn)物 圖8為輻抗肽的氨基酸序列；
圖9為NF-kB報(bào)告細(xì)胞系對(duì)TNF- α的反應(yīng)曲線 穩(wěn)定表達(dá)NF-kB報(bào)告基因的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系對(duì)TNF- α的反應(yīng)曲線；
圖10為輻抗肽蛋白激活NF-κ B的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。應(yīng)理解這些實(shí)施案例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出的某些改變和調(diào)整也應(yīng)被認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I重組輻抗肽的cDNA獲得利用DNA合成技術(shù)結(jié)合巢式PCR的方法獲得了鞭毛蛋白衍生多肽_輻抗肽的全長(zhǎng)基因核酸序列。并經(jīng)PCR產(chǎn)物應(yīng)用T-A克隆技術(shù)將該序列連接到pMD-18T simple載體中成為pMD-18T-FKT載體，經(jīng)過(guò)DNA序列測(cè)定，挑取序列正確的克隆，擴(kuò)增所得到的重組輻抗肽的cDNA序列如圖I所示。重組輻抗肽的cDNA編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸學(xué)列如圖7所示。?？箠y基因cDNA序列正確,如附圖I所不。實(shí)施例2重組輻抗肽誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建
合成下列輻抗肽的引物上游5，-TCCCCGGGATGGCACAAGTCATTAATAE-3’下游5，-GGGTCGACTTATTATTAACGCAGTAAAGAGAGGACG-3，為了將輻抗肽全長(zhǎng)序列克隆到pBV220原核表達(dá)載體，我們采用PCR方法，以PMD-18T-FKT為模板，以上述含有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的輻抗肽特異性引物擴(kuò)增了輻抗肽的全長(zhǎng)序列，獲得了大小約為891bp的DNA片段(附圖2)。將經(jīng)凝膠回收的輻抗肽擴(kuò)增條帶和PBV220表達(dá)載體分別用Sal I和Smal I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，分別回收酶切后，用T4DNA Ligase進(jìn)行過(guò)夜連接并轉(zhuǎn)化入JM-109感受態(tài)細(xì)胞中，在含有氨芐抗生素的LB平板，30°C過(guò)夜培養(yǎng)。挑取克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA后，經(jīng)測(cè)序和酶切鑒定，結(jié)果序列與原始序列一致，證實(shí)了 PBV220-FKT溫敏型表達(dá)載體的構(gòu)建成功(附圖3-5)。實(shí)施例3輻抗肽的誘導(dǎo)表達(dá)、復(fù)性和純化 將含有重組細(xì)菌鞭毛蛋白衍生多肽輻抗肽的JM109工程菌在30°C下震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1% (體積比)接入2XYT培養(yǎng)基中，在30°C條件下培養(yǎng)至菌體密度0D_ =
O.3 O. 8，優(yōu)選O. 6，升高溫度到42°C誘導(dǎo)輻抗肽基因的表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為3 8小時(shí)，優(yōu)選5小時(shí)，在優(yōu)選表達(dá)條件下，表達(dá)的輻抗肽蛋白占菌體總蛋白的比例大于50%，用非還原型聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，表明有目的條帶出現(xiàn)，分子量約為31KD。將細(xì)菌超聲破碎后，SOOOrpm離心，將離心沉淀和上清分別進(jìn)行非還原型聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，結(jié)果表明表達(dá)的輻抗肽蛋白全部在沉淀中，說(shuō)明表達(dá)的輻抗肽蛋白是以無(wú)活性的包涵體的形式存在的。將超聲液沉淀即粗制包涵體依次用20mM Tris-HCl (pH 6.8)、含0.511 NaCl的20mMTri s-HCl (pH 6.8)、20mM Tris-HCl (pH 6. 8)以及含 IM 尿素的 20mM Tris-HCl (pH6.8)的洗滌液洗滌，最后所得包涵體用含8M尿素的20mM Tris-HCl (pH 6.8)于4°C攪拌過(guò)夜。IOOOOrpm離心30分鐘，取離心上清加20mM Tris-HCl (pH 6. 8)稀釋至尿素終濃度為2M，并用O. 45 μ m濾膜過(guò)濾除菌。隨后進(jìn)行DEAE陰離子交換柱上復(fù)性。將上述尿素溶液的包涵體溶液上樣于用2M尿素20mM Tris-HCl (pH 6. 8)平衡后的DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱,上樣結(jié)束后，用2M尿素20mM Tris-HCl (pH 6. 8)平衡2_3個(gè)柱體積，再用20mM Tris-HCl (pH
6.8)平衡至基線平穩(wěn)。以2M尿素20mM Tris-HCl (pH 6. 8)由O 20% IM NaCl梯度洗脫60min，流速10ml/min，然后再由20 100% IM NaCl梯度洗脫30min (附圖6)，收集各洗脫峰，還原型SDS-PAGE電泳檢測(cè)目標(biāo)蛋白洗脫情況，目的蛋白主要出現(xiàn)在低鹽洗脫組分中。隨后，用 20mM Tris-HCl (pH 6. 8)柱平衡另一新DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱,將初純化所得目標(biāo)峰洗脫液用注射用水稀釋5倍(用IM Tris-HCI pH 6. 8調(diào)節(jié)其電導(dǎo)與平衡液相同)后上樣。上樣結(jié)束后用20mM Tris-HCl (pH 6.8)平衡2個(gè)柱體積，至基線平穩(wěn)，以10%IM NaCl/20mMTris-HCl (pH 6.8)洗脫 30min，流速為 5ml/min，然后以 100% IM NaCl/20mMTris-HCl (pH6. 8)洗脫lOmin，流速為10ml/min。收集各洗脫峰，還原型SDS-PAGE電泳檢測(cè)目標(biāo)蛋白洗脫情況，目的蛋白主要出現(xiàn)在低鹽洗脫組分中，蛋白質(zhì)純度大于95%，純化后的輻抗肽蛋白在非還原型的聚丙烯酰胺凝膠電泳中表現(xiàn)為31KD的條帶(附圖7)。實(shí)施例4表達(dá)NF- κ B報(bào)告基因穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建在建立NF-κ B穩(wěn)定報(bào)告細(xì)胞系之前對(duì)HEK293細(xì)胞進(jìn)行劑量一反應(yīng)分析以確定抗性藥物潮酶素B的篩選濃度為200 μ g/ml。接種HEK293細(xì)胞至Ij 24孔板(I X IO5/孔)，24小時(shí)后轉(zhuǎn)染NF- κ B-RE-luc2P報(bào)告基因載體，24小時(shí)后按照I 100、I 200稀釋到6孔板中，24小時(shí)后加入潮酶素B進(jìn)行持續(xù)加壓篩選，隔日更換培養(yǎng)基。2周后挑單克隆入96孔板中培養(yǎng)，逐步放大到24孔板、6孔板、培養(yǎng)瓶。待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部時(shí)對(duì)各克隆進(jìn)行NF-κ B報(bào)告基因活性鑒定。細(xì)胞活性鑒定將上述NF- κ B穩(wěn)定報(bào)告細(xì)胞系接種24孔板，培養(yǎng)基成份為不含潮酶素B只含10%胎牛血清的DMEM，接種細(xì)胞密度為IX IO5/孔，每組3復(fù)孔。24小時(shí)后給予 TNF- α 刺激，給藥濃度分別為 10_12、10-11、10_10、I O;9、I O-8、I O-7、10_6g/ml，6h 后利用檢測(cè)熒光素酶報(bào)告基因的數(shù)值(附圖9)。實(shí)施例5重組輻抗肽對(duì)NF- κ B的激活作用以及活性測(cè)定方法選取對(duì)NF- κ B刺激活性反應(yīng)最佳的陽(yáng)性克隆株接種96孔板，接種培養(yǎng)基為不含 潮霉素B只含10%胎牛血清的DMEM，每孔細(xì)胞數(shù)為I X IO4,總共8組，每組3個(gè)復(fù)孔。24小時(shí)后給予輻抗肽刺激，給藥濃度分別為10—11、10-1(1、10_9、10_8、10' 10' 10Vml,6小時(shí)檢測(cè)熒光素酶報(bào)告基因的數(shù)值(附圖10)。
權(quán)利要求
1.一種制備重組的細(xì)菌鞭毛蛋白衍生多肽(bacterial flagellin derviedpeptide)-?？闺?FuKangTai)的方法,其特征為利用溫度誘導(dǎo)型表達(dá)載體在原核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)重組輻抗肽的高效表達(dá)，采用柱上復(fù)性的方法在變性劑介導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)輻抗肽的體外復(fù)性，并應(yīng)用離子交換層析方法獲得了純化的輻抗肽蛋白產(chǎn)物，該方法包括 (1)應(yīng)用PCR的方法體外合成了輻抗肽的cDNA； (2)將輻抗肽的cDNA克隆代溫度誘導(dǎo)型原核表達(dá)載體中，構(gòu)建輻抗肽表達(dá)載體； (3)用輻抗肽表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，構(gòu)建輻抗肽基因表達(dá)工程菌； (4)30°C條件下培養(yǎng)基因表達(dá)工程菌，42°C條件下誘導(dǎo)輻抗肽表達(dá)； (5)分離輻抗肽包涵體，用變性劑裂解輻抗肽包涵體； (6)用DEAE陰離子交換層析實(shí)現(xiàn)輻抗肽的體外復(fù)性； (7)用DEAE陰離子交換層析實(shí)現(xiàn)對(duì)輻抗肽的進(jìn)一步純化。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征為工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)條件為菌體密度0D_= 0.6時(shí)。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征為輻抗肽包涵體的復(fù)性劑為尿素。
4.如權(quán)利要求I和3所述的方法，其特征為輻抗肽包涵體復(fù)性劑的濃度為2M。
5.如權(quán)利要求1、3和4所述的方法，其特征為輻抗肽復(fù)性過(guò)程在DEAE陰離子交換層析柱上實(shí)現(xiàn)。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征為復(fù)性后的輻抗肽蛋白在DEAE陰離子交換層析柱上實(shí)現(xiàn)純化。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其制備的輻抗肽具有以下特征分子量約為31，000道爾頓，在體外能刺激轉(zhuǎn)化有TLR5受體、NF- K B報(bào)告基因和pRL_TK載體的293T細(xì)胞中NF- κ B報(bào)告基因的表達(dá)活性。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組鞭毛蛋白衍生物(輻抗肽)的制備方法及其生物活性的鑒定方法，屬于生物產(chǎn)品的生產(chǎn)方法領(lǐng)域。在獲得細(xì)菌鞭毛蛋白衍生物cDNA之后，將此cDNA插入溫度敏感型原核表達(dá)載體，構(gòu)建原核高效表達(dá)工程菌，在此基礎(chǔ)上建立了一套工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體的分離與裂解、輻抗肽的體外復(fù)性和分離純化工藝。利用此工藝能最終得到具有生物學(xué)活性的輻抗肽純品，實(shí)現(xiàn)輻抗肽的工業(yè)化生產(chǎn)；本發(fā)明還提供了用于輻抗肽生物學(xué)活性的細(xì)胞系的建立方法以及輻抗肽活性的鑒定方法。
文檔編號(hào)C07K14/255GK102965386SQ201110257680
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2011年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月2日
發(fā)明者葛常輝, 王治東, 許望翔, 李長(zhǎng)燕, 于淼, 詹軼群, 楊曉明 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所