纖維二糖水解酶的變體的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年12月12日提交的美國臨時專利申請序列No. 61/736, 340的 優(yōu)先權(quán)權(quán)益，并且以引用的方式全文并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開總體上涉及糖苷水解酶變體，特別是纖維二糖水解酶（CBH)的變體。還描 述了編碼CBH變體的核酸、包含CBH變體的組合物、產(chǎn)生CBH變體的方法以及使用所述變體 的方法。
[0004] 政府權(quán)利
[0005] 本發(fā)明是在由美國能源部授予的基金號DE-FC36-08G018078下、在政府支持下進(jìn) 行的。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 纖維素和半纖維素是通過光合作用產(chǎn)生的最豐富的植物材料。它們能被許多會產(chǎn) 生能夠?qū)⒕酆衔锏孜锼獬蓡误w糖的胞外酶的微生物（包括細(xì)菌、酵母和真菌）降解并且 用作能源（Aro等人，2001)。由于對非可再生資源途徑的限制，所以纖維素成為主要可再生 能源的潛能是巨大的（Krishna等人，2001)。通過生物過程對纖維素的有效利用是克服食 品、飼料和燃料短缺的一種途徑（Ohmiya等人，1997)。
[0008] 纖維素酶是水解纖維素（0-1，4-葡聚糖或0D-糖苷鍵）導(dǎo)致形成葡萄糖、纖 維二糖、纖維低聚糖等的酶。傳統(tǒng)上將纖維素酶分成三個主要類型：內(nèi)切葡聚糖酶（EC 3. 2. 1. 4) ( "EG")、外切葡聚糖酶或纖維二糖水解酶（EC3. 2. 1. 91) ( "CBH"）和0 -葡萄糖 苷酶（[0]-D-葡萄糖苷葡糖水解酶；EC3. 2. 1.21) ("BG")。（Knowles等人，1987 ;Shulein， 1988)。內(nèi)切葡聚糖酶主要作用在纖維素纖維的非晶部分，而纖維二糖水解酶還能夠降解結(jié) 晶纖維素（Nevalainen和Penttila，1995)。因此，纖維二糖水解酶在纖維素酶體系中的存 在是結(jié)晶纖維素有效溶解所必需的（Suurnakki等人，2000)。葡萄糖苷酶起到從纖維二 糖、纖維低聚糖和其他葡萄糖苷釋放D-葡萄糖單位的作用（Freer，1993)。
[0009] 已知纖維素酶由大量細(xì)菌、酵母和真菌產(chǎn)生。某些真菌會產(chǎn)生能夠降解結(jié)晶形式 的纖維素的整個纖維素酶體系，使得纖維素酶容易通過發(fā)酵大量產(chǎn)生。由于許多酵母諸如 釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)缺少水解纖維素的能力，因此絲狀真菌起特殊作 用。（參見例如Aro等人，2001;Aubert等人，1988;Wood等人，1988 ;和Coughlan等人）。
[0010]CBH、EG和BG的真菌纖維素酶分類可進(jìn)一步擴(kuò)展以包括每個分類內(nèi)的多個組分。 例如，已從包括里氏木霉（Trichodermareesei)的多個真菌來源分離了多種CBH、EG和BG， 里氏木霉含有2種CBH的已知基因，g卩，CBHI和CBHII、至少8種EG的已知基因，g卩，EG 1、￡6 11、￡6 111、￡61￥、￡6￥、￡6￥1、￡6￥11和￡6￥111以及至少5種86的已知基因，即，861、BG2、BG3、BG4 和BG5。
[0011] 為了將結(jié)晶纖維素有效地轉(zhuǎn)化成葡萄糖，需要包含來自CBH、EG和BG每個分類 的組分的整個纖維素酶體系，而分離的組分在水解結(jié)晶纖維素方面不太有效（Filho等人， 1996)。已觀察到來自不同分類的纖維素酶組分之間的協(xié)同關(guān)系。具體地講，EG型纖維素 酶和CBH型纖維素酶協(xié)同地相互作用以有效地降解纖維素。（參見例如Wood，1985)。
[0012] 在本領(lǐng)域中已知的是，纖維素酶可用于處理紡織品，用于增強(qiáng)洗滌劑組合物的清 潔能力，用作軟化劑，用于改善棉織物的觸感和外觀等（Kumar等人，1997)。
[0013] 已描述了具有改善的清潔性能（美國專利No. 4, 435, 307;英國申請No. 2, 095, 275 和2, 094, 826)并且用于處理織物以改善紡織品的觸感和外觀的含有纖維素酶的洗滌劑組 合物（美國專利No. 5, 648, 263、5, 691，178 和 5, 776, 757;英國申請No. 1，358, 599;靜岡県 立紡織品工業(yè)研宄所報告（TheShizuokaPrefecturalHammamatsuTextileIndustrial ResearchInstituteReport)，第 24 卷，第 54-61 頁，1986)。
[0014] 在本領(lǐng)域中進(jìn)一步已知的是，纖維素酶可用于將纖維素原料轉(zhuǎn)化成乙醇。這一過 程具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括否則將丟棄（例如焚燒或土地填埋原料）的大量原料的易于可利用 性。已考慮將主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成的其他材料，例如木材、草本作物和農(nóng) 業(yè)或城市廢物用作乙醇產(chǎn)生的原料。
[0015] 本領(lǐng)域中有利地是提供纖維二糖水解酶（CBH)變體，其具有改善的用于將纖維素 材料轉(zhuǎn)化成單糖、二糖和多糖的特性。變體CBH的改進(jìn)的特性包括但不限于：改變的溫度依 賴性活性概況、熱穩(wěn)定性、pH活性、pH穩(wěn)定性、底物特異性、產(chǎn)物特異性和化學(xué)穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]本公開描述了具有纖維素酶活性的分離的纖維二糖水解酶（CBH)、編碼此類CBH酶的核酸、含有CBH酶編碼多核苷酸的宿主細(xì)胞（例如表達(dá)CBH酶的宿主細(xì)胞）、含有CBH 酶的組合物以及其產(chǎn)生和使用方法。
[0017] 因此，本發(fā)明的方面提供變體CBH酶，其相對于野生型CBH酶具有改善，其中對 于選自以下各項(xiàng)的一種或多種特性來說，所述變體得到顯著改善：增大的解鏈溫度（Tm)、 PASC水解測定性能、全水解產(chǎn)物PCS(whPCS)測定性能和稀氨玉米桿（daCS)測定性能。在 某些實(shí)施例中，CBH變體具有所述改善的特性中的至少兩種、所述改善的特性中的至少三種 或所有所述改善的特性。
[0018] 本發(fā)明的方面提供如以下所述的親本纖維二糖水解酶（CBH)的分離的變體，其中 任何所指示的CBH氨基酸位置均對應(yīng)于SEQIDN0:3的氨基酸序列：
[0019] 1.一種0811變體，其中所述變體具有纖維素酶活性，與3￡〇10勵:3具有至少80% 序列同一性，并且在稀氨玉米桿（daCS)測定中具有優(yōu)于所述親本CBH酶的顯著改善的性 能。
[0020] 2.根據(jù)1所述的CBH變體，其中所述變體進(jìn)一步包含氨基酸置換，所述氨基酸置換 選自由以下各項(xiàng)組成的組：D241N、G234D、P194V、T255I、T255K、T255R以及其組合。
[0021] 3.根據(jù)2所述的CBH變體，其中所述變體包含D241N置換。
[0022] 4.根據(jù)2或3所述的CBH變體，其中所述變體包含G234D置換。
[0023] 5.根據(jù)2、3或4所述的CBH變體，其中所述變體包含P194V置換。
[0024] 6.根據(jù)2、3、4或5所述的CBH變體，其中所述變體包含T255I置換。
[0025] 7.根據(jù)2、3、4或5所述的CBH變體，其中所述變體包含T255K置換。
[0026] 8.根據(jù)2、3、4或5所述的CBH變體，其中所述變體包含T255R置換。
[0027] 9.根據(jù)2至8中任一項(xiàng)所述的CBH變體，其中所述變體進(jìn)一步包含氨基酸置換，所 述氨基酸置換選自由以下各項(xiàng)組成的組：F418M、T246S、T255V以及其組合。
[0028] 10.根據(jù)2至9中任一項(xiàng)所述的CBH變體，其中所述變體進(jìn)一步包含氨基酸置換， 所述氨基酸置換選自由以下各項(xiàng)組成的組：Y247D、T246V、N49P、N200G以及其組合。
[0029] 11.根據(jù)2至10中任一項(xiàng)所述的CBH變體，其中所述變體進(jìn)一步包含氨基酸置換， 所述氨基酸置換選自由以下各項(xiàng)組成的組：T356L、T246P、T255D、N200R以及其組合。
[0030] 12.根據(jù)2至11中任一項(xiàng)所述的CBH變體，其中所述變體進(jìn)一步包含氨基酸置換， 所述氨基酸置換選自由以下各項(xiàng)組成的組：T255P、S92T、T41I以及其組合。
[0031] 13.根據(jù)3至5中任一項(xiàng)所述的CBH變體，其中所述變體進(jìn)一步包含T255V置換。
[0032] 14.根據(jù)3至5中任一項(xiàng)所述的CBH變體，其中所述變體進(jìn)一步包含T25?置換。
[0033] 15.根據(jù)3至5中任一項(xiàng)所述的CBH變體，其中所述變體進(jìn)一步包含T255P置換。
[0034] 16.根據(jù)3至5和13至15中任一項(xiàng)所述的CBH變體，其中所述變體進(jìn)一步包含 F418M置換。
[0035] 17.根據(jù)3至5和13至16中任一項(xiàng)所述的CBH變體，其中所述變體進(jìn)一步包含 T246S置換。
[0036] 18.根據(jù)3至5和13至16中任一項(xiàng)所述的CBH變體，其中所述變體進(jìn)一步包含 T246V置換。
[0037] 19.根據(jù)3至5和13至18中任一項(xiàng)所述的CBH變體，其中所述變體進(jìn)一步包含 P194V置換。
[0038] 20.根據(jù)3至5和13至19中任一項(xiàng)所述的CBH變體，其中所述變體進(jìn)一步包含 N200G置換。
[0039] 21.根據(jù)3至5和13至19中任一項(xiàng)所述的CBH變體，其中所述變體進(jìn)一步包含 N200R置換。
[0040] 22.根據(jù)3至5和13至21中任一項(xiàng)所述的CBH變體，其中所述變體進(jìn)一步包含 N49P置換。
[0041] 23.根據(jù)3至5和13至22中任一項(xiàng)所述的CBH變體，其中所述變體進(jìn)一步包含 Y247D置換。
[0042] 24.根據(jù)3至5和13至23中任一項(xiàng)所述的CBH變體，其中所述變體進(jìn)一步包含 T356L置換。
[0043] 25.根據(jù)3至5和13至24中任一項(xiàng)所述的CBH變體，其中所述變體進(jìn)一步包含 S92T置換。
[0044] 26.根據(jù)3至5和13至25中任一項(xiàng)所述的CBH變體，其中所述變體進(jìn)