一種新的吡喃酮類(lèi)化合物及其制備方法和應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種新的吡喃酮類(lèi)化合物及其制備方法和應(yīng)用，所述化合物是由Streptomyces sp.1H?GS5經(jīng)培養(yǎng)和液體發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾后，用甲醇提取，乙酸乙酯萃取，濃縮后硅膠柱層析、凝膠層析及C?18柱層析所得到的化合物。本發(fā)明的新化合物具有強(qiáng)的人肺癌細(xì)胞A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT?116和人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞增殖抑制活性，對(duì)我國(guó)醫(yī)藥的開(kāi)發(fā)研究具有重要意義。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
-種新的郵喃酬類(lèi)化合物及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明設(shè)及一種化喃酬類(lèi)化合物及其制備方法和在抗腫瘤方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[000^ 壯觀(guān)鏈菌素（Spectinabilin)是1976年Kakinuma等人從±壤鏈霉菌 (Str邱tomyces spec化bi 1 iS)中分離得到的細(xì)胞毒素，并于1994年申請(qǐng)了壯觀(guān)鏈菌素的專(zhuān) 利，保護(hù)了其制備方法及作為細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑的用途(US005360918A)。其中壯觀(guān)鏈菌素的 化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0003]
[0004] S化eptomyces sp. 1H-GS5是一株從日本弓背蟻頭部分離得到的產(chǎn)壯觀(guān)鏈菌素的 鏈霉菌巧IJ雙鶴等，2015)。該菌株在燕麥瓊脂培養(yǎng)基上形成橘紅色的氣生菌絲，3天后，在氣 生菌絲上形成直鏈抱子，抱子表面光滑。該菌株的16S rRNA在Genbank上的登錄號(hào)為 KP784764,與其相似性最高的菌株為產(chǎn)壯觀(guān)霉素的Streptomyces spectabilis NBRC 13424,相似性為99.93 %。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種新的化喃酬類(lèi)化合物，其分子結(jié)構(gòu)如下：
[0006；
[0007]本發(fā)明還提供了一種上述化喃酬類(lèi)化合物的制備方法，是WStreptomyces SP. 1H-GS5為出發(fā)菌株，發(fā)酵、分離純化生產(chǎn)上述化合物。
[000引所述制備方法，步驟如下：
[0009] 1)發(fā)酵培養(yǎng)Str邱tomyces sp. 1H-GS5,收集發(fā)酵液；
[0010] 2)發(fā)酵液經(jīng)100~200目篩網(wǎng)過(guò)濾后，濾渣用甲醇提??；
[0011] 3)將得到的浸提液濃縮至一定體積后用乙酸乙醋萃取，將萃取液濃縮后依次進(jìn)行 硅膠柱層析、凝膠層析、C-18柱層析，層析后得到該化合物。
[0012]本發(fā)明的化合物是采用如下具體方法來(lái)制備的：
[OOU] 1、發(fā)酵
[0014] (1)發(fā)酵菌種:發(fā)酵菌種是壯觀(guān)鏈菌素產(chǎn)生菌(Streptomyces SP.1H-GS5)，由東北 農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化工實(shí)驗(yàn)室提供，保藏于"中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中屯、"，保藏號(hào)為： CGMCC No.4.7313。
[00巧](2)斜面培養(yǎng):培養(yǎng)基組成按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì):可溶性淀粉10%-15%，酵母抽提粉2%- 3%，KN03l%-2%，瓊脂粉20%-25%，pH7.0-7.2，用去離子水配制，于12^C下滅菌20- 25min。接菌后置于28°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4-5d。
[0016] (3)種子培養(yǎng):種子培養(yǎng)基組成按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì):葡萄糖20%-25%，黃豆餅粉15%- 20 %，酵母水解物5%-10%，pH 7.0-7.2，用蒸饋水配制，于12rC下滅菌20min。向菌種斜面 上加入IOml無(wú)菌水，用已滅菌的接種環(huán)刮下抱子制成抱子懸液，使其濃度為107- IO8C. f.u.ml-i。然后取2ml抱子懸液接種于種子培養(yǎng)搖瓶中，種子搖瓶裝液量為25ml/ 250ml，置于250巧m旋轉(zhuǎn)式搖床，28 °C培養(yǎng)46-5化。
[0017] (4)發(fā)酵:發(fā)酵培養(yǎng)基組成按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì):玉米淀粉10%-15%，黃豆餅粉 棉巧餅粉 1%-2%，a-淀粉酶0.02%-0.03% ,NaCl 0.1%-0.2%，K2HP04 0.2%-0.3%， MgS〇4*7H2〇 0.1%-〇.15%，CaC〇3 0.7%-1.0%，環(huán)己燒簇酸0.1%-0.15%，pH 7.0-7.2， 用蒸饋水配制，于12rC下滅菌20min。按8%(V/V)接種量，將種子液接入到IL發(fā)酵搖瓶中， 發(fā)酵搖瓶的裝液量為lOOml/lL。置于25化pm旋轉(zhuǎn)式搖床，28°C發(fā)酵培養(yǎng)6-7d。
[001引 2、發(fā)酵液處理
[0019] (1)發(fā)酵液經(jīng)100~200目篩網(wǎng)過(guò)濾后，濾渣用3-4倍體積甲醇提取。
[0020] (2)將得到的浸提液濃縮至一定體積后用等體積乙酸乙醋萃取3-4次，將萃取液濃 縮后依次進(jìn)行硅膠柱層析、凝膠層析、C-18柱層析，層析后得到該化合物。
[0021] 所述硅膠柱層析用到的填料是100~200目的硅膠，流動(dòng)相為體積比石油酸:丙酬 =100:0-50: 50進(jìn)行梯度洗脫(流速為50-100ml/min，每個(gè)梯度持續(xù)30-40min，每個(gè)梯度收 集3-化），收集洗脫液，薄層層析(TLC)檢測(cè)合并相同組分。
[0022] 所述凝膠層析用LH-20凝膠，16〇山(：肥13 = 1:1等度洗脫，流速為1〇-2〇1111/111111，收 集洗脫液，薄層層析(TLC)檢測(cè)合并相同組分。
[0023] 所述C-18柱層析，其中使用充滿(mǎn)了 C-18反相填料，并且使用的混合溶劑為乙臘 70 % -90 % (V/V)的水溶液，甲醇的水溶液70 % -90 % (V/V)或者甲醇40 % -45 % (V/V)、乙臘 40 %-45 % (V/V)混合有機(jī)溶劑的水溶液等度洗脫，流速為1.0-2. OmL/min。，收集保留時(shí)間 為42.7min的峰得到新化合物。
[0024] 本發(fā)明提供的化合物具有抑制腫瘤的活性，可W用作細(xì)胞抑制劑。
[0025] 有益效果:采用本發(fā)明的方法得到的化合物具有很強(qiáng)的抑制肝癌、肺癌W及結(jié)腸 癌的細(xì)胞活性，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)我國(guó)醫(yī)藥的開(kāi)發(fā)研究具有重要意義。
[0026] 本發(fā)明所設(shè)及的新化喃酬類(lèi)化合物為壯觀(guān)鏈菌素衍生物，其抗腫瘤活性顯著高于 壯觀(guān)鏈菌素。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 實(shí)施實(shí)例1
[002引1、化合物制備:發(fā)酵
[0029] (1)斜面培養(yǎng)：培養(yǎng)基組成：可溶性淀粉10 %，酵母抽提粉2%，KN03 1%，瓊脂粉 20%，pH 7.〇-7.2，用去離子水配制，于121°[下滅菌20111；[]1。
[0030] 接菌后置于28°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4-5d。
[00川 （2)種子培養(yǎng):種子培養(yǎng)基組成：葡萄糖20 %，黃豆餅粉15 %，酵母水解物5 %，pH 7.0- 7.2，用蒸饋水配制，于12TC下滅菌20min。
[0032] 向菌種斜面上加入IOml無(wú)菌水，用已滅菌的接種環(huán)刮下抱子制成抱子懸液，使其 濃度為IO7C. f.u.mri。然后取2ml抱子懸液接種于種子培養(yǎng)搖瓶中，種子搖瓶裝液量為 25ml/250ml，置于250巧m旋轉(zhuǎn)式搖床，28°C培養(yǎng)46h。
[0033] (3)發(fā)酵:發(fā)酵培養(yǎng)基組成：玉米淀粉10%，黃豆餅粉1%，棉巧餅粉l%，a-淀粉酶 0.02，化C10.1%，K抽P04 0.2%，MgS04?7此0 0.1%，CaC03 0.7%，環(huán)己燒簇酸0.1%，pH 7.0- 7.2，用蒸饋水配制，于12TC下滅菌20min。
[0034] 按8% (V/V)接種量，將種子液接入到IL發(fā)酵搖瓶中，發(fā)酵搖瓶的裝液量為lOOml/ 1L。置于25化pm旋轉(zhuǎn)式搖床，28 °C發(fā)酵培養(yǎng)6d。
[0035] 2、化合物分離
[0036] 3化發(fā)酵液經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾得到菌絲體濾餅化。濾餅用去離子水洗后再用IOL工 業(yè)甲醇浸泡過(guò)夜，過(guò)濾得甲醇提取液。所得提取液在50°C減壓濃縮去除甲醇相直至剩余約 2L，然后用等體積乙酸乙醋分別萃取=次得乙酸乙醋萃取液，萃取液在減壓條件下濃縮至 干，得到25g油狀物質(zhì)。
[0037] 將所得的油狀物質(zhì)上硅膠柱(粒徑100~200目）進(jìn)行層析，用石油酸:丙酬= 100: 0-50:50(V/V)進(jìn)行梯度洗脫，50ml/min，收集洗脫液，薄層層析(TLC)檢測(cè)合并相同組分，得 到4個(gè)組分（1-4)。將組分1經(jīng)凝膠LH-20柱層析，Me0H:CHCl3 = l:l等度洗脫，流速為20ml/ min,收集洗脫液，薄層層析(TLC)檢測(cè)合并相同組分，得到組分1-1，組分1-1經(jīng)HPLC進(jìn)一步 分離純化，得到目的產(chǎn)物（15.6mg) dHPLC條件如下：
[003引液相系統(tǒng):Agilent 1100半制備高壓液相色譜儀
[0039] 色譜柱= ZORBAX SB-C18(250mm*9.4mm)
[0040] 洗脫劑：甲醇/乙臘/水=4:4:2(V/V/V)流速:1.5mL/min [0041 ]檢測(cè)波長(zhǎng):A = 254nm
[0042] 收集保留時(shí)間為42.7min的峰得到新化合物
[0043] 通過(guò)ID和2D NMR、MS等波譜分析確定該新化合物的結(jié)構(gòu)式為：
[004
[0045] 3、結(jié)構(gòu)鑒定
[0046] 性狀:黃色油狀物質(zhì)
[0047]溶解性:易溶解于氯仿、丙酬、甲醇，不溶于水 [004 引分子式:C28H33NO5
[0049] ESIMS m/z:464.2481[M+扣+
[0050] UV Amax化tOH)nm(loge):258(3.96),366(3.83)
[0051] IR Vmax 1651(unsat.C = 0)，1591(C = C)，1515(N〇2)，1338(N〇2)，856(geminal ar
[0052] Ih NMR(CDCl3,400MHz)和 13〇 NMR(CDCl3,100MHz)見(jiàn)表1。
[00日3] 擊1去（/心厶編左/^n/^l。rh的去女7：獻(xiàn)來(lái)/7'~1：臣/^烏*5並/mMMUn節(jié)巧*5並 1 MMMUn、
[0化4]
[0化5]
[0056] 4、抗腫瘤活性研究
[0057] CCK-8法測(cè)定人肺癌細(xì)胞A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞肥1'-116和人肝癌細(xì)胞化962細(xì)胞增 殖抑制率：
[0058] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺癌細(xì)胞A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116和人肝癌細(xì)胞化pG2,分 別用0.25%膜蛋白酶消化后用DMEM培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸浮液；W每孔1.OX IO4個(gè)細(xì)胞接 種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積90iil。將培養(yǎng)板移入C〇2培養(yǎng)箱中，在37°C，5%C02及飽和濕度 條件下，靜置培養(yǎng)4小時(shí)后，分別加入不同終濃度的壯觀(guān)鏈菌素和新化合物藥物IOiil，梯度 分別為lOOug/ml、50]ig/ml、2扣g/ml、12.5]ig/ml、6.25]ig/ml、3.12]ig/ml、1.56]ig/ml、0.7祉 g/ml、0.39iig/ml、0.19iig/ml，每個(gè)組2重復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，加入IOiil的 CCK-8試劑，37°C解育2小時(shí)，測(cè)定490nm吸光度，同時(shí)設(shè)W腫瘤細(xì)胞、藥物和空白培養(yǎng)基為對(duì) 照。通過(guò)測(cè)得的吸光度值，計(jì)算出藥物對(duì)相應(yīng)腫瘤細(xì)胞的抑制率：
[0059] 腫瘤抑制率=(OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組)/(00對(duì)照組-OD空白組）X 100%
[0060] 結(jié)果見(jiàn)表2。
[0061 ] 親2,新化合物對(duì)3株腫瘤細(xì)脯的抑制化巧 [0062]
[0063] 頭粒化明，軌化令、倒具巧化化挪鎖菌累史強(qiáng)的抑制人帥絕細(xì)MAMy、人結(jié)脅絕細(xì) 胞肥T-116和人肝癌細(xì)胞化pG2增殖活性。
[0064] 實(shí)施實(shí)例2
[0065] 1、化合物制備:發(fā)酵
[0066] (1)斜面培養(yǎng)：培養(yǎng)基組成：可溶性淀粉15 %，酵母抽提粉3 %，KN03 2 %，瓊脂粉 25%，pH 7.4，用去離子水配制，于121°(：下滅菌25111111。接菌后置于28°(：培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5(1。
[0067] (2)種子培養(yǎng):種子培養(yǎng)基組成：葡萄糖25%，黃豆餅粉20%，酵母水解物10%，pH 7.4，用蒸饋水配制，于121°[下滅菌25111；[]1。
[0068] 向菌種斜面上加入15ml無(wú)菌水，用已滅菌的接種環(huán)刮下抱子制成抱子懸液，使其 濃度為IO8C. f.u.mri。然后取3ml抱子懸液接種于種子培養(yǎng)搖瓶中，種子搖瓶裝液量為 40ml/250ml，置于250巧m旋轉(zhuǎn)式搖床，28°C培養(yǎng)72h。
[0069] (3)發(fā)酵:發(fā)酵培養(yǎng)基組成：玉米淀粉15%，黃豆餅粉2%，棉巧餅粉2%，a-淀粉酶 0.03%，船(：10.2%，1(2冊(cè)04 0.3%，]\%504*7出0 0.15%，(：曰(：03 1.0%，環(huán)己燒簇酸0.15%， pH 7.4，用蒸饋水配制，于121°[下滅菌25111；[]1。
[0070] 按10 % (V/V)接種量，將種子液接入到IL發(fā)酵搖瓶中，發(fā)酵搖瓶的裝液量為200ml/ 1L。置于25化pm旋轉(zhuǎn)式搖床，28 °C發(fā)酵培養(yǎng)7d。
[0071] 2、化合物分離
[0072] 3化發(fā)酵液經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾得到菌絲體濾餅3.化。濾餅用去離子水洗后再用1化 工業(yè)甲醇浸泡過(guò)夜，過(guò)濾得甲醇提取液。所得提取液在50°C減壓濃縮去除甲醇相直至剩余 約化，然后用等體積乙酸乙醋分別萃取S次得乙酸乙醋萃取液，萃取液在減壓條件下濃縮 至干，得到Mg油狀物質(zhì)。
[0073] 將所得的油狀物質(zhì)上硅膠柱(粒徑100~200目）進(jìn)行層析，用石油酸:丙酬= 100: 0-50:50(V/V)進(jìn)行梯度洗脫，100ml/min，收集洗脫液，薄層層析(TLC)檢測(cè)合并相同組分， 得到4個(gè)組分（1-4)。將組分1經(jīng)凝膠LH-20柱層析MeOH:CHCb= 1:1等度洗脫，流速為IOml/ min,收集洗脫液，薄層層析(TLC)檢測(cè)合并相同組分，得到組分1-1，組分1-1經(jīng)HPLC進(jìn)一步 分離純化，得到目的產(chǎn)物（15.2mg) dHPLC條件如下：
[0074] 液相系統(tǒng):Agilent 1100半制備高壓液相色譜儀
[0075] 色譜柱= ZORBAX SB-C18(250mm*9.4mm)
[0076] 洗脫劑：甲醇/乙臘/水=4:4:2(V/V/V)流速：1.5mL/min
[0077] 檢測(cè)波長(zhǎng):A = 254nm
[0078] 收集保留時(shí)間為42.7min的峰得到新化合物。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種新的吡喃酮類(lèi)化合物，其特征在于:結(jié)構(gòu)式如下：2. -種權(quán)利要求1所述的新的吡喃酮類(lèi)化合物的制備方法，其特征在于：以壯觀(guān)鏈菌素 產(chǎn)生菌Streptomyces sp. 1H-GS5為出發(fā)菌株，經(jīng)發(fā)酵及分離純化得到產(chǎn)物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于:發(fā)酵前需對(duì)菌株進(jìn)行斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述方法，其特征在于:所述發(fā)酵，培養(yǎng)基組成按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)：玉 米淀粉10 % -15 %，黃豆餅粉1 % -2 %，棉籽餅粉1 % -2 %，α-淀粉酶〇 . 02 % -0.03 %，NaCl 0·1%-〇·2%，Κ2ΗΡ〇4 0.2%-〇.3%，MgS〇4 · 7H20 0.1%-0.15%，CaC03 0·7%-1·0%，環(huán)己 烷羧酸0.1 . 15%，pH 7.2-7.4，用蒸餾水配制，滅菌;將種子培養(yǎng)所得的種子液接入到 發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于旋轉(zhuǎn)式搖床，28 °C發(fā)酵培養(yǎng)6-7d。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于:所述斜面培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì):可 溶性淀粉 1〇%_15%，酵母抽提粉2%-3%，KN〇3 1%-2%，瓊脂粉20%-25%，pH 7.0-7.2， 用去離子水配制，滅菌;接菌后置于28°C培養(yǎng)4-5d，將培養(yǎng)得到的孢子用無(wú)菌水配置成107-lOi.f.u.mr 1的孢子懸液備用。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于:所述種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基組成按質(zhì)量分?jǐn)?shù) 計(jì):葡萄糖20 %-25 %，黃豆餅粉15 %-20%，酵母水解物5%-10%，pH 7.0-7.2，用蒸餾水配 制，滅菌;取斜面培養(yǎng)所得107-108c. f. u .πιΓ1孢子懸液接種于種子培養(yǎng)基中，置于旋轉(zhuǎn)式搖 床，28°C 培養(yǎng)46-52h。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述的分離純化的方法為:發(fā)酵液經(jīng) 100~200目篩網(wǎng)過(guò)濾后，濾渣用3-4倍體積甲醇提取，提取液濃縮后用等體積乙酸乙酯萃取 3-4次，硅膠柱層析、凝膠層析、C-18柱層析，得到化合物。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于:所述硅膠柱層析用到的填料是100~ 200目的硅膠，流動(dòng)相為體積比石油醚：丙酮=100 : 0-50 : 50進(jìn)行梯度洗脫，流速為50-lOOml/min，收集洗脫液，薄層層析(TLC)檢測(cè)合并相同組分;所述凝膠層析用LH-20凝膠， 1 60!1:〇1(：13 = 1:1等度洗脫，流速為10-201111/1^11，收集洗脫液，薄層層析(孔〇檢測(cè)合并相 同組分。9. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于:所述C-18柱層析，使用C-18反相填料，并且使用 的溶劑為體積分?jǐn)?shù)70 % -90 %的乙腈水溶液，體積分?jǐn)?shù)70 % -90 %的甲醇水溶液或者甲醇體 積分?jǐn)?shù)40 % -45 %、乙腈體積分?jǐn)?shù)40 % -45 %的混合有機(jī)溶劑的水溶液，進(jìn)行等度洗脫，流速 為1·0-2·0mL/min〇10. -種權(quán)利要求1所述化合物在制備細(xì)胞抑制劑類(lèi)藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK105924418SQ201610279375
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月29日
【發(fā)明人】向文勝, 劉重喜, 王繼棟, 劉雙鶴
【申請(qǐng)人】東北農(nóng)業(yè)大學(xué)