專利名稱：結合分子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及經(jīng)歷了親和カ成熟的功能性僅有重鏈的抗體多樣性庫(diverserepertoire)的制造及其用途。本發(fā)明也涉及類別特異性僅有重鏈的抗體多樣性庫的制造和用途，也涉及具有抗體重鏈功能性優(yōu)選抗體重鏈結合功能性、恒定區(qū)效應子活性及任選其他效應子功能的多價多肽復合物的制造和用途。本發(fā)明也涉及在轉基因小鼠中響應抗原激發(fā)產(chǎn)生全功能性僅有重鏈的抗體的方法。本發(fā)明特別涉及產(chǎn)生任何種類的人抗原特異性、高度親和力、僅有重鏈的抗體或多種混合物的方法，分離及表達全功能性VH抗原結合域的方法。本發(fā)明也涉及產(chǎn)生包含重鏈功能性優(yōu)選重鏈效應子活性及其他結合和效應子功 能的多價多肽復合物。也描述了使用本發(fā)明方法產(chǎn)生的僅有重鏈的抗體及其他多價結合復合物及其用途。
背景技術：
在21世紀開發(fā)的新藥中將存在很大比例的單克隆抗體或其變異體。單克隆抗體治療已經(jīng)被公認為優(yōu)選途徑用于治療類風濕性關節(jié)炎和克羅恩病且在癌癥治療中有很大進展。用于治療心血管疾病及感染性疾病的基于抗體產(chǎn)品也在開發(fā)之中。單克隆產(chǎn)品識別并結合靶配體(例如TNFa)上単一、明確的表位。用于治療的人單克隆抗體的制造依然依賴于哺乳動物細胞培養(yǎng)。裝配包括兩個重鏈和兩個輕鏈的復合體(H2L2復合體)及接著翻譯后糖基化過程排除使用的細菌體系。通過哺乳動物細胞培養(yǎng)制造抗體的生產(chǎn)成本和資金耗費高且在缺乏可接受的其它療法時有限制基于抗體的療法潛力的風險。許多種轉基因生物能夠表達全功能性抗體。包括植物、昆蟲、雛雞、山羊和牛，但是仍然沒有用于制造銷售的治療性產(chǎn)品?？稍诖竽c桿菌(E. coli)中制造功能性抗體片段但是除非在制造過程中進行聚こニ醇化否則產(chǎn)物在血清中穩(wěn)定性通常較低。雙特異性抗體復合物是基于工程Ig能夠結合相同或不同抗原上兩種不同表位的分子。雙特異性結合蛋白単獨或與其他結合劑聯(lián)用參入抗體顯示有希望的治療模式即獲得人免疫功能而具治療效果，例如清除病原體(Van Spriel等，(1999) J. Infect. Diseases,
179,661-669 ;Tacken 等，(2004) J. Immunol.，172，4934-4940 ;美國 5，487，890)、癌的治療(Olennie和 van der Winkel, (2003)Drug Discovery Today, 8, 503-5100)和免疫治療(VanSpriel 等,(2000) Immunol. Today, 21, 391-397 ;Segal 等,(2001) J. Immunol. Methods, 248，1-6 ;Lyden 等，(2001) Nat. Med.，7，1194-1201)。制造方面問題的復雜性在于雙特異性抗體產(chǎn)物以兩種或多種H2L2復合體為基礎。例如兩套或多套重鏈和輕鏈基因的共同表達可致形成高達10種不同的組合，其中僅有一種為所需的異源ニ聚體(Suresh 等，(1986)Methods EnzymoL, 121, 210-228)。為解決這種問題，開發(fā)了許多方法生產(chǎn)保留重鏈效應子功能的哺乳動物細胞全長雙特異性IgG形式(BsIgG)。BsIgGs需要工程的"杵臼結構(knob and hole)"重鏈以防止異源ニ聚體形成且利用相同L-鏈來避免L-鏈錯配(Carter, (2001) J. Immunol.Methods，248，7-15)。也已經(jīng)描述了可選擇的化學交聯(lián)方法自各自識別不同抗原的抗體片段制備復合體(Ferguson 等，(1995) Arthritis and Rheumatism, 38,190-209)或將其他結合蛋白例如膠原凝集素交聯(lián)到抗體片段制備復合體(Tacken等，(2004) J. Immunol. , 172,4934-4940)。開發(fā)通常缺乏重鏈效應子功能的雙抗體或微型抗體(BsAb)也克服異源ニ聚體過剩。這些包含參入VH和VL結合位點(scFv)的極微小單鏈抗體隨后折疊(fold)并ニ聚化(dimerise)從而形成ニ價雙特異性抗體,對其姆個祀抗原為單價(Holliger等，(1993)PNAS，90，6444-6448 ;Muller 等，(1998)FEBS Lett.，422，259-264)。在一個實例中，CHl和L-恒定域用作形成雙特異性微型抗體的異源ニ聚化域(Muller等，(1998)FEBS Lett., 259-264)。已經(jīng)開發(fā)了許多基于E. coli表達體系的重組方法產(chǎn)生BsAbs (Hudson，(1999)Curr. Opin. Immunol. , 11, 548-557),可是生產(chǎn)臨床階段多價抗體材料的花費和規(guī)?？磥砣允瞧渑R床開發(fā)的首要障礙(Segal 等,(2001) J. Immunol. Methods, 248,1-6)。近來，BsAb概念已經(jīng)擴展到包括雙-雙抗體、四價的雙特異性抗體，其中在各H鏈和L鏈上的Vh和\域已經(jīng)被scFv結合域的工程對(engineered pairs)取代。雖然這類構建體的基因工程(engineer)方面的難度很大，但仍可在培養(yǎng)的哺乳動物細胞中裝配這種構建體而不出現(xiàn)過剩異源ニ聚體(Lu等，(2003) J. Immunol. Methods, 279, 219-232)。本領域中已經(jīng)熟知免疫球蛋白結構。大多數(shù)天然免疫球蛋白包含兩個重鏈和兩個輕鏈。重鏈通過大約位于每個重鏈中間的鉸鏈域之間的雙硫鍵互相結合。輕鏈與每個重鏈在鉸鏈域N末端一側上結合。每個輕鏈通過鉸鏈域附近雙硫鍵正常鍵合到其各自重鏈。當Ig分子正確折疊吋，每個鏈折疊成許多由更線性多肽序列結合的特殊球狀區(qū)域。例如輕鏈折疊成可變域(\)和恒定域(CJ。重鏈有鄰近輕鏈可變域的單一可變域VH、第一恒定域、鉸鏈域和兩個或三個另外的恒定域。重鏈(Vh)和輕鏈可變域的相互作用導致抗原結合區(qū)(Fv)形成。通常Vh和ん都需要抗原結合，盡管重鏈ニ聚體和氨基末端片段在沒有輕鏈時仍顯示保留有活性(Jaton等，(1968) Biochemistry，7，4185-4195)。隨著新分子生物學技術的發(fā)展，在人B細胞増殖性疾病(重鏈疾病)和鼠模型系統(tǒng)中鑒別出僅有重鏈的抗體(缺乏輕鏈)的存在。重鏈疾病分子水平分析顯示基因組水平的突變和缺失可導致重鏈ChI域不適當?shù)谋磉_，引起僅有重鏈而缺乏結合輕鏈活性的抗體表達(參見 Hendershot 等，(1987) J Cell Biol. , 104, 761-767 ;Brandt 等，(1984)MoLCell. Biol.，4，1270-1277)。對得自噬菌體文庫的分離的人Vh域単獨研究顯示Vh域的抗原特異性結合但是這些Vh域證明溶解度低。而且建議選擇具噬菌體陣列上展示的特異性結合性質的人Vh域可形成工程抗體結構單兀(Ward等，(1989) Nature, 341, 544-546)。使用其他脊椎動物物種研究顯示作為天然基因突變結果的駱駝(camelids)產(chǎn)生功能性僅有IgG2和IgG3重鏈ニ聚體，由于缺乏ChI輕鏈結合區(qū)其不能結合輕鏈(HamersCasterman等，(1993)Nature, 363,446-448)及例如S魚的物種產(chǎn)生僅有重鏈樣(heavy chain-only-like)結合蛋白家族,可能涉及哺乳動物T-細胞受體或免疫球蛋白輕鏈(Stanfield 等，(2004)Science，305，1770-1773)。駱駝僅有重鏈的抗體的ー個特征是提供相對于人Vh域提高了溶解度的駱駝Vh域。為改善溶解性可改造人Vh域(參見Davies和Riechmann, (1996) Protein Eng. ,9(6),531-537 ;Lutz 和 Muyldermans, (1999) J. Tmmun o. Methods, 231, 25-38)或可通過體內自然選擇獲得溶解性(參見Tonha等，(2001) J. Biol. Chem.，276，24774-24780)。盡管應用提高親和力策略例如親和カ熱點隨機化，可是得自噬菌體文庫的Vh結合域中對抗原的內在親和カ依然保持在低微摩爾-高納摩爾范圍(Yau等，(2005) J. Immunol. Methods, 297,213-224)。駱駝Vh抗體也具有修飾的⑶R3環(huán)特征。這種⑶R3環(huán)平均比非-駱駝抗體中發(fā)現(xiàn)的更長，且認為是影響整體抗原親和カ和特異性的主要特征，其補償了駱駝僅有重鏈的抗體物種中 Vl 域的缺失(Desmyter 等,(1996) Nat. Struct. Biol. , 3,803-811, Riechinann 和 Muyldermans, (1999)J. Tmmunol. Methods,23,25-28)。近來對駱駝抗體的結構研究表明依賴于V(D)J重組事件和體細胞突變的體內成熟過程大大促進了抗體多樣性(De Genst等，(2005) J. Biol. Chem.，280 (14)，14114-14121)。目前已經(jīng)開發(fā)出在轉基因哺乳動物中產(chǎn)生僅有重鏈的抗體的方法(參見W002/085945和W002/085944)。轉基因哺乳動物(優(yōu)選小鼠)經(jīng)抗原激發(fā)可產(chǎn)生任何可能種類(IgM、IgG、IgD、IgA或IgE)和得自任何哺乳動物(包括人)的功能性僅有重鏈的抗體。正常的免疫球蛋白重鏈基因座包含多個V基因片段、許多D基因片段和許多J基因片段。每個V基因片段編碼V域中從N末端幾乎直至C末端。每個V域的C末端由D基因片段和J基因片段編碼。親和カ成熟前的B細胞中VDJ重排提供Vh結合域，然后與\結合域形成抗原識別位點或結合位點。重鏈的ChI區(qū)和輕鏈的K或λ區(qū)促進了重鏈和輕鏈的相互作用。為產(chǎn)生僅有重鏈的抗體，種系(germime)中重鏈基因座包含編碼部分或全部可能的恒定區(qū)的基因片段。在成熟期間，重排的Vh結合域剪接到CH2恒定區(qū)編碼片段從而提供編碼缺乏ChI域的重鏈且因此提供不能連接于與免疫球蛋白輕鏈相連接的重鏈的重排基因。僅有重鏈單克隆抗體可通過標準克隆技術自脾的B細胞回收或通過噬菌體展示技術自B細胞mRNA回收(Ward等，(1989) Nature341，544-546)。得自駱駝或轉基因動物的僅有重鏈的抗體具高度親和力。正常H2L2四聚體序列分析證明多樣性主要源自VDJ重排和體細胞高度突變的結合(Xu和Davies，(2000) Immunity, 13，37-45)。表達的在駱駝內或在轉基因動物中產(chǎn)生的僅有重鏈mRNA序列分析支持這個觀察結果(Dc Genst等，(2005)J. Biol. Chem. ,280,14114—14121)。天然駱駝和人Vh區(qū)的ー個重要且共同的特征是每個區(qū)不依賴干與\區(qū)的ニ聚化而作為単體(與抗原)結合以取得最佳溶解性和結合親和力。這些特征早就被認為是特別適于產(chǎn)生阻滯劑和組織滲透劑。同-ニ聚體或異ニ聚體也可通過僅有重鏈的抗體的酶切或合成途徑產(chǎn)生(Jaton等，(1968) Biochemistry，7，4185-4195 和 US2003/0058074A1)。但是單體抗體結合域的優(yōu)勢仍有利于改造作為治療性或診斷性試劑的多聚體蛋白質。通過噬菌體展示技術產(chǎn)生的人Vh或駱駝Vhh缺少作為體細胞突變所致改善特征的優(yōu)點及通過正?？贵w結合位點⑶R3區(qū)中D和J區(qū)重組提供的其他多樣性(Xu和Davies，
(2000)Immunity, 13，37-45)。同時與人Vh相比顯示溶解性優(yōu)勢的駱駝Vhh在人體中有抗原性且必須通過駱駝免疫或通過噬菌體展示技術產(chǎn)生。Vh結合域的參入比使用自Vh和\域改造的與特異性和親和カ可能喪失有關的scFvs具有明顯的優(yōu)勢。為產(chǎn)生雙特異性或多特異性結合分子，得自相關基因家族例如 T-細胞受體或鯊魚免疫球蛋白家族的Vh結合域也可提供scFv方案的備擇方案。也可使用其他天然存在的結合蛋白及其域包括例如可溶性受體片段。各種抗體的生理功能不同。例如IgG在成熟免疫應答中發(fā)揮決定作用。IgM涉及補體固定和凝集作用。IgA是分泌物中Ig的主要類別-眼淚、唾液、初乳、粘液中的-且因此在局部免疫中起作用。當改造多價結合復合體時包括種類特異性重鏈恒定區(qū)根據(jù)所需功能提供了體內效應子功能的治療利益。工程個體效應子區(qū)也可導致功能性的添加和缺失(VanDijk 和 van der Winkel, Curr. Opin. Chem. Biol.，(2001)8 月 5 (4)，368-374)。看來包含高度親和カVh結合域(人或駱駝或其他來源)的最適合的僅有重鏈的抗體的產(chǎn)生和選擇將得益于依賴于自隨機化噬菌體文庫選擇并不促進體內重組和親和力成熟方案的備擇方案。因此包括IgA恒定區(qū)功能性將提高粘膜抗病原體功能(Leher等，(1999) Exp. Eye.Res, 69, 75-84)，同時IgGl恒定區(qū)功能性的存在提高體內血清穩(wěn)定性。存在的重鏈CH2和Ch3恒定域提供了如天然抗體中所見穩(wěn)定的ニ聚體作用基礎，且為翻譯后糖基化提供識別位點。如果使用雙特異性和多價復合體作為試劑和診斷劑，存在的Ch2和Ch3也促進第二種抗體識別。預先在鉸鏈區(qū)和人IgGl效應子域前克隆分離的重排前駱駝僅有重鏈可變區(qū)序列，插入載體并在COS細胞中表達而產(chǎn)生抗體。在這種體外環(huán)境中表達抗體已經(jīng)經(jīng)過駱駝體內類型(同種型)轉換和親和カ成熟(高突變)過程且可結合于抗原(Riechmann和Muyldermans, (1999)J. Immunol. Methods,231,25-38)。為在各種臨床、エ業(yè)和研究中應用，本領域需要使體內僅有重鏈的抗體多樣性和B-細胞應答最大化，從而特別生產(chǎn)種類特異性人僅有重鏈的抗體和功能性僅有Vh重鏈結合域的功能性庫，其保留最大的抗原結合能力。本領域也需要產(chǎn)生可溶的、ニ價的或多價的多肽結合復合體，單獨的或與效應子(輕)鏈組合的包含至少部分的抗體重鏈且為生理學上穩(wěn)定的和具有效應子功能。發(fā)明概述本發(fā)明提供了ー種用于在轉基因哺乳動物中產(chǎn)生僅有Vh重鏈或駱駝僅有Vh(Vhh)重鏈抗體的方法，包括哺乳動物中異源Vh或駱駝Vh(Vhh)重鏈基因座表達步驟，其中Vh或駱馬它Vh (Vhh)重鏈基因座包含不編碼ChI域的重鏈恒定區(qū)且如果表達，這種基因座能形成ー種或多種確定類別的僅有重鏈的抗體。這種Vh或駱駝Vh(Vhh)重鏈基因座可包含一種或多種駱駝或非駱駝V基因片段。優(yōu)選選擇或改造V基因片段從而提高溶解性。優(yōu)選的V基因片段得自人。這種重鏈基因座的重鏈恒定區(qū)可包含Cal和/或Ca2、Ce、Cs、Cy和/或Cij重鏈恒定區(qū)基因。而且此重鏈基因座的重鏈恒定區(qū)可包含ー種以上的下列重鏈恒定區(qū)ca、cal、Ce、C5、Cy、CyO優(yōu)選的Vh重鏈基因座包含含有至少ー個人或駱駝V基因片段、至少ー個D片段和至少ー個J片段的可變區(qū)，其中人或駱駝V基因片段、D基因片段和J基因片段能夠重組而形成VDJ編碼序列。重鏈基因座優(yōu)選包含20個或更多的D基因片段和/或5個或更多J基因片段。優(yōu)選的D和J片段為脊椎動物來源，優(yōu)選人。使用得自任何脊椎動物D和J基因片段且優(yōu)選人D和J基因片段可獲得CDR3環(huán)。Vh重鏈基因座也可包含能夠直接將J基因片段與重鏈恒定區(qū)基因重組的重組序列
krssノ。異源重鏈基因座的重鏈恒定區(qū)為人源或脊椎動物來源例如駱駝來源?；蛘哌@種恒定區(qū)可以并非免疫球蛋白重鏈來源。優(yōu)選的本發(fā)明方法導致基本正常B細胞成熟。本發(fā)明也提供僅有重鏈的抗體或其 片段，或根據(jù)本發(fā)明方法得到或可以得到多種僅有重鏈的抗體混合物。這種僅有重鏈的抗體可為單克隆抗體或其片段，例如人或駱駝Vh結合域。本發(fā)明的Vh結合域可缺乏延伸的駱駝樣⑶R3環(huán)或可包含延伸的駱駝樣⑶R3環(huán)。本發(fā)明也提供包含本發(fā)明的異源重鏈基因座的載體且用這種載體轉化宿主細胞。本發(fā)明也提供表達本文所述異源重鏈基因座的轉基因哺乳動物。優(yōu)選的本發(fā)明轉基因哺乳動物產(chǎn)生包括輕鏈的抗體的能力降低。本發(fā)明也提供了僅有重鏈的抗體或其片段在制備免疫治療藥物中的用途。本發(fā)明的僅有重鏈的抗體也可作為診斷劑、試劑、抗體酶或抑制劑。也提供包含本發(fā)明僅有重鏈的抗體或其片段和藥理學上適當載體的藥用組合物。本發(fā)明也提供產(chǎn)生并選擇僅有重鏈的抗體的方法，包括步驟(a)將抗原注射進本文所述的轉基因哺乳動物中；(b)分離表達所需抗原特異性、僅有重鏈的抗體的細胞或組織；(C)由步驟(b)的細胞或組織產(chǎn)生雜交瘤；(d)任選從所述雜交瘤克隆僅有重鏈的抗體mRNA，以便以后在異源表達體系例如哺乳動物、植物、昆蟲、微生物、真菌或其它可行的體系中產(chǎn)生該抗體。然后從步驟(C)的克隆的mRNA中鑒別和分離抗原特異性Vh域產(chǎn)生Vh結合域。本發(fā)明Vh結合域也可產(chǎn)生自(a)將抗原注射進本文所述的轉基因哺乳動物中；(b)分離表達所需抗原特異性、僅有重鏈的抗體的細胞或組織；(c)從得自分離細胞或組織的mRNA克隆Vh基因座；d)使用噬菌體或類似文庫展示編碼的蛋白質；(e)鑒定抗原特異性Vh域；且(f)在細菌、酵母或其它可行的表達體系中單獨表達或作為融合蛋白表達Vh域。發(fā)明詳述發(fā)明人克服了先有技術的局限性井指出可以使轉基因動物，尤其是小鼠，產(chǎn)生“微基因座”從而生產(chǎn)血漿或B細胞分泌的種類特異性，只有重鏈抗體，或只有重鏈抗體的不同種類的混合物。然后這些可用于使用已建立的雜交瘤技術產(chǎn)生能可靠供應的種類特異性、只有重鏈抗體，或者用作Vh (Vhh)結合域或僅有Vh重鏈結合域，優(yōu)選ー種沒有效應子功能但保留結合功能的人源可溶的僅有Vh重鏈結合域。通常在不存在擴展的⑶R3環(huán)的情況下，通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的只有重鏈抗體(包括駱駝抗體)顯示出由于V、D和J基因片段重排和體細胞突變而產(chǎn)生的高親和力。在離體血漿中可觀察到基本正常的B細胞成熟有高水平的只有重鏈抗體出現(xiàn)(條件是在重組基因座中出現(xiàn)的所有抗體種類中剔除了 ChI域)。B-細胞成熟和裝配的ニ聚體(例如IgG)或多聚體(IgM)的分泌不依賴輕鏈基因的存在和表達。編碼ー種從轉基因小鼠得到的雜交瘤分離的抗原特異性重鏈的抗原特異性mRNA的核酸序列分析證明重鏈抗體多祥性主要與VDJ重組有夫。而且，本發(fā)明者指出抗體多祥性產(chǎn)生在僅有重鏈的抗體的功能抗原結合域的CDR3區(qū)域，而來自Vh域中體細胞突變的貢 獻相當有限。使用這里描述的方法，可以在細菌系統(tǒng)克隆并表達功能VH域從而產(chǎn)生保留有全部抗原結合、特異性和親和カ的Vh結合域。另外，培養(yǎng)的雜交瘤細胞系能分泌種類特異性重鏈ニ聚體和多聚體。本發(fā)明也指出可按程序改造轉基因小鼠從而生產(chǎn)響應抗原激發(fā)的僅有重鏈的抗體的優(yōu)選種類，例如僅有IgG或者僅有IgM或例如IgA、IgG和IgM的混合物。發(fā)明者以前描述(參見W002/085945和W002/085944) 了表達ー種缺失ChI外顯子并通過人D和J片段連接兩個馬駝VHH基因的最小的人IgG重鏈恒定區(qū)基因座的轉基因小鼠的生產(chǎn)。當用抗原激發(fā)時，這些小鼠產(chǎn)生功能性、高親和力、抗原特異性僅有IgG重鏈抗體。通過串聯(lián)加入重鏈恒定區(qū)的基因構鍵體的使用(條件是所有恒定區(qū)基因缺乏ChI區(qū)并且有時會存在CH4區(qū))在體內經(jīng)過類轉換可獲得僅有重鏈的抗體種類的混合物(IgM和IgG)。這里描述的改進展示ー種具有通過人D和J片段連接兩種馬駝Vhh基因的相同IgG恒定區(qū)基因座和通過相同的人D和J片段連接兩種馬駝VHH基因的缺失CHl外顯子的人IgM恒定區(qū)基因座結構的小鼠，也產(chǎn)生高分子量(多聚體)僅有IgM重鏈抗體和僅有IgG (ニ聚體)重鏈抗體。驚人的是基本正常B-細胞成熟和抗體產(chǎn)生依賴于ChI序列從每個存在于轉基因基因座中的重鏈恒定區(qū)全部缺失。而且，如果CH4外顯子存在不需要去除。因此，例如，ー種轉基因動物攜帯一種通過相同的人D和J基因片段連接兩種馬駝V基因片段的帶有功能ChI外顯子的人IgM重鏈基因座，和通過相同的人D和J基因片段連接兩種馬駝V基因片段的缺失C0I外顯子的IgG恒定重鏈區(qū)基因座，則該轉基因動物產(chǎn)生相當?shù)退降膬H有重鏈的抗體并且不顯示B-細胞成熟跡象。按需要可以引入或不引入包括CH4域的其它效應子域，以將效應子特征引入所得僅有重鏈的抗體或從中去除。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)抗體的產(chǎn)生性表達(例如B-細胞成熟)可由存在于結構中的任何V基因片段的使用引起。來源于B-細胞的抗體mRNA的分離和測序顯示D和J基因片段重組產(chǎn)生⑶R3多樣性。所得的VH域的序列比較掲示體細胞突變，意味著在重組D和J基因片段中并且也在所得的表達的抗體mRNA的Vh域發(fā)生親和力成熟。優(yōu)選的構建體加入選擇或改造用于改善溶解度和連接用于重組的D和J鏈簇和 CDR3產(chǎn)生的V基因片段。優(yōu)選，VDJ序列連接于所選的串聯(lián)恒定效應子域，每個缺失C0I外顯子。本發(fā)明不限于人或駱駝種類特異性的僅有重鏈的抗體或人VH結合域(優(yōu)選可溶的Vh結合域)(単獨或連接于連接于所選的效應子域)的生產(chǎn)和衍生化，還包括連接于D和J基因片段脊椎動物來源(任選經(jīng)基因工程改造從而改善溶解性)的任何V基因片段的嵌合(chaemeric)組合(combination)的生產(chǎn)。優(yōu)選，V基因片段是人源的并且不是來自駱駝的V基因片段。所得的Vh域可以不包含擴展的駱駝樣CDR3環(huán)除非D和J片段來自駱駝。這導致展示CDR3多祥性和親和カ成熟的VH域操作性連接于效應子恒定區(qū)。后者確保在所選的親代轉基因脊椎動物中功能性分泌和任選裝配，并且以后如果需要還可以提供可選擇的效應子功能。這些觀察結果對改進和簡化種類特異性僅有重鏈的抗體和經(jīng)過體細胞突變加入親和カ成熟的高親和カ可溶的Vh域的改造有重要意義。選擇的重鏈恒定區(qū)效應子功能(缺失ChI)或它們的混合物的加入允許僅有重鏈的抗體的任 何種類或沒有另外抗體改造要求的僅有重鏈的抗體的任何混合物的產(chǎn)物。Vh域可被細菌和其它微生物系統(tǒng)單獨表達，或作為加入效應子域的功能性僅有重鏈的抗體由培養(yǎng)的雜交瘤或轉染的細胞分泌?？贵w和人源的Vh結合域在健康護理領域作為藥物、診斷劑和試劑有廣泛應用，同時還可應用于農業(yè)、環(huán)境和エ業(yè)。因此，第一方面，本發(fā)明提供ー種用于轉基因哺乳動物中僅有Vh重鏈抗體的生產(chǎn)方法，該方法包含在那種哺乳動物中表達ー種異源VH重鏈基因座的步驟。優(yōu)選，Vh重鏈基因座包含ー種不編碼ChI域并且當表達時基因座可形成完整的僅有重鏈的抗體的重鏈恒定區(qū)域的多祥性庫。本發(fā)明的第一方面也提供一種用于產(chǎn)生轉基因哺乳動物中駱駝僅有Vh重鏈抗體的方法，該方法包含在那種哺乳動物中表達ー種駱駝Vh重鏈基因座的步驟，其中VH重鏈基因座包含ー種不編碼CHl域并且當表達時基因座可形成加入VDJ重排和親和力成熟適應抗原激發(fā)的完整的僅有重鏈的抗體的多樣性庫的重鏈恒定區(qū)域。重鏈效應分子可改造成無功能域，例如羧基段CH4域，條件是改造不影響阻止細胞表面裝配并因此B-細胞成熟的分泌機制。CHl外顯子單獨從異源基因座刪除或從基因座缺失。另外的特點可經(jīng)改造加入到基因座中，例如改善糖基化，或増加功能。優(yōu)選，當表達時，異源基因座可形成功能性IgA、IgE、IgG、IgD或IgM分子或它們的同種型。因此，依據(jù)需要的抗體種類以及基本正常的B-細胞成熟，設計異源重鏈基因座以產(chǎn)生僅有重鏈的抗體的優(yōu)選種類或混合物。駱駝V、D和J基因片段和駱駝效應子區(qū)域的使用將產(chǎn)生帶有駱駝特有特點的駱駝抗體，例如擴展的CDR3環(huán)。包含隨機選擇或選擇或改造用于增強溶解度的V基因片段的人V、D和J基因片段的使用將產(chǎn)生功能性人僅有重鏈的抗體。依據(jù)本發(fā)明得到的抗體與先有技術的抗體相比其優(yōu)點在于它們是基本上是單ー或已知種類并優(yōu)選是人源的抗體。體內VDJ重組和親和力成熟共同使抗體具有高親和力。用本領域技術人員已知的完備方法可分離、鑒定和制備抗體及其片段。異源重鏈基因座在本發(fā)明的上下文中，術語“異源的”是指如本文所述的ー種核苷酸序列或ー種基因座，對于其所在的哺乳動物不是內源性的。在本發(fā)明的上下文中，“VH重鏈基因座”是指編碼包含ー種或多種V基因片段、一種或多種D基因片段和ー種或多種J基因片段，操作性連接于ー種或多種重鏈效應子區(qū)域(每種缺失CHl域)的Vh域的最少的微型基因座。優(yōu)選抗體庫可變性的主要來源是CDR3區(qū)，該區(qū)通過選擇D和J基因片段并進行V-D和D-J連接而形成。本發(fā)明的優(yōu)點是Vh基因序列重排得到的抗體庫和多祥性通過多個D和J基因片段的使用可以最大化。使用ー種不需要大量V基因片段或ん和Lc (輕鏈)免疫球蛋白基因座的最小的基因座(微基因座)的同時獲得以后的體細胞突變。優(yōu)選，Vh重鏈基因座包含來自任何脊椎動物種屬的2到5個V(2、3、4或5)基因片段。優(yōu)選的V基因片段是人源的，任選選擇或改造以改善溶解度。優(yōu)選的Vh 重鏈基因座包含 2 到 40 個(2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30或40)或更多D基因片段。D基因片段可以來自任何脊椎動物種屬但是最優(yōu)選的D基因片段是人D基因片段(正常地25個功能性D基因片段)。 優(yōu)選的VH 重鏈基因座包含 2 到 20 個(2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18 或 20)
或更多J基因片段。J基因片段可選自任何脊椎動物種屬但是最優(yōu)選的J基因片段是人J基因片段(正常地6J基因片段)。優(yōu)選的Vh重鏈基因座包含2個或更多V基因片段，25個功能性人D基因片段和6個人J基因片段。術語“V基因片段”包括來自ー種脊椎動物包括駱駝和人天然存在的V基因片段，該V基因片段任選經(jīng)選擇、突變或改造以改善特性，例如溶解度。V基因片段也在其它種屬例如鯊魚(見Kokubu等，(1988) ΕΜΒ0. J.，7，3413-3422)中發(fā)現(xiàn)或進化從而提供示例性結合蛋白的不同的Vh-樣家族，例如，免疫球蛋白輕鏈VL組分或T-細胞受體Vh組分的進化中。改善Vh域的溶解度的優(yōu)選方法結合了合理的(決不僅僅是隨機的)手段并且在Davies 和 Reichinann,(1996)Protein Eng. ,9(6),531-537 和 Riechmann 和 Muyldermans,(1999) J. immunol. Methods, 231, 25-38中舉例說明。通過親和力成熟和在接著VDJ重排的Vh基因有利突變的加入，自然選擇在體內也可發(fā)生。依據(jù)本發(fā)明當表達核酸時V基因片段必須可以和D基因片段、J基因片段和重鏈恒定(效應子)區(qū)(它可能包含幾個外顯子但ChI外顯子除外)重組從而產(chǎn)生僅有Vh重鏈抗體。依據(jù)本發(fā)明的V基因片段也包括在它的范圍內任何編碼同源物、衍生物或蛋白質片段基因序列，該基因序列可以和依據(jù)本發(fā)明的D基因片段、J基因片段和重鏈恒定區(qū)(包含I個或多個外顯子但非CHl外顯子)重組從而產(chǎn)生這里定義的僅有Vh重鏈抗體。因此VH編碼序列可以來自自然發(fā)生來源或使用本領域熟練者熟悉的方法合成。在本發(fā)明的上下文中“Vh域”指的是當與上述定義的D基因片段和J基因片段重組時V基因片段的表達產(chǎn)物。優(yōu)選，像這里使用的VH域保持溶解并且在不需要其它任何因子維持溶解度的生理性介質中有活性。優(yōu)選，通過VDJ重組和體細胞突變改善可溶的VH域結合抗原的能力。不依賴駱駝種屬特有的擴展的CDR3環(huán)的存在或缺失。VH域可以結合作為単體的抗原并且，當結合效應子恒定區(qū)時，依據(jù)使用的效應子分子(例如IgG、IgA IgM等)的選擇和改造或ニ聚化和多聚化的選擇機制可以產(chǎn)生單特異性、雙特異性、多特異性、ニ價或多價形式，通過去除CHl外顯子排除了當表達可溶的僅有重鏈的抗體合成物的部分時結合VL域的可能性(見Sitia等，(1990) Cell, 60, 781-790)。也可單獨改造VH域與不同蛋白域例如與毒素、酶和顯像劑從而產(chǎn)生用于靶向治療和診斷目的的融合蛋白。在本發(fā)明的上下文中術語“D基因片段”和“J基因片段”包括D和J基因片段的天然存在序列。優(yōu)選的D和J基因片段來自與V基因片段來源相同的脊椎動物。例如，如果V基因片段來自人那么溶解的或改造的D和J基因片段也優(yōu)選來自人?；蛘遃基因片段來自如駱駝而D和J基因片段來自人，反之亦然。術語D基因片段和J基因片段也包括在它們范圍內的衍生物、同源物和它們的片段只要所得的片段可以和像這里描述的重鏈抗體基因座的剩余組分重組從而產(chǎn)生這里描述的僅有重鏈的抗體。D和J基因片段也可來自自然發(fā)生來源或使用這里描述的本領域熟練者熟悉的方法合成。V、D和J基因片段可以重組并優(yōu)選經(jīng)過體細胞突變。V、D和J基因片段優(yōu)選來自單個脊椎動物種屬。這可以是任何脊椎動物種屬但優(yōu)
選人。另外，依據(jù)本發(fā)明的異源的重鏈基因座包含編碼重鏈恒定區(qū)的DNA的區(qū)域倘若在體內效應子起作用(例如IgG、IgM、IgA、IgE、IgD或它們的同種類型)。本發(fā)明也提供通過本發(fā)明的方法得到或可得到的抗原特異性僅有重鏈的抗體。重鏈恒定區(qū)操作上，在B細胞內可以和V基因片段、D基因片段和J基因片段重組的自然發(fā)生或改造的基因片段編碼重鏈恒定區(qū)。優(yōu)選重鏈恒定區(qū)來自免疫球蛋白基因座。依據(jù)本發(fā)明的這個方面，每個重鏈恒定區(qū)必需包含至少ー個重鏈恒定區(qū)基因，該重鏈恒定區(qū)基因不表達功能性ChI域所以僅有重鏈的抗體的產(chǎn)生可以發(fā)生。每個重鏈恒定區(qū)也可包含一個或多個其他重鏈恒定區(qū)外顯子，在其他重鏈恒定區(qū)基因也不表達功能性ChI域的條件下該重鏈恒定區(qū)外顯子選自CS，Cy 1-4，Cy，C ε和Ca 1-2。依據(jù)優(yōu)選種類或需要的抗體種類的混合物選擇重鏈恒定區(qū)基因片段。任選異源重鏈基因座為Cy -和CS-缺陷。例如，已知M類的Ig分子對激活巨噬細胞和補體途徑起重要作用。由于它的結合部位的極其近似，IgM對病原體包括病毒有高親和力。然而也已知IgM在快速免疫測定技術中難以使用而G類的Ig在這些技術中容易使用。為了這種使用，選擇優(yōu)選的抗體種類是有用的，例如IgG或IgM。缺失CHl的異源重鏈C Y基因座的全部或部分表達將產(chǎn)生任選的部分或全部IgG同種類型，依賴異源IgG基因座中存在的IgGl、IgG2、IgG3和IgG4同種類型?；蛘咧劓溈砂珻S基因。所得的IgE分子也可用于治療。或者，可以得到抗體的選擇混合物。例如，當重鏈恒定區(qū)包含Ca和Cy基因時可得到IgA和IgM0優(yōu)選依據(jù)本發(fā)明的重鏈恒定區(qū)是人源的，尤其當重鏈抗體用于人治療應用時。在重鏈抗體用于診斷或獸用目的吋，重鏈恒定區(qū)優(yōu)選來自實施診斷或獸醫(yī)治療的脊椎動物或哺乳動物的靶組織。當表達時,重鏈恒定區(qū)缺乏功能性ChI域。ChI外顯子和任選地，Cμ和CS恒定區(qū)，可突變、刪除或取代。優(yōu)選，刪除ChI外顯子。例如，帶有功能性ChI域的IgM的存在抑制B-細胞成熟并因此限制產(chǎn)生性表達。
哺乳動物本發(fā)明方法中使用的轉基因哺乳動物不為人。優(yōu)選的轉基因哺乳動物為嚙齒目動物例如兔、豚鼠、大鼠或小鼠。特別優(yōu)選小鼠。也可采用可選擇的其他哺乳動物例如山羊、綿羊、貓、狗或其它動物。優(yōu)選轉基因動物使用確定的卵母細胞注射技術及確定的ES細胞技術或克隆產(chǎn)
生。 有利的是，如果根據(jù)本發(fā)明方法表達僅有重鏈的抗體，哺乳動物內源性免疫球蛋白重鏈和任選輕鏈基因座缺失或被沉默。如上所述產(chǎn)生僅有重鏈的抗體的方法可特別用于產(chǎn)生人用治療用途的抗體，通常給予與抗體源物種不同的脊椎動物物種抗體導致抗所給予抗體免疫應答發(fā)生。因此，在另ー個方面本發(fā)明提供了表達異源重鏈基因座的轉基因哺乳動物?？筛脑爝@種哺乳動物使其產(chǎn)生包括輕鏈抗體的能力降低。產(chǎn)生抗體細胞可得自本發(fā)明轉基因哺乳動物且例如用來制備用于產(chǎn)生本文定義的僅有重鏈的抗體的雜交瘤。另外或可選擇性可自本發(fā)明轉基因哺乳動物分離核酸序列且用于產(chǎn)生其Vh域僅有重鏈的抗體或雙特異性/雙功能的復合體，所用DNA重組體技術對于本領域技術人員是熟知的?？蛇x擇性或另外的，可通過本發(fā)明轉基因動物免疫接種產(chǎn)生抗原特異性僅有重鏈的抗體。因此在另ー個方面，本發(fā)明提供了用抗原免疫本發(fā)明轉基因哺乳動物從而產(chǎn)生僅有重鏈的抗體的方法。在本發(fā)明這種方面的優(yōu)選實施方案中，哺乳動物為小鼠。僅有重鏈的抗體及其片段在另ー個方面中本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明方法可獲得的僅有重鏈的抗體及其功能性片段和衍生物。包括VH結合域的片段可通過酶切或溴化氰切割本發(fā)明僅有重鏈即缺乏輕鏈的抗體獲得(Jaton 等，(1968) Biochemistry, 7,4185-4195)。一種優(yōu)選的功能性片段為抗原特異性、僅有重鏈結合域即Vh結合域，其由在單V、D和J基因片段間重組然后體細胞突變所得Vh基因座表達。根據(jù)本發(fā)明這個方面，Vh基因座可自例如分離自上述免疫的轉基因動物的產(chǎn)生抗體細胞克隆。然后克隆序列可用噬菌體展示(Ward等，(1989) Nature, 341, 544-546)或用類似展示文庫展示,例如使用基于酵母體系(Boder 和 Wittrup, (1997)Nat. Biotechnol, 15, 553-7)和鑒定的抗原特異性 Vh 結合域。然后可單獨或作為融合蛋白在能放大規(guī)模(scalable)的細菌、酵母或其他表達體系中制備抗原特異性重鏈結合域。也可從通過免疫轉基因小鼠經(jīng)典方法所得特征性雜交瘤克隆編碼Vh結合域的序列。然后這些可用于產(chǎn)生Vh結合域及其衍生物包括具有不同效應子功能的工程的定義抗體種類(例如IgE或IgA)及其變異體。相應的，本發(fā)明也提供了產(chǎn)生Vh結合域的方法，包括步驟(a)分離表達所需抗原特異性、僅有重鏈的抗體的細胞或組織(優(yōu)選可溶的所需抗原特異性、僅有重鏈的抗體)；(b)自得自分離細胞或組織的mRNA克隆編碼Vh結合域的序列；(c)使用噬菌體或類似文庫展示編碼蛋白質；
(d)鑒定抗原特異性Vh結合域；且(e)在細菌、酵母、哺乳動物或其它可行的表達體系中單獨表達或作為融合蛋白表達Vh結合域?；蛘?，可使用酶切或化學切割技術及接著從其它切割產(chǎn)物分離含有Vh域片段而從本發(fā)明僅有重鏈的抗體產(chǎn)生含有Vh域的片段。自特征性雜交瘤分離Vh結合域，使用噬菌體或其他展示體系可直接將得自mRNA克隆的Vh結合域序列克隆進表達載體而不借助其它選擇步驟。
結合效應子區(qū)的僅有重鏈的抗體的產(chǎn)生體系包括適于大量培養(yǎng)技術的培養(yǎng)中哺乳動物細胞(例如CHO細胞)、植物(例如玉米)、轉基因山羊、兔、牛、綿羊、小雞和昆蟲幼蟲。其它產(chǎn)生體系包括病毒感染(例如昆蟲幼蟲和細胞系中桿狀病毒)是細胞培養(yǎng)和種系方法的備擇方法。其它產(chǎn)生方法對于本領域技術人員也是熟知的。如果需要僅有重鏈IgA或IgM裝配，共表達的“ J鏈”是有利的。用于產(chǎn)生駱駝僅有重鏈的抗體或單獨產(chǎn)生Vh結合域的適當方法也是本領域中已知的。例如駱駝Vh結合域在細菌體系中產(chǎn)生且駱駝僅有重鏈同ニ聚體在雜交瘤和轉染的哺乳動物細胞中產(chǎn)生(參見Reichmann和MuyIdermans, (1999)J. Immunol. Methods,231,25-38)。也適當建立了使用噬菌體展示技術獲得工程人Vh結合域的表達方法(Tanha等，
(2001)J. Biol. Chem.，276，24774-24780 及參考)。從轉基因飛行昆蟲系(fly lines)中昆蟲幼蟲顯示產(chǎn)生血淋巴內功能性僅有重鏈的抗體片段，性質與通過哺乳動物細胞產(chǎn)生的相同抗體一致(PCT/GB2003/0003319)。本發(fā)明也提供了根據(jù)本發(fā)明這個方面的方法能夠獲得的抗原特異性単體或ニ聚體的Vh結合域。本發(fā)明也提供包括異源重鏈基因座的多核苷酸序列、分離的編碼本發(fā)明僅有重鏈的抗體的多核苷酸及包含異源重鏈基因座的載體，或其片段，或分離的編碼本發(fā)明僅有重鏈的抗體多核苷酸。本發(fā)明也提供了用本發(fā)明的異源重鏈基因座或其片段或分離的編碼僅有重鏈的抗體或抗體片段轉化的宿主細胞。在第二個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明抗原特異性Vh結合域、以及與其連接的提供效應子活性的效應子部分的多肽復合體。此外，這種效應子活性由重鏈恒定區(qū)提供且定位在分子氨基末端或羧基末端。這些多肽復合體保留有抗原特異性Vh結合域賦予的生理學功能，也具其他靶向作用或效應子部分的效應子功能。這種多肽復合體可為功能性單體形式，或依賴于效應子部分、ニ聚體、四聚體、五聚體、多聚體或結合不同Vh結合域而賦予多價和多特異性的其他復合體間的設計及相互作用。Vh結合域可存在于結合分子的氨基末端或羧基末端(參見圖I的ニ聚體實例)。如果效應子部分包含結合域，其特異性可不同于抗原特異性Vh結合域的特異性。這種排列的優(yōu)點為多肽復合體可促進不同靶標的交聯(lián)。例如雙特異性多肽復合體可用于促進細胞-細胞相互作用及細胞/病原體相互作用。在此實施方案中，可利用本發(fā)明多肽復合體例如用來橋接兩種細胞類型例如病原體和巨噬細胞(參見Biburger等，(2005) J Mol.Biol. ,346,1299-1311)。Vh結合域的用途優(yōu)選為在這種雙特異性設計中scFV結合域的用途。Vh結合域具高度結合親和カ且可用最小載體結構將其結合進這種多肽復合體中且相對于四聚體親代分子在設計上不需考慮維持scFVs特異性和親和力。若要構建ニ聚體或多聚體多肽復合體，則加入ニ聚化域例如加入得自免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的Ch2和Ch3域(見圖2)。本文所用術語“效應子部分”包括在細胞上介導所需生物學效應的任何部分。此效應子部分優(yōu)選可溶的且可為肽、多肽或蛋白質或可為非肽結構。例如效應子部分可為酶、激素、細胞因子、藥物、前體藥物、毒素特別是蛋白質毒素，螯合結構中放射性核素、結合域、ニ聚化域或相互作用域、顯像劑、白蛋白或抑制劑。白蛋白可用作效應子部分而改善抗原特異性Vh結合域的穩(wěn)定性或藥物代謝動カ學和/或藥效學性質(Sung 等,(2003) J. interferon Cytokine Res. , 23 (I) :25-36)?；蛘撸硬糠挚蔀榫郅偿舜蓟慕Y構或天然糖基化的結構從而改善藥效學性質。這種效應子部分可為鍵合到抗原特異性Vh結合域的肽，或者其可化學性鍵合到抗原特異性重Vh域，例如通過使用化學連接結構例如馬來酰亞胺交聯(lián)劑?？蛇x擇的本發(fā)明的多肽復合體可為表達的融合蛋白。如此本發(fā)明也包括包括異源重鏈基因座多核苷酸序列， 或者本發(fā)明的編碼僅有重鏈的抗體的分離的多核苷酸，其中多核苷酸進一歩包含在閱讀框內編碼效應子部分的一個或多個外顯子。這種外顯子可為多核苷酸的5’或3’末端。例如多核苷酸可以下述次序(following order)并在閱讀框內包含Vh和結合域\效應子部分基因片段。關于基因融合，可用編碼融合蛋白氨基酸序列的重組DNA構建體與編碼位于相同閱讀框各個域的DNA達到各個域的連接。這種構建體具有診斷和治療價值。對于診斷，這種效應子域可為熒光蛋白質(例如GFP)或酶(例如β-gal)?；蛘?，這種效應子域可為增強結合于底物的tag(例如多組氨酸或生物素)，可為提供ニ抗結合位點或亮氨酸拉鏈或可利于結合熒光標記的類似結合基序的抗原。多肽復合體本發(fā)明人也清楚可能產(chǎn)生包含単獨或與包含互補裝配域且具其他效應子活性的分離效應子(輕)鏈組合的至少部分抗體重鏈的ニ價或多價多肽復合體。本發(fā)明的多肽復合體保留重鏈恒定區(qū)賦予的生理功能及與效應子鏈相關的另外的效應子部分功能(圖3)。因此在第三個方面，這種多肽復合體包含與ー種或多種效應子鏈(輕鏈)組合的重鏈。本發(fā)明的第二個方面提供了ー種包含一對重鏈和一對效應子鏈的多肽復合體，其中一對重鏈相互連接；一條效應子鏈與一條重鏈相連，而另一條效應子鏈與另一條重鏈相連；每個重鏈包含結合域、優(yōu)選包含至少Ch2、Ch3和任選Ch4恒定區(qū)域的ニ聚化域和能夠結合于效應子鏈互補裝配域的效應子部分；效應子鏈包含連接于效應子部分的互補裝配域，其中裝配域和互補裝配域通過非共價相互作用互相連接。優(yōu)選的重鏈中的效應子部分不同于效應子鏈中的效應子部分。任選的多肽復合體包括柔軟的鉸鏈樣域，該域位于Ch3域(或Ch4域，如果存在)的羧基末端并通過它與裝配域相連。優(yōu)選的多肽復合體包括天然鉸鏈域或柔軟的位于結合域和Ch2域之間工程鉸鏈樣域。存在的鉸鏈區(qū)促進所得多肽復合體中結合域和效應子部分獨立發(fā)揮功能。
在第一條多肽重鏈中效應子部分任選特異性不同于第二條多肽重鏈中效應子部分的特異性。根據(jù)本發(fā)明，多肽復合體的效應子部分可被結合域取代。優(yōu)選的結合域包含Vh域(如本發(fā)明第一個方面所定義)或細胞受體結合域。所得四價ニ聚體結合蛋白(多肽復合體)可包含多達4個不同效應子部分。優(yōu)選的在重鏈氨基末端的效應子部分相同，且在羧基末端的也相同(但是識別不同抗原或表位到氨基末端)，促進單個同ニ聚體的裝配。這種分子可確證捕獲病原體，通過包括適當?shù)闹劓溣?例如IgG或IgM)提供的效應子功能的優(yōu)勢。根據(jù)本發(fā)明第三個方面，示例性多肽復合體有利于細胞化學標記、靶向作用或治療。例如效應子分子包含定向于癌細胞表面標記的抗原特異性Vh結合域及包含結合域特定的前體藥物轉化酶(效應子鏈)的效應子部分。抗原特異性Vh結合域結合于靶標且使效應子部分幾乎進入靶標從而在結合效應子鏈上其在前體藥物(例如帶有CB1954的硝基還原酶)中可在靶標上發(fā)揮生物功能。作為ニ聚化域的包括的免疫球蛋白重鏈效應子功能也可利于消除靶細胞。效應子鏈效應子鏈包含互補結合域和效應子部分，其通過重鏈效應子部分與重鏈連接從而形成裝配的多肽結合復合體。效應子鏈互補裝配域可為效應子部分或蛋白質或融合或化學性連接于效應子部分的可選擇配體的整體部分。裝配多肽結合復合體的重鏈結合于靶標且使效應子(輕)鏈部分幾乎進入靶標從而發(fā)揮靶標的生物功能。效應子部分本文所用術語“效應子部分”包括在細胞上介導所需生物效應的任何部分。效應子域可為細胞例如T-細胞、肽、多肽或蛋白質或可為非肽結構。例如效應子域可為酶、藥物、前體藥物、毒素特別是蛋白質毒素、螯合結構中放射性核素或結合域。根據(jù)所需效應，與互補裝配域相關效應子部分可為細胞、蛋白質、有機物或天然的無機物。關于本發(fā)明所有上述方面中所用術語“結合域”包括任何生理性介質中有活性的多肽域。在生理條件下這種結合域也必須具有結合于靶標的活性。這種結合域包括可介導結合或附著到細胞表面的域。本發(fā)明的多肽復合體中可使用的適當?shù)挠驗椴溉閯游?、原核細胞或病毒細胞粘附分子、細胞因子、生長因子、受體拮抗劑或激動劑、配體、細胞表面受體、調節(jié)因子、結構蛋白質和肽、血清蛋白、分泌性蛋白、質膜相關蛋白質、病毒抗原、細菌性抗原、原生動物抗原、寄生性抗原、脂蛋白、糖蛋白、激素、ネ申經(jīng)遞質、凝固因子、工程單鏈Fvs等。優(yōu)選的結合域為脊椎動物Vh域，更優(yōu)選哺乳動物Vh域例如人Vh域。結合域可包含駱駝Vh(Vhh)域或可包含得自非-駱駝的Vh域。優(yōu)選的結合域為人Vh域。由于為適應體內抗原激發(fā)經(jīng)VDJ重排和體細胞突變產(chǎn)生而具有更高親和力，與得自合成噬菌體文庫的Vh結合域相比，Vh結合域優(yōu)選得自轉基因動物或駱駝(如前面所述)的B-細胞來源。如果效應子部分包含結合域，優(yōu)選其具有與重鏈結合域不同的特異性。重排的優(yōu)點是多肽復合體可促進不同靶標交聯(lián)或結合靶細胞上的不同抗原(例如病原體)。
第一條重鏈中結合域可具有與第二條重鏈中結合域不同的特異性。以這種方式，多肽復合體至少為ニ價且能夠交聯(lián)不同靶標，且效應子域能夠在兩個靶標均起作用?？赏ㄟ^結合四價重鏈和包含帶有不同特異性和功能性的效應子域的效應子鏈產(chǎn)生多價多肽復合體。同樣，第一條重鏈中效應子部分可具有與第二條重鏈中效應子部分不同的特異性，其允許捕獲超過一條具不同功能性的效應子鏈。結合于效應子部分的互補裝配域當重鏈與輕鏈相連時，本文所用術語“效應子部分”和“互補裝配域”包括相互間可形成至少非共價連接的任何部分。例如效應子部分和互補裝配域可為蛋白質、肽片段或能夠形成蛋白質-蛋白質相互作用的共有序列，蛋白質-蛋白質相互作用例如可見于免疫球蛋白重鏈C0I域和免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)、亮氨酸拉鏈、VCAM和VLA-4、整聯(lián)蛋白和細胞外基質蛋白、整聯(lián)蛋白和細胞表面分子例如⑶54或⑶102、ALCAMs和SRCR域、scFv和抗原或Vh結合域和抗原之間。重鏈
重鏈的ニ聚化域包含免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)，此恒定區(qū)(Ch外顯子)可賦予此多肽結合復合體其它生理功能。特別的是，根據(jù)抗體恒定域類別或亞類，免疫球蛋白重鏈恒定域除其它以外還可提供如補體結合作用、巨噬細胞活化和與Fe受體的結合。如上述討論，已經(jīng)很好證明了表達的這種重鏈在體內效應子功能中具有重要作用。建立的細胞系可產(chǎn)生多肽復合體，具有有利的靶向和生物活性但是重鏈恒定區(qū)可為不需要的診斷性或治療性類別，或者其可能不分泌適當?shù)臄?shù)量。相應的，本發(fā)明多肽復合體的重鏈恒定域可特異性改變或者局部或完全不產(chǎn)生或清除免疫球蛋白重鏈。例如，已知M類的Ig分子在巨噬細胞活化和補體途徑中起重要作用。由于幾乎進入其結合位點，IgM具有高度病原體親和力，包括病毒。但是亦知IgM難以使用于快速免疫測定技術，而G類的Ig可容易的使用于這些技術中。為這種用途，轉換重鏈類別自μ至Y域是有利的。重鏈ら基因座的單獨表達可產(chǎn)生IgG，包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4同種型，部分也可活化補體。IgG抗體結合及活化巨噬細胞和粒性白細胞，且可穿過胎盤。多種抗體類別的其它應用如前所述。本發(fā)明多肽復合體的重鏈恒定區(qū)可為如上文定義的人、兔、大鼠或小鼠來源。優(yōu)選的其為人源。也可単獨用本發(fā)明的多肽復合體通過使用沒有效應子功能的ニ聚化域來封閉配體與受體的結合?？赏ㄟ^多特異性多肽復合體封閉多重受體(Multiple receptors)。在本發(fā)明第四方面中，效應子分子可包含ニ聚化域，從而使效應子分子可與分離的效應子分子結合。ニ聚化域可包含ー種或多種Ch2、Ch3或Ch4抗體恒定區(qū)域和/或J鏈。在本發(fā)明這種實施方案中，兩種或多種效應子分子可結合產(chǎn)生效應子分子ニ聚體或多聚體。這些效應子分子可相同(使產(chǎn)生效應子分子同ニ聚體或同多聚體)或不同(使產(chǎn)生效應子分子異源ニ聚體或異源多聚體)。優(yōu)選的效應子分子ニ聚體或多聚體為ニ價或多價。優(yōu)選的兩種或多種效應子分子恒定區(qū)(即ニ聚化域)相同，因此降低產(chǎn)生不均一性的可能性。根據(jù)本發(fā)明第四個方面，提供了包含包括第一條多肽重鏈和第二條多肽重鏈的ニ聚體的多肽復合體，其中每個多肽重鏈包含結合域和任選包含至少Ch2、Ch3和任選Ch4抗體恒定域的ニ聚化域，和任選的效應子部分，其中優(yōu)選
在第一條多肽重鏈中結合域具有與第二條多肽重鏈中結合域相同的特異性，及這兩種多肽重鏈的恒定區(qū)(ニ聚化域)相同。優(yōu)選第一條和第二條鏈具有相同的效應子部分。優(yōu)選的ニ聚化域包含至少Ch2、Ch3和任選的Ch4抗體恒定域。本發(fā)明的第四個方面也提供包含多個多肽重鏈ニ聚體和J鏈的多肽復合體，其中多個多肽重鏈ニ聚體通過J鏈裝配；每個多肽重鏈包含結合域和相同的μ、ε、α或Y CH2、CH3和任選的CH4域 '及在多肽復合體中至少有兩種具有不同特異性的結合域(參見圖4和5)。如上述本發(fā)明第四方面所定義，每個重鏈恒定區(qū)優(yōu)選包含至少ー個重鏈恒定區(qū)基因，其表達產(chǎn)物沒有功能性ChI域從而產(chǎn)生僅有重鏈的抗體。每個重鏈恒定區(qū)也可包含一種或多種附加的選自包括CS、CYl_4、Cl·!、Ce和Ca"的基團的重鏈恒定區(qū)基因，條件是附加的重鏈恒定區(qū)基因也不表達功能性ChI域。根據(jù)優(yōu)選的所需抗體種類的類別或混合物選擇重鏈恒定區(qū)基因。優(yōu)選在表達的IgA和IgM中僅有兩種不同特異性的結合域。在一個實施方案中，每個重鏈包括CH4域，恒定域為a域且多肽復合體包括J鏈。在另ー個實施方案中，每個重鏈包括CH4域，恒定域為μ域且抗體包括J鏈。多肽復合體的裝配本發(fā)明多肽復合體的調節(jié)域排列使其以很多可能變化的排列次序構建。在多肽復合體的域結構和氨基酸序列中的這種轉變可通過適當突變或相應DNA編碼序列的適當區(qū)域的半合成和置換獲得。置換或附加域可得自相容的重組DNA序列。例如重鏈可包括天然鉸鏈或工程的柔性多肽域，其位于結合域和CH2域的氨基末端之間，也位于效應子域和重鏈(Ch3或Ch4)的C-末端之間。本發(fā)明多肽復合體中重鏈表達為融合蛋白。本發(fā)明這個方面的多肽復合體中效應子鏈可表達為融合蛋白或可通過化學方法裝配，或者如果細胞可自血液或組織中分離則或可進行體內捕獲(例如白蛋白)。在基因融合下，可使用編碼融合蛋白的氨基酸序列與編碼位于相同閱讀框內多種域的DNA達到各種域的連接。如果以融合蛋白部分存在，效應子部分可位于互補裝配域氨基末端或羧基末端?；蛘?，可通過如本領域中已知的正常肽化學方法而不通過合成融合蛋白的方法裝配效應子鏈中的域。可通過肽鍵或通過化學鍵連接。例如效應子部分可為鍵合到互補裝配域的肽，或者其可化學性鍵合到互補裝配域例如通過使用化學連接結構例如馬來酰亞胺交聯(lián)劑。效應子部分可位于重鏈中任何區(qū)域。例如效應子部分可位于重鏈C末端或在結合域與多肽復合體的Ch2域或鉸鏈域之間。由于可能干擾效應子功能和ニ聚化域，優(yōu)選裝配域不位于Ch2和Ch3之間。優(yōu)選效應子部分經(jīng)肽的柔性接頭或鉸鏈樣區(qū)連接于重鏈的氨基末端或羧基末端從而促進效應子部分的獨立結合/發(fā)揮功能。多核苷酸、載體和宿主細胞
本發(fā)明也提供了編碼任何一種本發(fā)明多肽復合體的重鏈的多核苷酸序列，也提供了包含ー種或多種上述多核苷酸的載體和用編碼本發(fā)明多肽復合體重鏈轉化的宿主細胞。多核苷酸優(yōu)選包括使表達的重鏈以同ニ聚體分泌進入宿主細胞生長培養(yǎng)基中的序列。宿主細胞可為任何來源，包括細菌和酵母細胞，但是優(yōu)選脊椎動物宿主細胞，更優(yōu)選哺乳動物宿主細胞。用編碼包含對不同靶向特異的結合域的重鏈的第二種載體轉染相同宿主細胞導致兩種構建體共表達及同ニ聚體和異ニ聚體混合物的裝配。同ニ聚體將顯示對同族抗原的特異性且異ニ聚體將結合兩個抗原。本發(fā)明也提供了用至少一條本發(fā)明多肽復合體的效應子鏈編碼的載體轉化的宿主細胞。這種宿主細胞可為任何來源，包括細菌和酵母細胞，但是優(yōu)選脊椎動物宿主細胞，更優(yōu)選哺乳動物宿主細胞?？蛇x擇的效應子鏈可使用本領域已知方法合成。本發(fā)明也提供用編碼至少一條本發(fā)明多肽復合體重鏈的載體轉化的宿主細胞。這種宿主細胞可為任何來源，包括細菌和酵母細胞，但是優(yōu)選脊椎動物宿主細胞，更優(yōu)選哺乳動物宿主細胞。可選擇的重鏈可使用本領域已知方法合成。本發(fā)明也提供了用編碼本發(fā)明多肽復合體的至少一條重鏈和至少一條效應子鏈的載體轉化的宿主細胞。這種宿主細胞可為任何來源，包括細菌和酵母細胞，但是優(yōu)選脊椎動物宿主細胞，更優(yōu)選哺乳動物宿主細胞?？蛇x擇的這些鏈可使用本領域已知方法獨立或裝配合成。另外本發(fā)明提供了表達本發(fā)明的至少ー種重鏈同ニ聚體或異ニ聚體多肽復合體的轉基因生物體。這種轉基因生物體可為非人脊椎動物或哺乳動物，植物或昆蟲。本發(fā)明也提供了產(chǎn)生種類特異性僅有重鏈的抗體及其Vh域的方法，根據(jù)本發(fā)明第ー個方面通過用抗原免疫本發(fā)明的轉基因生物體而制得。在本發(fā)明這個方面的優(yōu)選實施方案中，生物體為小鼠。用于健康護理應用產(chǎn)生的抗體和多肽復合體需要大規(guī)模的制造體系，上述詳細討論了其實例。這種體系包括適于大規(guī)模培養(yǎng)技術的植物(例如玉米)、轉基因牛和綿羊、雛雞和昆蟲幼蟲。其他產(chǎn)生體系包括病毒感染(例如昆蟲幼蟲和細胞系中桿狀病毒)細胞培養(yǎng)和種系方法也為本領域技術人員所熟知。這些方法和本領域已知的其他適當方法可用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽結合復合體?？墒褂眠@些方法產(chǎn)生同ニ聚體和/或異ニ聚體。本發(fā)明的僅有重鏈的抗體和多肽復合體的用途本發(fā)明的僅有重鏈的抗體和多肽結合復合體有許多用途。例如，本發(fā)明的僅有重鏈的抗體和多肽復合體包含雙特異性和多特異性多肽復合體。這些復合體特別有利于例如治療性用于治療和預防感染性疾病。本發(fā)明的僅有重鏈的抗體和多肽結合復合體有利于細胞化學標記、靶向作用、治療和診斷。
在單抗體治療中，病原體逃避(pathogen escape),例如由于突變導致失去單ー結合位點將喪失抗體的治療效應。產(chǎn)生的異ニ聚體多肽復合體識別相同病原體上不同抗原可克服這種問題。在本發(fā)明多肽復合體中具有不同特異性的至少兩種結合域的用途也可用于提高細胞-細胞相互作用和細胞/病原體相互作用。
在這種實施方案中，本發(fā)明多肽復合體可用作例如在兩種細胞類型例如病原體和巨噬細胞，或腫瘤細胞和T-細胞之間的橋接(bridge)多肽復合體?？蛇x擇的該多肽復合體可識別相同病原體上兩種或多種表位，通過由重鏈恒定區(qū)単獨提供的效應子功能?；蛘?，雙特異性多肽結合復合體可使用在體內的靶細胞和組織，接著可使用于捕獲循環(huán)的效應子分子或顯像劑。例如雙特異性腫瘤靶向劑可使用到捕獲前途前體藥物轉化復合物(pro-drug converting complexes)從而局限性轉化前體藥物為活性劑。依賴于選擇的結合域，與效應子劑結合的雙特異性或多特異性結合復合體也可用于結合并破壞ー種或多種病原體。可選擇的識別相同病原體上不同抗原的兩種或多種結合域的存在提供臨床利益且降低了病原體逃避和病原體內突變導致藥物過量的可能性。本發(fā)明根據(jù)本發(fā)明第一個方面提供了僅有重鏈的抗體或其片段，根據(jù)本發(fā)明第二個方面提供了多肽鏈和復合體，且根據(jù)本發(fā)明第三個方面提供了效應子鏈和多肽復合體。所有均適于人的藥物用途，且如此本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的僅有重鏈的抗體、多肽鏈、效應子鏈或多肽復合體的藥用組合物。本發(fā)明也提供了本發(fā)明的僅有重鏈的抗體、多肽鏈、效應子鏈或多肽復合體在制備用于預防和/或治療疾病藥物中的用途。依賴于給藥方法和藥物效應，可共同或単獨制備重鏈和效應子鏈。在給予患者前典型制備藥用組合物和藥物。例如特別如果其為凍干，僅有重鏈的抗體或多肽復合體可與穩(wěn)定劑混合。加入糖(例如甘露醇、蔗糖或海藻糖)典型的賦予冷凍干燥期間穩(wěn)定性，且優(yōu)選的穩(wěn)定劑為甘露醇。人血清白蛋白(優(yōu)選重組體)也可作為穩(wěn)定劑加入。也可使用糖類混合物例如蔗糖和甘露醇、海藻糖和甘露醇等。可向組合物中加入緩沖液例如Tris緩沖液、組氨酸緩沖液、甘氨酸緩沖液或優(yōu)選的磷酸鹽緩沖液(例如含有磷酸ニ氫鈉和磷酸氫ニ鈉)。加入緩沖液使pH優(yōu)選為7. 2-7. 8，且特別的PH約為7. 5。為冷凍干燥后重組，可使用無菌注射用水。也可能用包含人血清白蛋白(優(yōu)選重組體)的含水組合物重建凍干塊(lyophilised cake)。通常使用純化形式的僅有重鏈的抗體和多肽復合體連同藥理學適當?shù)妮d體。由此本發(fā)明提供了用于治療患者的方法，包括給予患者本發(fā)明的藥用組合物。優(yōu)選患者為人，可為兒童(例如幼兒或嬰兒)、青少年或成人但通常為成人。本發(fā)明也提供了本發(fā)明僅有重鏈的抗體、多肽鏈、效應子鏈或多肽復合體作為藥物的用途。本發(fā)明也提供了本發(fā)明僅有重鏈的抗體、多肽鏈、效應子鏈或多肽復合體在制造治療患者藥物中的用途。這些用途、方法和藥物優(yōu)選用來治療ー種下列疾病或紊亂傷ロ愈合，細胞増殖性疾病包括腫瘍、黑素瘤、肺、結腸直腸、骨肉瘤、直腸、卵巣肉瘤、頸部、食管、乳房、胰腺、膀胱、頭部和頸部及其他實體腫瘤,骨髓組織增殖性疾病例如非白血性白血病、非霍奇金淋巴瘤、白細胞減少、血小板減少癥、血管發(fā)生疾病、卡波西肉瘤，自身免疫性/炎性疾病包括變態(tài)反應癥、炎性腸病、關節(jié)炎、銀屑病和呼吸道炎癥、哮喘、免疫疾病和器官移植排異反應， 心血管和脈管病包括高血壓、水腫、心絞痛、動脈粥樣硬化、血栓形成、敗血病、休克、再灌注損害和局部缺血，神經(jīng)疾病包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、阿爾茨海默病、腦損害、肌萎縮的側生硬化癥和疼痛，發(fā)育障礙，代謝疾病包括糖尿病、骨質疏松癥和肥胖癥，AIDS和腎臟病，感染包括病毒感染、細菌感染、真菌感染和寄生蟲感染，與胎盤相關的病癥及其他癥并用于免疫療法。在另外的方面，本發(fā)明提供本發(fā)明僅有重鏈的抗體或多肽結合復合體作為診斷齊U、預后劑或治療性顯像劑的用途。另外本發(fā)明提供単獨或與一種或多種本發(fā)明效應子(輕)鏈結合的本發(fā)明重鏈同ニ聚體或異ニ聚體作為治療性顯像劑、細胞化學試劑或診斷劑的用途。本發(fā)明提供本文所述僅有重鏈的抗體或其片段作為細胞內結合劑或抗體酶的用途。優(yōu)選的僅有重鏈的抗體片段為可溶性抗原特異性Vh結合域。本發(fā)明也提供本發(fā)明抗原特異性單鏈抗體或Vh結合域作為酶抑制劑或受體阻滯劑的用途。優(yōu)選的僅有重鏈的抗體片段為可溶的抗原特異性VH結合域。本發(fā)明也提供融合到效應子分子的Vh域作為治療性顯像劑、診斷劑、抗體酶或試劑的用途。附圖簡述圖IA和IB :顯示包含結合域(Vh) ニ聚化域(任選CH2、CH3和CH4)及效應子部分(EM)。結合域和效應子部分可定位在ニ聚化域的氨基末端或羧基末端。標示了柔性接頭(一)和鉸鏈(/ )區(qū)圖2A和2B :顯示結合域的不同構型及通過其他結合域置換效應子部分。A.優(yōu)選選項，因為產(chǎn)生同ニ聚體。不需要分離產(chǎn)物。B.產(chǎn)生同ニ聚體和異ニ聚體的混合物。需要分離產(chǎn)物。圖3 :顯示與效應子鏈結合的重鏈多肽復合體。效應子鏈包含互補結合域(CBD)和效應子部分(EM)。CBD由重鏈的EM識別。CBD與效應子融合或是效應子的一部分，例如酶、毒素、螯合劑、顯影劑。效應子鏈可獨立于重鏈合成。圖4顯示與J鏈結合的ニ價分泌型IgA。圖5顯示經(jīng)J鏈裝配的多價僅有重鏈IgM樣多肽復合體。圖6 :顯示產(chǎn)生表達IgG基因座的轉基因小鼠并用抗原激發(fā)后產(chǎn)生功能性僅有重鏈的抗體和Vh域的策略。圖7 :顯示產(chǎn)生表達IgM基因座的轉基因小鼠并用抗原激發(fā)后產(chǎn)生功能性僅有重鏈的抗體和Vh域的策略。圖8 :顯示產(chǎn)生表達IgA基因座的轉基因小鼠并用抗原激發(fā)后產(chǎn)生功能性僅有重鏈的抗體和Vh域的策略。圖9 :使用VhhI和Vhh2引物以及人CY2引物對其基因座中帶有的恒定區(qū)中具駱駝剪接突變的小鼠的骨髄cDNA進行PCR而去除CH1，并對PCR產(chǎn)物進行序列対比。結果顯示CHl未被清除。

圖10-13 VH/駱駝Vh(Vhh)構建體的結構。l_n代表任何數(shù)量的VH基因，或D或J片段。人基因座的正常補體為51個V基因，25個功能性D片段(附加2個沒有功能的片段)及6個J片段。在Cy (IgM)或C ε (IgE)區(qū)的情況下，沒有H區(qū)且在CH3和Ml之間有另外的外顯子。VH基因突變而提供如共有域(public domain)中溶解性。VH基因、D和J片段及C外顯子優(yōu)選人，但是可源自任何其他物種包括駱駝。后者、情況下駱駝VH(VHH)由于天然可溶而不突變。
圖14 :用于產(chǎn)生對E. coli HSP70的僅有重鏈IgG的小鼠免疫接種方案和抗體測定。圖15 :得自轉基因小鼠脾細胞流動細胞計數(shù)分析和免疫組化結果。圖16 =DKTP免疫的轉基因小鼠的ELISA分析結果和抗體文庫的序列分析結果。圖17 :在免疫的轉基因小鼠中體細胞突變和VDJ重排的實例。圖18 :用含有A5抗體應激質粒轉染的Tet-on細胞系上免疫染色測定結果。圖19 :轉基因小鼠系血清的蛋白質印跡分析結果。圖20 :人IgM混合通過IgM附加IgG基因座小鼠產(chǎn)生的人單鏈IgM的大小分級分離。圖21 :單鏈IgM和抗人TNF α產(chǎn)生的IgG抗體的ELISA分析結果。圖22 :顯示具有對HSP70和a GAG結合親和力的同ニ聚體質粒的產(chǎn)生策略。圖23 =CHO細胞中同ニ聚體多肽復合體的功能性表達。圖24 :證明同ニ聚體多肽復合體同時功能性結合于a GAG和HSP70。圖式代表ニ價、雙特異性抗體。第二種可變區(qū)(直接抗gag的VHH2)克隆到含有其他特異性的僅有重鏈的抗體(直接抗HSP70的VHH1)的羧基末端。CH3和VHH2之間的鉸鏈區(qū)被聯(lián)結子置換，其中所有半胱氨酸被脯氨酸置換(箭頭)。用Gag包被ELISA板，用I %牛奶/I % BSA的PBS溶液封閉，首先用雙抗體培養(yǎng)基(I 2稀釋)然后用BI21細胞裂解物(含有HSP70)(I 2稀釋)孵育。Elute結合蛋白和樣品緩沖液=2-巰基こ醇且在8%凝膠上跑電泳。用抗Gag的多克隆/單克隆抗體、雙抗體和HSP70染色。a Gag :兔多克隆儲α兔-AP (藍色)。aHSP70 :單克隆/山羊α人IgG-HRP (棕色)。α雙抗體山羊α人IgG-HRP (棕色)。泳道I :Gag/雙抗體/BI21細胞裂解物。泳道2 =Gag/培養(yǎng)基(為雙抗體陰性對照)/BI21。泳道3 牛奶-BSA/雙抗體/BI21。泳道4 牛奶-BSA/培養(yǎng)基/BI21。泳道5 :Gag/雙抗體/-牛奶-BSA。泳道6 =Gag/培養(yǎng)基/-牛奶-BSA。圖25 :顯示產(chǎn)生同ニ聚體多肽復合體，任選與具有IgG效應子功能的效應子鏈結合的策略。圖26 :顯示產(chǎn)生同ニ聚體多肽復合體，任選與具有IgG效應子功能的效應子鏈結合的策略。通用技術除非另有定義，本文所用所有技術或科學方法具有與本領域普通技術人員的(例如在細胞培養(yǎng)、分子遺傳學、核酸化學、雜交技術和生物化學中)通常理解相同的意義。標準技術用為分子、遺傳、生物化學方法(普遍參見Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆實驗指南)，第二版.(1989) Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.和 Ausubel 等，Short Protocols inMolecular Biology (精編分子生物學實驗指南)(1999)第四版,John Wiley & Sons, Inc.)和化學方法。另外優(yōu)選 Harlow & Lane,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N. Y,為標準免疫技術。在產(chǎn)生本發(fā)明ニ價和多價多肽復合體、單一重鏈抗體及其片段中可使用任何適當?shù)闹亟MDNA技術。構建包含編碼每個多肽復合體鏈或抗體鏈的DNA序列的典型表達載體例如質粒。為免疫球蛋白酶和化學片段并分離所得片段可使用任何適當建立的技木。本發(fā)明也提供包括用于表達轉基因小鼠中僅有重鏈的抗體的構建體的載體，及本發(fā)明多肽復合體的構建和表達的載體。應理解可構建含有編碼超過多肽鏈的DNA序列的單個載體。例如編碼兩種不同重鏈的DNA序列可插入在相同質粒上不同位置。 可選擇的編碼每個多肽鏈的DNA序列可獨自插入質粒，從而產(chǎn)生許多構建的質粒，每個編碼ー種特定的多肽鏈。優(yōu)選質粒與插入的序列相客。然后使用每個質粒轉化宿主細胞從而每個宿主細胞含有編碼多肽復合體中每條多肽鏈的DNA序列。在細菌體系中可用于克隆的適當?shù)谋磉_載體包括質粒例如ColEl、pcRl、pBR322、pACYC 184和RP4，噬菌體DNA或這些的任何衍生物。在酵母體系中克隆使用的適當?shù)谋磉_載體包括基于2微米來源的質粒。含有適當哺乳動物基因啟動子序列的任何質?？墒褂迷诓溉閯游矬w系克隆。昆蟲或桿狀病毒(bacculoviral)啟動子序列可用于昆蟲細胞基因表達。這種載體包括得自例如pBR322、牛絨毛狀瘤病毒、逆轉錄病毒、DNA病毒及牛痘病毒的質粒。為表達多肽復合體或抗體可使用適當?shù)乃拗骷毎?，包括細菌、酵母和真核細胞例如昆蟲或哺乳動物細胞系，轉基因植物、昆蟲、哺乳動物和其他無脊椎動物或脊椎動物表達體系。本發(fā)明的多肽復合體和單一重鏈抗體應理解本發(fā)明術語“多肽復合體”、“單一重鏈抗體”及“異源重鏈基因座”也包括得自任何來源的同源多肽和核酸序列，例如相關細胞同源物、其他物種的同源物及其變異體或衍生物。因此本發(fā)明包括變異體、多肽復合體和本文所述抗體的同源物或衍生物。在本發(fā)明上下文中，同源序列其中至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%、99· 6%、99· 7%、99· 8%、99· 9%相同，優(yōu)選至少 98 %或 99 %相同，包括氨基酸序列，在氨基酸水平至少30，優(yōu)選50、70、90或100個氨基酸。雖然同源性也可依據(jù)類似性考量(即具有類似化學性質/功能的氨基酸殘基)，但是在本發(fā)明上下文中優(yōu)選依據(jù)序列鑒定表達同源性。本發(fā)明也包括為產(chǎn)生本發(fā)明多肽復合體和抗體中使用而構建的表達載體和轉化的宿主細胞。在相同宿主細胞中表達各個鏈后，其可恢復而提供活化形式的全部多肽復合體或僅有重鏈的抗體?？紤]在本發(fā)明優(yōu)選形式中，各個重鏈經(jīng)宿主細胞處理從而形成利于自其分泌的全部多肽復合體或抗體。優(yōu)選的效應子鏈分別通過宿主細胞或合成方法產(chǎn)生。用于制備重組抗體多肽復合體的技術在上述參考文獻中描述，且也參見于例如EP-A-0623679、EP-A-0368684 和 EP-A-0436597。轉基因生物體的免疫接種在另ー個方面，本發(fā)明提供用于制備產(chǎn)生本發(fā)明抗體的方法，包括給予本發(fā)明的轉基因生物體抗原。
本發(fā)明的轉基因動物產(chǎn)生的抗體和多肽復合體包括多克隆和單克隆抗體及其片段。如果需要多克隆抗體，可通過已知技術用抗原和免疫動物血清免疫轉基因動物(例如小鼠、兔、山羊、馬等)，收集和處理。如果含有多克隆抗體血清含有其他抗原的抗體，可通過本領域技術人員熟知的免疫親和色譜等技術純化感興趣的多克隆抗體。本領域也已知產(chǎn)生和處理多克隆抗血清的技術。本發(fā)明多肽結合復合體和抗體的用途本發(fā)明的多肽復合體和抗體包括其片段的可應用于體內治療性和預防性應用、體外和體內診斷應用、體外測定和試劑應用等。本發(fā)明多肽復合體和抗體的治療及預防用途涉及給予上述受試哺乳動物例如人。給予哺乳動物的基本純化的多肽復合體和抗體包括其片段的優(yōu)選至少90% -95%的同源性，作為藥物用途特別是哺乳動物為人時最優(yōu)選98% -99%或更高的同源性。一旦部分純化局部或所需同源性，本文所述多肽復合體和僅有重鏈的抗體可用于診斷或治療(或體外使用)或顯像或使用本領域技術人員已知方法進行測定。通常本發(fā)明的多肽復合體和抗體以純化形式連同藥理學上適當載體使用。典型的，這些載體包括水溶液或醇/水溶液、乳狀液或混懸液，其可包括鹽和/或緩沖介質。胃腸道外載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉和乳酸鹽林格氏液。如果需要保持多肽復合體為混懸液，可選擇作為增稠劑的適當生理學可接受賦形齊U，例如羧甲基纖維素、聚こ烯吡咯烷酮、明膠和海藻酸鹽。靜脈內載體包括例如基于林格氏葡萄糖的液體和營養(yǎng)補充劑和電解質補充劑。也可存在防腐劑及其他添加劑例如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體(Mack(1982)Remington' s Pharmaceutical Sciences,16 te ノ。本發(fā)明的多肽復合體和抗體包括其片段的可単獨作為藥用組合物使用或與其他藥物聯(lián)用。包括各種免疫治療藥物例如環(huán)孢霉素、氨甲喋呤、阿霉素、順鉬或免疫毒素?？蛇x擇的多肽復合體可與在效應位點轉化前體藥物的酶結合使用。藥物組合物可包括多種細胞毒素或其他藥物“雞尾酒”結合本發(fā)明選擇的抗體或甚至結合本發(fā)明選擇抗體的組合。給予本發(fā)明藥用組合物的途徑可為本領域技術人員已知的任何常規(guī)途徑。為了治療包括但不局限于免疫治療，本發(fā)明的多肽復合體或抗體可根據(jù)標準方法給予任何患者。給藥可通過任何適當模式包括胃腸外、靜脈內、肌內、腹膜內、經(jīng)皮膚、經(jīng)肺途徑給藥，也或 者適當?shù)耐ㄟ^導管直接輸注。給藥劑量和頻率根據(jù)患者年齡、性別和病情、聯(lián)用的其他藥物、禁忌癥及其他參數(shù)由臨床醫(yī)生考慮。本發(fā)明多肽復合體和抗體可凍干保存且用前在適當載體中重建。可采用已知的凍干和重建技術。本領域技術人員應理解冷凍干燥和重建可導致不同程度的功能喪失且使用水平應由于補償而調整。另外本發(fā)明多肽復合體和抗體可用作診斷目的。例如本文所述抗體可對抗抗原產(chǎn)生或増加，在疾病狀態(tài)特定表達或自疾病狀態(tài)其水平變化。為某些目的例如診斷或追蹤目的，可加入標記。適當?shù)臉擞洶ǖ幌抻谌魏蜗铝械姆派湫詷擞洝MR自旋標記及突光標記。標記檢測方法為本領域技術人員所熟知?？山o予含有本發(fā)明多肽復合體和抗體的組合物或其混合劑用于預防和/或治療。
含有本發(fā)明多肽復合體和抗體的組合物可用在預防和治療設備中以幫助轉化、滅活、殺滅或清除哺乳動物中選擇的靶向細胞群。另外本文所述多肽復合體和抗體的選定組分可體外使用或體外選擇性殺滅、耗盡或其他有效清除來自細胞的異源收集物的靶向細胞群。實施例I在預實驗中，制備轉基因小鼠以表達重鏈基因座，其中兩個馬駝(Ilama)VHH外顯子連接于人重鏈多變(D)和連接(J)片段，接著是Cy、C S、CY2、CY3人恒定區(qū)基因和人重鏈免疫球蛋白3' LCR0人C γ2和C γ3基因包括G —A剪接突變(splice mutation)。存在的Frt位點使單拷貝轉基因小鼠通過Flp介導的重組由多拷貝轉基因陣列產(chǎn)生。但是具有G — A剪接突變的轉基因基因座序列顯示異常剪接但是未完全清除CHl (圖9)。構建體為克服這種問題，使用標準方法篩選基因組黏粒文庫得到含有VH基因的克隆。基于其序列隨機選擇ー種(或多種)不同種系VHs (在人VH’ s中有5屬類)。根據(jù)IMGT編號在42、49、50和52位引入親水性氨基酸密碼子(Lefranc等，(1999))。通過標準程序例如使用定做的接頭或同源重組直接克隆將VH基因結合進BAC載體中。從人基因組Pac文庫RPCI_11(BACPAC Recource Center，美國)中選擇兩種克隆含有人重鏈D和J片段、C μ (IgM)和C δ (IgD)的克隆1065Ν8及含有C y 3 (IgG3)基因的克隆1115 N15。使用來自不同人基因組文庫(Incyte Genomics, CA,美國)的Bac克隆11771作為Cy2(IgG2)基因和免疫球蛋白重鏈LCR的來源(Mills等，(1997) J. Exp. Med.，15 ；186(6) :845-58)。使用標準技術將C Y 3和C Y 2分別亞克隆入pFastBac載體(Invitrogen)。同樣，可從這些BACs(IgA、IgE)克隆任何其它的Ig恒定區(qū)。使用每個恒定區(qū)CHl外顯子側翼序列通過同源重組取得CHl外顯子的完全缺失(Imam等，(2001))。任選可在C μ轉換區(qū)前引入frt位點從而通過用標準方法例如與rosa-flp小鼠雜交在體內用flp重組酶處理而從多拷貝基因座產(chǎn)生單拷貝基因座(圖10)。通過常規(guī)限制消化和連接或通過同源重組(或二者混用)或其它任何克隆技術將分離的VH基因、D和J片段及C和LCR外顯子克隆進ー個BAC中。然后可構造進一步的構建體。僅有IgM的基因座為獲得IgM構建體(圖11)，ー種或多種VHs基因(優(yōu)選工程人VH基因從而提供可溶性或駱駝VHH基因)，接著將人D和J重鏈片段及C μ克隆進BAC。方法學參見上述。這樣僅有C μ區(qū)克隆進終BAC。IgM附加IgG基因座，(C5任選)為獲得IgM附加IgG構建體(圖12)，ー種或多種VH基因(優(yōu)選工程人VH片段從而提供可溶性或駱駝VHH基因)，接著將人D和J重鏈片段、C μ (沒有CHl但有CH4外顯子)，(任選Cs)及修飾的人C Υ2和C Υ3基因和3’ LCR克隆進BAC。為產(chǎn)生僅有IgG基因座，在標準克隆步驟(如上述)期間引入IoxP位，且BAC在294Cre E. coli菌株中生長(Buscholz等)，ere介導的重組生成產(chǎn)生僅有IgG的基因座的細菌。進ー步構造細節(jié)參見上述。
IgM附加IgG基因座，(C5任選)為獲得IgM附加IgG構建體(圖13)，ー種或多種VHs基因(優(yōu)選工程人VH片段從而提供可溶性或駱駝VHH基因)，接著將人D和J重鏈片段、Cli (帶有CHl和CH4)，(任選Cs)及修飾的人CY2和CY3基因和3’LCR克隆進BAC。為產(chǎn)生僅有IgG基因座，在標準克隆步驟(如上述)期間引入IoxP位,且BAC在294 Cre E. coli菌株中生長(Buscholz等)，ere介導的重組生成產(chǎn)生僅有IgG的基因座的細菌。轉基因小鼠，繁殖和基因分型通過標準受精卵顯微注射或經(jīng)胚胎干細胞轉染技術將終BAC引入到轉基因小鼠中。用5'和3'末端基因座探針通過尾部DNA的DNA印跡分析(Southern 1975)檢查轉基因基因座完整性和拷貝數(shù)。創(chuàng)始鼠(founder)作為在μ MT-/-背景中的品系繁殖。 通過標準PCR分析使用基因座不同區(qū)域各自的引物完成基因分型。得自轉基因小鼠的BMcDNA的RT-PCR產(chǎn)物序列分析，其中C Y 2和C Y 3的整個CHl外顯子缺失(其中ー種具有(HLL品系)而另ー種沒有Cy和CS基因)，顯示這種轉基因座不僅能夠VDJ重組,而且IgG轉錄物類似于在馬駝和駱駝HCAbs中所見。免疫組化在OCT化合物中鑲嵌脾。在丙酮中固定冷凍的5 μ m冷凍切片且如前面所述單或雙標記(Leenen 等，1998)。米用單克隆抗體抗 B220/RA3-6B2、抗-CDllc/N418 (Steimnan 等，1997)，作為雜交瘤培養(yǎng)上清液。過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗人-IgG和抗-人IgM得自Sigma。第二步驟試劑為過氧化物酶標記的山羊抗-大鼠Ig(DAK0, Glostrup,丹麥)或抗-侖鼠Ig(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)和山羊抗-大鼠 Ig 喊性憐酸酶(Southern Biotechnology, Rimmngam, AL,美函 ノ。圖15顯示在μ MT+背景中來自μ MT+、WT和HLL及HLL-MD轉基因小鼠中5 μ m冷凍脾切片的免疫組化分析。切片用B細胞的抗B220 (藍色)和樹狀突細胞的抗-⑶11c/N418(棕色)染色。箭頭顯示小簇B細胞的定位。流式細胞計數(shù)分析在PBS中自淋巴器官制備單細胞懸液，如前所述(Slieker等.1993)。4°C下在96孔板中約IX IO6個細胞與抗體在PBS/0.5%牛血清白蛋白(BSA)中孵育30分鐘。在PBS/0. 5% BSA中洗滌細胞兩次。對于每個樣品，每3X IO4數(shù)使用FACScan分析儀評分(Becton Dickinson, Sunnyvale,加拿大)。使用CellQuest I. O版計算機軟件分析FACS數(shù)據(jù)。在Becton Dickinson FACS Calibur上進行四色分析。下列mAbs得自BDPharmingen (San Diego，加拿大)FITC 偶聯(lián)的抗 B220-RA3-6B2、PE 偶聯(lián)的的抗 CD19。在圖15的底格中展示了用抗-CD 19和抗-B 220染色的脾細胞FACS掃描數(shù)據(jù)。圖的左側為通過將HLL品系與FlpeR轉基因品系雜交的體內FLP重組的圖像，以及提供支持的重組體脾細胞的FACS掃描數(shù)據(jù)，顯示在直接產(chǎn)生的原始HLL-MD品系中可見B細胞獲救。右側為與Cag Cre轉基因品系雜交的體內Cre重組圖像，以及單拷貝重組體的脾細胞的FACS數(shù)據(jù)。免疫接種和雜交瘤產(chǎn)生(圖14)制造含有包括兩個馬駝VHH域、人D和J區(qū)及IgG2和3恒定區(qū)(沒有CHl域)的僅有重鏈的抗體基因座的轉基因小鼠。8周齡小鼠用大腸桿菌熱休克蛋白70(hsp 70)免疫。分別在第O、14、28、42天皮下注射及在第50天腹腔注射20 μ g或5 μ g的抗原和Specol佐劑(IDDLO, Lelystadt, NL)。在第O、14和45天取血。三次加強免疫后，3分之I的用Hsp70免疫的HLL-MDl小鼠中檢測到低滴度抗原特異性抗體(圖14)。
進行標準的脾細胞與骨髄瘤細胞株系融合從而生成在單克隆雜交瘤細胞系中產(chǎn)生的抗hsp70蛋白的單克隆抗體。這種抗-HSP 70HCAb包括馬駝VHH片段，其最接近與人IgHD3-10片段(檢索號X13972)和人IgHJ4_02片段(檢索號X86355)重組的D區(qū)(VHH2) ο與種系構建(germ line configuration)相比雖然沒有高頻率,但是VHHs幾乎沒有引起氨基酸改變的突變，參見圖9A。RT-PCR分析也顯示，在雜交瘤中僅有ー種產(chǎn)生性的IgH轉錄物，表明沒有其他轉錄物產(chǎn)生。aHSP70 IgG2抗體作為僅有重鏈ニ聚體分泌(變性凝膠下蛋白質印跡(ニ聚體)和非變性凝膠下蛋白質印跡(單體)環(huán)境，圖14)。使用Glonal細胞TM-HY試劑盒(StemCell Technologies,UK)根據(jù)廠家說明書在第56天融合脾細胞與Sp2-0-Agl4 骨髓瘤細胞(R. Haperen 饋贈)。用TNFa免疫含有僅有重鏈的抗體基因座的轉基因小鼠，其包括兩個馬駝VHH域、人D和J區(qū)、人IgM和IgG及3恒定區(qū)(均無CHl域，圖12)，從而獲得HC-IgM抗體。在標準ELISA測定中三分之一小鼠顯示出陽性血清。標準骨髄瘤融合產(chǎn)生陽性IgM雜交瘤(圖16)。瓊脂糖凝膠6B凝膠過濾后在非還原條件下層析柱每級流分在還原條件下裝柱且用a人IgM-HRP檢測(圖20)。非還原條件下分級分離顯示HC-IgM作為多聚體抗體分泌且與人對照IgM(HC-IgM中減去輕鏈和CHl分子量后)大小相同。還原條件下每個柱流分的凝膠過濾顯示預期的(圖20)的単體。血清Ig ELISA在涂鋪EDTA的試管中收集15-25周齡小鼠血液，室溫(RT)下離心15’且用PBSl 5稀釋上清液。用5mg/ml山羊抗人IgG(YES Biotechnology)或山羊抗人IgM(Sigma)包被96孔板2小時，用PBS洗滌，室溫下用封閉溶液(I. 5 % BSA/1. 5 %奶粉/0. I % tween 20/PBS)封閉I小時且用PBS洗滌3次。裝入梯度稀釋的血清樣品和標準品(人IgG2或人IgM(Sigma, Zwijndrecht, NL))且孵育2_4小時,在加入第二種抗體(I 2000稀釋的偶聯(lián)到HRP的山羊抗人IgG或山羊抗人(Sigma,Zwijndrecht,NL))前用PBS洗滌板6次。所有稀釋均用封閉液完成。室溫下孵育1-2小時后且用PBS洗滌，加入POD 底物(Roche)。圖16顯示了檢測自IgG2噬菌體文庫的抗原特異性可溶sdAbs的ELISA?？扇躶dAbs在包被抗原的板上用作ー抗，然后是小鼠a -myc抗體和HRP偶聯(lián)的山羊α -小鼠抗體。使用POD作為底物。底部圖示用限制性內切酶Hinf I的克隆酶解圖譜，顯示編碼抗B. Pertusts的sdAb的5個不同插入片段?？贵w文庫構建和篩選使用Ultraspec RNA 分離體系(Biotecx Laboratories Inc, Houston, Texas,美國)自DKTP免疫的單拷貝僅有IgG小鼠的脾(圖12，ere處理后)分離總RNA。使用寡dT制備cDNAo使用特異性引物vhl后Sfi I引物(Dekker等,2003)聯(lián)用hIgG2hingrev引物(5' -AATCTGGGCAGCGGCCGCCTCGACACAACATTTGCGCTC-3/ )通過 PCR 擴增編碼 VHHDJ 的DNA片段。這種擴增的VHHDJs ( 400bp)用Sfi I/Not I消化、凝膠純化且克隆進Sf i I/Not I消化的噬菌粒載體pHEN-1。轉化進TGl電感受態(tài)細胞，產(chǎn)生人單域抗體文庫。使用吸附在塑料(用未稀釋疫苗包被的免疫試管)上的疫苗抗原淘選兩輪。進行標準的限制性分析和序列測定。僅有重鏈基因座的RT-PCR然后用IgG2和IgG3特異性引物從淋巴集結得到cDNA形式的RT PCR產(chǎn)物，并通過測定產(chǎn)物序列來研究HLL-MD基因座是否作為正?；蜃诋a(chǎn)生多樣抗體庫中發(fā)揮作用。圖17顯示自非免疫小鼠(左邊部分)和免疫小鼠(右邊部分)克隆體細胞突變的部分實例。這些小鼠僅有IgG基因座，并用大腸桿菌hsp70、百日咳溶菌產(chǎn)物、破傷風類毒素免疫?；疑幱盀樽訣RKCCV起始的IgG2鉸鏈區(qū)。
雖然對淋巴集結的RT-PCR分析顯示使用兩個VH，所有已測序抗體都重排了 VH2。通過選擇D和J片段并進行V-D和D-J連接形成的CDR3區(qū)是抗體庫可變性的來源。人J片段的使用與人重排中所見的類似，最常用的是JH4和JH6片段。這種分析顯示所用的兩種VHs、不同人D及所有人J片段構成了多祥性抗體庫(repertoire)。也通過將每個重排基因與其種系負體即轉基因構建體中原始Vh做比較，顯示存在IgG3轉換的B細胞和發(fā)生了體細胞突變(參見圖17)。因此人僅有重鏈IgG抗原受體可提供B細胞成熟必需信號。免疫染色圖18顯示另外用含有A5抗體的應答質粒轉染細胞系上Tet-之一的免疫染色結果(Dekker等.2003)。上面顯示在細胞質中多西環(huán)素誘導的A5抗體的產(chǎn)生(紅色)及用DAPI染色的細胞核(藍色)。下面顯示核中表達rtTA的細胞為經(jīng)誘導產(chǎn)生A5的細胞(上面)。用一種帶有下列顯示序列的抗rtTA的人HCAb (緑色)完成染色。使用這種FITC偶聯(lián)的山羊抗人IgG作為第二個步驟。通過Dekker等，2003先前所述檢測A5。rTTA抗體為帶有下列序列的IgG3 241 AGACTCT80 R L30I CCTGTGCAGCCTCTGGAAGCATCTTCAGTATCAATGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTC100 SCAASGSIFSINAMGffYRQA36I CAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCAGCTATTACTAGTGGTGGTAGCACAAGGTATGCAG120PGKQRELVAAITSGGSTRYA42I ACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGC140DSVKGRFTISRDNAKNTVYL48I AAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTTTGATCTCTATGGTTC160QMNSLKPEDTAVYYCLISMV54I GGGGAGCCCGTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGAGCTCA180 RGARFDYffGQGTLVTVSSEL601 AAACCCCACTT200 K T P LIgG3鉸鏈起始于氨基酸198ELKTPL。比較參看圖17中IgG2鉸鏈區(qū)。
蛋白質印跡分析圖19顯示ere處理(即IgM缺失，僅余留IgG)后含有IgM附加IgG基因座(圖10)的不同轉基因小鼠系的血清蛋白質印跡。在還原(圖19右面)和非還原(圖19左面)條件下通過prot G和凝膠分級分離純化血清。對照為背景KO小鼠和正常人血清樣品。注意在兩種凝膠間大小差別顯示人僅有重鏈IgG為ニ聚體。圖19中顯示信號用抗人IgG抗體通過標準方法檢測。通過I礎附加IgG基因座小鼠產(chǎn)生人I礎的大小分級與作為對照的人血清樣品混合后，在非還原條件下通過凝膠過濾將IgM附加IgG小鼠的血清(圖13)分級分離。結果顯示于圖20。柱上復合體分子量從左至右每個泳道(代表每種流分)逐級下降。通過凝膠電泳在還原條件下分析流分(每個泳道)。 在許多由用人TNFa免疫的含有IgM附加IgG(圖13)基因座小鼠制備的雜交瘤上進行ELISA分析。結果顯示于圖21。圖21中頂部兩行用抗人IgG分析，接下來的兩行用抗人IgM分析。血清樣品(行)顯示小鼠產(chǎn)生IgG和IgM抗-TNF α抗體。単行顯示陽性IgM雜交瘤。各孔用可商業(yè)購得的人TNF α包被。所有均為標準方法。實施例2通過將兩種僅有重鏈單特異性抗體相結合產(chǎn)生雙特異性雙價抗體。第一種抗體形成骨架而產(chǎn)生第一種特異性和效應子功能(分別為可變區(qū)和恒定區(qū))。經(jīng)新型改造的鉸鏈結合具有第二種特異性的第二種抗體。這種鉸鏈類似于現(xiàn)存IgG2鉸鏈序列但是用脯氨酸代替半胱氨酸從而阻止抗體ニ聚體中半胱氨酸交聯(lián)，且提供由脯氨酸帶來的額外柔性而預防第二種抗體受到可能抑制其功能的空間位阻。起始的骨架抗體為抗E. coli HSP70蛋白質而產(chǎn)生的抗體。此HSP70抗原注射進含有(參見前文圖14)中所述的僅有重鏈的抗體基因座轉基因小鼠。通過標準雜交瘤融合技術(參見上文)從這些小鼠產(chǎn)生單克隆抗體。然后通過標準RT-PCR重組DNA方法克隆編碼a HSP-抗體的cDNA產(chǎn)生含有全長cDNA的質粒，其從5’末端至3’末端(在蛋白質中從N末端至COOH末端)包括起始密碼子ATG、信號肽序列、可變域VHHl (參見Janssens等)、重組D和J區(qū)及Cy2的恒定區(qū)(缺少CHl區(qū))，但是包括終止密碼子和polyA位點(圖22左邊上部)。為克隆使用正向引物和反向引物通過PCR擴增編碼a HSP70抗體的cDNA。正向引物為CTGGAATTC TCAACC^M GAGCTGGGGCTGAGC，提供用于克隆目的(加下劃線的)
的EcoRI位點，有效翻譯起始序列(粗體)和正常起始密碼子(灰色底紋)。反向引物為GACAAGCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC,提供Hindi 11 克隆位點(加下劃線的)并保留了正常終止密碼子。這種擴增因而導致形成EcoRI/Hindlll片段，其包括EcoRI位點(加下劃線的)、有效翻譯起始序列(粗體)和正常aHSP70抗體基因的起始密碼子(灰色底紋，也見于圖22)。反向3’末端引物為GACAAGCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC,提供 HindIII 克降位點(加下劃線的)并清除了正常終止密碼子。如此產(chǎn)生的片段帶有EcoRI位點和HindIII位點(圖22左邊從上數(shù)第2)，其中EcoRI位點克隆在啟動子序列上，HindIII位點用于將5’末端克隆在表達質粒上并將3’末端克隆在新型鉸鏈序列上(參見下述)。最后，用EcoRI和HindIII切割該片段從而提供用于克隆的適當?shù)膯捂溎┒?。產(chǎn)生第二種特異性的第二種克隆的抗體包含抗豬逆轉錄病毒(PERV) gag抗原的馬駝抗體 VHH 域(Dekker 等，(2003) J. Virol.，77 (22) : 12132-9，圖 22 上右)。使用下列引物經(jīng)標準PCR擴增法擴增a gag 正向GTCGCCCAGGTCCAACTGCAGGAGTCTG 和反向引物GTCGAATTCTCATTCCGAGGAGACGGTGACCTGGGTC。其提供的擴增片段(圖 22 右從上數(shù) 第2)帶有XhoI位點(灰色底紋)知EcoRI位點(加下劃線的)，其中XhoI位點克隆框架內5’末端與新型鉸鏈(參見下列)，EcoRI位點用于將3’末端克隆進表達質粒(圖22，右中)。最后用EcoRI和XhoI切割該片段從而產(chǎn)生用于克隆的單鏈末端。這兩種抗體序列經(jīng)新型鉸鏈結合成ー種雙抗體序列。新型鉸鏈由兩種寡核苷酸在一起形成帶有以克隆為目的的5’和3’突出端(分別與HindIII和XhoI相客)的雙鏈寡核苷酸而產(chǎn)生相客。結構中改造進CIHSP70序列末端和a gag序列的起始端。形成的ニ硫鍵(sulphide bridges)通常存在于人IgG2鉸鏈中，通過用脯氨酸(加下劃線的)代替半胱氨酸(灰色底紋)防止其形成。脯氨酸向鉸鏈中加入額外柔性從而使經(jīng)鉸鏈連接于第一種抗體COOH末端的第二種抗體域起適當功能。正常IgG鉸鏈序列(半胱氨酸密碼子為灰色底紋，脯氨酸密碼子為加下劃線的)。GAGCGCAAATGCGAG _ CCACCG _ CCA 及其互補序列被下述序列AGCT TCTGAGCGCAAACCACCAGTCGAGCCACCACCGCCACCAC,及其互補序列;tcG/4Gtggtggcggtggtggctcgactggtggittgcgctcaga)替代。這也提供了帶有兩種單鏈末端與用于克隆目的的HindIII (粗體)和XhoI (斜體)位點相容的片段(白框鉸鏈，圖22，中部)。這3種片段(a HSP70IgG2、鉸鏈和a gag)然后通過標準重組DNA技術連接進含有小雞肌動蛋白啟動子和CMV增強序列(圖22,表達質粒)的bluescript (Pbluescriptllsk+)表達質粒中。當這種質粒表達時(參見下列)則產(chǎn)生圖22底部所示的雙抗體。通過標準方法(superfect)培養(yǎng)雙抗體表達質粒并將其與質粒pGK hygro共轉染(從而使得能夠選擇轉染的細胞)進CHO細胞(圖23)。通過使用α人IgG-HRP檢測含有由CHO細胞分泌的雙鏈抗體的生長培養(yǎng)基的標準a gag ELISA法(Dekker等，J. Virol. 2003)在含有均霉素的培養(yǎng)基中選擇陽性克隆并將其鑒定為表達雙鏈抗體的陽性克隆。a -gag活性陽性試驗使其最可能使某一給定的克隆表達完整雙抗體，因為gag特異性在于雙抗體后端(C00H末端)。然后HSP70的ELISA試驗也為陽性。為與55KD的單體(非還原及還原條件及蛋白質印跡，圖23右部)比較而顯示質粒中表達的蛋白質為IlOKD的ニ聚體(如圖23底部顯示)，進行非還原條件和還原條件下這些ELISA選定的克隆的蛋白質印跡。因此ELISA和蛋白質印跡共同顯示轉染的CHO細胞產(chǎn)生的雙抗體以ニ聚體表達并分泌進入培養(yǎng)基中(以> 70ng/ml),并且抗體可結合HSP70和gag抗原。但是其未顯示相同ニ聚體抗體分子可同時結合兩種抗原。因此進行了后續(xù)實驗。首先將gag抗原(圖24中部第一個孔)固定到塑料孔底部。然后在應用克隆I的CHO細胞上清液(圖24中部第2個孔)后通過第一種抗原(gag)捕獲雙抗體(圖24上部)。接著充分洗滌且然后應用第二種抗原(HSP 70，圖24中部第3孔)，然后再充分洗滌。如果雙抗體分子可同時結合兩種抗原，其應通過結合第一種抗原(gag)而被捕獲在孔底部并接著捕獲第二種抗原(HSP70)。當隨后從該孔(圖24中部，右孔)洗脫整個復合體時，在蛋白質印跡上雙抗體和抗原都可見到(圖24底部)。為收集分泌的雙抗體，CHO克隆在相同標準條件和用于收集雜交瘤產(chǎn)生抗體的培養(yǎng)基(SIGMA雜交瘤培養(yǎng)基，沒有血漿)中生長。方法用純化的重組gag蛋白質(12. 5 μ g/ul的PBS溶液)0/N 4C包被Nunc-免疫板(Maxisorp)的孔。用1%牛奶/1% BSA的PBS溶液封閉2小吋。CH0-DB克隆-I培養(yǎng)基在PBS-牛奶-BSA (或對照)中稀釋一倍，室溫(RT)下孵育3小吋。細菌B121細胞裂解物(含有HSP70蛋白質)在PBS-牛奶-BSA中稀釋一倍，在室溫下孵育3小時并洗滌。用含有2-巰基こ醇的Laemmli樣品緩沖液稀釋結合蛋白。通過蛋白質印跡分析樣品且因此進行10% SDS-PAGE且印跡在硝酸纖維素膜上。印跡用PBS-牛奶-BSA封閉2小時且用初 級抗體孵育。產(chǎn)物使用偶聯(lián)到可目測染色的酶的ニ抗通過標準方法顯影。使用的試劑為a Gag :兔多克隆(I : 2000)2小時室溫α雙抗體山羊α人IgG_HRP(l 2500)2小時室溫0邯 70:單克隆620-380培養(yǎng)基(1:2)2小時室溫ニ抗為山羊α兔-ΑΡ(1 2000)2小時室溫及山羊抗HSP70單克隆的α人IgG-HRP(l 2500)2 小時室溫為顯影蛋白質條帯，首先使用與堿性磷酸酶(AP)反應的NBT/BCIP底物(紫色)，然后用與辣根過氧化物酶反應的DAB底物(棕色)。用PBS-0. 05% Tween-20完成所有洗滌步驟。通過去掉一種組分或添加不產(chǎn)生雙抗體(圖24)的CHO細胞的培養(yǎng)基進行對照，即；缺乏沒有雙抗體應用(培養(yǎng)基來自非轉染的CO細胞)因此僅有gag(泳道2);孔底部缺乏gag(用牛奶蛋白代替)因而沒有產(chǎn)物(泳道3);缺乏gag和雙抗體因而沒有產(chǎn)物(泳道4);缺乏HSP70抗原(被牛奶抗原代替)因而僅有雙抗體和gag (泳道5);缺乏HSP70和雙抗體因而僅有gag (泳道6)。所有3種組分(雙抗體附加兩種抗原)僅存在于泳道I的孔，其接受所有3種組分(也見于圖24底部插圖的說明)這一事實顯示單一雙抗體同時結合兩種抗原。雙特異性IgA或多特異性IgM的產(chǎn)生雙特異性IgA的產(chǎn)生基本類似于所述的IgG (上述)，但是除另外使用Vhsol、D和J外，還使用導致產(chǎn)生IgA的恒定區(qū)Ca (圖25)。IgM的產(chǎn)生大同小異，但是因為IgM分子可形成大的多聚體(有或沒有J鏈)而提供了其他可能性。因此除類似于前面所述分子(圖26右底部，除去多聚化的序列后)夕卜，也可簡單通過共表達具有不同特異性的IgM’ s產(chǎn)生多聚體。實施例3如Sambrook 等((1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press)中所述分子生物學技術構建了一種編碼多肽復合體的表達載 體，該復合體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包括結合于PSCA (前列腺干細胞抗原)的結合域、含Jun亮氨酸拉鏈基序和抗體鉸鏈的裝配域、CH2和CH3域，而輕鏈包括含F(xiàn)os亮氨酸拉鏈基序的互補裝配域。然后通過常規(guī)技術將表達載體轉移到適當?shù)乃拗骷毎麖亩a(chǎn)生最適合載體表達的轉染宿主細胞。然后使用本領域技術人員已知的任何適當技術培養(yǎng)轉染或轉化的宿主細胞從而產(chǎn)生本發(fā)明的多肽復合體。一 旦產(chǎn)生就通過標準技術步驟包括交叉流過濾、硫酸銨沉淀法和親和層析(例如蛋白A)純化多肽復合體。然后使用本領域技術人員已知技術將包括3，3' - ニ吲哚基甲烷(DM)的可溶效應子域融合到互補裝配域。實施例4如SambiOOk等所述分子生物學技術構建了編碼本發(fā)明多肽復合體重鏈的表達載體，該復合體包含結合于AFP ( α胎兒蛋白)的可溶性VHH結合域和包括Jun亮氨酸拉鏈基序和抗體鉸鏈的裝配域、CH2和CH3。也構建了編碼本發(fā)明多肽復合體輕鏈的第二種表達載體。其包含包括Fos亮氨酸拉鏈基序的互補裝配域。然后通過常規(guī)技術將表達載體轉移到適當宿主細胞從而產(chǎn)生最適合載體表達的共轉染宿主細胞。然后使用本領域技術人員已知的任何適當技術培養(yǎng)轉染或轉化的宿主細胞從而產(chǎn)生本發(fā)明的多肽復合體。一旦產(chǎn)生就通過標準技術步驟包括交叉流過濾、硫酸銨沉淀法和親和層析(例如蛋白Α)純化多肽復合體。然后使用本領域技術人員已知技術將包括3，3' - ニ吲哚基甲烷(DM)的可溶效應子域融合到互補裝配域。實施例5VCAM 和 VLA-4使用如SambiOOk等所述分子生物學技術構建了編碼多肽復合體的表達載體，該復合體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包括結合于PSCA(前列腺干細胞抗原)的結合域、包括VCAM和抗體鉸鏈的裝配域、CH2和CH3域，而輕鏈包括含融合到蓖麻毒蛋白A毒素的VLA-4的互補裝配域。然后通過常規(guī)技術將表達載體轉移到適當?shù)乃拗骷毎麖亩a(chǎn)生最適合載體表達的轉染宿主細胞。然后使用本領域技術人員已知的任何適當技術培養(yǎng)轉染或轉化的宿主細胞從而產(chǎn)生本發(fā)明的多肽復合體。一旦產(chǎn)生就通過標準技術步驟包括交叉流過濾、硫酸銨沉淀法和親和層析(例如蛋白Α)純化多肽復合體。實施例6使用如SambiOOk等所述分子生物學技術構建了編碼多肽復合體的表達載體，該復合體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包括結合于PSCA(前列腺干細胞抗原)的結合域、包括Jun亮氨酸拉鏈基序和抗體鉸鏈的裝配域、CH2和CH3域，輕鏈包括含F(xiàn)os亮氨酸拉鏈基序的互補裝配域和編碼嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)的可溶性效應子域。然后通過常規(guī)技術將表達載體轉移到適當?shù)乃拗骷毎麖亩a(chǎn)生最適合載體表達的轉染宿主細胞。然后使用本領域技術人員已知的任何適當技術培養(yǎng)轉染或轉化的宿主細胞從而產(chǎn)生本發(fā)明的多肽復合體。一旦產(chǎn)生就通過標準技術步驟包括交叉流過濾、硫酸銨沉淀法和親和層析(例如蛋白A)純化多肽復合體。PNP將氟達拉濱轉化為毒性代謝產(chǎn)物2-氟腺嘌呤，其殺滅包含PNP酶細胞并進ー步擴散而殺滅周圍未感染細胞而形成局部旁觀者效應。實施例7使用如SambiOOk等所述分子生物學技術構建了編碼本發(fā)明多肽復合體第一條重鏈的表達載體，該復合體包含結合于糖蛋白抗原gpl20的V3-PND區(qū)的可溶性VHH結合域和包括Jun亮氨酸拉鏈基序和抗體鉸鏈的裝配域、CH2和CH3域。也構建了編碼本發(fā)明多肽復合體第二條重鏈的第二種表達載體，該復合體包含結合于GP-41的可溶性VHH結合域、包括Jun亮氨酸拉鏈基序和抗體鉸鏈的裝配域、CH2和CH3 域。還構建了編碼本發(fā)明多肽復合體輕鏈的第三種表達載體。其包括含F(xiàn)os亮氨酸拉鏈基序的互補裝配域。然后通過常規(guī)技術將這些表達載體轉移到適當?shù)乃拗骷毎麖亩a(chǎn)生最適合載體表達的共轉染宿主細胞。然后使用本領域技術人員已知的任何適當技術培養(yǎng)轉染或轉化的宿主細胞從而產(chǎn)生本發(fā)明的多肽復合體。一旦產(chǎn)生就通過標準技術步驟包括交叉流過濾、硫酸銨沉淀法和親和層析(例如蛋白A)純化多肽復合體。然后使用本領域技術人員已知技術將包括HIV-I MN V3 (PND)肽免疫原的可溶性效應子域融合到互補裝配域。實施例8使用Sambrook 等((1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press)所述分子生物學技術構建了編碼本發(fā)明多肽復合體第一條重鏈的表達載體，該復合體包含可溶性VHH結合域，其結合于糖蛋白抗原的V3-PND區(qū)。也構建了編碼本發(fā)明多肽復合體第二條重鏈的第二種表達載體，包含結合于GP-41的可溶性VHH結合域。這兩種重鏈的特征在于兩重鏈恒定區(qū)包含相同的μ、CH2、CH3和CH4域。然后通過常規(guī)方法將這些表達載體轉移到組成型表達J鏈的宿主細胞從而產(chǎn)生最適合載體表達的共轉染宿主細胞。然后使用本領域技術人員已知的任何適當技術培養(yǎng)轉染或轉化的宿主細胞從而產(chǎn)生本發(fā)明的多肽復合體。一旦產(chǎn)生就通過標準技術步驟包括交叉流過濾、硫酸銨沉淀法和親和層析(例如蛋白Α)純化多肽復合體。然后使用本領域技術人員已知技術將包括HIV-I MN V3 (PND)肽免疫原的可溶性效應子域融合到互補裝配域。在前面說明書中提及的所有公開通過引用結合到本文中。未偏離本發(fā)明范圍和精神的本發(fā)明所述的方法及體系的各種修改和變化對于本領域技術人員是顯而易見的。雖然已結合特定實施方案描述了本發(fā)明，但是應理解本發(fā)明不應局限于這些特定 的實施方案。事實上，對于生物化學、分子生物學和生物技術或相關領域中技術人員來說顯而易見的實踐本發(fā)明所述方法的各種修改均在下列權利要求書的范圍內。
權利要求
1.產(chǎn)生僅有Vh重鏈的抗體的方法，所述方法包括 (a)提供表達異源Vh重鏈基因座的轉基因非人哺乳動物，其中 (i)所述Vh重鏈基因座包含可變區(qū)，所述可變區(qū)包含至少一個Vh基因片段、至少一個D基因片段、至少一個J基因片段和至少一個重鏈恒定區(qū)； (ii)每個恒定區(qū)不編碼功能性ChI域； (iii)V基因片段、D基因片段和J基因片段能夠重組而形成VDJ編碼序列； (iv)每個重鏈恒定區(qū)來源于脊椎動物，但非來源于人類； (v)重組后的￥0重鏈基因座在表達時，能夠形成可溶性的僅有重鏈的抗體，所述抗體包含可溶性抗原特異性Vh結合域和缺乏功能性ChI域的恒定效應子域； (b)用抗原免疫所述轉基因非人哺乳動物。
2.權利要求I的方法，其中在免疫所述轉基因非人哺乳動物后，編碼所述僅有Vh重鏈的抗體的所述Vh基因座經(jīng)過體細胞突變加入親和力成熟。
3.權利要求I或2的方法，其中所述轉基因非人哺乳動物經(jīng)工程改造，其產(chǎn)生含輕鏈的內源性抗體的能力降低。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其中該哺乳動物內源性的免疫球蛋白重鏈基因座缺失或被沉默。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述免疫包括將抗原注射進所述轉基因哺乳動物中，并且其中所述方法包括下述的額外步驟 (C)分離表達所需抗原特異性、僅有重鏈的抗體的細胞或組織； (d)從步驟(c)的細胞或組織產(chǎn)生雜交瘤； (e)從所述雜交瘤克隆僅有重鏈的抗體mRNA; (f)在異源表達體系中生產(chǎn)所述僅有重鏈的抗體。
6.產(chǎn)生可溶性的抗原特異性Vh結合域的方法，其包括權利要求1-4中任一項的步驟，其中所述免疫包括將抗原注射進所述轉基因哺乳動物中，并且其中所述方法包括下述的額外步驟 (C)分離表達所需抗原特異性、僅有重鏈的抗體的細胞或組織； (d)從步驟(c)的細胞或組織產(chǎn)生雜交瘤； (e)從所述雜交瘤克隆僅有重鏈的抗體mRNA; (f)從步驟(e)的克隆mRNA中鑒定并分離抗原特異性Vh域；和 (g)在異源表達體系中生產(chǎn)所述可溶性的抗原特異性Vh結合域。
7.產(chǎn)生可溶性的抗原特異性Vh結合域的方法，其包括權利要求1-4中任一項的步驟，其中所述免疫包括將抗原注射進所述轉基因哺乳動物中，并且其中所述方法包括下述的額外步驟 (c)分離表達所需抗原特異性、僅有重鏈的抗體的細胞或組織； (d)從來源于所分離細胞或組織的mRNA克隆Vh基因座； (e)使用噬菌體或類似文庫展示編碼的蛋白質； (f)鑒定可溶性的抗原特異性Vh域；且 (g)表達所述可溶性的抗原特異性Vh域，或作為融合蛋白表達所述可溶性的抗原特異性乂11域。
8.任一前述權利要求的方法，其中所述Vh重鏈基因座包含哺乳動物V、D和J基因片段。
9.任一前述權利要求的方法，其中所述Vh重鏈基因座包含人V、D和J基因片段。
10.任一前述權利要求的方法，其中所述Vh重鏈基因座包含超過一個V基因片段、超過一個D基因片段和超過一個J基因片段。
11.任一前述權利要求的方法，其中所述V基因片段經(jīng)過選擇、突變或工程改造，以改進諸如溶解性的特性。
12.通過權利要求1-5或7-11中任一項的方法獲得的僅有重鏈的抗體。
13.通過權利要求6-11中任一項的方法獲得的可溶性的抗原特異性Vh結合域。
14.權利要求12的僅有重鏈的抗體或權利要求13的可溶性的抗原特異性Vh結合域，其用于治療。
15.一種或多種權利要求13的可溶性的抗原特異性Vh結合域、或所述Vh結合域與分開的效應子鏈的組合在產(chǎn)生二價或多價多肽復合物中的用途，其中所述效應子鏈包含互補裝配域并含有額外的效應子活性。
全文摘要
一種結合分子。本發(fā)明涉及經(jīng)歷了親和力成熟的功能性僅有重鏈的抗體多樣性庫的制造及其用途。本發(fā)明也涉及類別特異性僅有重鏈的抗體多樣性庫的制造和用途，也涉及具有抗體重鏈功能性優(yōu)選抗體重鏈結合功能性、恒定區(qū)效應子活性及任選其他效應子功能的多價多肽復合物的制造和用途。本發(fā)明還涉及在轉基因小鼠中響應抗原激發(fā)產(chǎn)生全功能性僅有重鏈的抗體的方法。本發(fā)明特別涉及產(chǎn)生任何種類的人抗原特異性、高度親和力、僅有重鏈的抗體或多種混合物的方法，以及分離及表達全功能性VH抗原結合域的方法。
文檔編號C07K16/00GK102659940SQ201210057668
公開日2012年9月12日 申請日期2005年7月22日 優(yōu)先權日2004年7月22日
發(fā)明者D·德拉貝克, F·G·格洛斯費爾德, R·W·楊森斯, 羅杰·金登·克雷格 申請人:伊拉茲馬斯大學鹿特丹醫(yī)學中心, 羅杰·金登·克雷格