專利名稱：：改良toll樣受體5刺激活性的修飾的鞭毛蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有增強(qiáng)的toll樣受體-5(下文稱為"TLR5")刺激活性的鞭毛蛋白突變體，特別涉及由點(diǎn)突變TRL5激動劑鞭毛蛋白的某些氨基酸以增強(qiáng)鞭毛蛋白的TLR5剌激活性而制備的鞭毛蛋白突變體。
背景技術(shù)：
：鞭毛是決定細(xì)菌運(yùn)動性的重要結(jié)構(gòu)元件，其通常由鉤狀體、基體和絲狀體所組成。己知鞭毛有助于游動或集群運(yùn)動、細(xì)菌趨向性、病原微生物對宿主細(xì)胞的粘附和生物膜的形成。形成鞭毛絲狀體的亞基蛋白被稱為鞭毛蛋白，鞭毛蛋白規(guī)則地裝配形成絲狀體。Hayashi等公開了哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的TLR5可識別革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌的鞭毛蛋白而激活NF-kB(HayashiF，SmithKD，OzinskyA,HawnTR，YiEC,GoodlettDR,EngJK，AkiraS,UnderhillDM,AderemA:Nature410:1099-1103,2001)。Toll樣受體(TLRs)是典型的"模式識別受體(PRRs)"，它識別存在于病原體中的"病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)"，且不僅在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了該受體，還在昆蟲和植物細(xì)胞的表面發(fā)現(xiàn)該受體。至今已發(fā)現(xiàn)十三種TLRs，這積極地引導(dǎo)了對TLRs激動劑的研究(AkiraS,UematsuS，TakeuchiO:Cell124(4):783-801,2006)。PRRs(例如TLRs)分布在宿主細(xì)胞的表面或細(xì)胞質(zhì)中，在受到多種PAMPs刺激之后，PRRs能誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答，而且調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。因而，TLR激動劑可作為適合于開發(fā)多種免疫調(diào)節(jié)劑(尤其是疫苗佐劑)的靶點(diǎn)。在本文中，術(shù)語"疫苗佐劑"指在與疫苗共同給藥時，可以增強(qiáng)、延長或5加速由疫苗抗原誘導(dǎo)的Ag-特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)。批準(zhǔn)用于人體的疫苗佐劑包括磷酸鋁，氫氧化鋁，和角鯊烯乳化劑。疫苗佐劑必須滿足以下五個要求中的至少一個1)調(diào)節(jié)共刺激分子在抗原呈遞細(xì)胞表面上的表達(dá)，誘導(dǎo)抗原特異性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，或免疫調(diào)控(例如調(diào)控細(xì)胞因子的分泌)；2)抗原呈遞；3)誘導(dǎo)CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答；4)靶向作用；和5)形成貯存。理想的疫苗佐劑1)必須是安全的；2)必須是在體內(nèi)可生物降解的；3)與抗原單獨(dú)給藥時相比，必須顯示有效的預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答；4)必須是經(jīng)化學(xué)或生物驗(yàn)證的物質(zhì)；5)優(yōu)選在濃度低于抗原時起作用；和6)必須具有長的半衰期，以便它們可以容易地用于商業(yè)或臨床應(yīng)用。目前用作疫苗佐劑或可考慮用作疫苗佐劑的物質(zhì)包括1)礦物鹽，例如氫氧化鋁凝膠；2)表面活性劑物質(zhì)；3)細(xì)菌衍生的物質(zhì)；4)細(xì)胞因子或激素；5)聚陰離子；6)聚丙烯基；7)載體；8)含病毒的活體載體；和9)賦形劑，例如礦物油脂質(zhì)體。其中，目前正被活躍研究且受到很大關(guān)注的蛋白衍生的疫苗佐劑包括霍亂弧菌(附n'oc/^/erae)衍生的霍亂毒素(CT)和大腸桿菌(五sc/^n'c/n'aco//)衍生的不耐熱毒素(LT)。據(jù)報導(dǎo)這些疫苗佐劑誘導(dǎo)在粘膜區(qū)和血漿中產(chǎn)生抗原特異性抗體，并誘導(dǎo)B7-2在抗原呈遞細(xì)胞(APCs)表面的表達(dá)以刺激CD4+輔助T細(xì)胞的共刺激信號。但是，這些佐劑是具有高腸毒性的外毒素，因而正在進(jìn)行有關(guān)降低它們的毒性和增強(qiáng)它們的佐劑活性的研究。如PCT國際專利公開文本W(wǎng)O2005/070455中所公開的，本發(fā)明人構(gòu)建了轉(zhuǎn)座子突變體文庫以篩選創(chuàng)傷弧菌(P%n'OVM/m:/Cw)的粘附和入侵因子，并分析了已喪失對宿主細(xì)胞的粘附和運(yùn)動性的三個克隆的Tn側(cè)翼區(qū)，結(jié)果本發(fā)明人鑒別了兩個含56個基因的鞭毛操縱子。在這個分析過程中，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌總共有六個鞭毛蛋白基因(_/7"丄^a萬、^aF、y/aC、^/7aD和^a五)，白的主要組分。本發(fā)明人研究了創(chuàng)傷弧菌的極性鞭毛蛋白成分——鞭毛蛋白重組蛋白(FlaB)可作為針對創(chuàng)傷弧菌的組成疫苗的可能性，結(jié)果本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了鞭毛蛋白重組蛋白(FlaB)除具有高抗原性以外，還具有強(qiáng)的疫苗佐劑效力。為解釋這個發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。結(jié)果證明了當(dāng)疫苗抗原破傷風(fēng)類毒素與鞭毛蛋白一起施用于試驗(yàn)動物鼻腔時，所述鞭毛蛋白通過將信號傳遞給宿主細(xì)胞的TLR5以激活免疫系統(tǒng)而擴(kuò)大了疫苗效力，當(dāng)致死劑量的破傷風(fēng)毒素攻擊通過施用破傷風(fēng)毒素和鞭毛蛋白而免疫的小鼠時，所述鞭毛蛋白誘導(dǎo)了對毒素的完全的防御免疫，表明所述鞭毛蛋白具有優(yōu)異的粘膜疫苗佐劑效力(LeeSE,KimSY，JeongBC，KimYR，BaeSJ,AhnOS,LeeJJ，SongHC,KimJM，ChoyHE,ChungSS，Kweon麗，RheeJH.:Infect.Immun.74:694-702，2006)。在多種TLR激動劑中，刺激TLR5的鞭毛蛋白是一種不同于其他TLR激動劑(CpG-DNA、MLP(支原體脂肽))的蛋白質(zhì)組成。因而，可以合成特性可被持續(xù)控制的重組鞭毛蛋白，此外，可以構(gòu)建多種具有增強(qiáng)的TLR5刺激活性的重組融合蛋白。根據(jù)對鞭毛蛋白三維結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果，在鞭毛蛋白單體中極性氨基酸殘基和帶電荷氨基酸殘基與在其它單體中那些極性氨基酸殘基和帶電荷氨基酸殘基反應(yīng)，致使發(fā)生單體之間的軸向相互作用而形成聚合體，從而形成鞭毛蛋白的特征性絲狀體結(jié)構(gòu)(YonekuraK,Maki-YonekuraS,NambaK:Completeatomicmodelofthebacterialflagellarfilamentbyelectroncryomicroscopy.Nature.2003424(6949):643-50;SamateyFA,ImadaK,NagashimaS，VondervisztF，KumasakaT,YamamotoM,NambaK:Structureofthebacterialflagellarprotofilament禾口implicationsforaswitchforsupercoiling.Nature.2001410(6826):331-7)。根據(jù)Smith等的研究，TLR5不識別絲狀體類型的鞭毛蛋白聚合體，但識別鞭毛蛋白單體(SmithKD,Andersen-NissenE，HayashiF，StrobeK,BergmanMA，BarrettSL，CooksonBT，AderemA.TolI-like7receptor5recognizesaconservedsiteonflagellinrequiredforprotofilamentformation和bacterialmotility.NatImmunol.20034(12):1247-53)。在目前臨床應(yīng)用中使用的預(yù)防性和治療性疫苗(傳染病、自身免疫性疾病、過敏性疾病和癌癥的疫苗)中觀察到的共同問題是這些疫苗缺乏有效的可特異性地擴(kuò)大相關(guān)應(yīng)答的疫苗佐劑。因而，強(qiáng)烈地需要開發(fā)更安全和更有效力的疫苗佐劑。
發(fā)明內(nèi)容相應(yīng)地，本發(fā)明人通過改變預(yù)期參與軸向相互作用的氨基酸殘基而制備了創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白基因y/as的重組鞭毛蛋白突變體，該突變體可以抑制在鞭毛蛋白單體之間的軸向相互作用中涉及的極性電荷反應(yīng)，且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)制備的鞭毛蛋白突變體與現(xiàn)有的(野生型)鞭毛蛋白相比具有顯著增強(qiáng)的TLR5剌激活性，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的目的是提供具有增強(qiáng)的TLR5刺激活性的鞭毛蛋白突變體。本發(fā)明的另一目的是提供含有至少一種所述鞭毛蛋白突變體作為活性成分的疫苗佐劑。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了用于抑制在TLR5激動劑鞭毛蛋白中鞭毛蛋白單體之間相互作用的鞭毛蛋白突變體。本發(fā)明還提供含有至少一種所述鞭毛蛋白突變體作為活性成分的疫苗佐劑。在本發(fā)明中，通過提供與現(xiàn)有鞭毛蛋白相比具有增強(qiáng)的TLR5刺激活性的鞭毛蛋白突變體開發(fā)了改良的鞭毛蛋白疫苗佐劑，已發(fā)現(xiàn)該改良的鞭毛蛋白疫苗佐劑通過刺激TLR5顯示出有效的粘膜疫苗佐劑效力，如PCT國際專利公開文本No.WO2005/070455中所公開的。根據(jù)本發(fā)明的鞭毛蛋白突變體將被應(yīng)用于治療傳染病，自身免疫性疾病，過敏性疾病等等，此外在抗癌治療中，所述鞭毛蛋白突變體將提供連接基礎(chǔ)研究和臨床研究的重要環(huán)節(jié)。因而，本發(fā)明的鞭毛蛋白突變體應(yīng)用到多種疫苗制劑中會創(chuàng)造很高的增值價值。圖1顯示了沙門氏菌(&/mo"e〃a)鞭毛蛋白St-FliC、大腸桿菌鞭毛蛋白Ec-FliC和創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白Vv-FlaB之間的氨基酸同源性的比較，其中框中的序列為各菌株的鞭毛蛋白結(jié)構(gòu)域(SamateyFA，等人.，Structureofthebacterialflagellarprotofilament禾口implicationsforaswitchforsupercoiling.Nature.2001410(6826):331-7)。圖2是顯示在構(gòu)建本發(fā)明的鞭毛蛋白突變體過程中，在創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白基因flaB上誘導(dǎo)定點(diǎn)突變的策略的示意圖(SamateyFA，等人，Structureofthebacterialflagellarprotofilament禾卩implicationsforaswitchforsupercoiling.Nature.2001410(6826):331-7)。圖3和4顯示本發(fā)明的重組鞭毛蛋白突變體對水溶液中的鞭毛蛋白聚合的影響。圖5和6是顯示本發(fā)明鞭毛蛋白突變體的TLR刺激活性的測量結(jié)果的圖表。具體實(shí)施例方式下文將更為詳細(xì)地描述本發(fā)明。本發(fā)明涉及鞭毛蛋白突變體，該鞭毛蛋白突變體是通過點(diǎn)突變TLR5激動劑鞭毛蛋白的某些氨基酸而制備，以使鞭毛蛋白突變抑制鞭毛蛋白單體的多聚合作用，因而該鞭毛蛋白突變體表現(xiàn)出增強(qiáng)的TLR5刺激活性。本發(fā)明涉及SEQIDNO:2所示的鞭毛蛋白突變體(D70A)，其是通過將野生型創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB上第70位的天冬氨酸(D70)定點(diǎn)誘變成丙氨酸(A)而制備的，據(jù)分析所述鞭毛蛋白FlaB參與了TLR5激動劑鞭毛蛋白中鞭毛蛋白單體之間的軸向相互作用；SEQIDNO:4所示的鞭毛蛋白突變體(R93A)，其是通過將第93位上的精氨酸(R93)定點(diǎn)誘變成丙氨酸(A)而制備的；SEQIDNO:6所示的鞭毛蛋白突變體(L97W)，其是通過將第97位上的亮氨酸(L97)定點(diǎn)誘變成色氨酸(W)而制備的；SEQIDNO:8所示的鞭毛蛋白突變體(N101A),其是通過將第101位上的天冬酰胺(N101)定點(diǎn)誘變成丙氨酸(A)而制備的；SEQIDNO:10所示的鞭毛蛋白突變體(S103W)，其是通過將第103位上的絲氨酸(S103)定點(diǎn)誘變成色氨酸(W)而制備的；SEQIDNO:12所示的鞭毛蛋白突變體(E108A)，其是通過將第108位上的谷氨酸(E108)定點(diǎn)誘變成丙氨酸(A)而制備的；SEQIDNO:14所示的鞭毛蛋白突變體(N135D)，其是通過將第135位上的天冬酰胺(N135)定點(diǎn)誘變成天冬氨酸(D)而制備的；SEQIDNO:16所示的鞭毛蛋白突變體(A151W)，其是通過將第151位上的丙氨酸(A151)定點(diǎn)誘變成色氨酸(W)而制備的；SEQIDNO:18所示的鞭毛蛋白突變體(N153W)，其是通過將第153位上的天冬酰胺(N153)定點(diǎn)誘變成色氨酸(W)而制備的；和SEQIDNO:20所示的鞭毛蛋白突變體(V291W)，其是通過將第291位上的纈氨酸(V291)定點(diǎn)誘變成色氨酸(W)而制備的。此外，在鞭毛蛋白突變體之中，具有兩個或多個氨基酸取代的鞭毛蛋白突變體也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，其實(shí)例可包括SEQIDNO:44所示的鞭毛蛋白突變體(D70A/N135D)，其是通過將野生型創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第70位上的天冬氨酸(D70)定點(diǎn)誘變成丙氨酸(A)并將第135位上的天冬酰胺(N135)定點(diǎn)誘變成天冬氨酸(D)而制備的，但本發(fā)明的范圍不限于此。本文中術(shù)語"鞭毛蛋白"指構(gòu)成決定細(xì)菌運(yùn)動性的鞭毛的單個分子。10本發(fā)明所提供的鞭毛蛋白突變體具有顯著增強(qiáng)的TLR5刺激活性，而這個現(xiàn)象是由于所述鞭毛蛋白突變體與現(xiàn)有鞭毛蛋白突變體相比較顯著地降低了鞭毛蛋白的多聚合作用，從而抑制鞭毛蛋白聚合。相應(yīng)地，根據(jù)本發(fā)明制備的具有顯著增強(qiáng)的TLR5刺激活性的鞭毛蛋白突變體可提供更有效的TLR激動劑以取代現(xiàn)有的鞭毛蛋白，從而提供與現(xiàn)有的鞭毛蛋白相比具有增強(qiáng)的效力的疫苗佐劑。證明本發(fā)明的鞭毛蛋白突變體具有增強(qiáng)的TLR5刺激活性的方法包括以下步驟1)制備SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44所示的鞭毛蛋白突變體；2)確認(rèn)鞭毛蛋白突變體抑制在水溶液中鞭毛蛋白的聚合；和3)確認(rèn)在大腸桿菌中誘導(dǎo)的各重組鞭毛蛋白突變體的TLR5激活作用。實(shí)施例下文中將參照實(shí)施例和測試實(shí)施例更為詳細(xì)地描述本發(fā)明。但應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例和測試實(shí)施例僅是舉例說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所用菌株和質(zhì)粒的特征在下表1中總結(jié)。在實(shí)施例和測試實(shí)施例中顯示了每種鞭毛蛋白突變體的制備方法和各鞭毛蛋白突變體的具體特性。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>各菌株的培養(yǎng)和保存以下實(shí)施例和測試實(shí)施例所用的大腸桿菌在LuriaBertani培養(yǎng)基(DifcoCo.)中培養(yǎng)。該培養(yǎng)菌株于30M甘油中保存在-8(TC冰箱。實(shí)施例l:通過定點(diǎn)誘變制備重組鞭毛蛋白突變體根據(jù)以前報導(dǎo)的沙門氏菌鞭毛蛋白三維結(jié)構(gòu)的分析數(shù)據(jù)(YonekuraK,Maki-YonekuraS，NambaK:Completeatomicmodelofthebacterialflagellarfilamentbyelectroncryomicroscopy.Nature.2003424(6949》643-50;SamateyFA，ImadaK,NagashimaS，VondervisztF，KumasakaT，YamamotoM，NambaK:Structureofthebacterialflagellarprotofilament禾口implicationsforaswitchforsupercoiling.Nature.2001410(6826):331-7)，和本發(fā)明人進(jìn)行的生物信息學(xué)分析，創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB單體之間軸向相互作用所需要的氨基酸殘基如下。即分別為參與了軸向相互作用的各單體的上亞基(uppersubimit)第70位的天冬氨酸(D70)、上亞基第135位的天冬酰胺(D135)、和上亞基第153位的丙氨酸(A151)，通過分別與各單體的下亞基(lowersubunit)第10020位的天冬酰胺(N100)、下亞基第108位的谷氨酸(E108)、下亞基第93位的精氨酸(R93)和下亞基第292位的丙氨酸(A292)的極性電荷反應(yīng)而形成多聚體。即在以下氨基酸殘基之間發(fā)生極性電荷反應(yīng)上鞭毛蛋白D70與下鞭毛蛋白N100;上鞭毛蛋白N135與下鞭毛蛋白E107;上鞭毛蛋白A151與下鞭毛蛋白R93;和上鞭毛蛋白N153與下鞭毛蛋白A292。在本發(fā)明中，通過對據(jù)分析參與鞭毛蛋白亞基之間軸向相互作用的以下氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)誘變而制備以下鞭毛蛋白突變體SEQIDNO:2所示的鞭毛蛋白突變體(D70A)，其是通過將第70位上的天冬氨酸(D70)定點(diǎn)誘變成丙氨酸(A)而制備的；SEQIDNO:4所示的鞭毛蛋白突變體(R93A)，其是通過將第93位上的精氨酸(R93)定點(diǎn)誘變成丙氨酸(A)而制備的；SEQIDNO:8所示的鞭毛蛋白突變體(N101A),其是通過將第101位上的天冬酰胺(N101)定點(diǎn)誘變成丙氨酸(A)而制備的；SEQIDNO:12所示的鞭毛蛋白突變體(E108A)，其是通過將第108位上的谷氨酸(E108)定點(diǎn)誘變成丙氨酸(A)而制備的；SEQIDNO:14所示的鞭毛蛋白突變體(N135D)，其是通過將第135位上的天冬酰胺(N135)定點(diǎn)誘變成天冬氨酸(D)而制備的；SEQIDNO:16所示的鞭毛蛋白突變體(A151W)，其是通過將第151位上的丙氨酸(A151)定點(diǎn)誘變成色氨酸(W)而制備的；和SEQIDNO:18所示的鞭毛蛋白突變體(N153W)，其是通過將第153位上的天冬酰胺(N153)定點(diǎn)誘變成色氨酸(W)而制備的。然而，據(jù)分析參與了鞭毛蛋白單體之間的軸向相互作用的第292位上的丙氨酸(A292)不用于構(gòu)建突變體，因?yàn)榧词乖谠摪被釟埢煌蛔兒筝S向相互作用也不會發(fā)生改變。此外，通過對推測參與鞭毛蛋白單體之間的軸向相互作用的以下氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)誘變來制備以下突變體SEQIDNO:6所示的鞭毛蛋白突變體(L97W)，其是通過將第97位上的亮氨酸(L97)定點(diǎn)誘變成色氨酸(W)13而制備的；SEQIDNO:IO所示的鞭毛蛋白突變體(S103W)，其是通過將第103位上的絲氨酸(S103)定點(diǎn)誘變成色氨酸(W)而制備的；和SEQIDNO:20所示的鞭毛蛋白突變體(V291W)，其是通過將第291位上的纈氨酸(V291)定點(diǎn)誘變成色氨酸(W)而制備的。首先，為了獲得用于定點(diǎn)誘變的DNA模板，采用SEQIDNO.21所示的PCR引物FlaB畫V5(5'-gcggccgcatggcagtgaatgtaaatgtaaatacaaac國3';劃線部分用于克隆的A^I限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn))和SEQIDNO:22所示的PCR引物FlaB隱V4(5'-cccggggcctagtagacttagcgctga-3':劃線部分用于克隆的5Vwal限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn))，通過PCR擴(kuò)增含有基因ORF的1,142-bpDNA片段。用引物FlaB-V5和FlaB-V4在以下條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增95。C起始變性1分鐘，然后95°C30秒變性、7(TC退火30秒和72'C延伸1分鐘進(jìn)行30個循環(huán)，然后在72"C最后延伸IO分鐘。擴(kuò)增的yZ"SDNA片段被克隆到PCR2.1-TOPO克隆載體(InvitrogenCo.)中，制得的載體稱為"pCMM270"。pCMM270質(zhì)粒作為DNA模板用于后續(xù)的定點(diǎn)誘變。用于構(gòu)建創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白基因/"B定點(diǎn)突變體的PCR條件和克隆的質(zhì)粒在下面表2中總結(jié)。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>采用如上表2所示的各引物對、以pCMM270作為PCR模板、和使用保真尸/w聚合酶(StratageneCo.)按供應(yīng)商的說明進(jìn)行PCR反應(yīng)來合成突變鏈。在以下條件下進(jìn)行各PCR反應(yīng)95'C起始變性45秒，然后95'C變性45秒、在表2所示溫度下退火1分鐘和68X:延伸10分鐘進(jìn)行16個循環(huán)，之然后在68。C最后延伸IO分鐘。將SEQIDN0:1、3、5、7、9、11、13、15、17和19的各擴(kuò)增的定點(diǎn)突變y^BDNAs克隆到PCR2.1-TOPO克隆載體中，得到的載體稱為"pCMM272"、"pCMM281"、"pCMM282"、"pCMM283"、"pCMM284"、"pCMM285"、"pCMM273"、"pCMM286"、"pCMM287"和"pCMM288"(表2)。為制備SEQIDNO:44所示的D70A/N135D雙定點(diǎn)突變鞭毛蛋白D70A/N135D，以含DNA的pCMM273作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。用SEQIDNO:23所示的PCR引物FlaB-SDl、SEQIDNO:24所示的PCR引物FlaB-SD2和保真尸/"聚合酶(StratageneCo.)按供應(yīng)商的說明進(jìn)行PCR來合成突變鏈(D70A)。在以下條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)95。C起始變性45秒，然后95'C變性45秒、在63'C退火1分鐘和68。C延伸10分鐘進(jìn)行16個循環(huán)，然后在68。C最后延伸10分鐘。SEQIDNO:43所示的擴(kuò)增的D70A/N135D雙定點(diǎn)突變y/a萬DNA稱為"pCMM274"。以限制性內(nèi)切酶A^I和Sm"I消化SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17和19的含有定點(diǎn)突變^7a5基因(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)的各DNA片段，然后克隆到以相同限制性內(nèi)切酶消化的pTYB12質(zhì)粒(NewEnglandBiolabs)中。得到的質(zhì)粒分別稱為"pCMM276"、"pCMM291'，、"pCMM292"、"pCMM293"、"pCMM293"、"pCMM294"、"pCMM295"、"pCMM277"、"pCMM296"、"pCMM297"、"pCMM298"和"pCMM278"。這些質(zhì)粒被電轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌ER2566中，并向其中添加0.5mM的5-溴』引哚-3-氯-異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)以誘導(dǎo)突變鞭毛蛋白基因的表達(dá)。使用1，4-二硫蘇糖醇(1,4-DTT)和幾丁質(zhì)磁珠柱按供應(yīng)商的說明從內(nèi)含肽融合蛋白中獲得點(diǎn)突變鞭毛蛋白(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)。使用之前，使用AffinityPakDetoxiGel內(nèi)毒素消除凝膠(Pirece)去除在分離的點(diǎn)突變蛋白中含有的內(nèi)毒素。使用Superdex120柱(AKTA-Prime,Amersham)對分離的重組蛋白進(jìn)行凝膠過濾，從而純化高純度的SEQIDN0:2，4，6，8，10，12，14，16，18，20和44所示的重組鞭毛蛋白突變體。測試實(shí)施例1:重組鞭毛蛋白突變體的產(chǎn)生和其在水溶液中的生物化學(xué)特性為了制備重組鞭毛蛋白突變體，SEQIDNO:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19和43所示的編碼鞭毛蛋白突變體的每個基因都被克隆到pTYB12質(zhì)粒中，然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大腸桿菌ER2566中。在培養(yǎng)基中添加0.3mMIPTG(異丙基-!3-D-l-硫代半乳糖苷)以誘導(dǎo)重組鞭毛蛋白突變體的產(chǎn)生，然后通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和天然凝膠電泳來分析得到的蛋白。分析結(jié)果如圖3和4所示。圖3和4顯示了野生型鞭毛蛋白(FlaB)和突變鞭毛蛋白FlaB的SDS-PAGE分析結(jié)果，圖中顯示SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44的點(diǎn)突變鞭毛蛋白(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70雄135D)和野生型鞭毛蛋白(FlaB)都在41.5kDa處有主要條帶。在天然凝膠電泳結(jié)果中，可以觀察到野生型FlaB蛋白形成了巨大的多聚體，使得大部分蛋白保留在濃縮膠中，而進(jìn)入分離膠中的一些FlaB蛋白分布在66kDa和140kDa之間。然而，本發(fā)明的點(diǎn)突變鞭毛蛋白(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)形成了大約140kDa的多聚體。上述結(jié)果表明野生型FlaB蛋白在水溶液中形成了巨大的多聚體，但本發(fā)明的點(diǎn)突變鞭毛蛋白突變體(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)形成的多聚體小于野生型鞭毛蛋白形成的多聚體。因此，可以確定SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44所示的本發(fā)明鞭毛蛋白突變體(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)抑制了鞭毛蛋白的聚合。測試實(shí)施例2:鞭毛蛋白突變體的TLR5刺激活性為了測量參與TLR5-介導(dǎo)信號的NF-KB的轉(zhuǎn)錄活性，以確定野生型FlaB禾口SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44所示的本發(fā)明鞭毛蛋白突變體的TLR5刺激活性，按1x105細(xì)胞/孔的密度將293T細(xì)胞分種在24孔板的每個孔中并培養(yǎng)過夜。然后，使用FuGENE6(Roche)將可使轉(zhuǎn)錄活性被觀測到的報告質(zhì)粒NF-kB-Luc(由Jeong-MokKim教授，InstituteofBiomedicalScience,HanyangUniversityCollegeofMedicine,韓國提供)、克隆TLR5基因的p3xFlag-hTLR5質(zhì)粒(由Dr.StevenB.Mizel，D印artmentsofMicrobiologyandImmunology,WakeForestUniversitySchoolofMedicine,USA提供)和P-半乳糖苷表達(dá)質(zhì)粒(Clontech)同時導(dǎo)入細(xì)胞中。細(xì)胞再培養(yǎng)24小時之后，更換新鮮培養(yǎng)液，并以實(shí)施例l分離的SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44所示的鞭毛蛋白突變體(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W禾口D70A/N135D)處理細(xì)胞18-24小時。然后，通過用發(fā)光計(Berthold)測量熒光素酶活性來檢測細(xì)胞中NF-kB的轉(zhuǎn)錄，測量結(jié)果在圖5和6中顯示。如圖5和6所示，以20ng/ml野生型FlaB蛋白處理的組與僅以磷酸緩沖液處理的對照組相比，TLR5介導(dǎo)NF-kB轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)了約6.6倍。而以20ng/ml的每各重組鞭毛蛋白FlaB突變體(D70A、R93A、L97W、N101A、S103W、E108A、N135D、A151W、N153W、V291W和D70A/N135D)處理的組與僅以磷酸緩沖液處理的對照組相比，TLR5介導(dǎo)的NF-kB轉(zhuǎn)錄活性分別增強(qiáng)了約24.6倍、14倍、25倍、22.6倍、23.7倍、21倍、21.7倍、22.5倍、24.5倍、16.6倍和14.9倍。序列表文本SEQIDNO:l和2是鞭毛蛋白突變體(D70A)的基因和氨基酸序列，該鞭毛蛋白突變體是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第70位上的天冬氨酸(D70)定點(diǎn)誘變成丙氨酸(A)而制備的。SEQIDNO:3和4是鞭毛蛋白突變體(R93A)的基因和氨基酸序列，該鞭毛蛋白突變體是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第93位上的精氨酸(R93)定點(diǎn)誘變成丙氨酸(A)而制備的。SEQIDNO:5和6是鞭毛蛋白突變體(L97W)的基因和氨基酸序列，該鞭毛蛋白突變體是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第97位上的亮氨酸(L97)定點(diǎn)誘變成色氨酸(W)而制備的。SEQIDNO:7和8是鞭毛蛋白突變體(N101A)的基因和氨基酸序列，該鞭毛蛋白突變體是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第101位上的天冬酰胺(N101)定點(diǎn)誘變成丙氨酸(A)而制備的。SEQIDNO:9和10是鞭毛蛋白突變體(S103W)的基因和氨基酸序列，該鞭毛蛋白突變體是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第103位上的絲氨酸(S103)定點(diǎn)誘變成色氨酸(W)而制備的。SEQIDNO:ll禾卩12是鞭毛蛋白突變體(E108A)的基因和氨基酸序列，該鞭毛蛋白突變體是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第108位上的谷氨酸(E108)定點(diǎn)誘變成丙氨酸(A)而制備的。SEQIDNO:13和14是鞭毛蛋白突變體(N135D)的基因和氨基酸序列，該鞭毛蛋白突變體是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第135位上的天冬酰胺(N135)定點(diǎn)誘變成天冬氨酸(D)而制備的。SEQIDNO:15禾卩16是鞭毛蛋白突變體(A151W)的基因和氨基酸序列，該鞭毛蛋白突變體是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第151位上的丙氨酸(A151)定點(diǎn)誘變成色氨酸(W)而制備的。SEQIDNO:17和18是鞭毛蛋白突變體(N153W)的基因和氨基酸序列，該鞭毛蛋白突變體是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第153位上的天冬酰胺(N153)定點(diǎn)誘變成色氨酸(W)而制備的。SEQIDNO:19和20是鞭毛蛋白突變體(V291W)的基因和氨基酸序列,該鞭毛蛋白突變體是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第291位上的纈氨酸(V291)定點(diǎn)突變成色氨酸(W)而制備的。SEQIDNO:21-42是用于SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44所示的鞭毛蛋白突變體的引物序列。SEQIDNO:43和44是鞭毛蛋白突變體(D70A/N135D)的基因和氨基酸序列，該鞭毛蛋白突變體通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第70位上的天冬氨酸(D70)定點(diǎn)突變成丙氨酸(A)并將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第135位上的天冬酰胺(N135)定點(diǎn)誘變成天冬氨酸(D)而制備的。權(quán)利要求1、一種創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白突變體，該鞭毛蛋白突變體具有增強(qiáng)的toll樣受體(TLR-5)刺激活性。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:2所示的鞭毛蛋白突變體(D70A)，該鞭毛蛋白突變體(D70A)是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第70位上的天冬氨酸(D70)定點(diǎn)誘變成丙氨酸(A)而制備的。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:4所示的鞭毛蛋白突變體(R93A)，該鞭毛蛋白突變體(R93A)是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第93位上的精氨酸(R93)定點(diǎn)誘變成丙氨酸(A)而制備的。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:6所示的鞭毛蛋白突變體(L97W)，該鞭毛蛋白突變體(L97W)是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第97位上的亮氨酸(L97)定點(diǎn)誘變成色氨酸(W)而制備的。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:8所示的鞭毛蛋白突變體(N101A)，該鞭毛蛋白突變體(N101A)是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第101位上的天冬酰胺(N101)定點(diǎn)誘變成丙氨酸(A)而制備的。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:10所示的鞭毛蛋白突變體(S103W)，該鞭毛蛋白突變體(S103W)是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第103位上的絲氨酸(S103)定點(diǎn)誘變成色氨酸(W)而制備的。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:12所示的鞭毛蛋白突變體(E108A)，該鞭毛蛋白突變體(E108A)是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第108位上的谷氨酸(E108)定點(diǎn)誘變成丙氨酸(A)而制備的。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:14所示的鞭毛蛋白突變體(N135D)，該鞭毛蛋白突變體(N135D)是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第135位上的天冬酰胺(N135)定點(diǎn)誘變成天冬氨酸(D)而制備的。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:16所示的鞭毛蛋白突變體(A151W)，該鞭毛蛋白突變體(A151W)是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第151位上的丙氨酸(A151)定點(diǎn)誘變成色氨酸(W)而制備的。10、根據(jù)權(quán)利要求l所述的創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:18所示的鞭毛蛋白突變體(N153W)，該鞭毛蛋白突變體(N153W)是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第153位上的天冬酰胺(N153)定點(diǎn)誘變成色氨酸(W)而制備的。11、根據(jù)權(quán)利要求l所述的創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:20所示的鞭毛蛋白突變體(V291W)，該鞭毛蛋白突變體(V291W)是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第291位上的纈氨酸(V291)定點(diǎn)誘變成色氨酸(W)而制備的。12、根據(jù)權(quán)利要求l所述的創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白突變體，其中，該鞭毛蛋白突變體是SEQIDNO:44所示的鞭毛蛋白突變體(D70A/N135D)，該鞭毛蛋白突變體(D70A/N135D)是通過將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第70位上的天冬氨酸(D70)定點(diǎn)誘變成丙氨酸(A)并且將創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白FlaB第135位上的天冬酰胺(N135)定點(diǎn)誘變成天冬氨酸(D)而制備的。13、一種疫苗佐劑，其特征在于，該疫苗佐劑含有至少一種選自由SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44所組成的組中的鞭毛蛋白突變體作為活性成分。14、鞭毛蛋白突變體用于刺激toll樣受體-5活性的用途，其中，所述鞭毛蛋白突變體為至少一種選自由SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和44所組成的組中的鞭毛蛋白突變體。全文摘要本發(fā)明公開了具有增強(qiáng)的toll樣受體-5(下文稱為“TLR5”)刺激活性的鞭毛蛋白突變體。更具體而言，本發(fā)明公開了由點(diǎn)突變TRL5激動劑鞭毛蛋白的某些氨基酸以增強(qiáng)鞭毛蛋白的TRL-刺激活性而制備的鞭毛蛋白突變體。文檔編號C07K14/255GK101622272SQ200880004041公開日2010年1月6日申請日期2008年2月5日優(yōu)先權(quán)日2007年2月9日發(fā)明者李施恩,李浚行,金守永申請人:全南大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)