專利名稱:與dickkopf-1或dickkopf-4或兩者的結(jié)合分子的組合物及使用方法
與DICKK0PF-1或DICKK0PF-4或兩者的結(jié)合分子的組合物
及使用方法
發(fā)明背景
Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路涉及對(duì)胚胎發(fā)育和致瘤性過程的控制。胞外Wnt蛋白負(fù)責(zé)胚胎發(fā)生過程中的多種細(xì)胞類型的生長(zhǎng)和分化，并對(duì)許多癌癥的發(fā)展有貢獻(xiàn)。
存在至少兩個(gè)抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白質(zhì)家族，即分泌性frizzled相關(guān)家族和 Dickkopf(DKK)家族。DKK家族目前含有四個(gè)家族成員，即DKKl(人DNA登錄號(hào)NM_012242 ； PRT 登錄號(hào)094907)、DKK2 (人登錄號(hào)ΝΜ_014421 ；PRT 登錄號(hào)NP_055236)、DKK3 (人登錄號(hào)NM_015881 ；PRT 登錄號(hào)AAQ88744)，和 DKK4 (人登錄號(hào)NM_014420 ；PRT 登錄號(hào) NP_055235)。
Dickkopf-I (DKKl)是Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路的分泌性抑制劑。參見例如 Niehrs 的 PCT 公開號(hào) W09922000 ；McCarthy 的 W09846755 ；Shulok 等人的 W02007/084344。 DKKl具有抑制Wnt誘導(dǎo)的軸復(fù)制(axis duplication)的能力，遺傳分析表示DKKl在上游作用來抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。DKKl與LRP6拮抗性的相互作用，阻斷Wnt介導(dǎo)的信號(hào)激活。參見例如Mao等人，2001Nature 411:321。DKKl還在脂肪生成、軟骨發(fā)生、胃腸道上皮增殖的增殖、骨丟失相關(guān)性風(fēng)濕病，和啟動(dòng)毛囊基板形成中發(fā)揮作用。參見Online Mendelian Inheritance 中的 Man ( “0MIM，，)登錄號(hào) 6O5I890
Dickkopf-4 (DKK4)表征較差，但也是Wnt通路的分泌性抑制劑。DKK4表現(xiàn)出沉積在患阿茲海默氏病的斑塊中，并在肌肉、小腦、T細(xì)胞、食管和肺中表達(dá)。參見OMIM登錄號(hào) 605417。
對(duì)治療癌癥、骨密度異常和代謝紊亂的組合物和方法存在需要，包括干擾或中和 DKKl和/或DKK4介導(dǎo)的對(duì)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗作用的此類活性劑。
Wnt蛋白在細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮重要作用，并已知調(diào)控脂肪生成。WntlOb過表達(dá)的ob/ ob和agouti小鼠具有顯著更少的脂肪組織，并且更耐受葡萄糖和對(duì)胰島素敏感。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及特異性針對(duì)Dickkopf-I (DKKl)、Dickkopf-4 (DKK4)或兩者(其中，對(duì) DKKl或DKK4或兩者的特異性在本文中稱為“DKK1/4”)的結(jié)合分子的組合物以及使用方法， 用于治療與DKK1/4相關(guān)的骨、骨密度、代謝、糖尿病、癌癥等的異常。
本發(fā)明的實(shí)施方案在本文中提供了選擇性結(jié)合和中和DKKl和/或DKK4多肽或其片段的結(jié)合分子或其抗原結(jié)合部分，及其在治療疾病中的用途。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療與DKKl和/或DKK4(DKKl/4)的表達(dá)相關(guān)的病癥或病況的方法。DKKl或DKK4相關(guān)性疾病包括但不限于骨髓瘤(包括多發(fā)性骨髓瘤、 重要性不明的單克隆丙種球蛋白病(MGUS)或良性單克隆丙種球蛋白病、平臺(tái)型(plateau) 和郁積型(smoldering)骨髓瘤)；惡性纖維狀組織細(xì)胞增多癥(MFH)(也稱為高度未分化多形性肉瘤)；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；β地中海貧血；炎性腸??；和骨疾。其他疾病或病癥包括但不限于例如骨疾，包括但不限于骨折愈合、骨溶解性病損——尤其是與骨髓瘤(尤其是多發(fā)性骨髓瘤、MGUS、平臺(tái)型和郁積型骨髓瘤)相關(guān)的骨溶解性病損和轉(zhuǎn)移、或者與下述的癌癥或其轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨溶解性病損和轉(zhuǎn)移骨、乳房、結(jié)腸、黑色素細(xì)胞、肝細(xì)胞、上皮、食道、 腦、肺、前列腺或胰腺；與移植相關(guān)的骨丟失；骨質(zhì)減少、骨質(zhì)疏松、骨密度異常、骨肉瘤和骨質(zhì)溶解。其他疾病或病癥包括但不限于例如癌癥、各種肌肉和代謝疾病、阿茲海默氏病、 風(fēng)濕病、結(jié)腸炎和/或不想要的脫發(fā)。還包括脂肪生成、軟骨發(fā)生和色素沉著的病癥。其他病癥包括但不限于心血管疾病，例如冠狀動(dòng)脈病、血管鈣化、跛行、動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈硬化、急性心力衰竭、充血性心力衰竭、心肌病、心肌梗塞、心絞痛、高血壓、低血壓、中風(fēng)、局部缺血、缺血再灌注損傷、動(dòng)脈瘤、再狹窄和血管狹窄。已知DKKl和Wnt通路基因在多種這類疾病中具有改變的表達(dá)，包括MFH(也稱為高度未分化多形性肉瘤)(Matushanasky等人，2007 J. Clin. Invest. 117 :3248-3257)；炎性腸病(You 等人，2008 Dig. Dis. Sci. 53 1013-1019)；骨肉瘤(Lee 等人，2007 Brit. J. Cancer 97 :1552-1559 ;Gregory 等人，2003 J. Biol. Chem. 278 :28067-28078)；骨髓(骨骼肌)轉(zhuǎn)移(Granchi 等人，2008 Int. J. Cancer 123 :1526-1535)；和肺癌和食道鱗狀細(xì)胞癌(ESCC) (Yamabuki 等人，2007 Cancer Res. 67 2517-2525)。與DKKl或DKK4相關(guān)的特定肌肉和代謝疾病包括抗胰島素性、非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)、低胰島素血癥、糖尿病(尤其是2型糖尿病，或糖皮質(zhì)激素或其它藥物相關(guān)性糖尿病)、肥胖、體重減輕、持續(xù)體重減輕(weight loss maintenance)、神經(jīng)性厭食、貪食癥、惡病質(zhì)、X綜合征、代謝綜合征、餐后高血糖癥、餐后高脂血癥和/或高甘油三酯血癥、 低血糖癥、高血糖癥、高尿酸血癥、高胰島素血癥、高膽固醇血癥、高脂血癥、血脂異常、混合型血脂異常、高甘油三酯血癥、胰腺炎和非酒精性脂肪肝病；以及肌肉創(chuàng)傷、萎縮、消耗、變性、修復(fù)、再生。在相關(guān)的實(shí)施方案中，待治療的癌癥是骨髓瘤，例如MGUS、多發(fā)性骨髓瘤或郁積型或平臺(tái)型骨髓瘤、下述的癌癥或其轉(zhuǎn)移骨、乳房、結(jié)腸、黑色素細(xì)胞、肝細(xì)胞(例如肝細(xì)胞癌(HCC))、上皮、食道、腦、肺、前列腺或胰腺。
方法涉及向需要其的對(duì)象施用有效量的包括本發(fā)明的結(jié)合分子的藥物組合物。
本發(fā)明的中和性DKK1/4結(jié)合分子適合治療患有或有風(fēng)險(xiǎn)患膽固醇相關(guān)性病癥的人類患者，包括但不限于升高的膽固醇或與升高的膽固醇相關(guān)的病況，例如脂類病癥(例如，高脂血癥、I型、II型、III型、IV型或V型高脂血癥、繼發(fā)性高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、黃瘤病、膽固醇乙酰轉(zhuǎn)移酶缺陷)。DKK1/4結(jié)合分子還適合治療患有心血管疾病的人類患者，和有風(fēng)險(xiǎn)患該病的患者，例如由于存在一種或多種風(fēng)險(xiǎn)因子(例如，高血壓、吸煙、 糖尿病、肥胖或高同種半胱氨酸血癥)的。
在某些實(shí)施方案中，任何上述方法都還涉及施用化療活性劑或其他藥用活性劑。 在相關(guān)的實(shí)施方案中，化療劑是抗癌劑。在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，化療劑是抗骨質(zhì)疏松劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，將結(jié)合分子與一種或多種骨合成代謝療法、體重減輕療法和/或糖尿病療法組合施用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合分子是DKK1/4中和性結(jié)合分子(即，特異性的中和DKKl 或DKK4或兩者)。在多個(gè)實(shí)施方案中，DKK1/4中和性結(jié)合分子的抗原結(jié)合部分不結(jié)合DKK2 或DKK3。
在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合分子或其抗原結(jié)合部分排列在免疫球蛋白樣支架內(nèi)，例如選自如人、人源化、人體工程(humaneering)、鯊魚或駱駝(camelid)支架的構(gòu)架，和/或額外的是重組的、嵌合的或移植CDR的抗體。例如，設(shè)計(jì)將人抗鼠抗體反應(yīng)最小化的技術(shù) (Kalobios的人體工程技術(shù)或PDL的人源化技術(shù))被認(rèn)為落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，特異性針對(duì)DKKl或DKK4的抗原結(jié)合部分可以在非免疫球蛋白樣支架內(nèi)，包括例如排列在源自 adnectin、纖維蛋白原、錨蛋白的重復(fù)等構(gòu)架類型內(nèi)的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，DKKl結(jié)合分子的特征是具有特異性針對(duì)靶蛋白DKKl的抗原結(jié)合區(qū)，和結(jié)合分子或功能片段結(jié)合DKKl或其片段。在相關(guān)的實(shí)施方案中，DKK4結(jié)合分子的特征是具有特異性針對(duì)靶蛋白DKK4的抗原結(jié)合區(qū)，并且結(jié)合分子或功能片段結(jié)合DKK4 或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合分子或其抗原結(jié)合部分結(jié)合DKKl或DKK4多肽或兩者， 但不結(jié)合DKK2或DKK3多肽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合分子或其抗原結(jié)合部分是單克隆的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分是多克隆的。在多個(gè)實(shí)施方案中，DKKl結(jié)合分子或其抗原結(jié)合部分結(jié)合由DKKl或DKK4多肽的30個(gè)連續(xù)的氨基酸組成的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合包含不連續(xù)的氨基酸的DKKl或DKK4表位。
在相關(guān)的實(shí)施方案中，通過至少一個(gè)下列測(cè)定來確定與DKKl或DKK4的結(jié)合抑制 DKKl或DKK4對(duì)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)錄的拮抗作用；表面等離振子共振親和測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定結(jié)合；基于電化學(xué)發(fā)光的結(jié)合分析；FMAT、SET、SPR、ALP、TopFlash、生物標(biāo)記物例如骨鈣蛋白(OCN)、I型前膠原含氮前肽(PlNP)和護(hù)骨蛋白(OPG)的血清濃度，以及與細(xì)胞表面受體例如Frizzled(Fz)、LRP(LRP5/6)或Kremen(Krm)的結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，DKKl結(jié)合分子或抗原結(jié)合部分具有至少一個(gè)下列特性與DKKl的選擇性比與人DKK2或DKK3的大至少IO3-倍、IO4-倍或IO5-倍；與DKKl或DKK4的結(jié)合具有小于100ηΜ、50ηΜ、ΙΟηΜ、1. OnM、 500pM、100pM、50pM 或 IOpM 的 Kon ；與 DKKl 具有小于 1(Γ2 每秒、1(Γ3 每秒、1(Γ4 每秒或 1(Γ5 每秒的脫離速率。
在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子與DKKl和/或DKK4競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合LRP5/6。 在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子與DKKl和/或DKK4競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Krm。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了任何上述結(jié)合分子或其功能性片段的分離的抗原結(jié)合區(qū)，及其氨基酸序列。因而，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了選自SEQ ID NO 2-20和SEQ ID NO :40-72的分離的氨基酸序列，以及這些序列的保守的或人體工程變體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的結(jié)合分子的核苷酸序列和多肽序列，尤其包括DKK1/4抗體的，重鏈和輕鏈的⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)，以及各種構(gòu)架區(qū)和支架的核苷酸序列和多肽序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)化序列用于表達(dá)、生產(chǎn)和臨床應(yīng)用。為臨床應(yīng)用而優(yōu)化的特征包括但不限于例如半衰期、藥物動(dòng)力學(xué)(PK)、抗原性、效應(yīng)子功能、FcRn清除率和患者應(yīng)答，包括抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與表18所述的任何一個(gè)或多個(gè)加陰影的CDR區(qū) (SEQ ID NO 49-98)具有至少 60、70、80、90、95、96、97、98 或 99% 同一性的氨基酸序列，其中表18提供了本發(fā)明抗體的重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO :2-20)和輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NO: 21-39)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與SEQ ID NO :40-48的任何一個(gè)或多個(gè)所提供的Vh鏈亞類的⑶R共有序列，和/或SEQ ID NO 113-118的任何一個(gè)或多個(gè)所提供的/鏈亞類的CDR共有序列具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99 %同一性的氨基酸序列。表 18的克隆支架序列顯示在SEQ ID NO =125-130中。
表18 提供了 SEQ ID NO 2-39 的重鏈和輕鏈可變區(qū)。SEQ ID NO :99、101、103、105、107、109和111提供了本發(fā)明抗體的優(yōu)化的LC和HC變體的DNA序列，而SEQ ID NO :100、 102、104、106、108、110和112分別提供了所編碼的多肽序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與SEQ ID NO 2-39和100、102、104、106、108、110與112所述的任何一個(gè)或多個(gè)序列具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%同一性的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與SEQ ID NO :99、101、103、105、107、109和111所述的任何一個(gè)或多個(gè)序列具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%同一性的核苷酸序列。
優(yōu)化的八鏈的序列，更具體的是它的DNA正義鏈、它的相應(yīng)的反義鏈及其編碼的多肽，分別提供在SEQ ID N0:119-121中。優(yōu)化的Vh鏈的序列，更具體的是它的DNA正義鏈、它的相應(yīng)的反義鏈及其編碼的多肽，分別提供在SEQ ID NO :122-1 中。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與SEQ IDNO 121或1 所述的序列具有至少60、70、80、90、95、96、 97、98或99%同一性的氨基酸序列。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與SEQ IDNO 119-120和122-123所述的序列具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%同一性的核苷酸序列。
在某些實(shí)施方案中，任何上述分離的抗體是IgG。在相關(guān)的實(shí)施方案中，任何上述分離的抗體是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是IgE、IgM、IgD 或IgA。在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明選自單克隆或多克隆抗體組合物。在其他實(shí)施方案中，抗體是嵌合的、人源化的、人體工程的、重組的，等。
功能性片段包括Fv和Fab片段(包括單鏈版本，例如scFv)，以及本發(fā)明抗體的其他抗原結(jié)合區(qū)，包括與非免疫球蛋白支架和重鏈抗體例如駱駝和鯊魚抗體和納米抗體相連的那些。在相關(guān)的實(shí)施方案中，上述分離的抗體是IgG。在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，上述分離的抗體是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是IgE、IgM、IgD 或IgA。在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明是多克隆抗體組合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的人或人源化結(jié)合分子或其功能性片段， 其具有特異性針對(duì)DKKl的表位的抗原結(jié)合區(qū)，并且結(jié)合分子或功能片段結(jié)合DKKl或DKK4， 或者另外阻斷DKKl或DKK4與細(xì)胞表面受體(例如受體如LRP5/6、Kremen, Frizzled)的結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合分子或其片段預(yù)防、治療或緩解骨溶解性病損的發(fā)展。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗DKK組合物預(yù)防、治療或緩解與DKKl-或DKK4-相關(guān)的癌癥或疾病。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的人或人源化結(jié)合分子或其功能性片段， 其具有特異性針對(duì)靶DKKl或DKK4的表位的抗原結(jié)合區(qū)，和所述表位含有來自這樣的多肽片段的6個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基，所述多肽片段包含DKKl和/或DKK4的CYSl-接頭-CYS2 結(jié)構(gòu)域。在相關(guān)的實(shí)施方案中，表位是構(gòu)象表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，表位位于CYS2結(jié)構(gòu)域中。在特定的實(shí)施方案中，表位包括修飾的氨基酸殘基。在相關(guān)的實(shí)施方案中，表位含有至少一個(gè)糖基化的氨基酸殘基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的藥物組合物，所述藥物組合物具有至少一個(gè)任意或多種上述結(jié)合分子或功能性片段或保守變體，以及其可藥用的載體或賦形劑。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，任意上述人的或人源化的結(jié)合分子或其片段是合成的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了任何上述結(jié)合分子或其功能性片段以及額外的治療劑的藥物組合物。額外的治療劑可以選自抗癌劑；抗骨質(zhì)疏松劑；抗生素；抗代謝劑；抗糖尿病劑；抗炎劑；抗血管發(fā)生劑；生長(zhǎng)因子；骨合成代謝劑、體重減輕療法、抗糖尿病劑、降血脂劑(hypylipidemic agent)、和減肥藥(anti-obesity agent)、抗高血壓劑、和 /或過氧化物酶體增殖子-激活子受體(PPAR)的激動(dòng)劑，和細(xì)胞因子。
本發(fā)明還涉及用下述藥劑的組合的預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物特別是人中的與DKK1、 DKK4或DKK1/4相關(guān)的疾病或病癥的方法，所述藥劑組合包括
(a)本發(fā)明的DKK1/4結(jié)合分子；和
(b) 一種或多種藥用活性劑；和任選的
(c)可藥用的載體；
其中至少一種藥用活性劑是抗癌治療劑。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，包括
(a) DKK1/4 中和劑；禾口
(b)藥用活性劑；和任選的
(c)可藥用的載體；
其中至少一種藥用活性劑是骨合成代謝劑、體重減輕治療劑或糖尿病治療劑。
本發(fā)明還涉及商業(yè)化包裝或產(chǎn)品，包括
(a)DKKl/4中和性結(jié)合分子的藥物制劑；和
(b)同時(shí)的、共同的、分別的或順序的使用的藥用活性劑的藥物制劑；
其中至少一種藥用活性劑是抗癌治療劑、骨合成代謝劑、體重減輕治療劑或糖尿病治療劑。
附圖簡(jiǎn)介

圖1顯示了抗DKK1/4抗體與人DKKl具有高親和力(2pM)，其結(jié)合動(dòng)力學(xué)對(duì)于具有該親和力的抗體是典型的。
圖2A顯示了全長(zhǎng)和截短的DKKl的示意圖。
圖2B描述了中和性抗DKK1/4抗體與DKKl蛋白的結(jié)合。
圖3顯示了抗DKK1/4抗體競(jìng)爭(zhēng)性抑制DKKl與LRP6結(jié)合。
圖4顯示了抗DKK1/4抗體重新激活被DKKl抑制的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，表觀EC50為 0.16nM。
圖5顯示了建立的體外測(cè)定，用于測(cè)量多能性小鼠細(xì)胞系C3H10Tl/2(10Tl/2)的 Wnt介導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化。
圖6顯示了抗DKK1/4抗體3次給藥對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的效應(yīng)。
圖7顯示了在用PBS、IgG和抗DKKl/4(抗體)處理的動(dòng)物中的百分比鈣化骨骼。
圖8顯示了抗DKK1/4抗體表現(xiàn)出類似hmeta的抗溶骨活性。
圖9顯示了抗DKK1/4抗體的骨合成代謝效率是劑量依賴性的，最小有效劑量在20 和60 μ g/只小鼠3x/周之間。
圖IOA和圖IOB顯示了 Wntl和DKKl對(duì)分化標(biāo)志物的RNA表達(dá)的影響，其中GLUT4 蛋白質(zhì)的表達(dá)隨Wnt3a和DKKl增加。
圖11是用Wnt3a、DKKl和M0R4910 (“BHQ880”)處理的細(xì)胞的分化標(biāo)志物PPAR γ、C/EBP2和AP2的表達(dá)水平的圖示。
圖12描述了用Western印跡分析的GLUT4水平。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及分離的DKK1/4結(jié)合分子，特別是人抗體的用途，所述分子特異性結(jié)合 DKKl或DKK4，且抑制DKKl或DKK4的功能特性。在一個(gè)實(shí)施方案中，DKK1/4結(jié)合分子(結(jié)合DKKl和/或DKK4的分子)不特異性的結(jié)合DKK2或DKK3。
如本文中使用的，“DKK1相關(guān)的疾病或病癥”或者“DKK4相關(guān)的疾病或病癥”，或者可選的“DKK1/4相關(guān)的疾病或病癥”(與DKKl和/或DKK4相關(guān)的疾病或病癥)，包括但不限于骨髓瘤(包括多發(fā)性骨髓瘤、MGUS、平臺(tái)型和郁積型骨髓瘤)、惡性纖維狀組織細(xì)胞增多癥或組織細(xì)胞瘤(MFH)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、β地中海貧血、腸易激惹綜合征、炎性腸病和骨病癥。如本文中使用的，對(duì)DKKl或DKK4或兩者的指代都稱為“DKK1/4”。其他此類疾病或病癥包括但不限于例如骨病癥，包括但不限于骨折愈合、骨溶解性病損和轉(zhuǎn)移；與移植相關(guān)的骨丟失；骨質(zhì)減少、骨質(zhì)疏松、骨密度異常、骨肉瘤和骨質(zhì)溶解。其他此類疾病或病癥包括但不限于例如癌癥、各種肌肉和代謝疾病、阿茲海默氏病、風(fēng)濕病、結(jié)腸炎和/或不想要的脫發(fā)。還包括脂肪生成、軟骨發(fā)生和皮膚色素沉著的病癥。其他疾病或病癥包括但不限于心血管疾病。在相關(guān)的實(shí)施方案中，待治療的癌癥是骨髓瘤(例如多發(fā)性骨髓瘤、MGUS、 平臺(tái)型和郁積型骨髓瘤)、下述的癌癥或者其轉(zhuǎn)移骨、乳房、結(jié)腸、黑色素細(xì)胞、肝細(xì)胞、上皮、食道、腦、肺、前列腺或胰腺。如果對(duì)象患有或有風(fēng)險(xiǎn)患升高的膽固醇或與升高的膽固醇相關(guān)的病況，例如脂類病癥(例如，高脂血癥、I型、II型、III型、IV型或V型高脂血癥、 繼發(fā)性高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、黃瘤病、膽固醇乙酰轉(zhuǎn)移酶缺陷)，或者如果對(duì)象患有心血管疾病或有風(fēng)險(xiǎn)患此類病癥，例如由于存在一種或多種風(fēng)險(xiǎn)因子(例如，高血壓、吸煙、糖尿病、肥胖或高同種半胱氨酸血癥)，則所述對(duì)象可能也具有DKK1/4相關(guān)性疾病或病癥。本申請(qǐng)呈遞的數(shù)據(jù)顯示，用DKKl抗體M0R4910處理3T3L1成纖維細(xì)胞，抑制其分化為脂肪細(xì)胞。對(duì)脂肪細(xì)胞的抑制可用于與脂肪細(xì)胞活性和體脂相關(guān)的代謝疾病和病況，例如， 肥胖、持續(xù)體重減輕和高脂血癥，以及癌癥患者中的體脂降低。
方法涉及向需要其的對(duì)象施用有效量的包含本發(fā)明的結(jié)合分子的藥物組合物。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是源自特定重鏈和輕鏈序列的抗體，和/ 或包括特定的結(jié)構(gòu)特征，例如包含特定氨基酸序列的CDR區(qū)。本發(fā)明提供了分離的抗體，制備此類抗體的方法，包含此類抗體的免疫綴合物和雙特異性分子，以及含有本發(fā)明的抗體、 免疫綴合物或雙特異性分子的藥物組合物。如本文提供的，本發(fā)明還涉及使用所述抗體抑制與DKKl或DKK4或兩者相關(guān)的病癥或病況的方法。
為了更便于理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語。在詳細(xì)描述中列出其它定義。
術(shù)語“免疫應(yīng)答”指淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和上述細(xì)胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細(xì)胞因子和補(bǔ)體)的作用，其導(dǎo)致選擇性損害、破壞或從人體清除侵入性病原體、受病原體感染的細(xì)胞或組織、癌性細(xì)胞，或者(在自身免疫或病理炎癥的情況下)正常人細(xì)胞或組織。
“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路”指多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之間的生物化學(xué)關(guān)系，所述分子在信號(hào)從細(xì)胞的一部分傳遞到細(xì)胞的另一部分中起作用。本文所用的短語“細(xì)胞表面受體”包括例如， 分子或分子復(fù)合體，其能夠接受信號(hào)并且能夠?qū)⑦@種信號(hào)經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜傳遞。本發(fā)明的“細(xì)胞表面受體”的實(shí)例是DKKl或DKK4蛋白質(zhì)分子結(jié)合的受體。這類細(xì)胞表面受體包括但不限定于 Frizzled (Fz)、LRP (LRP5 和 LRP6)和 Kremen (Krm)。
如本文中使用的，術(shù)語“結(jié)合分子”指特異性識(shí)別和結(jié)合靶分子的表位的免疫球蛋白和非免疫球蛋白部分。
如本文中使用的，"DKK1/4結(jié)合分子”是特異性結(jié)合DKKl或DKK4或兩者的多肽。 在一個(gè)實(shí)施方案中，DKK1/4結(jié)合分子優(yōu)先結(jié)合DKKl，與結(jié)合DKK4的親和力相差約10倍至約1000倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，親和力的差異是100倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，DKK1/4結(jié)合分子不識(shí)別DKK2或DKK3多肽。DKK1/4結(jié)合分子的實(shí)例包括但不限于至少一個(gè)⑶R片段。 本發(fā)明的具體的CDR片段可以是本領(lǐng)域已知的多種支架，包括但不限于例如抗體或抗體片段，或特異性識(shí)別和結(jié)合一種或多種靶分子的表位的免疫球蛋白或非免疫球蛋白部分。
本文所用的術(shù)語“抗體”指免疫球蛋白例如多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、 單鏈抗體及其片段如Fab、F(ab)2、Fv，以及保留母體抗體的抗原結(jié)合功能的其他片段。同樣地， 抗體可指免疫球蛋白或糖蛋白，或其片段或部分，或指包括修飾的免疫球蛋白樣構(gòu)架內(nèi)包含的抗原結(jié)合部分的結(jié)構(gòu)，或指包含非免疫球蛋白樣構(gòu)架或支架的結(jié)構(gòu)內(nèi)包括的抗原結(jié)合部分。
本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”指含有同源抗體群體的抗體組合物。該術(shù)語未限定關(guān)于抗體的種類或來源，也未旨在由制備的方式所限定。該術(shù)語包括全部免疫球蛋白以及片段如Fab、F(ab)2、Fv，以及保留抗體的抗原結(jié)合功能的其他片段。在本發(fā)明中可使用任一哺乳動(dòng)物種類的單克隆抗體。然而，實(shí)踐中，由于大鼠或鼠細(xì)胞系在用于制備產(chǎn)生單克隆抗體所需的雜交細(xì)胞系或雜交瘤中的實(shí)用性，抗體一般將是大鼠或鼠源性的。
本文所用的術(shù)語“多克隆抗體”指含有異源抗體群體的抗體組合物。多克隆抗體常源自免疫動(dòng)物或所選人類的混合血清。
本文所用的短語“單鏈抗體”指通過測(cè)定結(jié)合抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(重鏈和輕鏈)， 以及提供允許保持結(jié)合功能的連接部分制備的抗體。實(shí)質(zhì)上，這形成僅具有結(jié)合抗原所需可變結(jié)構(gòu)域的部分的極短縮抗體。單鏈抗體的測(cè)定和構(gòu)建描述于Ladner等人的美國(guó)專利號(hào) 4，946，778。
“天然存在的抗體”是糖蛋白，其包含通過二硫鍵連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(本文中簡(jiǎn)寫和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(本文中簡(jiǎn)寫為Vj和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域Q。可以將V1^nt進(jìn)一步細(xì)分為高變區(qū)，稱作互補(bǔ)決定區(qū) (CDR)，其散布著更保守的稱作構(gòu)架區(qū)(FR)的區(qū)域。每個(gè)V1^Pt由三個(gè)CDR和四個(gè)DR組成，它們從氨基末端到羧基末端以下面的順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。 重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，所述組織或因子包括免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞) 和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)。
本文所用的術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡(jiǎn)單地“抗原部分”)指結(jié)合靶標(biāo)的蛋白質(zhì)序列，例如一個(gè)或多個(gè)CDR。它包括例如，全長(zhǎng)抗體、一個(gè)或多個(gè)抗體片段，和/或保留抗原(如DKK1)特異性結(jié)合能力的非免疫球蛋白相關(guān)的支架上的CDR?？贵w的抗原結(jié)合功能可以通過全長(zhǎng)抗體的片段執(zhí)行。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)包括的結(jié)合片段的實(shí)例包括Fab片段、由/、Vh、(^和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；F (ab) 2片段、包含通過二硫鍵在鉸鏈區(qū)連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；由V1^P CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；由抗體的單臂的/和Vh結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；由Vh結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等人，1989Nature 341 =544-546)；和分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。
本文所用的“抗原”或“表位”可互換使用，指靶蛋白上的多肽序列，所述多肽序列由抗體、抗體片段、結(jié)合分子或其等價(jià)體的抗原結(jié)合部分特異識(shí)別。抗原或表位包括在靶序列內(nèi)連續(xù)或非連續(xù)的至少六個(gè)氨基酸。構(gòu)象表位可包括非連續(xù)殘基，并且任選可包括天然或人工修飾的氨基酸殘基。對(duì)殘基的修飾包括但不限定于，磷酸化、糖基化、聚乙二醇化、泛素化、呋喃化等。
此外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域/和Vh由單獨(dú)的基因編碼，但是它們可以用重組方法通過合成接頭連接，所述接頭使得它們成為一條蛋白質(zhì)鏈，其中/和Vh區(qū)配對(duì)形成單價(jià)分子(稱作單鏈Fv(scFv)；參見例如，Bird等人，1988 Science 242 :423-426 ；和Huston 等人，1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :5879-5883)。此類單鏈抗體意在被術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”包括。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)得到這些抗體片段，并且以與完整抗體相同的方式篩選所述片段的效用。
如本文描述的，保守變體包括任何鑒定的氨基酸序列中的氨基酸殘基，特別是蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域任一普通技術(shù)人員眾所周知的保守改變。
本文所用的“分離的抗體”指抗體，其基本上沒有具有不同抗原特異性的其他抗體 (例如，特異結(jié)合DKKl的分離的抗體基本上無特異結(jié)合不同于DKKl的抗原的抗體)。然而， 特異結(jié)合DKKl的分離的抗體可以與其他抗原，如來自其他物質(zhì)的DKKl分子，或其他家族成員如DKK4或相關(guān)的側(cè)向同源物具有交叉反應(yīng)性。此外，分離的抗體可以基本上無其他細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)品。
本文所用的術(shù)語“人抗體”意在包括具有可變區(qū)的抗體，其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)都來自人來源的序列。此外，如果抗體含有恒定區(qū)，那么該恒定區(qū)也來自此類人序列，例如，人種系序列，或者人種系序列的突變形式。本發(fā)明的人抗體可以包括不由人序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過在體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變導(dǎo)入的突變)。然而，如本文所用的術(shù)語“人抗體”不意在包括這樣的抗體，其中來自另一哺乳動(dòng)物物種如小鼠的種系的CDR序列已經(jīng)被嫁接到人構(gòu)架序列上。
術(shù)語“人單克隆抗體”指顯示出單結(jié)合特異性的抗體，其具有可變區(qū)，其中構(gòu)架區(qū)和⑶R區(qū)都來自人序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過雜交瘤產(chǎn)生人單克隆抗體，雜交瘤包括來自轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠的B細(xì)胞，其具有包含與永生細(xì)胞融合的人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。
本文所用的術(shù)語“人源化抗體”指衍生自人類免疫球蛋白序列的免疫球蛋白構(gòu)架區(qū)的至少一部分。已移植到人類構(gòu)架序列上的“人源化”抗體如具有CDR序列的抗體源自其他物種的種系，特別是哺乳動(dòng)物種如小鼠。技術(shù)實(shí)例包括PDL的人源化技術(shù)。
本文所用的術(shù)語“人工程化的抗體”指結(jié)合相同表位但序列不同的抗體。技術(shù)實(shí)例包括通過Kalobios的人工程化技術(shù)制備的人工程化抗體，其中抗原結(jié)合區(qū)序列是源于例如突變而非源于保守性氨基酸取代。
本文所用的術(shù)語“重組人抗體”包括通過重組手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，如從對(duì)于人免疫球蛋白基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的動(dòng)物(例如，小鼠)或從其制備的雜交瘤分離的抗體，從被轉(zhuǎn)化而表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞分離的抗體，例如，從轉(zhuǎn)染瘤分離的抗體，從重組的組合人抗體文庫分離的抗體，和通過涉及將人免疫球蛋白基因序列的全部或部分剪接成其他DNA序列的任何其他手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。此類重組人抗體具有可變區(qū)，其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)來自人種系免疫球蛋白序列。然而，在一些實(shí)施方案中，此類重組人抗體可以進(jìn)行體外誘變(或者，當(dāng)使用人Ig序列轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物時(shí)，體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，并且從而重組抗體的Vh和/區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，其盡管來自并且涉及人種系％和/序列，但是可以不天然在體內(nèi)存在于人抗體種系所有組成成分。
本文所用的“同種型”指重鏈恒定區(qū)基因提供的抗體類別(例如IgA、IgD、IgM、 IgE、IgG 如 IgGl、IgG2、IgG3 或 IgG4)。
短語“識(shí)別抗原的抗體”和“抗原特異性的抗體”在本文中與術(shù)語“特異性結(jié)合抗原的抗體”可互換使用。本文所用的“特異性結(jié)合人DKK1”的抗體意指以切10_1或更小、 2χ ΙΟ—Ι或更小，或Ix IO-ltlM或更小的Kd結(jié)合到人DKKl的抗體?！芭c不同于人DKKl的抗原交叉反應(yīng)”的抗體意指以0. 10_%或更小、5x KTi3M或更小，或h 101或更小的Kd結(jié)合該抗原的抗體?！安慌c特定抗原交叉反應(yīng)”的抗體意指以1. ΙΟΛ 或更大，或5-lOx IO-8M 或Ix KT7M或更大的Kd結(jié)合該抗原的抗體。在某些實(shí)施方案中，不與所述抗原交叉反應(yīng)的此類抗體在標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)定中顯示出對(duì)于這些蛋白質(zhì)的基本上檢測(cè)不到的結(jié)合。
本文所用的“抑制DKKl結(jié)合細(xì)胞表面受體”的結(jié)合分子如LRPJz或&!11，指以InM 或更小，0. 75nM或更小，0. 5nM或更小，或0. 25nM或更小的K抑制DKKl結(jié)合受體的結(jié)合分子。
本文所用的“骨質(zhì)溶解”指骨密度的減少，其可能由于多種作用機(jī)理，包括例如，減少的成骨細(xì)胞活性、增加的破骨細(xì)胞活性。骨質(zhì)溶解因此包含通常影響骨礦物質(zhì)密度的機(jī)理。本文所用的“抑制骨質(zhì)溶解活性”的結(jié)合分子意指通過增加骨形成或阻礙骨再吸收來抑制骨密度損失的結(jié)合分子。
本文所用的術(shù)語"Kass。。”或“Ka”意指特定抗體-抗原相互作用的結(jié)合速率，而本文所用的術(shù)語"Kdis“或"KD，“意指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。如本文所用的，術(shù)語〃 K/意指解離常數(shù)，其從Kd與Ka的比(即Kd/Ka)得到并且表達(dá)為摩爾濃度(M)0 可以使用本領(lǐng)域成熟的方法測(cè)定抗體的Kd值。用于測(cè)定抗體Kd的方法是通過使用表面等離振子體共振，或者使用生物傳感器系統(tǒng)，如Biacore 系統(tǒng)。
本文所用的術(shù)語“親和力”指在單個(gè)抗原位點(diǎn)上結(jié)合分子例如抗體和抗原之間相互作用的強(qiáng)度。在每一抗原位點(diǎn)，抗體“臂”的可變區(qū)通過弱的非共價(jià)力與抗原在多位點(diǎn)相互作用；相互作用越強(qiáng)，親和力越強(qiáng)。
本文所用的術(shù)語“抗體親抗原性”指結(jié)合分子-抗原復(fù)合物全部的穩(wěn)定性或強(qiáng)度的度量。它由三種主要因素調(diào)節(jié)結(jié)合分子表位親和力；結(jié)合分子和抗原兩者的效價(jià)；以及相互作用部分的結(jié)構(gòu)排列。最終這些因素限定結(jié)合分子的特異性，即特定結(jié)合分子結(jié)合到精確的抗原表位的可能性。
為獲得更高抗體親抗原性探針，可構(gòu)建二聚綴合物(連結(jié)FACS標(biāo)記的兩分子 JWJ-1)，從而使得低親和力相互作用(如與種系抗體)通過FACS更易檢測(cè)到。此外，增加結(jié)合抗原的抗體親抗原性的其他方法包括產(chǎn)生DKKl或DKK4結(jié)合分子的任一本文描述的纖連蛋白結(jié)構(gòu)的二聚體或多聚體?？赏ㄟ^各個(gè)分子間的共價(jià)結(jié)合產(chǎn)生這類多聚體，例如，通過模擬天然C至N端結(jié)合或通過模擬經(jīng)其恒定區(qū)保持在一起的抗體二聚物。設(shè)計(jì)進(jìn)入Fc/Fc 界面的鍵可以是共價(jià)的或非共價(jià)的。此外，在DKKl或DKK4雜化物中可使用不同于Fc的二聚化或多聚化配偶體以創(chuàng)建這種更有序的結(jié)構(gòu)。
本文所用的術(shù)語“交叉反應(yīng)”指結(jié)合分子或結(jié)合分子群體結(jié)合其他抗原表位。這可由結(jié)合分子的低抗體親抗原性或特異性，或由具有同樣或非常相似表位的多個(gè)不同抗原引起。當(dāng)需要大體結(jié)合到抗原相關(guān)組時(shí)，或當(dāng)抗原表位序列在進(jìn)化中不是高度保守而嘗試跨種標(biāo)記時(shí)，交叉反應(yīng)有時(shí)是所期望的。
本文所用的術(shù)語IgG抗體的“高親和力”或“高特異性”指對(duì)靶抗原具有ΙΟΛ 或更小、101或更小，或ΙΟ,Μ或更小的Kd的抗體。然而，“高親和力”結(jié)合可因其他抗體同種型而不同。例如，IgM同種型的“高親和力”結(jié)合指具有10_7Μ或更小，或10_%或更小的Kd 的抗體。
本文所用的術(shù)語“對(duì)象”包括任何人或非人動(dòng)物。
術(shù)語“非人動(dòng)物”包括所有脊椎動(dòng)物，例如，哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、綿羊、狗、貓、馬、奶牛、雞、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物等。術(shù)語“非人細(xì)胞”指不是人起源的任何細(xì)胞，其為真核的或原核的，尤其包括脊椎動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物、微生物、真菌或其他來源的細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語“優(yōu)化”指已被改變成此類氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列使用在產(chǎn)生的細(xì)胞或有機(jī)體中優(yōu)選的密碼子，和/或已被改變成除去潛在的剪接供體或剪接受體位點(diǎn)的核酸序列。對(duì)于多種物種的優(yōu)化的密碼子表是本領(lǐng)域眾所周知的。剪接供體或受體位點(diǎn)的序列也是本領(lǐng)域公知的并且潛在的剪接位點(diǎn)可通過例如分析轉(zhuǎn)錄或表達(dá)數(shù)據(jù)來鑒定。產(chǎn)生的細(xì)胞包括但不限定于，原核細(xì)胞，例如如細(xì)菌(大腸桿菌(E. coli))的原核細(xì)胞，或真核細(xì)胞，例如酵母(如畢赤酵母屬(Pichia))、真菌細(xì)胞、桿狀病毒感染的細(xì)胞、中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、骨髓瘤細(xì)胞或人細(xì)胞。將優(yōu)化的核苷酸序列設(shè)計(jì)成完全保留或盡可能多地保留由也被認(rèn)為是“母本”序列的啟動(dòng)核苷酸序列最初編碼的氨基酸序列和殘基數(shù)。本文已將優(yōu)化序列設(shè)計(jì)成具有在產(chǎn)生的細(xì)胞中優(yōu)選的密碼子，然而本文也預(yù)見其他真核或原核細(xì)胞中這些序列的優(yōu)化表達(dá)。優(yōu)化核苷酸序列編碼的氨基酸序列任選稱為優(yōu)化的。
在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明的中和抗-DKK1/4組合物的多肽序列以及編碼它們的核苷酸進(jìn)行生產(chǎn)和臨床用途的優(yōu)化。臨床使用優(yōu)化的特征包括但不限定于，例如，半壽期、藥物代謝動(dòng)力學(xué)(PK)、抗原性、效應(yīng)功能、FcRn清除，以及包括抗體依賴細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)或補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(CDC)活性的患者應(yīng)答。
如本文中使用的，“與DKKl相關(guān)的疾病”和/或“與DKK4相關(guān)的疾病”(“與DKK1/4 相關(guān)的疾病”)包括但不限于骨溶解性病損——尤其是與骨髓瘤(尤其是多發(fā)性骨髓瘤、 MGUS、平臺(tái)型和郁積型骨髓瘤)相關(guān)的骨溶解性病損；或者與下述的癌癥或其轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨溶解性病損骨、乳房、結(jié)腸、黑色素細(xì)胞、肝細(xì)胞、上皮、食道、腦、肺、前列腺或胰腺； 與移植相關(guān)的骨丟失。其他疾病或病癥包括但不限于例如骨肉瘤、前列腺癌、肝細(xì)胞癌 (HCC)、骨髓瘤(包括多發(fā)性骨髓瘤、MGUS、平臺(tái)型和郁積型骨髓瘤)、糖尿病、肥胖、肌肉萎縮、阿茲海默氏病、骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)減少、風(fēng)濕病、結(jié)腸炎和/或不想要的脫發(fā)。[0101]本文所用的“治療”是以預(yù)防發(fā)展或改變病癥的病狀為目的進(jìn)行的干預(yù)。“治療” 指治療性處理和預(yù)防或預(yù)止性措施。需要治療的個(gè)體包括患有病癥的個(gè)體以及待預(yù)防病癥的個(gè)體。在腫瘤(如癌癥)治療中，治療劑可直接減少腫瘤細(xì)胞的病狀，或使腫瘤細(xì)胞更易感于通過其他的活性劑如輻射和/或化學(xué)療法的治療。癌癥的“病狀”包括危害患者健康的所有現(xiàn)象。這非限定地包括異?；驘o法控制的細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、干擾鄰近細(xì)胞的正常功能、 異常水平釋放細(xì)胞因子或其他分泌產(chǎn)物、炎癥或免疫應(yīng)答的抑制或惡化等。
患有臨床疾病、生物化學(xué)疾病、放射性疾病或主觀疾病(如骨質(zhì)溶解)的患者治療，可包括減輕一些或全部這類癥狀或減少患病誘因。
通常，本發(fā)明的中和抗-DKK1/4組合物預(yù)防、治療或改善與DKK1、DKK4或該兩者有關(guān)，而不是與DKK2、DKK3或Wnt途徑的其他調(diào)節(jié)劑有關(guān)的Wnt相關(guān)疾病。
本發(fā)明的多個(gè)方面進(jìn)一步詳細(xì)描述于下面部分。
Wnt途徑是充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)分化成成骨細(xì)胞的主要調(diào)節(jié)因子。它也是活性成骨細(xì)胞的重要存活因子。Dickkopf-I (DKKl)是主要在成人骨中表達(dá)的Wnt途徑拮抗物并且在患有骨質(zhì)溶解性損傷的骨髓瘤患者中被增量調(diào)節(jié)。中和抗-DKK1/4的結(jié)合分子確實(shí)是合成代謝劑，其通過增加成骨細(xì)胞的活性同時(shí)減少破骨細(xì)胞活性來起作用。相反，目前的藥物如作為合成代謝劑銷售的PTH，實(shí)際上增加了成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記。
本發(fā)明提供的是選擇用于結(jié)合DKKl的多克隆和單克隆抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中， 本發(fā)明的抗體具有針對(duì)人DKKl小于IOpM的親和力。在某些實(shí)施方案中，抗DKKl抗體與 DKK4(Kd 300pM)交叉反應(yīng)而不與DKK2交叉反應(yīng)(應(yīng)用現(xiàn)有方法不可檢測(cè))。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將抗-DKKl或抗-DKK4結(jié)合分子的表位定位到Cys_2結(jié)構(gòu)域 (第189-263位氨基酸)，其被認(rèn)為負(fù)責(zé)LRP6和Kremen的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，該表位包括DKKl或DKK4多肽的Cys-2結(jié)構(gòu)域的至少六個(gè)且至多三十個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，表位包括至少六個(gè)連續(xù)的氨基酸的一段序列。在另一實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)是非線性的，即包括非連續(xù)性的氨基酸殘基。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合取決于N-糖基化。僅僅預(yù)知Cys-2結(jié)構(gòu)域中的殘基256處的一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子在小鼠中顯示劑量線性藥物代謝動(dòng)力學(xué) (AUC)，在小鼠中劑量超過20-200 μ g/小鼠時(shí)具有35-96小時(shí)的劑量依賴性終末半壽期。
因此，“抑制”依據(jù)本領(lǐng)域公知并描述于本文的方法學(xué)測(cè)定的一種或多種這些DKKl 功能性質(zhì)(例如，生物化學(xué)活性、免疫化學(xué)活性、細(xì)胞活性、生理學(xué)活性或其他生物學(xué)活性) 的結(jié)合分子，將被認(rèn)為與相對(duì)于缺乏結(jié)合分子時(shí)(例如，或當(dāng)無相關(guān)特異性的對(duì)照結(jié)合分子存在時(shí))所顯示的特定活性的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著降低相關(guān)。抑制DKKl活性的結(jié)合分子影響這類統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著降低至少10%的測(cè)量參數(shù)，至少50%、80%或90%，并且在某些實(shí)施方案中本發(fā)明結(jié)合分子可抑制大于95^^98%或99%的DKKl功能性活性。
Dickkopf 家族成員
本發(fā)明的DKK 多肽包括 DKKl (SEQ ID NO 1)和 DKK4 (SEQ ID NO: 133)，以及 DKK2 (SEQ ID NO :131)禾口 DKK3 (SEQ ID NO :132)。DKK 家族成員具有示于表 A-DKK1 家族成員堆積(pileup)中的兩個(gè)CYS結(jié)構(gòu)域(CYS1和CYS2)。DKK蛋白質(zhì)包含酸性N端信號(hào)肽、 由分枝連接區(qū)(divergent linker region)隔開的含半胱氨酸殘基簇的兩個(gè)CYS結(jié)構(gòu)域， 以及潛在的C末端N糖基化位點(diǎn)。DKK4中的CYS2結(jié)構(gòu)域具有可在質(zhì)膜上促進(jìn)WNT/DKK相互作用的脂質(zhì)結(jié)合功能。OMIM登錄號(hào)605417。
權(quán)利要求
1.治療與DKKl和/或DKK4的存在相關(guān)的病癥或病況的方法，包括向需要其的對(duì)象施用有效量的藥物組合物，所述藥物組合物用作藥物，所述組合物包括特異性結(jié)合DKKl多肽 (SEQ ID NO 1)和/或DKK4多肽(SEQ ID NO :131)中的表位的抗原結(jié)合區(qū)，其中，抗體或其功能片段結(jié)合DKKl或DKK4或兩者中的至少一個(gè)表位，且所述藥物是用于治療與DKKl和 /或DKK4的存在相關(guān)的病癥或病況。
2.治療與DKKl和/或DKK4的存在相關(guān)的病癥或病況的方法，其中所述病癥或病況選自i.惡性纖維狀組織細(xì)胞增多癥(MFH)； . β地中海貧血；iii.神經(jīng)母細(xì)胞瘤；iv.炎性腸病和腸易激惹綜合征；v.2型糖尿病；vi.糖皮質(zhì)激素或其他藥物相關(guān)性糖尿病；vii.非胰島素依賴性糖尿?。籿iii.低胰島素血癥；ix.與色素沉著相關(guān)的病癥； χ.心血管病癥；xi.膽固醇相關(guān)性病癥；xii.MGUS ；xiii.平臺(tái)型骨髓瘤；和xiv.郁積型骨髓瘤，所述方法方法包括向需要其的對(duì)象施用藥學(xué)有效量的DKK1/4抗體，所述抗體包含選自表 5、6、7 和 8 的 CDR1、CDR2 和 CDR3 區(qū)。
3.權(quán)利要求
2的方法，其中所述方法還包括施用第二治療劑。
4.權(quán)利要求
3的方法，其中所述第二治療劑選自抗癌劑；抗骨質(zhì)疏松劑；抗生素；抗代謝劑；抗糖尿病劑；抗炎劑；抗血管發(fā)生劑；生長(zhǎng)因子；骨合成代謝劑，體重減輕療法，降血脂劑，和減肥藥，抗高血壓劑，和/或過氧化物酶體增殖子-激活子受體(PPAR)的激動(dòng)劑， 和細(xì)胞因子。
5.權(quán)利要求
3的方法，其中所述第二治療劑是除中和性抗DKK1/4組合物或其衍生物以外的藥用活性劑，所述活性劑選自i.芳化酶抑制劑； .抗雌激素物質(zhì)、抗雄激素物質(zhì)或促性腺激素釋放因子激動(dòng)劑；iii.拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑或拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑；iv.微管活性劑、烷化劑、抗腫瘤的抗代謝物或鉬化合物；v.靶向/降低蛋白質(zhì)或脂質(zhì)激酶活性、或者蛋白質(zhì)或脂質(zhì)磷酸酶活性的化合物，或進(jìn)一步的抗血管發(fā)生的化合物或誘導(dǎo)細(xì)胞分化過程的化合物；vi.單克隆抗體；vii.環(huán)加氧酶抑制劑、雙磷酸鹽、類肝素酶抑制劑、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑；viii.Ras致癌同種型抑制劑；ix.端粒末端轉(zhuǎn)移酶抑制劑；χ.蛋白酶抑制劑、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、甲硫氨酸氨肽酶抑制劑或蛋白酶體抑制劑；xi.用于治療血液性惡性腫瘤的活性劑或者靶向、降低或抑制Flt-3活性的化合物；xii.HSP90抑制劑；xiii.抗增殖性抗體；xiv.組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑；XV.靶向、降低或抑制絲氨酸/蘇氨酸mTOR激酶活性/功能的化合物；xvi.促生長(zhǎng)素抑制素受體拮抗劑；xvii.抗白血病的化合物；xviii.腫瘤細(xì)胞損傷方式；xix.EDG結(jié)合劑；XX.核糖核苷酸還原酶抑制劑；xxi.S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶抑制劑；xxii.VEGF或VEGFR的單克隆抗體；xxiii.光動(dòng)力學(xué)治療；xxiv.血管穩(wěn)定類固醇；XXV.包含皮質(zhì)類固醇的植入物；xxvi.ATl受體拮抗劑；xxvii.ACE 抑制劑；xxviii.抗糖尿病劑；xxix.降血脂劑； XXX.減肥藥；xxxi.抗高血壓齊Ll；禾口xxxii.過氧化物酶體增殖子-激活子受體(PPAR)的激動(dòng)劑； 和任選的可藥用的載體。
6.治療惡性纖維狀組織細(xì)胞增多癥(MFH)的方法，包括向需要其的對(duì)象施用藥學(xué)有效量的DKK1/4抗體，所述抗體包含選自表5、6、7和8的⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)。
7.權(quán)利要求
2的方法，其中所述骨病癥選自骨折愈合、骨溶解性病損和轉(zhuǎn)移、骨質(zhì)減少、骨質(zhì)疏松、骨密度異常、骨肉瘤和骨質(zhì)溶解。
8.權(quán)利要求
2的方法，其中所述癌癥選自骨髓瘤、多發(fā)性骨髓瘤、MGUS、郁積型或平臺(tái)型骨髓瘤；下述的癌癥或其轉(zhuǎn)移骨、乳房、結(jié)腸、黑色素細(xì)胞、肝細(xì)胞、肝細(xì)胞癌(HCC)、上皮、食道、腦、肺、前列腺或胰腺。
9.權(quán)利要求
2的方法，其中所述肌肉疾病選自肌肉創(chuàng)傷、萎縮、消耗、變性、修復(fù)、再生。
10.權(quán)利要求
2的方法，其中所述代謝疾病選自抗胰島素性、非胰島素依賴性糖尿病 (NIDDM)、低胰島素血癥、糖尿病(尤其是2型糖尿病，或糖皮質(zhì)激素或其它藥物相關(guān)性糖尿病)、肥胖、體重減輕、持續(xù)體重減輕、神經(jīng)性厭食、貪食癥、惡病質(zhì)、X綜合征、代謝綜合征、 餐后高血糖癥、餐后高脂血癥和/或高甘油三酯血癥、低血糖癥、高血糖癥、高尿酸血癥、高胰島素血癥、高膽固醇血癥、高脂血癥、血脂異常、混合型血脂異常、高甘油三酯血癥、胰腺炎和非酒精性脂肪肝病。
11.權(quán)利要求
2的方法，其中所述心血管疾病選自冠狀動(dòng)脈病、血管鈣化、跛行、動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈硬化、急性心力衰竭、充血性心力衰竭、冠狀動(dòng)脈病、心肌病、心肌梗塞、心絞痛、高血壓、低血壓、中風(fēng)、局部缺血、缺血再灌注損傷、動(dòng)脈瘤、再狹窄和血管狹窄。
12.權(quán)利要求
2的方法，其中所述膽固醇相關(guān)性病癥選自升高的膽固醇、與升高的膽固醇相關(guān)的病況、脂類病癥、高脂血癥、I型、II型、III型、IV型和V型高脂血癥、繼發(fā)性高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、黃瘤病和膽固醇乙酰轉(zhuǎn)移酶缺陷。
13.治療MHF的方法，包括向需要其的對(duì)象施用藥學(xué)有效量的DKK1/4抗體，所述抗體包含選自表5、6、7和8的CDRU CDR2和CDR3區(qū)。
14.權(quán)利要求
2-13的任一項(xiàng)的方法，其中所述選自表5、6、7和8的⑶R1、⑶R2和⑶R3 區(qū)是選自 SEQ ID NO :49-52 的 Vh CDRLSEQ ID NO :53-63 的 Vh CDR2，SEQ ID NO :64-69 的 Vh CDR3，和 SEQ ID NO :70-74 的 / CDRl, SEQ ID NO :75-79 的 / CDR2, SEQ ID NO :80-98 的 /CDR3。
15.權(quán)利要求
2-13的任一項(xiàng)的方法，其中所述選自表5、6、7和8的⑶R1、⑶R2和⑶R3 區(qū)包括選自以下的共有序列，對(duì)于Vh⑶SEQ ID NO :40-43的共有序列，對(duì)于Vh⑶R2 SEQ ID NO :44-47的共有序列，對(duì)于Vh CDR3 SEQ ID NO :48的共有序列，以及對(duì)于Vl CDRl SEQ ID NO :113和116的共有序列，對(duì)于/ CDR2 SEQ ID NO :114禾Π 117的共有序列，對(duì)于八 CDR3 SEQ ID NO :115 和 118 的共有序列。
專利摘要
提供了使用結(jié)合蛋白質(zhì)靶Dickkopf-1(DKK1)、Dickkopf-4(DKK4)或兩者(其中，與DKK1或DKK4或兩者的特異性在本文中稱為“DKK1/4”)的結(jié)合分子及其片段的方法。
文檔編號(hào)A61P3/10GKCN102421798SQ201080019959
公開日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2010年5月6日
發(fā)明者A·泰勒, D·R·斯托弗, E·布倫德勒, P·雷, S·M·蘭瓦拉 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan