用微生物生產(chǎn)聚羥基烷酸酯類的方法
【專利說明】用微生物生產(chǎn)聚羥基烷酸酯類的方法
1.發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及用于從包含各種微生物的天然來源選擇產(chǎn)生聚羥基烷酸酯(PHA)的微生物的方法。本發(fā)明還涉及用于通過這樣的選定的微生物生產(chǎn)PHA的方法。
2.現(xiàn)有技術(shù)
[0002]通過聚合有機(jī)單體、最常見的是來源于石油化學(xué)制品的單體制造塑料。然而，油正在變得稀有，塑料生產(chǎn)促成了溫室氣體排放和氣候改變，以及進(jìn)而塑料在環(huán)境中的大量蓄積，它們對于天然降解而言非常難以應(yīng)對，代表了顯著的擔(dān)憂。因此，已經(jīng)研發(fā)了生物塑料的生產(chǎn)方法作為替代。這些可替代方法之一涉及用微生物生產(chǎn)基于生物的聚合物，如聚羥基烷酸酯類(PHA)，它們隨后可以用作生物塑料生產(chǎn)的原料。產(chǎn)生PHA的微生物包括野生型天然PHA生產(chǎn)者(例如鉤蟲貪銅菌(Cupriavidus necator));重組生物體，例如修飾的大腸桿菌(E.coli);乃至微生物聚生體，例如存在于生物廢水處理系統(tǒng)中的那些。
[0003]在不平衡的生長條件下，細(xì)菌通過合成PHA儲存過量的胞內(nèi)備用形式的碳。胞內(nèi)PHA顆粒隨后可以用作細(xì)胞的碳和能量來源?？梢酝ㄟ^設(shè)定相對于細(xì)胞生長速率過量的碳攝取流量、導(dǎo)致營養(yǎng)或電子受體限制或胞內(nèi)生長需求缺乏(暴露于長期饑荒期限后)生成這樣的不平衡條件。
[0004]PHA屬于羥基烷酸酯單體的直鏈聚酯類的家族，所述羥基烷酸酯單體根據(jù)其組成展示出不同的和有意義的熱和機(jī)械特性。特別地，PHA組合物顯著地依賴于用作PHA蓄積的底物的碳源和細(xì)菌菌株。其中，它們是熱塑性的、延伸性的、或多或少彈性的、UV穩(wěn)定的且顯示對于水和空氣的低滲透。因此，PHA看來是用于替代常用的聚烯烴類如聚丙烯的極為富有希望的解決方案。
[0005]生物塑料可以被定義為基于生物的，即由可更新的和天然的原料制成；和/或可生物降解的塑料。一些目前可利用的生物塑料是基于生物的，但不可生物降解(例如基于淀粉的具有石油化學(xué)衍生的接枝物的聚合物)，然而也存在基于合成的聚合物，可以修飾它們以滿足生物降解性標(biāo)準(zhǔn)。PHA具有基于生物的和可生物降解的優(yōu)點(diǎn)，由此能夠用于閉環(huán)生產(chǎn)-利用-處理生命周期。
[0006]此外，當(dāng)它們既是基于生物的，又是可生物降解的時(shí)，PHA允許短的產(chǎn)品生命周期:這對于單一應(yīng)用而言是理想的，其中產(chǎn)品被污染(例如廢物收集)；或直接接觸天然環(huán)境的應(yīng)用。其生產(chǎn)可以被視為可持續(xù)的。由于所有這些原因，PHA引起了學(xué)術(shù)界和化學(xué)工業(yè)的巨大關(guān)注。
[0007]迄今為止已經(jīng)提出了兩個(gè)主要策略用于微生物PHA生產(chǎn)并且可以將其分類為:
[0008]-使用野生型或遺傳修飾的有效生產(chǎn)PHA的菌株的純培養(yǎng)系統(tǒng)和通常高成本的單一碳底物(例如葡萄糖、蔗糖或玉米漿)的工業(yè)化生物技術(shù)方法；和
[0009]-使用混合的培養(yǎng)系統(tǒng)或由不同微生物菌株組成的微生物聚生體的環(huán)境生物技術(shù)方法，所述微生物選自天然來源以富含在儲存PHA的生物體中。這些菌株能夠在預(yù)處理階段后利用復(fù)雜的原料(例如工業(yè)廢棄物和副產(chǎn)物，特別是液體流出物形式)。通常，預(yù)處理階段是產(chǎn)酸的發(fā)酵步驟，以便在揮發(fā)性脂肪酸(VFA)中富含流出物，VFA是用于PHA儲存的足夠的前體)，作為用于PHA蓄積的碳來源。
[0010]純培養(yǎng)系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例公開在專利申請US-5871980-A中。該申請涉及通過在補(bǔ)料分批反應(yīng)器中培養(yǎng)富養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligenes eutrophus)來生產(chǎn)PHA的方法。不連續(xù)補(bǔ)料分批方法通常包括兩個(gè)連續(xù)的期:
[0011]I)用于細(xì)胞生長最大化的期(在無限制生長條件下)，以便增加細(xì)胞密度和由此使產(chǎn)率最大化；
[0012]2)用于在限制性營養(yǎng)條件下PHA蓄積的期。
[0013]根據(jù)這種技術(shù)，在無菌條件下培養(yǎng)細(xì)菌，以防止接種的非PHA產(chǎn)生菌株污染且由此使在底物上的PHA產(chǎn)率、PHA含量最大化并且還可以控制PHA質(zhì)量。實(shí)際上，非儲存生物體的污染將會導(dǎo)致底物消耗中的競爭，所得到的每一生物質(zhì)中的最終PHA比例的稀釋以及產(chǎn)生的PHA的異質(zhì)性。在該對比文件中，C/P重量比在生長期間為40-100，并且在蓄積階段期間為300 - 600。
[0014]純培養(yǎng)系統(tǒng)確保細(xì)胞中的高PHA含量和高PHA產(chǎn)生速率(至多2，86g/L/h)。然而，在無菌條件下操作因高能量需求而顯著地增加了生產(chǎn)成本。此外，所用的碳原料也構(gòu)成了重要的成本因素(約占總PHA生產(chǎn)成本的40% ) [I]。使用這些方法的平均PHA生產(chǎn)成本隨后為由石油化學(xué)制品制成的常規(guī)塑料價(jià)格的4 一 9倍。這項(xiàng)技術(shù)的另一個(gè)缺點(diǎn)在于通常使用食物作物作為用于PHA蓄積方法的碳原料(例如玉米糖或菜籽油)。基于農(nóng)業(yè)的專用于燃料、化學(xué)品和聚合物生產(chǎn)的作物的應(yīng)用可以導(dǎo)致對自然資源的壓力和對于耕作土地的惡性競爭增加。總之，盡管相對于聚烯烴類存在高技術(shù)替代的可能性[2]，但是由純培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)的PHA仍然無法抵抗常規(guī)塑料的成本競爭。
[0015]為了克服這些缺陷，已經(jīng)提出了混合的培養(yǎng)系統(tǒng)，如盛宴和饑荒法。根據(jù)各種文獻(xiàn)來源[3-5]，盛宴和饑荒系統(tǒng)包含兩個(gè)隨后的步驟:
[0016]I)來自第一種接種物的PHA產(chǎn)生微生物的選擇步驟，所述微生物包括在連續(xù)模式下，最常見地在排序分批反應(yīng)器(SBR)中操作的各種微生物；和
[0017]2)使用選定的微生物聚生體以補(bǔ)料分批模式進(jìn)行的PHA蓄積步驟。
[0018]該方法的名稱來源于所述選擇步驟，其通過改變盛宴和饑荒條件進(jìn)行。每一 SBR操作循環(huán)由盛宴期和饑荒期組成。每一 SBR循環(huán)在于在需氧條件下在發(fā)酵的工業(yè)化流出物或刺激這樣的流出物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。該期稱作盛宴期，在此期間，碳源(典型地是揮發(fā)性脂肪酸VFA)可完全利用，在盛宴期后是無可利用的外部碳源的期，但其中除所述碳源外的營養(yǎng)物可在非限制條件下利用(饑荒期)。換句話說，微生物在盛宴期過程中使用外部碳源以合成PHA且隨后可以使用儲存的PHA用于細(xì)胞生長和/或維持饑荒期過程中的需求。這種選擇步驟的目的特別地在于選擇PHA儲存微生物與非PHA儲存的微生物。更具體地，所施加的盛宴和饑荒條件對于儲存PHA的生物體產(chǎn)生兩個(gè)競爭性優(yōu)勢:在盛宴期過程中因驅(qū)動(dòng)對于PHA儲存的過量碳攝取的可能性和在饑荒期過程中逐步適應(yīng)儲存的PHA的可能性而導(dǎo)致的較快的底物攝取。后面的優(yōu)勢依賴于選擇階段中的過量營養(yǎng)物條件，使得在饑荒期過程中能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞生長[6-7]。
[0019]在這種類型的混合的培養(yǎng)系統(tǒng)中，存在兩種類型的盛宴和饑荒過程:
[0020]-常規(guī)類型的盛宴和饑荒方法，其中使微生物培養(yǎng)物進(jìn)行交替盛宴和饑荒條件，且其中碳相對于非碳的營養(yǎng)物而言使受限的。這些系統(tǒng)(盡管富含產(chǎn)生PHA的生物體(涉及PHA產(chǎn)生者與總細(xì)菌至多88%的比例[6])) —般在微生物組成方面是相對不同的，其通常包含PHA產(chǎn)生者和非產(chǎn)生者且通常包含一種以上產(chǎn)生PHA的種類[3，8-9]。此外，一些出版物[10]報(bào)道了隨操作時(shí)間的延續(xù)群體結(jié)構(gòu)的顯著性改變:盡管PHA儲存功能得以維持，但是不同群體的相對部分可變。
[0021]-專利申請EP2135954 Al中所述的盛宴和饑荒系統(tǒng)。根據(jù)該對比文件，將較強(qiáng)的選擇壓力在選擇步驟過程中施加于生物質(zhì)。特別地，這種強(qiáng)力選擇階段通過合并在盛宴和饑荒條件上的兩個(gè)附加壓力與過量的營養(yǎng)物與碳比實(shí)現(xiàn):(I)縮短飼喂期限和延長饑荒期(甚至得到低于通常對盛宴和饑荒系統(tǒng)報(bào)道的盛宴與饑荒比，即低于0.1);和(2)對每一生物質(zhì)停留時(shí)間施加少量操作循環(huán)，將其與長饑荒期合并促使細(xì)胞再更新以便完全依賴于PHA合成。然而，這種方法仍然包含兩個(gè)步驟。
[0022]一般而言，基于盛宴和饑荒的方法因需要兩步法(其中給PHA蓄積步驟(第二步)接種第一步(選擇步驟)中產(chǎn)生的生物質(zhì))而具有明顯低于純培養(yǎng)方法的產(chǎn)率。這意味著蓄積步驟中的細(xì)胞濃度受限于選擇步驟中達(dá)到的細(xì)胞濃度。盛宴和饑荒方法的蓄積步驟通常以低于純培養(yǎng)方法的細(xì)胞密度操作(對于混合的培養(yǎng)方法報(bào)道至多6g/L ;對于純培養(yǎng)報(bào)道約為100g/L)。適用于盛宴和饑荒選擇方法的使用交替盛宴和饑荒期的動(dòng)態(tài)飼喂策略促使內(nèi)部生長受限(以引起PHA儲存)，這還導(dǎo)致低生物質(zhì)產(chǎn)率。此外，在盛宴和饑荒選擇方法中維持低盛宴/饑荒期持續(xù)時(shí)間比的需求防止了對這些系統(tǒng)施加的高載量[9]，由此限制了得到的生物質(zhì)濃度。在盛宴和饑荒方法中報(bào)道的低細(xì)胞密度最終限制了該方法的總體產(chǎn)率，并且還導(dǎo)致對于生物質(zhì)濃度的高能需求和蓄積步驟后的干燥。
[0023]另外重要的是認(rèn)為，為了維持盛宴和饑荒方法中的實(shí)時(shí)競爭性優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞中儲存的PHA需氧有效地用作生物質(zhì)合成的底物。因此，在選擇步驟過程中需氧應(yīng)用相對于碳過量的營養(yǎng)物。相反，在蓄積步驟過程中，施加營養(yǎng)限制，以便限制細(xì)胞生長和將PHA儲存響應(yīng)最大化。因此，該方法有必要運(yùn)行隨后的兩步。
[0024]此外，選擇步驟需要兩個(gè)反應(yīng)期:
[0025]-盛宴期，具有底物攝取或轉(zhuǎn)化成PHA;且然后
[0026]-饑荒期，通常為盛宴期的3— 5倍長乃至長于盛宴期10倍。在饑荒期過程中，PHA被水解并且用作細(xì)胞生長和/或維持的碳和能量來源。
[0027]這意味著該方法的產(chǎn)率也受到操作饑荒期所需的反應(yīng)體積和操作要求(例如通氣)約束。
[0028]與盛宴和饑荒PHA生產(chǎn)方法需要微生物選擇和PHA生產(chǎn)階段解偶聯(lián)這一事實(shí)相關(guān)的另一個(gè)缺點(diǎn)在于對于底物的較低的總產(chǎn)率。這種較低的總產(chǎn)率歸因于在選擇階段的盛宴期過程中必須將外部的碳源部分地轉(zhuǎn)化成PHA。因此，在隨后的饑荒期過程中PHA被轉(zhuǎn)化成生物質(zhì)，使得隨后產(chǎn)生的生物質(zhì)可以作用生物催化劑，其用于在最終蓄積階段將VFA轉(zhuǎn)化成 PHA。
[0029]此外，當(dāng)可以選擇和在同一反應(yīng)器中共同培養(yǎng)大量不同PHA儲存菌株時(shí)，進(jìn)行PHA質(zhì)量控制是困難的。所選擇的微生物聚生體的多樣性程度取決于所施加的選擇壓力的效率，由此依賴于底物組成和用于控制盛宴和饑荒方法的操作參數(shù)的數(shù)量。已經(jīng)對大部分盛宴和饑荒方法報(bào)道了相對不同的群體，其不僅包含占優(yōu)勢的PHA儲存群體，而且包含明顯不儲存的側(cè)翼群體。還證實(shí)這些系統(tǒng)維持高度進(jìn)化的群體動(dòng)態(tài)，可能在組成和分子量方面導(dǎo)致聚合物質(zhì)量的變異性。
[0030]本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。更具體地，本發(fā)明在上述一個(gè)實(shí)施方案中旨在提供更有效的方法，其用于使用開放的培養(yǎng)系統(tǒng)選擇穩(wěn)定的產(chǎn)生PHA的微生物群體。
[0031]本發(fā)明還旨在在至少一個(gè)實(shí)施方案中提供這樣的方法，其比現(xiàn)有技術(shù)的方法更低廉。
[0032]本發(fā)明還旨在在至少一個(gè)實(shí)施方案中提供用于生產(chǎn)PHA的方法，其至少部分滿足可持續(xù)發(fā)展的要求。
[0033]3.發(fā)明概述
[0034]如下所示的這些目的和其它目的通過本發(fā)明來實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明涉及用于同時(shí)選擇和維持選定的微生物聚生體用于聚羥基烷酸酯類(PHA)生產(chǎn)的方法，給所述微生物聚生體飼喂至少一種易于可生物降解的碳底物，所述方法包括在混合生物反應(yīng)器中對所述微生物聚生體進(jìn)行需氧培養(yǎng)的第一步。
[0035]根據(jù)本發(fā)明，在所述需氧培養(yǎng)的第一步中將所述微生物聚生體的比細(xì)胞生長速率U1固定在目標(biāo)值，并且所述需氧培養(yǎng)的第一步在營養(yǎng)限制下進(jìn)行，例如易于可生物降解的碳底物攝取速率QS1與所述固的細(xì)胞生長速率μ工不平衡。
[0036]本文的術(shù)語“營養(yǎng)物”應(yīng)理解為包含促使細(xì)胞生長的任意的物質(zhì)，除外碳源。
[0037]術(shù)語“催化生物質(zhì)濃度”被定義為生物質(zhì)濃度或混懸的固體濃度減去胞內(nèi)PHA含量且隨后可以如下計(jì)算:催化生物質(zhì)濃度=生物質(zhì)濃度-胞內(nèi)PHA含量。
[0038]以“1Γ1”表示比細(xì)胞生長速率。易于可生物降解的碳底物攝取速率qS1是生物質(zhì)消耗易于可生物降解的碳底物時(shí)的速率。另外，QS1被定義為每單位時(shí)間和每質(zhì)量單位生物質(zhì)濃度消耗的底物量(g碳源/小時(shí)/g催化生物質(zhì))。
[0039]易于可生物降解的碳底物可以在下文中命名為“碳源”、“RBC0D底物”、“碳底物”和“碳流入物”。本文的術(shù)語RBCOD底物(易于可生物降解的化學(xué)需氧量(ReadilyB1degradable Chemical Oxygen Demand)")應(yīng)理解為包含易于和可生物降解的水中的任意底物。RBCOD包括各種簡單的有機(jī)碳分子，例如揮發(fā)性脂肪酸、醇類和糖類。
[0040]為了澄清如下描述的措詞，且特別是當(dāng)術(shù)語“步驟”和“階段”出現(xiàn)在同一句子中時(shí)，術(shù)語“步驟”在本文中是指行為，例如生物質(zhì)選擇、生物質(zhì)生長或PHA產(chǎn)生。術(shù)語"階段"在本文中擴(kuò)展至應(yīng)用方法的“物理”水平，如在該方法過程中應(yīng)用的反應(yīng)器的數(shù)量。
[0041]本發(fā)明的方法能夠僅在一步中選擇和連續(xù)培養(yǎng)儲存PHA的