包含至少一種烴基(硫代)糖苷的微生物檢測介質(zhì)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及通過生化手段、且更特別地通過酶促手段的微生物分析。更特別地，本 發(fā)明涉及通過接種反應(yīng)介質(zhì)檢測微生物（例如細菌菌株），特別地用于表征（鑒定所述微生 物、測定后者對至少一種抗微生物劑的潛在的抗性性質(zhì)等）和/或枚舉所述微生物的目的。 這些反應(yīng)介質(zhì)包括生色底物和/或熒光底物，所述生色底物和/或熒光底物能夠與對尋求 的微生物是特異性的微生物酶反應(yīng)。 現(xiàn)有技術(shù)
[0002] 在本發(fā)明的框架內(nèi)，無論在醫(yī)療環(huán)境還是工業(yè)環(huán)境中，最特別感興趣的是：檢 測病原微生物或質(zhì)量指標（特別地用于表征和/或枚舉其的目的）；并且更特別地檢測 具有酯酶（特別地包括羧酸酯酶、脂肪酶和磷脂酶活性）、糖苷酶（osidase)、肽酶、硫 酸酯酶或磷酸酯酶類型的酶活性的微生物，例如沙門氏菌（Salmonella)屬、埃希氏桿 菌（Escherichia)屬、假單胞菌（Pseudomonas)屬、李斯特菌（Listeria)屬、葡萄球菌 (Staphylococcus)屬、腸球菌（Enterococcus)屬、假絲酵母（Candida)屬的細菌或酵母； 并且更特別地，基于示出酯酶活性的存在/檢測酯酶活性來檢測沙門氏菌屬的細菌。
[0003]大腸桿菌（Escherichiacoli)菌株經(jīng)常通過示出糖苷酶類型的酶活性（比如 0-葡萄糖醛酸酶或半乳糖苷酶活性）的存在被揭示。
[0004] 以相同的方式，李斯特菌屬通過示出葡萄糖苷酶活性的存在被檢測。
[0005] 氨肽酶活性也可以被用于揭示微生物的群、屬或種。例如，L-丙氨酸氨肽酶活性 使得區(qū)分革蘭氏陰性細菌與革蘭氏陽性細菌成為可能。
[0006] 沙門氏菌屬是人類多種嚴重感染（傷寒熱、食物中毒）的原因，其具備能夠水解合 成的生色底物例如靛原底物的非特異性酯酶。
[0007] 沙門氏菌-且更通常地酯酶活性細菌-通常在培養(yǎng)肉湯中或在瓊脂介質(zhì)上被檢測 并且被表征，這使得酯酶活性細菌、特別地沙門氏菌的可疑菌落的檢測和表征成為可能。此 種介質(zhì)的接種通過使生物學樣品與介質(zhì)接觸來進行。
[0008] 具有酯酶、糖苷酶、肽酶、硫酸酯酶或甚至磷酸酯酶活性的細菌在它們的酶資產(chǎn) (enzymeasset)上具備醋酶、糖苷酶、肽酶、硫酸醋酶或磷酸醋酶，這些酶將存在于介質(zhì)中 的合成酶底物的靶標鍵裂解，并且因此釋放所述底物的活化的發(fā)色團或熒光團部分。這導(dǎo) 致揭示水解、并且因此揭示靶標細菌或靶標細菌的菌落的存在的顯色或熒光。
[0009] 為了能夠進行大規(guī)模的例行測試，有必要的是，檢測和/或表征和/或枚舉介質(zhì)是 穩(wěn)定的并且通過限制操作實例使得可以在最大可能的程度上簡化相應(yīng)的檢測和/或表征 和/或枚舉方法。此外，重要的是，方法提供非常良好的靈敏度（顯色或熒光的強度）以及 第一流的檢測特異性（以便限制或甚至避免"假陽性"的檢測）?？梢删涞慕沂韭蔬€是用 于檢測呈現(xiàn)上述酶活性的細菌的這些類型的介質(zhì)以及方法的基本參數(shù)。
[0010] 已知的是，酶比如酯酶、糖苷酶、肽酶、硫酸酯酶或磷酸酯酶的合成底物造成與用 于微生物且特別地用于具備這些活性的細菌的培養(yǎng)介質(zhì)之間的相容性問題。此外，隨著時 間推移此種底物是不穩(wěn)定的，這導(dǎo)致隨著儲存時間增加，關(guān)注的酶活性的靈敏度減少。
[0011]關(guān)于這點，標題為"SynthSsedesubstratsindigog6niques.MiseenEvidence de1'activiteesterasiquedessalmonelles'，[Synthesisofindigogenicsubstrates. Showingthepresenceoftheesteraseactivityofsalmonellae]的科學論文： A.Agban等人，Eur.J.Med.Chem. (1990) 25, 697-699,公布了包含靛原底物即特別地 溴-5-吲哚酚壬酸酯（C9)以及膽汁鹽即脫氧膽酸鈉的瓊脂培養(yǎng)介質(zhì)。此種培養(yǎng)介質(zhì)經(jīng)受 與在下文中參考文獻FR-A-2697028闡明的那些相同的缺點。
[0012] 專利申請FR-A-2697028公開用于示出沙門氏菌的存在的培養(yǎng)介質(zhì)，所述培養(yǎng)介 質(zhì)包含由辛酸與吲哚殘基的酯（5-溴-4-氯-3-吲哚基-辛酸酯）構(gòu)成的生色酯酶底物、 以及選自膽汁鹽（脫氧膽酸鈉）的清潔劑。此生色和此膽汁鹽被包含于允許沙門氏菌生 長的營養(yǎng)介質(zhì)中。根據(jù)專利申請FR-A-2697028的教導(dǎo)，直接將膽汁鹽添加至其中已經(jīng)包 含酯酶底物的選擇性介質(zhì)。然而，此種培養(yǎng)介質(zhì)不提供在酯酶底物的穩(wěn)定性方面的所有合 意的保證。此外，證明的是此后者與培養(yǎng)介質(zhì)不是完全混溶的。這顯然損害了獲得的關(guān) 于靈敏度（獲得的顯色的強度）、快速性和穩(wěn)定性的結(jié)果的質(zhì)量。還應(yīng)當注意的是，根據(jù) FR-A-2697028的培養(yǎng)介質(zhì)采取粉末的形式。這迫使使用者進行在先操作以重構(gòu)液體或膠凝 介質(zhì)。這種限制由利用的酯酶底物的無穩(wěn)定性造成。
[0013] 與膽汁鹽-比如脫氧膽酸鈉_的使用有關(guān)的另一個缺點-基于以下事實：后者是 動物來源的原材料，在質(zhì)量方面的可變性程度起源于所述動物來源。
[0014] 此外，用根據(jù)FR-A-2697028的培養(yǎng)介質(zhì)獲得的結(jié)果在生物學活性方面是可完成 的。
[0015] 以該申請人的名義的專利EP-B-1334206,描述用于檢測/鑒定具有選自酯酶和/ 或糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的酶活性的微生物（以及特別地 細菌和/或酵母）的介質(zhì)。準備好使用且儲存穩(wěn)定的以液體或瓊脂形式的此種介質(zhì)特別地 包含：
[0016]-酯酶、糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶中的至少一種底物，其 是生色的或熒光的，以及
[0017]-至少一種脫水山梨糖醇脂肪酸酯（SFAE)或至少一種脂肪酸（FA)或SFAE/FA混 合物，作為乳化穩(wěn)定劑（以某種重量百分比），
[0018]-以及任選地至少一種溶劑（S)。
[0019] 還根據(jù)EP-B-1334206,優(yōu)選地從包括以下的組中選擇SFAE:
[0020] -聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯，包含20個環(huán)氧乙烷（E.O.)單元， -TWEEN?20-;
[0021]-聚氧乙烯脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯（20E. 0.)，-TWEEN?40-;
[0022]-聚氧乙烯脫水山梨糖醇單硬脂酸酯（20E. 0.),-TVVEEN?60-;
[0023] -聚氧乙烯脫水山梨糖醇三硬酯酸酯（20E. 0.),-TWEEN?65-;
[0024]-聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯（20E. 0.)，-TWEEN?80-;
[0025]-聚氧乙烯脫水山梨糖醇倍半油酸酯（20E.0.),-TWEEN?83-;
[0026]-聚氧乙烯脫水山梨糖醇三油酸酯（20E. 0.)，-TWEEN?85-;
[0027] 以及其混合物。
[0028] 脫水山梨糖醇脂肪酸酯（SFAE)是在食品和藥物制備中廣泛使用的已知的表面活 性劑。通過例證的方式，我們可以提及由DICKINSON等人的論文："J Colloid interface Sci1999年4月15日；212(2) :466-473"，其涉及包含酪蛋白酸鈉以及包含20個環(huán)氧乙烷 .(TWEEN?20)?單元的聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯的乳液的穩(wěn)定化?？紤]的乳液是 水包油乳液（在PH6. 8下的30%體積的正十四烷）。
[0029] 雖然根據(jù)EP-B-1334206的反應(yīng)介質(zhì)的檢測靈敏度是相對滿意的，但存在對開發(fā) 微生物檢測介質(zhì)的需求，所述微生物檢測介質(zhì)基于示出選自微生物的酯酶和/或糖苷酶和 /或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的微生物酶活性的存在，并且基于比通過利用 現(xiàn)有技術(shù)的介質(zhì)獲得的那些且特別地專利EP-B-1334206的那些優(yōu)越的性能。優(yōu)越的性能 可以被采用以意指提高的檢測靈敏度，即用于靶標微生物的菌落的最高可能的顯色和/或 熒光強度。關(guān)于通過示出酯酶活性的存在檢測沙門氏菌，這證明是特別地合意的。此外，且 除了必備的靈敏度標準以外，還重要的是，上述微生物檢測介質(zhì)是可靠的、特異性的以及可 再生的。
[0030] 本發(fā)明的一個目標是開發(fā)微生物檢測介質(zhì)（特別地用于表征和/或枚舉其的目 的），所述微生物檢測介質(zhì)基于示出選自微生物的酯酶和/或糖苷酶和/或肽酶和/或硫 酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的微生物酶活性的存在，所述微生物檢測介質(zhì)包括選自酯酶底 物和/或糖苷酶底物和/或肽酶底物和/或硫酸酯酶底物和/或磷酸酯酶底物的至少一種 酶底物，所述至少一種酶底物是生色的和/或熒光的且所述至少一種酶底物是儲存穩(wěn)定的 (揭示的顯色或熒光強度被保持在最大水平持續(xù)若干周）。
[0031] 本發(fā)明的另一個目標是獲得微生物檢測介質(zhì)，所述微生物檢測介質(zhì)基于示出選自 微生物的酯酶和/或糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的微生物酶活 性的存在，所述微生物檢測介質(zhì)不采取待被液體再生以重構(gòu)液體或膠凝介質(zhì)的干燥粉末的 形式，而是直接地采取準備好使用的形式。
[0032] 本發(fā)明的另一個目標旨在減少使用的生色和/或熒光酶底物（本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知其是特別昂貴的）的量。
[0033] 本發(fā)明的又另一個目標在于開發(fā)獲得上述檢測介質(zhì)的方法，所述方法易于利用， 且所述方法特別地使得可以表征尋求的微生物（特別地經(jīng)由它們的鑒定和/或它們對至少 一種抗微生物劑的潛在的抗性性質(zhì)的測定）和/或枚舉它們而沒有過多的困難。
[0034] 在閱讀本申請后，其他目標將變得明顯。
[0035] 發(fā)明陳述
[0036] 本發(fā)明旨在滿足上述需求，且實現(xiàn)上文提到的目標中的全部或某些。
[0037] 因此，本發(fā)明的第一目標涉及微生物檢測介質(zhì)，所述檢測基于示出選自微生物的 酯酶和/或糖苷酶和/或肽酶和/或硫酸酯酶和/或磷酸酯酶活性的微生物酶活性的存在， 優(yōu)選地所述微生物酶活性是酯酶活性，所述介質(zhì)包含：
[0038] _至少一種生色底物和/或熒光底物，其對尋求的酶活性是特異性的，優(yōu)選地對酯 酶活性是特異性的；
[0039] _至少一種烴基（硫代）糖苷；
[0040]