櫻花品種“咲耶姬”的分子特異性標(biāo)記引物及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及櫻花品種"咲耶姬"的分子特異性標(biāo)記引物以及利用該分子特異性標(biāo) 記引物對櫻花品種"咲耶姬"進行快速鑒定的方法。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 櫻花隸屬于薔薇科（Rosaceae)櫻屬（Cerasus)，是世界著名的觀賞植物。目前已 知櫻花品種有300多個，因其株型優(yōu)美、花色艷麗、整個花期延續(xù)期長，在園林上有極大的 應(yīng)用價值。近年來，我國各地大規(guī)模種植櫻花并應(yīng)用于公園、學(xué)校、街道、庭院等綠地中，成 為早春主要觀賞花木之一。北京、武漢、青島、上海等城市每年紛紛舉辦櫻花節(jié)，櫻花產(chǎn)業(yè)得 到迅猛發(fā)展，這對于建設(shè)美麗中國，促進農(nóng)民增收，推進山區(qū)綜合開發(fā)和建設(shè)社會主義新農(nóng) 村，都具有十分重要的意義。
[0003] 我國櫻屬植物資源豐富，分布廣泛，且櫻屬植物表型具有較強可塑性，種間雜交容 易，品種數(shù)量眾多，有些品種間性狀差異較小，傳統(tǒng)形態(tài)分類很難快速、準(zhǔn)確有效評價與區(qū) 分。學(xué)術(shù)界對目前種植櫻花品種的名稱和描述都很混亂，"同物異名"或"同名異物"現(xiàn)象較 為嚴(yán)重，缺乏統(tǒng)一規(guī)范的名稱及科學(xué)系統(tǒng)的分類體系，不便于品種鑒定、推廣、交流及新品 種的培育，因此亟需建立一個科學(xué)合理的櫻花品種分類鑒定系統(tǒng)。
[0004] 目前就全國范圍內(nèi)的櫻花品種調(diào)查和分類還僅僅是通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征、過氧 化物酶和酯酶同工酶技術(shù)、電鏡掃描花粉粒和Q型聚類分析等方法，這些方法盡管有用，但 很難對櫻花品種進行正確的鑒定和應(yīng)用。而近年來在植物分類界已廣泛應(yīng)用的DNA分子標(biāo) 記技術(shù)迄今尚未在櫻花品種分類、品種間親緣關(guān)系及遺傳多樣性等研宄上得以應(yīng)用。因此， 有必要利用分子標(biāo)記技術(shù)手段，對我國現(xiàn)有的櫻花品種進行科學(xué)鑒別，不僅有助于櫻花品 種分類鑒定系統(tǒng)的建立，也為櫻屬植物資源的進一步研宄提供分子依據(jù)。
[0005] 目前國內(nèi)引進大量的櫻花品種，在北京、青島、武漢、上海等各大公園內(nèi)廣泛栽植， 觀賞價值極高，其中以晚櫻品種居多，普遍具有花量大、花色艷麗、花瓣多、花期長、抗性 強、適應(yīng)性廣等特點。我們經(jīng)過長期的調(diào)查工作，發(fā)現(xiàn)20個晚櫻品種包括紅笠（Cerasus serrulata'Benigasa'）、紅華（C. serrulata'Kouka'）、一葉（C. serrulata'Hisakura'）、福 綠壽（C. serrulata'Conto;rta'）、普賢象（C. serrulata'Alb〇-;rosea'）、松月（C. serrulata 'Superba'）、郁金（C. serrulata 'Grandifora'）、紅豐（CerasusXsieboldii 'Beni -yutaka'）、御衣黃(C. serrulata 'Gioiko'）、關(guān)山(C. serrulata 'Kanzan'）、大提 燈（C. serrulata 'Ojochin'）、八重紅枝垂（C. spachiana 'Plena Rosea'）、市原虎 尾（C. serrulata 'Albo Plena'）、咲耶姬（Cerasus Xyedoensis 'Sakuyahime'）、 朱雀（C. serrulata 'Shujaku'）、楊貴妃（C. serrulata 'Mollis'）、雨情枝垂 (C. spachiana 'Ujou-shidare'）、菊垂樓（C. serrulata 'Plena-pendula'）、平野妹背 (C. serrulata 'Imose'）、旭山樓（C. serrulata 'Asahiyama'）在園林中的應(yīng)用極其廣泛， 但這些品種的"同名異物"、"同物異名"現(xiàn)象也異常嚴(yán)重，從表型特征方面很難鑒別，給園林 植物應(yīng)用、推廣以及新品種選育帶來很多困難，因此著力從分子水平上開發(fā)出這些品種穩(wěn) 定、特異的DNA指紋標(biāo)記才是實現(xiàn)櫻花品種準(zhǔn)確快速鑒定的科學(xué)途徑。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供櫻花品種"咲耶姬"的分子特異性標(biāo)記引物，以及利用該對引物 對櫻花品種"咲耶姬"進行快速鑒定的方法。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0008] 櫻花品種"咲耶姬"的分子特異性標(biāo)記引物，所述引物序列為：
[0009] 上游引物：5，-TGAGTCCAAACCGGACCGAGAAG-3，；
[0010] 下游引物：5' -GACTGCGTACGAAITGACGGGAAT-3 '。
[0011] 該引物對是采用PCR技術(shù)，經(jīng)過大量篩選試驗獲得櫻花品種"咲耶姬"的特異性 DNA片段之后，將該片段克隆測序，以得到的DNA序列為基礎(chǔ)設(shè)計特異性引物，以該特異性 引物對櫻花品種進行PCR擴增，僅"咲耶姬"可獲得491bp大小的特異性片段，其他櫻花品 種均不能獲得特異性片段。需要說明的是，本發(fā)明分子特異性標(biāo)記引物僅限于櫻花品種的 鑒定（鑒定其是否為"咲耶姬"），即待測樣品僅限于櫻花。
[0012] 本發(fā)明還涉及一種利用所述的分子特異性標(biāo)記引物對櫻花品種"咲耶姬"進行快 速鑒定的方法，所述方法為：提取待測櫻花品種葉片的基因組DNA作為模板，以所述分子 特異性標(biāo)記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn) 491bp大小的DNA條帶，則待測櫻花品種為櫻花品種"咲耶姬"，反之則否；所述分子特異性 標(biāo)記引物序列為：
[0013] 上游引物：5，-TGAGTCCAAACCGGACCGAGAAG-3，；
[0014] 下游引物：5' -GACTGCGTACGAAITGACGGGAAT-3 '。
[0015] 本發(fā)明方法關(guān)鍵在于擴增引物的選擇、DNA提取、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件確定， 以及電泳檢測，均可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進行。
[0016] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述PCR擴增體系組成如下：
[0017]
[0018]
[0019] 余量為 ddH20。
【主權(quán)項】
1. 櫻花品種"咲耶姬"的分子特異性標(biāo)記引物，所述引物序列如下： 上游引物：5 ' -TGAGTCCAAACCGGACCGAGAAG-3 ' ； 下游引物：5' -GACTGCGTACGAATTGACGGGAAT-3'。
2. -種利用權(quán)利要求1所述的分子特異性標(biāo)記引物對櫻花品種"咲耶姬"進行快速鑒 定的方法，所述方法為：提取待測櫻花品種葉片的基因組DNA作為模板，以所述分子特異性 標(biāo)記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn)491bp 的特異DNA條帶，則待測櫻花品種為櫻花品種"咲耶姬"，反之則否；所述分子特異性標(biāo)記引 物序列為： 上游引物：5 ' -TGAGTCCAAACCGGACCGAGAAG-3 ' ； 下游引物：5' -GACTGCGTACGAATTGACGGGAAT-3'。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR擴增條件如下：95°C預(yù)變性3min ; 95°C變性40s，57°C退火40s，72°C延伸2min，共35個循環(huán)；最后于72°C補平7min，終止溫 度為4°C。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下： (1) 取待測櫻花葉片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待測櫻花葉片的基因組DNA ; (2) 以步驟⑴提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物作為擴增引物， 進行PCR擴增： PCR擴增體系每25 μ L組成如下： PCR擴增條件如下：
95°C預(yù)變性3min ;95°C變性40s，57°C退火40s，72°C延伸2min，共35個循環(huán)；最后于 72°C補平7min，終止溫度為4°C ; (3) 取步驟（2)擴增產(chǎn)物5 μ L，與1 μ L0. 25 %溴酚蘭緩沖液混勻，點樣于1. 5%的瓊脂 糖凝膠上，于IXTAE緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后EB染色，于自動凝膠圖像分 析儀上照相，若電泳結(jié)果出現(xiàn)491bp的DNA條帶，則待測櫻花品種為"咲耶姬"，反之則否。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一對特異性高的櫻花品種“咲耶姬”的分子特異性標(biāo)記引物，以及一種能對櫻花品種“咲耶姬”進行快速鑒定的方法。所述引物序列如下：上游引物：5′-TGAGTCCAAACCGGACCGAGAAG-3′；下游引物：5′-GACTGCGTACGAATTGACGGGAAT-3′。本發(fā)明分子特異性標(biāo)記引物可對櫻花品種“咲耶姬”進行快速的早期鑒別，方法簡單、快捷、準(zhǔn)確，是表觀特征辨別櫻花品種所不能替代的分子手段。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104673913
【申請?zhí)枴緾N201510078432
【發(fā)明人】柳新紅, 徐梁, 李海波, 王青華, 趙慶杰, 郭佳, 余建國
【申請人】浙江省林業(yè)科學(xué)研究院
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月13日