白質的DNA(含有在pSec-CBD-LN丫 1E8中）的堿基序列示于序列號6。
[0178] (2)重組CBD附加層粘連蛋白511E8的表達和純化
[0179] 重組CBD附加層粘連蛋白511E8或重組層粘連蛋白511E8使用FreeStyle?293表 達系統(tǒng)（Invitrogen)來制作。使用293fectin(Invitrogen)，將3種表達載體組合轉染到 FreeStyle?293-F細胞中（參考表1)，在無血清FreeStyle?293表達培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小 時?；厥振Z化培養(yǎng)基，通過離心分離進行凈化。最初將馴化培養(yǎng)基供于使用Ni-NTA瓊脂糖 的親和層析。將柱用TBS清洗，將結合的蛋白質用含有200mM咪唑的TBS洗脫。接著，將咪 唑洗脫級分施加到抗FLAGM2瓊脂糖柱上，將結合的蛋白質用含有100yg/ml的FLAG肽的 TBS洗脫。將洗脫蛋白質在PBS中透析。將透析后的純化物用0.22ym的盤式注射過濾器 (密理博、#SLGV033RS)過濾滅菌，在-80°C下保存。將重組CBD附加層粘連蛋白511E8和 重組層粘連蛋白511E8的制作中使用的表達載體的組合示于表4。
[0180] [表 4]

[0182] (3)重組CBD附加層粘連蛋白511E8的SDS-PAGE分析
[0183] 純化蛋白質的濃度通過使用牛血清白蛋白（BSA)作為標準的BCA法來進行定量。 純化蛋白質的純度通過在非還原條件下進行SDS-PAGE并進行考馬斯亮藍染色來確認。
[0184] 將SDS-PAGE的結果示于圖1。重組層粘連蛋白511E8和CBD附加層粘連蛋白511E8 在非還原條件下均檢測到a5鏈E8的單體和0 1鏈E8-y1鏈E8二聚體這2個條帶，確認 到能夠作為異三聚體蛋白質進行純化。
[0185][實施例2 :CBD附加層粘連蛋白511E8與膠原或明膠的結合活性的研宄]
[0186] (1)結合活性的測定
[0187] 將I型膠原（新田明膠I-A型，來源于豬）或明膠（SigmaG1890-100G，來源于豬） 用0? 1MNaHC03稀釋至10yg/ml，以50y1/孔添加到96孔酶標板（NuncMaxisorp)中，在 4°C下包被過夜。棄掉板中的包被液，添加含有1 %BSA的TBS，在室溫下孵育2小時，進行封 閉。然后，將板用含有〇. 1%BSA和0. 02%吐溫-20的TBS(以下記為"洗滌緩沖液"）清洗 2次。接著，添加在洗滌緩沖液中改變濃度而進行了稀釋的各CBD附加層粘連蛋白511E8溶 液，在室溫下振蕩3小時。將板用洗滌緩沖液清洗3次后，以50y1/孔添加將抗層粘連蛋 白a5抗體5D6抗血清用洗滌緩沖液稀釋3000倍而得到的溶液。在室溫下振蕩1小時后， 將板用洗滌緩沖液清洗3次。以50y1/孔添加將HRP標記抗小鼠IgG抗體用洗滌緩沖液 稀釋3000倍而得到的溶液，在室溫下振蕩1小時。將板用洗滌緩沖液清洗3次，以50y1/ 孔添加鄰苯二胺溶液而使其顯色。以50y1/孔添加2. 5M硫酸而使顯色停止，測定490nm 的吸光度。
[0188] (2)實驗結果
[0189] 將對I型膠原的結合活性的結果示于圖2。未附加CBD的層粘連蛋白511E8(圖中 的LN511-E8)幾乎不與I型膠原結合，與此相對，在M鏈或y1鏈上僅附加有1個CBD的 CBD-E8 ( 0 )和CBD-E8 (Y)顯著地與I型膠原結合。另外，在0 1鏈和Y1鏈這2條鏈上附 加有CBD的CBD-E8 ( 0y)和在a0y這3條鏈上均附加有CBD的CBD-E8 (a0y)與僅附 加有1個CBD的層粘連蛋白相比，以更低的濃度與I型膠原結合，在10nM時達到飽和。由 該結果可知，CBD的附加數(shù)為2個（二價）以上的層粘連蛋白對I型膠原的結合活性比CBD 的附加數(shù)為1個（一價）的層粘連蛋白大約高1個數(shù)量級。但是，在二價與三價之間未觀 察到差異。另外，雖未示出，但在a5鏈和M鏈這2條鏈上附加有CBD的CBD_E8(a0)、 在a5鏈和y1鏈這2條鏈上附加有CBD的CBD-E8 (ay)也具有與CBD-E8 ( 0y)同等的 結合活性。
[0190] 將對明膠的結合活性的結果示于圖3?？芍c對I型膠原的結合活性同樣，未附 加CBD的LN511-E8幾乎不與明膠結合，但附加有CBD的LN511-E8與明膠顯著結合，CBD為 二價以上的層粘連蛋白的結合比CBD為一價的層粘連蛋白大約強3倍。
[0191][實施例3 :使用CBD附加層粘連蛋白511E8的人iPS細胞的培養(yǎng)]
[0192] (1)人iPS細胞
[0193] 人iPS細胞使用從獨立行政法人醫(yī)藥基礎研宄所生物資源庫購買的細胞株（克隆 名：tic(JCRB1331))。tic細胞按照獨立行政法人醫(yī)藥基礎研宄所生物資源庫推薦的方法， 通過與小鼠飼養(yǎng)細胞的共培養(yǎng)進行維持。在共培養(yǎng)皿中添加lU/ml分散酶/DMEM-F12,用細 胞刮刀刮取收集tic細胞的集落。將100ym含有該tic細胞集落和小鼠飼養(yǎng)細胞的溶液 從BDFalcon細胞濾網(wǎng)通過，對濾網(wǎng)進行清洗，由此，分離出tic細胞集落。將殘留的集落 用mTeSRl(商品名，STEMCELLTECHNOLOGIES公司）培養(yǎng)基進行回收，使用P-1000移液器 細細地破碎后，再懸浮于mTeSRl培養(yǎng)基中，接種到包被有Matrigel的培養(yǎng)器中。在37°C、 5% 0)2條件下每天進行培養(yǎng)液的更換，擴大培養(yǎng)至4~5天。將如此擴大培養(yǎng)的細胞供于 實驗。
[0194] (2)培養(yǎng)方法
[0195] 將I型膠原（新田明膠I-C型，來源于豬）用PBS稀釋至200yg/ml而得到的溶 液、或者〇. 1%明膠（Sigma)以lml/孔添加到12孔板中，在37°C下孵育1小時。然后，在 膠原包被條件下吸去膠原溶液，以lml/孔添加0. 1 %明膠，在37°C下孵育2小時，由此進行 封閉。然后，除去明膠液，將板用PBS清洗2次。將各層粘連蛋白E8以達到8nM的方式用 PBS稀釋，以lml/孔進行添加，在4°C下孵育過夜。然后，將板用PBS清洗3次。
[0196] 將在Matrigel包被皿（10cm)上進行了培養(yǎng)的上述iPS細胞的培養(yǎng)基吸 去，添加含4. 8mMEDTA的PBS，在室溫下孵育3分鐘。除去EDTA液，添加TrypLE 已1?^88(6讓(3〇)11111，在371：下孵育1分鐘，將1?3細胞剝離。將細胞用添加有補充劑的 mTeSRl培養(yǎng)基（STEMCELLTECHNOLOGIES公司）懸浮，轉移至15ml管中后，以lOOOrpm離心 分離3分鐘。吸去上清后，將細胞用添加有補充劑的mTeSRl培養(yǎng)基以達到7. 6X104個/ml 的方式進行懸浮。將板中的PBS吸去、抽吸除去后，以lml/孔接種iPS細胞。將板在37°C、 5%C02的孵育箱中進行培養(yǎng)。每天進行培養(yǎng)基的更換，培養(yǎng)3天。
[0197] (3)實驗結果
[0198] 將在I型膠原包被條件下培養(yǎng)第3天的iPS細胞的照片示于圖4。由圖4可知， 在僅包被I型膠原（圖中的僅ColI)時，幾乎觀察不到iPS細胞的增殖。在添加了未附加 CBD的LN511-E8(圖中+511E8)的情況下，也同樣幾乎觀察不到iPS細胞的增殖。另一方 面，在添加了CBD為一價的LN511-E8(圖中的+CBD-E8(0)和+CBD-E8(y))的條件下，稍 微觀察到iPS細胞的增殖。在添加了CBD為二價的LN511-E8(圖中的+CBD-E8(f3Y))的 條件下，觀察到iPS細胞數(shù)比CBD為一價的LN511-E8增多的狀態(tài)。
[0199] 將在明膠包被條件下培養(yǎng)第3天的iPS細胞的照片示于圖5。由圖5可知，在明膠 包被條件下，觀察到比I型膠原包被條件下更顯著的差異。在僅明膠（圖中的僅明膠）或 添加了未附加CBD的LN511-E8(圖中+511E8)的條件下，稍微觀察到iPS細胞的增殖，在添 加了CBD為一價的LN511-E8(圖中的+CBD-E8(0)和+CBD-E8(y))的條件下，確認到iPS 細胞的增殖，在添加了CBD為二價的LN511-E8(圖中+的CBD-E8(0y))的條件下，觀察到 細胞數(shù)進一步增加的狀態(tài)。
[0200] [實施例4 :來源于層粘連蛋白511以外的層粘連蛋白異形體的重組CBD附加層粘 連蛋白E8的制作]
[0201] 除了實施例1中制作的各鏈E8表達載體以外，分別制作來源于a5鏈以外的層粘 連蛋白a鏈的人層粘連蛋白E8片段的表達載體（a1鏈E8、a2鏈E8、a3鏈E8、a4鏈E8)、層粘連蛋白0 2鏈E8和CBD附加層粘連蛋白0 2鏈E8的表達載體。關于Y鏈，使用 實施例1中制作的層粘連蛋白Y1鏈E8和CBD附加層粘連蛋白y1鏈E8的表達載體。將 這些表達載體組合轉染到宿主細胞中，由此，制作來源于層粘連蛋白511以外的層粘連蛋 白異形體的重組層粘連蛋白E8和CBD附加層粘連蛋白E8。
[0202] (1)表達載體的構建
[0203] (1-1)人層粘連蛋白a1鏈E8片段表達載體的制作
[0204] 以克隆用質粒pBluescriptKS(+) (Stratagene公司）作為模板，使用以下的引物 組⑴進行PCR，制作在質粒的多克隆位點內的EcoRV的5'側插入有限制酶AscI識別序列 和編碼 6XHis標簽的DNA的pBluescriptKS(+)。
[0205] ⑴6XHis標簽-AscI位點導入用引物
[0206] 5 ' -ATGATGATGGGCGCGCCAAGCTTATCGATACCGT-3 '（正向，序列號 7)
[0207] 5'-CATCATCATGATATCGAAITCCTGC-3'（反向，序列號 8)
[0208] 然后，以含有人層粘連蛋白a1鏈的CDNA序列的質粒（Idoetal.，J.Biol. Chem.，279, 10946-10954, 2004)作為模板來進行PCR，對相當于a1鏈（登記號： NP_005550(參考表2)的Phel878-Gln2700)的區(qū)域進行擴增。另外，在反向（reverse)引 物的5'側附加有BamHI識別序列。
[0209] 將擴增的cDNA插入到附加有AscI識別序列和6XHis標簽序列的pBluescript KS(+)的多克隆位點的EcoRV和BamHI位點。然后，將含有編碼5'側的6XHis標簽和 a1鏈E8片段的序列的cDNA用限制酶AscI和BamHI切出，插入到哺乳細胞用表達載體 pSecTag2A(Invitrogen)的該位點，制作人a1鏈E8片段（在N末端側含有6XHis標簽） 的表達載體pSec-LNa1E8。
[0210] (1-2)人層粘連蛋白a2鏈E8片段表達載體的制作
[0211]以含有人層粘連蛋白a2鏈的cDNA序列的質粒（Idoetal.，J.Biol. Chem.，283, 28149-28157, 2008)作為模板來進行PCR，對相當于a2鏈（登記號： NP_000417(參考表2)的Leul900-Ala2722)的區(qū)域進行擴增。另外，在反向（reverse)引 物的5'側附加有BamHI識別序列（GGATCC)。
[0212] 將擴增的cDNA插入到附加有AscI識別序列和6XHis標簽序列的pBluescript KS(+)的多克隆位點的EcoRV和BamHI位點。然后，將含有編碼5'側的6XHis標簽和 a1鏈E8片段的序列的cDNA用限制酶AscI和BamHI切出，插入到哺乳細胞用表達載體 pSecTag2A(Invitrogen)的該位點，制作人a2鏈E8片段（在N末端側含有6XHis標簽） 的表達載體pSec-LNa2E8。
[0213] (1-3)人層粘連蛋白a3鏈E8片段表達載體的制作
[0214] 以含有人層粘連蛋白a3鏈（除層粘連蛋白球狀結構域的第4位和第5位以外） 的cDNA序列的質粒（Idoetal.，J.Biol.Chem.，282, 11144-11154, 2007)作為模板來進行 卩0?，對相當于（13鏈（登記號：即_000218(參考表2)的41 &579-41&1364)的區(qū)域進行擴 增。另外，在反向（reverse)引物的5'側附加有Xbal識別序列。
[0215]將擴增的cDNA插入到附加有AscI