附加有膠原結(jié)合性分子的改造層粘連蛋白及其利用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及附加有膠原結(jié)合性分子的改造層粘連蛋白、含有該改造層粘連蛋白的 細(xì)胞外基質(zhì)材料、培養(yǎng)基材和支架、以及使用該改造層粘連蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞特別是ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞等多能干細(xì)胞在再生醫(yī)療中的應(yīng)用在世界范圍內(nèi) 受到矚目。但是，為了在保持多能性的狀態(tài)下對干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、維持，通常，細(xì)胞在作為飼 養(yǎng)細(xì)胞的、使用放射線、抗生素進(jìn)行處理而使細(xì)胞分裂停止的小鼠胚胎來源的成纖維細(xì)胞 (MEF)的共存下進(jìn)行培養(yǎng)。但是，在對人干細(xì)胞進(jìn)行臨床應(yīng)用的階段，這些飼養(yǎng)細(xì)胞的使用 成為很大的制約。
[0003] 為了將人干細(xì)胞應(yīng)用于再生醫(yī)療，需要滿足不使用飼養(yǎng)細(xì)胞的無飼養(yǎng)細(xì)胞條件和 從培養(yǎng)體系中排除異種來源成分的無異源成分（XenO-Free)條件的培養(yǎng)環(huán)境。本發(fā)明人 發(fā)現(xiàn)，人層粘連蛋白（特別是由a30 3Y2構(gòu)成的層粘連蛋白332和由a50 1Yl構(gòu)成的 層粘連蛋白511)的重組蛋白對于維持人ES細(xì)胞的多能性有效（參考非專利文獻(xiàn)1)，作為 能夠在保持多能性的狀態(tài)下維持培養(yǎng)干細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)，提出了重組人層粘連蛋白的E8 片段、或者在重組人層粘連蛋白的E8片段上附加有細(xì)胞粘附分子、增殖因子結(jié)合分子的改 造層粘連蛋白（參考專利文獻(xiàn)1、2、非專利文獻(xiàn)2)。
[0004] 作為人干細(xì)胞的維持培養(yǎng)的下一階段，為了對人干細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)并應(yīng)用于再 生醫(yī)療，需要構(gòu)建來源于人干細(xì)胞的三維組織結(jié)構(gòu)體。以往，在利用從組織中分離的細(xì)胞構(gòu) 建三維組織結(jié)構(gòu)體的情況下，使用從過量產(chǎn)生基底膜成分的小鼠EHS腫瘤中制備的粗提物 (商品名：Matrigel(Y卜yy;1/)(注冊商標(biāo)））作為細(xì)胞外基質(zhì)。但是，由于Matrigel來 源于小鼠，因此，對人的安全性存在問題。另一方面，在三維培養(yǎng)體系中廣泛使用的膠原凝 膠的維持干細(xì)胞的活性弱，因此，即使單獨使用膠原凝膠作為細(xì)胞外基質(zhì)，也難以由人干細(xì) 胞構(gòu)建三維組織結(jié)構(gòu)體。即，現(xiàn)狀是，不存在替代Matrigel(注冊商標(biāo)）的用于構(gòu)建三維組 織結(jié)構(gòu)體的適當(dāng)?shù)募?xì)胞外基質(zhì)材料。因此，強烈要求提前開發(fā)出用于構(gòu)建對人安全的再生 醫(yī)療用三維組織結(jié)構(gòu)體的細(xì)胞外基質(zhì)材料。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0006] 專利文獻(xiàn)
[0007] 專利文獻(xiàn)1 :日本特開2011-78370號公報
[0008] 專利文獻(xiàn)2 :國際公開第2012-137970號 [0009]非專利文獻(xiàn)
[0010]非專利文獻(xiàn) 1:MiyazakiT,FutakiS,HasegawaK,KawasakiM,SanzenN,Hayashi M,KawaseE,SekiguchiK，NakatsujiN，SuemoriH.Recombinanthumanlamininisoforms cansupporttheundifferentiatedgrowthofhumanembryonicstemcells.Biochem. Biophys.Res.Commun. 375:27-35, 2008.
[0011]非專利文獻(xiàn) 2:MiyazakiT，F(xiàn)utakiS，SuemoriH，TaniguchiY，Yamada M,KawasakiM,HayashiM，KumagaiH,NakatsujiN，SekiguchiK,KawaseE.Laminin E8fragmentssupportefficientadhesionandexpansionofdissociatedhuman pluripotentstemcells.Naturecommunications.DOI:10. 1038/ncomms2231, 2012.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 發(fā)明所要解決的問題
[0013] 本發(fā)明的課題在于提供對用于構(gòu)建對人安全的再生醫(yī)療用三維組織結(jié)構(gòu)體有用 的細(xì)胞外基質(zhì)材料作為替代Matrigel(注冊商標(biāo)）的細(xì)胞外基質(zhì)材料。
[0014] 用于解決問題的方法
[0015] 為了解決上述課題，本發(fā)明包含下述發(fā)明。
[0016] [1] 一種改造層粘連蛋白，其特征在于，在層粘連蛋白或者形成了異三聚體的層粘 連蛋白片段的a鏈的N末端、0鏈的N末端和Y鏈的N末端中的至少一處結(jié)合有膠原結(jié) 合性分子。
[0017] [2]如上述[1]所述的改造層粘連蛋白，其特征在于，在層粘連蛋白或者形成了異 三聚體的層粘連蛋白片段的a鏈的N末端、0鏈的N末端和y鏈的N末端中的兩處以上 結(jié)合有膠原結(jié)合性分子。
[0018] [3]如上述[1]或[2]所述的改造層粘連蛋白，其特征在于，層粘連蛋白片段具有 整合素結(jié)合活性。
[0019] [4]如上述[3]所述的改造層粘連蛋白，其中，層粘連蛋白片段為層粘連蛋白E8片 段。
[0020] [5]如上述[1]~[4]中任一項所述的改造層粘連蛋白，其特征在于，層粘連蛋白 或者形成了異三聚體的層粘連蛋白片段由選自a1~a5中的一種a鏈或其片段、選自 0 1~0 3中的一種0鏈或其片段和選自Y1~Y3中的一種Y鏈或其片段構(gòu)成。
[0021] [6]如上述[5]所述的改造層粘連蛋白，其中，層粘連蛋白或者形成了異三聚體的 層粘連蛋白片段為層粘連蛋白或其片段、層粘連蛋白a3f33Y2或其片段、層 粘連蛋白alMyl或其片段、層粘連蛋白alf32Yl或其片段、層粘連蛋白a2MYl 或其片段、層粘連蛋白a2f3 2yl或其片段、層粘連蛋白a3Myl或其片段、層粘連蛋白 (13 02丫1或其片段、層粘連蛋白（1401丫1或其片段、層粘連蛋白（1402丫1或其片段或 者層粘連蛋白a5f32yl或其片段。
[0022] [7]如上述[1]~[6]中任一項所述的改造層粘連蛋白，其特征在于，膠原結(jié)合性 分子為選自下述（a)~（r)中的至少一種以上，
[0023] (a)纖連蛋白或者其包含膠原結(jié)合活性位點的片段
[0024] (b)膠原酶或者其包含膠原結(jié)合活性位點的片段
[0025](c)整合素a1鏈或者其包含膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段
[0026] (d)整合素a2鏈或者其包含膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段
[0027] (e)整合素a10鏈或者其包含膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段
[0028] (f)整合素a11鏈或者其包含膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段
[0029] (g)血小板糖蛋白VI或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0030] (h)盤狀結(jié)構(gòu)域受體1或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0031] (i)盤狀結(jié)構(gòu)域受體2或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0032] (j)甘露糖受體或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0033] (k)磷脂酶A2受體或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0034] (1)DEC205或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0035] (m)Endol80或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0036] (n)血管性血友病因子或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0037] (o)MMP_2或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0038] (p)MMP_9或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0039] (q)白細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體1或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0040] (r)白細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體2或者其包含膠原結(jié)合位點的片段。
[0041] [8]如上述[1]~[7]中任一項所述的改造層粘連蛋白，其來源于人。
[0042] [9] 一種細(xì)胞外基質(zhì)材料，其特征在于，含有上述[1]~[8]中任一項所述的改造 層粘連蛋白、以及膠原和/或明膠。
[0043] [10] -種培養(yǎng)基材，其特征在于，包被有上述[1]~[8]中任一項所述的改造層粘 連蛋白、以及膠原和/或明膠。
[0044] [11] 一種支架，其特征在于，含有上述[1]~[8]中任一項所述的改造層粘連蛋 白、以及膠原和/或明膠。
[0045][12]-種培養(yǎng)方法，其為哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，在上述[1]~ [8]中任一項所述的改造層粘連蛋白、以及膠原和/或明膠的存在下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0046] [13]如上述[12]所述的培養(yǎng)方法，其中，哺乳動物細(xì)胞為ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞或者 成體干細(xì)胞。
[0047] 發(fā)明效果
[0048] 根據(jù)本發(fā)明，能夠提供對用于構(gòu)建對人安全的再生醫(yī)療用三維組織結(jié)構(gòu)體有用的 含有改造層粘連蛋白以及膠原和/或明膠的細(xì)胞外基質(zhì)材料、培養(yǎng)基材、支架。
【附圖說明】
[0049] 圖1是表示將附加有1個、2個或3個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘連蛋白511E8 和未附加CBD的層粘連蛋白511E8供于非還原條件SDS-PAGE分析的結(jié)果的圖。
[0050] 圖2是表示對附加有1個、2個或3個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘連蛋白511E8 和未附加CBD的層粘連蛋白511E8與膠原的結(jié)合活性進(jìn)行研宄的結(jié)果的圖。
[0051] 圖3是表示對附加有1個、2個或3個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘連蛋白511E8 和未附加CBD的層粘連蛋白511E8與明膠的結(jié)合活性進(jìn)行研宄的結(jié)果的圖。
[0052] 圖4是表示在包被有I型膠原的板中添加3種膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)附加層粘連 蛋白511E8或者層粘連蛋白511E8并對人iPS細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的結(jié)果的圖。
[0053] 圖5是表示在包被有明膠的板中添加3種膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)附加層粘連蛋白 511E8或者層粘連蛋白511E8并對人iPS細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的結(jié)果的圖。
[0054] 圖6是表示將附加有1個或2個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘連蛋白111E8和未 附加CBD的層粘連蛋白111E8供于非還原條件SDS-PAGE分析的結(jié)果的圖。
[0055] 圖7是表示將附加有1個或2個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘連蛋白121E8和未 附加CBD的層粘連蛋白121E8供于非還原條件SDS-PAGE分析的結(jié)果的圖。
[0056] 圖8是表示將附加有1個或2個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘連蛋白211E8和未 附加CBD的層粘連蛋白211E8供于非還原條件SDS-PAGE分析的結(jié)果的圖。
[0057] 圖9是表示將附加有1個或2個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘連蛋白221E8和未 附加CBD的層粘連蛋白221E8供于非還原條件SDS-PAGE分析的結(jié)果的圖。
[0058] 圖10是表示將附加有1個或2個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘連蛋白311E8和 未附加CBD的層粘連蛋白311E8供于非還原條件SDS-PAGE分析的結(jié)果的圖。
[0059] 圖11是表示將附加有1個或2個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘連蛋白321E8和 未附加CBD的層粘連蛋白321E8供于非還原條件SDS-PAGE分析的結(jié)果的圖。
[0060] 圖12是表示將附加有1個或2個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘連蛋白411E8和 未附加CBD的層粘連蛋白411E8供于非還原條件SDS-PAGE分析的結(jié)果的圖。
[0061] 圖13是表示將附加有1個或2個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘連蛋白421E8和 未附加CBD的層粘連蛋白421E8供于非還原條件SDS-PAGE分析的結(jié)果的圖。
[0062] 圖14是表示將附加有1個或2個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘連蛋白521E8和 未附加CBD的層粘連蛋白521E8供于非還原條件SDS-PAGE分析的結(jié)果的圖。
[0063] 圖15是表示對附加有1個或2個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘連蛋白111E8和 未附加CBD的層粘連蛋白111E8與膠原的結(jié)合活性進(jìn)行研宄的結(jié)果的圖。
[0064] 圖16是表示對附加有1個或2個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘連蛋白121E8和 未附加CBD的層粘連蛋白121E8與膠原的結(jié)合活性進(jìn)行研宄的結(jié)果的圖。
[0065] 圖17是表示對附加有1個或2個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘連蛋白211E8和 未附加CBD的層粘連蛋白211E8與膠原的結(jié)合活性進(jìn)行研宄的結(jié)果的圖。
[0066] 圖18是表示對附加有1個或2個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘