連蛋白221E8和 未附加CBD的層粘連蛋白221E8與膠原的結(jié)合活性進(jìn)行研宄的結(jié)果的圖。
[0067] 圖19是表示對附加有1個或2個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘連蛋白311E8和 未附加CBD的層粘連蛋白311E8與膠原的結(jié)合活性進(jìn)行研宄的結(jié)果的圖。
[0068] 圖20是表示對附加有1個或2個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘連蛋白321E8和 未附加CBD的層粘連蛋白321E8與膠原的結(jié)合活性進(jìn)行研宄的結(jié)果的圖。
[0069] 圖21是表示對附加有1個或2個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘連蛋白411E8和 未附加CBD的層粘連蛋白411E8與膠原的結(jié)合活性進(jìn)行研宄的結(jié)果的圖。
[0070] 圖22是表示對附加有1個或2個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘連蛋白421E8和 未附加CBD的層粘連蛋白421E8與膠原的結(jié)合活性進(jìn)行研宄的結(jié)果的圖。
[0071] 圖23是表示對附加有1個或2個膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)的層粘連蛋白521E8和 未附加CBD的層粘連蛋白521E8與膠原的結(jié)合活性進(jìn)行研宄的結(jié)果的圖。
【具體實施方式】
[0072] [改造層粘連蛋白]
[0073] 本發(fā)明提供一種改造層粘連蛋白，其中，在層粘連蛋白或者形成了異三聚體的層 粘連蛋白片段的a鏈的N末端、0鏈的N末端和Y鏈的N末端中的至少一處結(jié)合有膠原 結(jié)合性分子。
[0074] 層粘連蛋白為由a鏈、0鏈和Y鏈這3條亞基鏈構(gòu)成的異三聚體分子。a鏈 已知al~a5這5種，0鏈已知01~03這3種，y鏈已知yl~y3這3種，它們 的組合存在至少12種以上的異形體（參考表1)。構(gòu)成本發(fā)明的改造層粘連蛋白的層粘連 蛋白可以為任意一種異形體。即，構(gòu)成本發(fā)明的改造層粘連蛋白的層粘連蛋白或者形成了 異三聚體的層粘連蛋白片段只要由選自a 1~a 5中的一種a鏈或其片段、選自M~ 03中的一種0鏈或其片段和選自y1~y3中的一種y鏈或其片段構(gòu)成即可。具體而 言，可以優(yōu)選使用表1記載的12種異形體以及除這些以外的所有異形體及其片段。優(yōu)選為 層粘連蛋白a5Myl或其片段、層粘連蛋白a3f33Y2或其片段、層粘連蛋白alMyl 或其片段、層粘連蛋白a 10 2yl或其片段、層粘連蛋白a 2Myl或其片段、層粘連蛋白 a 2 0 2Y1或其片段、層粘連蛋白a 3 0 1Y1或其片段、層粘連蛋白a 3 0 2Y1或其片段、層 粘連蛋白a4MYl或其片段、層粘連蛋白a4f32Yl或其片段、層粘連蛋白a5f32Yl或 其片段，更優(yōu)選為層粘連蛋白a 30 3 y2或其片段、層粘連蛋白a 5Myl或其片段。
[0075] [表 1]
[0077] 層粘連蛋白的來源沒有特別限定，可以使用各種生物來源的層粘連蛋白。優(yōu)選為 哺乳動物來源的層粘連蛋白。作為哺乳動物，可以列舉例如人、小鼠、大鼠、牛、豬等，沒有限 定。其中，特別優(yōu)選使用人來源的層粘連蛋白。在為了得到人的再生醫(yī)療材料而對人干細(xì) 胞進(jìn)行培養(yǎng)的情況下，要求滿足從培養(yǎng)體系中排除異種來源成分的無異源成分條件的培養(yǎng) 環(huán)境，因此，優(yōu)選使用人來源的層粘連蛋白。
[0078] 構(gòu)成本發(fā)明的改造層粘連蛋白的層粘連蛋白可以為全長，也可以為其片段。即，可 以是由全長a鏈、全長0鏈和全長Y鏈構(gòu)成的全長層粘連蛋白，也可以是由a鏈、0鏈 和Y鏈中的至少一種以上為比全長短的片段構(gòu)成的層粘連蛋白片段。但是，層粘連蛋白片 段需要形成異三聚體。另外，層粘連蛋白片段優(yōu)選具有整合素結(jié)合活性。層粘連蛋白片段 形成了異三聚體可以通過將層粘連蛋白片段供于SDS-PAGE并檢測條帶數(shù)等來確認(rèn)。層粘 連蛋白片段具有整合素結(jié)合活性可以通過固相結(jié)合分析等來確認(rèn)。
[0079] 構(gòu)成本發(fā)明的改造層粘連蛋白的層粘連蛋白片段只要形成由a鏈、0鏈和Y 鏈構(gòu)成的異三聚體即可，分子量等沒有特別限定。從整合素結(jié)合活性的強(qiáng)度、作為重組 蛋白質(zhì)的表達(dá)效率（與全長層粘連蛋白相比較，能夠以重組蛋白質(zhì)的形式以高收率進(jìn) 行制造）的觀點出發(fā)，優(yōu)選層粘連蛋白的E8片段。層粘連蛋白的E8片段是在將小鼠 層粘連蛋白a1MY1(以下記為"小鼠層粘連蛋白111"）用彈性蛋白酶消化而得到的 片段中作為具有強(qiáng)細(xì)胞粘附活性的片段而被鑒定的片段（EdgarD.，TimplR.，Thoenen H.Theheparin-bindingdomainoflamininisresponsibleforitseffectson neuriteoutgrowthandneuronalsurvival.EMBOJ.，3:1463-1468,1984.、Goodman SL，DeutzmannR. ,vonderMarkK.Twodistinctcell-bindingdomainsinlaminin canindependentlypromotenonneuronalcelladhesionandspreading.J.Cell Biol.，105:589-598, 1987.)。推測對小鼠層粘連蛋白111以外的層粘連蛋白用彈性蛋白酶 消化時也存在與小鼠層粘連蛋白111的E8片段相當(dāng)?shù)钠危€沒有將小鼠層粘連蛋白 111以外的層粘連蛋白用彈性蛋白酶消化而分離、鑒定E8片段的報告。因此，本發(fā)明中使用 的層粘連蛋白E8并不需要為層粘連蛋白的彈性蛋白酶消化產(chǎn)物，只要為具有與小鼠層粘 連蛋白111的E8同樣的細(xì)胞粘附活性、具有同樣的結(jié)構(gòu)且具有相同程度的分子量的層粘連 蛋白的片段即可。
[0080] 層粘連蛋白可以為天然型，也可以為保持了其生物學(xué)活性的、1個或1個以上的氨 基酸殘基被修飾后的修飾型。層粘連蛋白的制造方法沒有特別限定，可以列舉例如從層粘 連蛋白高表達(dá)細(xì)胞中純化的方法、以重組蛋白質(zhì)的形式制造的方法等。層粘連蛋白片段的 制造方法也沒有特別限定，可以列舉例如將全長層粘連蛋白用彈性蛋白酶等蛋白質(zhì)分解酶 消化并分取目的片段進(jìn)行純化的方法、以重組蛋白質(zhì)的形式制造的方法等。從制造量、品質(zhì) 的均勻性、制造成本等觀點出發(fā)，層粘連蛋白和層粘連蛋白片段這兩者均優(yōu)選以重組蛋白 質(zhì)的形式進(jìn)行制造。
[0081] 重組層粘連蛋白、重組層粘連蛋白片段可以通過適當(dāng)使用公知的基因重組技術(shù)來 制造。作為重組層粘連蛋白、重組層粘連蛋白片段的制造方法，例如可以通過如下方法來 制造：分別獲取編碼a鏈、0鏈和Y鏈的各全長蛋白質(zhì)或者部分蛋白質(zhì)的DNA，將其分 別插入到表達(dá)載體中，將所得到的3種表達(dá)載體共導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中并使其進(jìn)行表 達(dá)，將形成了三聚體的蛋白質(zhì)利用公知的方法進(jìn)行純化。作為重組層粘連蛋白（全長）的 制造方法，可以列舉例如Ido等（HiroyukiIdo，KenjiHarada，SugikoFutaki，Yoshitaka Hayashi,RyokoNishiuchi，YukoNatsuka，ShaoliangLi，YoshinaoWada，Ariana C.Combs,JamesM.Ervasti,andKiyotoshiSekiguchi，"Moleculardissectionof thea-dystroglycan-andintegrin-bindingsiteswithintheglobulardomainof humanlaminin-10^TheJournalofBiologicalChemistry, 279, 10946-10954, 2004.) 的方法等，但并不限定于此。作為重組層粘連蛋白片段（層粘連蛋白E8)的制造方 法，可以列舉例如Ido等（HiroyukiIdo，AyaNakamura，ReikoKobayashi，Shunsuke Ito,ShaoliangLi，SugikoFutaki，andKiyotoshiSekiguchi，"Therequirementof theglutamicacidresidueatthethirdpositionfromthecarboxylterminiof thelamininychainsinintegrinbindingbylaminins"TheJournalofBiological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007.)的方法，但并不限定于此。
[0082]編碼構(gòu)成主要的哺乳動物的層粘連蛋白的a鏈、0鏈、Y鏈的基因的堿基序列信 息和各鏈的氨基酸序列信息可以從公知的數(shù)據(jù)庫（GenBank等）獲取。表1示出了包括人 在內(nèi)的主要的哺乳動物中構(gòu)成層粘連蛋白的各鏈的登記號。除此以外的各種生物來源的層 粘連蛋白構(gòu)成鏈的堿基序列信息和氨基酸序列信息也同樣可以從公知的數(shù)據(jù)庫（GenBank 等）獲取。
[0083][表2]
[0085]層粘連蛋白E8為從a鏈的C末端片段除去球狀結(jié)構(gòu)域4和5而成的片段（以下記 為"a鏈E8")、f3鏈的C末端片段（以下記為鏈E8"）和Y鏈的C末端片段（以下記為 "y鏈E8"）形成三聚體而得到的片段，三聚體的分子量為約150kDa~約170kDa。a鏈E8 通常由約770個氨基酸構(gòu)成，N末端側(cè)的約230個氨基酸參與三聚體形成。0鏈E8通常由約 220個~約230個氨基酸構(gòu)成。y鏈E8通常由約240個~約250個氨基酸構(gòu)成。y鏈E8的 自C末端部起第3位的谷氨酸殘基對于層粘連蛋白E8的細(xì)胞粘附活性是必須的（Hiroyuki Ido,AyaNakamura,ReikoKobayashi,ShunsukeIto,ShaoliangLi,SugikoFutaki,and KiyotoshiSekiguchi,"Therequirementoftheglutamicacidresidueatthethird positionfromthecarboxylterminiofthelamininychainsinintegrinbinding bylaminins"TheJournalofBiologicalChemistry, 282, 11144-11154,2007.)〇 [0086] 構(gòu)成本發(fā)明的改造層粘連蛋白的膠原結(jié)合性分子只要是具有膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的 分子，則沒有特別限定。膠原結(jié)合性分子可以為具有膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的分子的全長，也可以 為包含膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段。作為結(jié)合對象的膠原的種類沒有特別限定，可以將各種膠 原作為結(jié)合對象。優(yōu)選為I型膠原、II型膠原、III型膠原、IV型膠原、V型膠原（Engvall etal.,1978,J.Exp.Med. 1584-1595>Woodleyetal.,1983,BiochemicaetBiophysica Acta.,761, 278-283)〇
[0087] 作為膠原結(jié)合性分子，只要是能夠與各種膠原結(jié)合的分子，則沒有特別限定?？梢?列舉例如以下的（a)~（r)等。
[0088] (a)纖連蛋白或者其包含膠原結(jié)合活性位點的片段
[0089] (b)膠原酶或者其包含膠原結(jié)合活性位點的片段
[0090] (c)整合素a1鏈或者其包含膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段
[0091] (d)整合素a2鏈或者其包含膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段
[0092] (e)整合素a10鏈或者其包含膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段
[0093] (f)整合素a11鏈或者其包含膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段
[0094] (g)血小板糖蛋白VI或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0095] (h)盤狀結(jié)構(gòu)域受體1或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0096] (i)盤狀結(jié)構(gòu)域受體2或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0097] (j)甘露糖受體或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0098] (k)磷脂酶A2受體或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0099] (1)DEC205或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0100] (m)Endol80或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0101] (n)血管性血友病因子或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0102] (〇)MMP-2或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0103] (p)MMP_9或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0104] (q)白細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體1或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0105] (r)白細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體2或者其包含膠原結(jié)合位點的片段
[0106]膠原結(jié)合性分子的來源沒有特別限定，可以使用各種生物來源的膠原結(jié)合性分 子。優(yōu)選為哺乳動物來源的膠原結(jié)合性分子。作為哺乳動物，可以列舉例如人、