一種花生總脂的提取及測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種花生總脂的提取及測定方法，包括以下步驟：新鮮的花生組織經(jīng)冷凍干燥獲得干組織；稱取花生干組織，放入研缽中，加入液氮研磨；加入有機試劑提取，超聲混勻，離心分離，保留上層有機相；轉(zhuǎn)移有機相提取液，加入有機試劑和鹽溶液，混勻，靜置分層，回收下層，置于提脂瓶中，揮干溶劑至恒重，于天平稱量得到總脂和提脂瓶的總重量；采用重量法計算總脂的含量。本發(fā)明方法利用相對較少的設備和較為簡單的步驟，提取的材料范圍廣（根、莖、葉和種子），提取耗時短、提取率高，成本低，是一種實驗室中方便快捷的花生脂肪提取和測定方法。
【專利說明】一種花生總脂的提取及測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及花生總脂的提取及測定方法，屬于花生油脂提取【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]花生是我國重要的油料作物、經(jīng)濟作物和出口創(chuàng)匯作物。我國花生常年種植面積500萬hm2左右，總產(chǎn)近1500萬t，約占國內(nèi)油料作物總產(chǎn)的50%?；ㄉ偖a(chǎn)約55%_60%用于榨油，花生油常年產(chǎn)量230萬t左右，占國產(chǎn)食用植物油產(chǎn)量的25%，僅次于菜籽油產(chǎn)量，是國產(chǎn)植物油的第二大來源。
[0003]目前實驗室中測定花生脂肪含量的方法很多，有傳統(tǒng)的有機溶劑提取法和索氏提取法，也有當前廣泛使用的熒光染料測定法、傅立葉變換近紅外漫反射光譜法和磷酸香草醛法，還有其他的一些方法如:銅試劑法、蘇丹黑染色法、核磁共振法、超臨界CO2提取法、離子液體提取法等。有機溶劑提取法和索氏提取法操作簡單、成本低，但存在所需試劑和樣品量大、提取效率低、耗時費力的缺點。熒光染料測定法、傅立葉變換近紅外漫反射光譜法、磷酸香草醛法、銅試劑法、蘇丹黑染色法以及核磁共振法所需樣品量少、所用時間短，但測定的總脂含量均為相對值。超臨界CO2提取法和離子液體提取法提取效率高，所得總脂含量較高，但測定成本較高。因此，傳統(tǒng)的有機溶劑提取法和索氏提取法是使用較為普遍的實驗室規(guī)模的總脂絕對含量的測定方法。
[0004]索氏提取法只能提取游離態(tài)的脂肪，而對脂蛋白“磷脂”等結(jié)合態(tài)的脂類則不能完全提取出來。極性的甲醇和非極性的氯仿混合物卻能有效地提取結(jié)合態(tài)脂類，同時也能將磷脂等極性脂質(zhì)提取出來，從而有效地提取出全部脂類。由于有機溶劑滲透性較差，測定的組織內(nèi)總脂含量并不是十分準確。因此，可將有機溶劑提取法與細胞破碎方法結(jié)合起來以達到更理想的提取效果。目前，細胞破碎的方法主要有研磨破碎法、酸熱法和超聲波輔助提取法等。研磨破碎法對細胞的破碎率高，但處理時間長。酸熱法是向樣品中加入一定量的適宜濃度的鹽酸，振蕩均勻后在室溫下放置30min，再沸水浴3min后迅速放置到。C冷凍，該法簡單方便、破碎效果好。超聲波輔助提取法基本原理是應用超聲波強化提取待提取物有效成分，是一種物理破碎過程，具有較高的破碎率。
[0005]目前對于花生種子中脂肪提取技術(shù)研究較多，而對于花生根、莖和葉等組織的脂肪提取技術(shù)的研究還未見報道。本研究發(fā)明的花生總脂的提取及測定方法將有機溶劑提取法與研磨破碎法及超聲波輔助提取法相結(jié)合，提取的材料范圍廣(根、莖、葉和種子)，提取耗時短、提取率高，成本低，是一種實驗室中方便快捷的花生脂肪提取和測定方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供適合實驗室操作的方便快捷的花生脂肪提取和測定的方法。
[0007]為達到上述目的，本發(fā)明采用以下步驟:
新鮮的花生組織經(jīng)冷凍干燥獲得干組織；稱取花生干組織，放入研缽中，加入液氮研磨；加入有機試劑提取，超聲混勻，離心分離，保留上層有機相；轉(zhuǎn)移有機相提取液，加入有機試劑和鹽溶液，混勻，靜置分層，回收下層，置于提脂瓶中，揮干溶劑至恒重，于天平稱量得到總脂和提脂瓶的總重量；采用重量法計算總脂的含量。
[0008]具體來說，所述的方法如下:
Cl)新鮮的花生組織經(jīng)冷凍干燥獲得干組織；
(2)稱取花生干組織，放入研缽中，加入液氮研磨；
(3)加入有機試劑提取，超聲混勻，離心分離，保留上層有機相；殘渣加入有機試劑，超聲混勻，離心分離，保留上層有機相，一共重復3次；
(4)合并有機相提取液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入有機試劑和鹽溶液，混勻，靜置分層，回收下層；
(5)加有機溶劑于原上、中層溶液中再萃取一次，再加有機溶劑于原上、中層溶液中再萃取一次，合并下層液，置于提脂瓶中，揮干溶劑至恒重，于天平稱量得到總脂和提脂瓶的
總重量；
(6)采用重量法計算總脂的含量。
[0009]優(yōu)選地，步驟(I)所述的樣品制備是取新鮮的花生根、莖或者葉片，用滅菌的蒸餾水清洗3次，經(jīng)冷凍干燥后獲得干組織。取新鮮的花生種子，清洗后采用液氮反復研磨，然后再把研碎的種子冷凍干燥。
[0010]優(yōu)選地，步驟(2)中采用萬用天平準確稱取花生根、莖或者葉片干組織0.2g (m),放入研缽中，加入液氮反復研磨，以破壞組織細胞壁。對于花生種子，直接稱取0.2g (m)干粉末，進行后續(xù)的實驗。
[0011 ] 優(yōu)選地，步驟(3)所述的有機試劑為體積比2:1的甲醇-氯仿混合物，第一次提取加入體積為7ml，第二、三、四次加入體積分別為3ml，2ml，lml ;超聲波輔助提取的條件為超聲波功率300w，超聲波頻率28kHz，第一次超聲時間為lOmin，第二、三、四次超聲時間均為5min ;離心條件為20°C, 6000r/min轉(zhuǎn)速離心15min。
[0012]優(yōu)選地，步驟(4)所述的有機試劑為氯仿，加入體積為2.5ml ;鹽溶液為氯化鈉溶液，濃度為1%，加入體積為3ml。
[0013]優(yōu)選地，步驟(5)所述的有機試劑為氯仿，加入體積為2.5ml ;提脂瓶使用前應在105°C烘箱中干燥2h，放入干燥器冷卻至恒重，于萬用天平稱量得到提脂瓶的重量U1);采用氮吹儀，50°C水浴加熱，氮氣揮干溶劑至恒重。把提脂瓶置入105°C烘箱中干燥2h，放入干燥器冷卻至恒重，于萬用天平稱量得到總脂和提脂瓶的總重量(m2)。
[0014]優(yōu)選地，步驟(6)所述的采用重量法計算總脂的含量，公式如下:ω = (m2 - Hi1) /m X 100%ο
[0015]利用本發(fā)明提供的花生總脂的提取及測定方法，提取的材料范圍廣(根、莖、葉和種子)，提取耗時短、提取率高，成本低，是一種實驗室中方便快捷的花生脂肪提取和測定方法，社會效益和科研價值顯著。
【具體實施方式】
[0016]實施例1
在花生品種花育19種子發(fā)育的不同時期取樣，從果針下地后10天開始，每隔10天取一次樣，共取6次樣品。剝掉果殼，保留種子，采用液氮反復研磨，然后再把研碎的種子冷凍干燥。采用萬用天平稱取0.2g (m)干粉末，放入15ml玻璃管中，加入7.0ml甲醇-氯仿(2:1，V: V)提取液，超聲(300w，28kHz) IOmin混勻。6000r/min轉(zhuǎn)速離心15min，采用膠頭滴管吸取上層有機相到新的15ml玻璃管中，殘渣先后加3ml、2ml、lml甲醇-氯仿(2:1，V: V)，超聲5min混勻，6000r/min轉(zhuǎn)速離心15min，保留上層有機相。合并有機相提取液轉(zhuǎn)移到25ml分液漏斗中，加入2.5ml氯仿和3.0 ml 1%氯化鈉溶液，混勻，靜置分層，分為三層，回收下層。加2.5ml氯仿于原上、中層溶液中再萃取一次，再加2.5ml氯仿于原上、中層溶液中再萃取一次，合并下層液，置于提脂瓶中。提脂瓶使用前已在105°C烘箱中干燥2h，放入干燥器冷卻至恒重，于萬用天平稱量得到提脂瓶的重量U1X采用氮吹儀，50°C水浴加熱，氮氣揮干溶劑至恒重。把提脂瓶置入105°C烘箱中干燥2h，放入干燥器冷卻至恒重，于萬用天平稱量得到總脂和提脂瓶的總重量(m2)。采用重量法計算總脂的含量，公式如下:ω=(m2 - Hi1) / m X 100%。得到的花育19種子發(fā)育6個階段的總脂含量分別為17.77%，29.42%, 37.25%, 48.27%, 49.75% 和 47.97%。
實施例2
花生品種花育19在16小時光照/8小時黑暗(28° C/22° C)的光照培養(yǎng)箱中生長，待花生幼苗生長到三葉期后進行ABA處理實驗。將花生幼苗從土中拔出，將根部小心沖洗干凈后直接浸泡到100 μ M ABA溶液中。在處理的Oh、lh、3h、6h、12h、24h、48h和72h取新鮮葉片，用滅菌的蒸餾水清洗3次，經(jīng)冷凍干燥后獲得干組織。采用萬用天平準確稱取花生葉片干組織0.2g(m)，放入研缽中，加入液氮反復研磨，以破壞組織細胞壁。加入7.0ml甲醇-氯仿(2:1，V:V)提取液到研缽中，充分轉(zhuǎn)移組織提取液和殘渣到15ml玻璃管中，超聲(300w，28kHz)10min混勻。6000r/min轉(zhuǎn)速離心15min,采用膠頭滴管吸取上層有機相到新的15ml玻璃管中，殘渣先后加3ml、2ml、lml甲醇-氯仿(2:1，V:V)，超聲5min混勻，6000r/min轉(zhuǎn)速離心15min，保留上層有機相。合并有機相提取液轉(zhuǎn)移到25ml分液漏斗中，加入2.5ml氯仿和3.0 ml 1%氯化鈉溶液，混勻，靜置分層，分為三層，回收下層。加2.5ml氯仿于原上、中層溶液中再萃取一次，再加2.5ml氯仿于原上、中層溶液中再萃取一次，合并下層液，置于提脂瓶中。提脂瓶使用前已在105°C烘箱中干燥2h，放入干燥器冷卻至恒重，于萬用天平稱量得到提脂瓶的重量(Hi1)15采用氮吹儀，50°C水浴加熱，氮氣揮干溶劑至恒重。把提脂瓶置入105°C烘箱中干燥2h，放入干燥器冷卻至恒重，于萬用天平稱量得到總脂和提脂瓶的總重量(m2)。采用重量法計算總脂的含量,公式如下:ω = (m2 — Hi1) / m X 100%。得到的花育19葉片ABA處理不同時間段(Oh — 72h)的總脂含量分別為9.63%,9.90%, 10.26%，9.44%, 9.22%,9.11%,10.11%,9.13%。
[0017] 實施例3
花生品種花育19在16小時光照/8小時黑暗(28° C/22° C)的光照培養(yǎng)箱中生長，待花生幼苗生長到三葉期后進行氯化鈉處理實驗。將花生幼苗從土中拔出，將根部小心沖洗干凈后直接浸泡到200mM氯化鈉溶液中。在處理的Oh、lh、3h、6h、12h、24h、48h和72h取新鮮根，用滅菌的蒸餾水清洗3次，經(jīng)冷凍干燥后獲得干組織。采用萬用天平準確稱取花生根干組織0.2g(m)，放入研缽中，加入液氮反復研磨，以破壞組織細胞壁。加入7.0ml甲醇-氯仿(2:1，V:V)提取液到研缽中，充分轉(zhuǎn)移組織提取液和殘渣到15ml玻璃管中，超聲(300w，28kHz)10min混勻。6000r/min轉(zhuǎn)速離心15min,采用膠頭滴管吸取上層有機相到新的15ml玻璃管中，殘渣先后加3ml、2ml、lml甲醇-氯仿(2:1，V:V)，超聲5min混勻，6000r/min轉(zhuǎn)速離心15min，保留上層有機相。合并有機相提取液轉(zhuǎn)移到25ml分液漏斗中，加入2.5ml氯仿和3.0 ml 1%氯化鈉溶液，混勻，靜置分層，分為三層，回收下層。加2.5ml氯仿于原上、中層溶液中再萃取一次，再加2.5ml氯仿于原上、中層溶液中再萃取一次，合并下層液，置于提脂瓶中。提脂瓶使用前已在105°C烘箱中干燥2h，放入干燥器冷卻至恒重，于萬用天平稱量得到提脂瓶的重量U1X采用氮吹儀，50°C水浴加熱，氮氣揮干溶劑至恒重。把提脂瓶置入105°C烘箱中干燥2h，放入干燥器冷卻至恒重，于萬用天平稱量得到總脂和提脂瓶的總重量(m2)。采用重量法計算總脂的含量,公式如下:ω = (m2 — Hi1) / m X 100%。得到的花育19根氯化鈉處理不同時間段(Oh — 72h)的總脂含量分別為7.38%，7.50%, 9.60%，
4.81%, 4.47%, 4.81%, 5.13% 和 7.44%。
【權(quán)利要求】
1.一種花生總脂的提取及測定方法，包括以下步驟: (1)新鮮的花生組織經(jīng)冷凍干燥獲得干組織； (2)稱取花生干組織，放入研缽中，加入液氮研磨； (3)加入有機試劑提取，超聲混勻，離心分離，保留上層有機相；殘渣加入有機試劑，超聲混勻，離心分離，保留上層有機相，一共重復3次； (4)合并有機相提取液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入有機試劑和鹽溶液，混勻，靜置分層，回收下層； (5)加有機溶劑于原上、中層溶液中再萃取一次，再加有機溶劑于原上、中層溶液中再萃取一次，合并下層液，置于提脂瓶中，揮干溶劑至恒重，于天平稱量得到總脂和提脂瓶的總重量； (6)采用重量法計算總脂的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生總脂的提取及測定方法，其特征在于，步驟(I)所述的樣品制備是取新鮮的花生根、莖或者葉片，用滅菌的蒸餾水清洗3次，經(jīng)冷凍干燥后獲得干組織；取新鮮的花生種子，清洗后采用液氮反復研磨，然后再把研碎的種子冷凍干燥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生總脂的提取及測定方法，其特征在于，步驟(2)中采用萬用天平準確稱取花生根、莖或者葉片干組織0.2g(m)，放入研缽中，加入液氮反復研磨，以破壞組織細胞壁，對于花生種子，直接稱取0.2g (m)干粉末，進行后續(xù)的實驗。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生總脂的提取及測定方法，其特征在于，步驟(3)所述的有機試劑為體積比2:1的甲醇-氯仿混合物，第一次提取加入體積為7ml，第二、三、四次加入體積分別為3ml，2ml，lml ;超聲波輔助提取的條件為超聲波功率300w，超聲波頻率28kHz，第一次超聲時間為lOmin，第二、三、四次超聲時間均為5min，離心條件為20°C，6000r/min 轉(zhuǎn)速離心 15min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生總脂的提取及測定方法，其特征在于，步驟(4)所述的有機試劑為氯仿，加入體積為2.5ml ;鹽溶液為氯化鈉溶液，濃度為1%，加入體積為3ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生總脂的提取及測定方法，其特征在于，步驟(5)所述的有機試劑為氯仿，加入體積為2.5ml ;提脂瓶使用前應在105°C烘箱中干燥2h，放入干燥器冷卻至恒重，于萬用天平稱量得到提脂瓶的重量(Hi1);采用氮吹儀，50°C水浴加熱，氮氣揮干溶劑至恒重，把提脂瓶置入105°C烘箱中干燥2h，放入干燥器冷卻至恒重，于萬用天平稱量得到總脂和提脂瓶的總重量(m2)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生總脂的提取及測定方法，其特征在于，步驟(6)所述的采用重量法計算總脂的含量，公式如下:ω = (m2 -1ii1) / m X 100%。
【文檔編號】G01N5/04GK103528914SQ201310483662
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月16日
【發(fā)明者】遲曉元, 禹山林, 楊慶利, 陳娜, 潘麗娟, 陳明娜, 王通, 王冕, 楊珍 申請人:山東省花生研究所