一種脂肪酶發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種脂肪酶發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶是一類特殊的酯鍵水解酶，可催化油脂的選擇性水解及其它酯類的轉(zhuǎn)酯、氨解反應(yīng)等，是一種高效的生物催化劑，廣泛應(yīng)用于生物能源、食品、制革、洗滌、醫(yī)藥和有機(jī)合成等諸多工業(yè)領(lǐng)域。在眾多脂肪酶中南極假絲酵母固定化脂肪酶B (以下簡(jiǎn)稱固定化脂肪酶)的用途最為廣泛，它對(duì)非水溶性和水溶性物質(zhì)都有很強(qiáng)的催化活性。
[0003]全球范圍內(nèi)，脂肪酶生產(chǎn)和銷售呈每年擴(kuò)張的趨勢(shì)。脂肪酶的主要供應(yīng)商丹麥諾維信的產(chǎn)能已經(jīng)達(dá)到滿產(chǎn)，而在丹麥，該產(chǎn)品的產(chǎn)能擴(kuò)大受到成本的限制。國(guó)內(nèi)的脂肪酶生產(chǎn)商缺乏提升產(chǎn)品品質(zhì)的能力，一直處于低價(jià)格低質(zhì)量的競(jìng)爭(zhēng)狀態(tài)，且沒有產(chǎn)業(yè)化的固定化脂肪酶。
[0004]國(guó)際上適于生物柴油的脂肪酶產(chǎn)品主要有丹麥諾維信公司以及日本天野公司，其中諾維信公司生產(chǎn)的脂肪酶產(chǎn)品在整個(gè)酶法有機(jī)合成、藥物合成以及生物柴油制備領(lǐng)域占?jí)艛嗟匚?。?jù)估計(jì)中國(guó)脂肪酶市場(chǎng)容量約為50億元人民幣，鑒于中國(guó)生物柴油、造紙、皮革、食品、飼料、醫(yī)藥制造行業(yè)的高速發(fā)展，脂肪酶的應(yīng)用會(huì)越來越廣泛，市場(chǎng)需求越來越大，預(yù)計(jì)在未來幾年脂肪酶每年將以10%-15%的速度增長(zhǎng)。
[0005]中國(guó)專利201310116628.3公開了一種制備固定化脂肪酶的方法。該方法，利用耦合固定化技術(shù)即吸附、交聯(lián)及包埋三種結(jié)合的方法對(duì)脂肪酶進(jìn)行固定化。但該方法動(dòng)力消耗大，產(chǎn)量少，產(chǎn)出率低，成本高，固定化脂肪酶產(chǎn)品質(zhì)量低，活性不好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了一種脂肪酶發(fā)酵方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
一種脂肪酶發(fā)酵方法，依次包括以下步驟:
1)稱取蛋白胨4g、酵母提取物2g、甘油4g放入燒杯中，然后加入純化水90g溶解，分裝至搖瓶中，每個(gè)搖瓶中裝量35ml，滅菌得到搖瓶培養(yǎng)基；
2)將試管菌種分別接入搖瓶培養(yǎng)基中，用八層紗布封口，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)22?24h，得到搖瓶種子；
3)向一級(jí)種子罐中加入甘油0.06kg、蛋白胨0.04kg、酵母浸粉0.03kg、消泡劑3ml，加入水至3L，調(diào)節(jié)pH至7.0，滅菌得到一級(jí)種子培養(yǎng)基；
4)調(diào)節(jié)一級(jí)種子罐內(nèi)溫度至30°C，用壓差法將搖瓶種子接種至一級(jí)種子罐內(nèi)，攪拌lOOrpm，壓力0.03?0.05MPa，控制DO彡30%，培養(yǎng)16?22h，得到一級(jí)種子；
5)向二級(jí)種子罐中加入甘油1.2kg、氯化鈉0.15kg、硫酸鎂0.3kg、氫氧化鉀0.18kg、硫酸鈣0.0516kg、85%磷酸0.5lkg、消泡劑30 ml，加入水至29L，調(diào)節(jié)pH至5.0，滅菌得到二級(jí)種子培養(yǎng)基； 6)調(diào)節(jié)二級(jí)種子罐內(nèi)溫度至30°C，將一級(jí)種子接種至移種至二級(jí)種子罐內(nèi)，攪拌150rpm，壓力0.03MPa，控制D0100%，培養(yǎng)12?18h，得到二級(jí)種子；
7)向發(fā)酵罐中加入甘油92kg、氯化鈉1.15kg、硫酸鎂23kg、氫氧化鉀13.8kg、硫酸媽39.lkg、85%磷酸3.956kg、消泡劑4.6 L，加入水至2100L，調(diào)節(jié)pH至5.5，滅菌得到發(fā)酵培養(yǎng)基;
8)調(diào)節(jié)發(fā)酵罐內(nèi)溫度至30°C，用壓差法將二級(jí)種子移種至發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)，移種時(shí)，發(fā)酵罐壓力 0.03MPa，攪拌 150 ?250rpm，控制 D0100% ；
9)當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)DO( 30%時(shí)，升罐壓至0.04?0.05MPa，攪拌150?250rpm ；
10)向補(bǔ)料罐中加入甘油250kg，滅菌；調(diào)節(jié)補(bǔ)料罐內(nèi)溫度至30°C;當(dāng)發(fā)酵罐中溶氧回升時(shí)，對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行補(bǔ)料，控制發(fā)酵罐D(zhuǎn)030?40% ；
11)當(dāng)補(bǔ)料罐中甘油<100升時(shí)，向發(fā)酵罐補(bǔ)充甲醇，控制D015?25%，調(diào)節(jié)發(fā)酵罐內(nèi)溫度至25 °C ；
12)發(fā)酵培養(yǎng)130h，得到脂肪酶成品。
[0008]進(jìn)一步，所述搖瓶培養(yǎng)基、一級(jí)種子培養(yǎng)基、二級(jí)種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、補(bǔ)料罐中甘油的滅菌采用蒸汽滅菌，其滅菌步驟為:
A)預(yù)熱，40分鐘內(nèi)升溫至100C；
B)保溫滅菌，20?30分鐘內(nèi)升溫到121?123°C，保溫20分鐘；
C)一次降溫，30分鐘降溫到100C ;
D)二次降溫，120分鐘降溫至30°C。
[0009]進(jìn)一步，所述一級(jí)種子罐、二級(jí)種子罐、發(fā)酵罐、補(bǔ)料罐皆設(shè)置有空氣分過濾器；在使用一級(jí)種子罐、二級(jí)種子罐、發(fā)酵罐、補(bǔ)料罐前先對(duì)空氣分過濾器進(jìn)行滅菌，滅菌時(shí)，蒸汽的壓力為0.10?0.13MPa，保壓時(shí)間為30?40分鐘。
[0010]進(jìn)一步，在步驟3中，使用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。
[0011]進(jìn)一步，在步驟5、7中，使用氨水調(diào)節(jié)pH。
[0012]本發(fā)明在脂肪酶提取過程中不使用大量有機(jī)溶劑和其他有害原料，減少了對(duì)操作人員的傷害；不用對(duì)菌體進(jìn)行分離破碎，減少了動(dòng)力消耗；脂肪酶的產(chǎn)出率高，產(chǎn)量高，成本低，脂肪酶產(chǎn)品質(zhì)量好，活性高。提高了固化酶活性，提高產(chǎn)品的使用批次達(dá)200或以上。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
[0014]一種脂肪酶發(fā)酵方法，依次包括以下步驟:
1)稱取蛋白胨4g、酵母提取物2g、甘油4g放入燒杯中，然后加入純化水90g溶解，分裝至搖瓶中，每個(gè)搖瓶中裝量35ml，滅菌得到搖瓶培養(yǎng)基；
2)將試管菌種分別接入搖瓶培養(yǎng)基中，用八層紗布封口，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)22?24h，得到搖瓶種子；
3)向一級(jí)種子罐中加入甘油0.06kg、蛋白胨0.04kg、酵母浸粉0.03kg、消泡劑3ml，加入水至3L，使用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0，滅菌得到一級(jí)種子培養(yǎng)基；
4)調(diào)節(jié)一級(jí)種子罐內(nèi)溫度至30°C，用壓差法將搖瓶種子接種至一級(jí)種子罐內(nèi)，攪拌lOOrpm，壓力0.03?0.05MPa，控制DO彡30%，培養(yǎng)16?22h，得到一級(jí)種子； 5)向二級(jí)種子罐中加入甘油1.2kg、氯化鈉0.15kg、硫酸鎂0.3kg、氫氧化鉀0.18kg、硫酸鈣0.0516kg、85%磷酸0.51kg、消泡劑30 ml，加入水至29L，使用氨水調(diào)節(jié)pH至5.0，滅菌得到二級(jí)種子培養(yǎng)基；
6)調(diào)節(jié)二級(jí)種子罐內(nèi)溫度至30°C，將一級(jí)種子接種至移種至二級(jí)種子罐內(nèi)，攪拌150rpm，壓力0.03MPa，控制D0100%，培養(yǎng)12?18h，得到二級(jí)種子；
7)向發(fā)酵罐中加入甘油92kg、氯化鈉1.15kg、硫酸鎂23kg、氫氧化鉀13.8kg、硫酸媽39.lkg、85%磷酸3.956kg、消泡劑4.6 L，加入水至2100L，使用氨水調(diào)節(jié)pH至5.5，滅菌得到發(fā)酵培養(yǎng)基；
8)調(diào)節(jié)發(fā)酵罐內(nèi)溫度至30°C，用壓差法將二級(jí)種子移種至發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)，移種時(shí)，發(fā)酵罐壓力 0.03MPa，攪拌 150 ?250rpm，控制 D0100% ；
9)當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)DO( 30%時(shí)，升罐壓至0.04?0.05MPa，攪拌150?250rpm ；
10)向補(bǔ)料罐中加入甘油250kg，滅菌；調(diào)節(jié)補(bǔ)料罐內(nèi)溫度至30°C;當(dāng)發(fā)酵罐中溶氧回升時(shí)，對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行補(bǔ)料，控制發(fā)酵罐D(zhuǎn)030?40% ；
11)當(dāng)補(bǔ)料罐中甘油<100升時(shí)，向發(fā)酵罐補(bǔ)充甲醇，控制D015?25%，調(diào)節(jié)發(fā)酵罐內(nèi)溫度至25 °C ；
12)發(fā)酵培養(yǎng)130h，得到脂肪酶成品。
[0015]所述搖瓶培養(yǎng)基、一級(jí)種子培養(yǎng)基、二級(jí)種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、補(bǔ)料罐中甘油的滅菌采用蒸汽滅菌，其滅菌步驟為:
A)預(yù)熱，40分鐘內(nèi)升溫至100C；
B)保溫滅菌，20?30分鐘內(nèi)升溫到121?123°C，保溫20分鐘；
C)一次降溫，30分鐘降溫到100C ;
D)二次降溫，120分鐘降溫至30°C。
[0016]所述一級(jí)種子罐、二級(jí)種子罐、發(fā)酵罐、補(bǔ)料罐皆設(shè)置有空氣分過濾器；在使用一級(jí)種子罐、二級(jí)種子罐、發(fā)酵罐、補(bǔ)料罐前先對(duì)空氣分過濾器進(jìn)行滅菌，滅菌時(shí)，蒸汽的壓力為0.10?0.13MPa，保壓時(shí)間為30?40分鐘。
[0017]經(jīng)檢驗(yàn)得到的固定化堿性脂肪酶活力為12100U/g。
[0018]凡在不脫離本發(fā)明核心的情況下做出的簡(jiǎn)單的變形或修改均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種脂肪酶發(fā)酵方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 1)稱取蛋白胨4g、酵母提取物2g、甘油4g放入燒杯中，然后加入純化水90g溶解，分裝至搖瓶中，每個(gè)搖瓶中裝量35ml，滅菌得到搖瓶培養(yǎng)基； 2)將試管菌種分別接入搖瓶培養(yǎng)基中，用八層紗布封口，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)22?24h，得到搖瓶種子； 3)向一級(jí)種子罐中加入甘油0.06kg、蛋白胨0.04kg、酵母浸粉0.03kg、消泡劑3ml，加入水至3L，調(diào)節(jié)pH至7.0，滅菌得到一級(jí)種子培養(yǎng)基； 4)調(diào)節(jié)一級(jí)種子罐內(nèi)溫度至30°C，用壓差法將搖瓶種子接種至一級(jí)種子罐內(nèi)，攪拌lOOrpm，壓力0.03?0.05MPa，控制DO彡30%，培養(yǎng)16?22h，得到一級(jí)種子； 5)向二級(jí)種子罐中加入甘油1.2kg、氯化鈉0.15kg、硫酸鎂0.3kg、氫氧化鉀0.18kg、硫酸鈣0.0516kg、85%磷酸0.5lkg、消泡劑30 ml，加入水至29L，調(diào)節(jié)pH至5.0，滅菌得到二級(jí)種子培養(yǎng)基； 6)調(diào)節(jié)二級(jí)種子罐內(nèi)溫度至30°C，將一級(jí)種子接種至移種至二級(jí)種子罐內(nèi)，攪拌150rpm，壓力0.03MPa，控制D0100%，培養(yǎng)12?18h，得到二級(jí)種子； 7)向發(fā)酵罐中加入甘油92kg、氯化鈉1.15kg、硫酸鎂23kg、氫氧化鉀13.8kg、硫酸媽39.lkg、85%磷酸3.956kg、消泡劑4.6 L，加入水至2100L，調(diào)節(jié)pH至5.5，滅菌得到發(fā)酵培養(yǎng)基; 8)調(diào)節(jié)發(fā)酵罐內(nèi)溫度至30°C，用壓差法將二級(jí)種子移種至發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)，移種時(shí)，發(fā)酵罐壓力 0.03MPa，攪拌 150 ?250rpm，控制 D0100% ； 9)當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)DO( 30%時(shí)，升罐壓至0.04?0.05MPa，攪拌150?250rpm ； 10)向補(bǔ)料罐中加入甘油250kg，滅菌；調(diào)節(jié)補(bǔ)料罐內(nèi)溫度至30°C;當(dāng)發(fā)酵罐中溶氧回升時(shí)，對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行補(bǔ)料，控制發(fā)酵罐D(zhuǎn)030?40% ； 11)當(dāng)補(bǔ)料罐中甘油<100升時(shí)，向發(fā)酵罐補(bǔ)充甲醇，控制D015?25%，調(diào)節(jié)發(fā)酵罐內(nèi)溫度至25 °C ； 12)發(fā)酵培養(yǎng)130h，得到脂肪酶成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酶發(fā)酵方法，其特征在于:所述搖瓶培養(yǎng)基、一級(jí)種子培養(yǎng)基、二級(jí)種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、補(bǔ)料罐中甘油的滅菌采用蒸汽滅菌，其滅菌步驟為: A)預(yù)熱，40分鐘內(nèi)升溫至100C； B)保溫滅菌，20?30分鐘內(nèi)升溫到121?123°C，保溫20分鐘； C)一次降溫，30分鐘降溫到100C ; D)二次降溫，120分鐘降溫至30°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的脂肪酶發(fā)酵方法，其特征在于:所述一級(jí)種子罐、二級(jí)種子罐、發(fā)酵罐、補(bǔ)料罐皆設(shè)置有空氣分過濾器；在使用一級(jí)種子罐、二級(jí)種子罐、發(fā)酵罐、補(bǔ)料罐前先對(duì)空氣分過濾器進(jìn)行滅菌，滅菌時(shí)，蒸汽的壓力為0.10?0.13MPa，保壓時(shí)間為30?40分鐘ο
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的脂肪酶發(fā)酵方法，其特征在于:在步驟3中，使用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的脂肪酶發(fā)酵方法，其特征在于:在步驟5、7中，使用氨水調(diào)節(jié)pHo
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脂肪酶發(fā)酵方法，其步驟為1）制取搖瓶培養(yǎng)基；2）接種脂肪酶試管菌種，培養(yǎng)得到搖瓶種子；3）制取一級(jí)種子培養(yǎng)基；4）接種搖瓶種子，培養(yǎng)得到一級(jí)種子；5）制取二級(jí)種子培養(yǎng)基；6）接種一級(jí)種子，培養(yǎng)得到二級(jí)種子；7）制取發(fā)酵培養(yǎng)基；8）移種二級(jí)種子，發(fā)酵培養(yǎng)130h，得到脂肪酶成品。本發(fā)明在脂肪酶提取過程中不使用大量有機(jī)溶劑和其他有害原料，減少了對(duì)操作人員的傷害；不用對(duì)菌體進(jìn)行分離破碎，減少了動(dòng)力消耗；脂肪酶的產(chǎn)出率高，產(chǎn)量高，成本低，脂肪酶產(chǎn)品質(zhì)量好，活性高。提高了固化酶活性，提高產(chǎn)品的使用批次達(dá)200或以上。
【IPC分類】C12N9-20
【公開號(hào)】CN104762278
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510196047
【發(fā)明人】林楠棋, 張欣, 王悅璋, 詹艷艷
【申請(qǐng)人】焦作健康元生物制品有限公司
【公開日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2015年4月23日