專利名稱：一種定量測定作物種子脂肪氧化酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種對作物種子中脂肪氧化酶活性進行 單粒、定量測定的方法。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)侨祟愖钪饕氖澄飦碓粗?，它可以被多年貯藏并利用。但一直 以來，對小麥的研究主要集中在提高產(chǎn)量、蛋白質(zhì)品質(zhì)和抗性方面，而沒有 關(guān)注其貯藏品質(zhì)，小麥作為我國重要的糧食戰(zhàn)略儲備物質(zhì)，其貯藏品質(zhì)與產(chǎn) 出同樣重要。小麥在一般貯藏條件下第二年開始陳化變質(zhì)，在高溫高濕地區(qū) 貯藏發(fā)生陳化劣變的時間則更短，小麥陳化變質(zhì)將導(dǎo)致品質(zhì)降低，商品性下 降，加上霉變，倉儲害蟲危害等影響，嚴(yán)重威脅著糧食的貯藏安全。
脂肪氧化酶(Lipoxygenase, EC 1.13.11.12)是一種含鐵的氧化還原酶， 它催化含有順-順-l,4-戊二烯的多不飽和脂肪酸及其酯形成氫過氧化物。脂肪 氧化酶廣泛存在于自然界，已經(jīng)在植物、動物及真菌中發(fā)現(xiàn)，在植物中已發(fā) 現(xiàn)多種脂肪氧化酶的同工酶，如在大豆種子中已發(fā)現(xiàn)至少有三種由不同基 因編碼的同工酶。脂肪氧化酶的底物為亞油酸和花生四烯酸，亞油酸是許多 植物種子中含量最高的脂肪酸。亞油酸經(jīng)脂肪氧化酶催化形成C6醛類、醇類 化合物，這些揮發(fā)性物質(zhì)會產(chǎn)生陳味，導(dǎo)致加工食品的品質(zhì)降低。研究表明 種子保存過程中脂肪酸的降解是導(dǎo)致品質(zhì)劣變，產(chǎn)生陳味及劣變的根源，脂 肪氧化酶缺失或其活性降低能減少氧化變質(zhì)，延長種子C藏期。
小麥脂肪氧化酶活性的測定方法已經(jīng)報道的大約有以下3種。最常應(yīng)用 的是測定234nm處脂肪氧化酶反應(yīng)直接產(chǎn)物-氫過氧化物的含量，這種方法對 己經(jīng)提純的酶很適用，但不適合測定粗酶活性，因為粗酶中含有其它吸收紫 外光的物質(zhì)會干擾測定；同時，此方法操作繁瑣，因此限制了它的應(yīng)用。另 一種方法是氧-電極法，這種方法測定很準(zhǔn)確，但由于氧電極價格昂貴，同時 需要專業(yè)人員，測定繁瑣，推廣很難。第三種方法是單克隆抗體法，這種方
法需要制備專一的抗體，測定準(zhǔn)確，但周期長，對實驗設(shè)備要求很高，普通 實驗室很難進行。以上3種方法均需要數(shù)克以上分析樣品，不能實現(xiàn)單粒定

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速、準(zhǔn)確、簡便的作 物單粒種子脂肪氧化酶活性定量測定方法。
本發(fā)明所述的作物包括小麥、玉米、大豆、水稻、花生、蕎麥、大麥等 農(nóng)作物。
本發(fā)明的單粒小麥種子中脂肪氧化酶活性定量測定方法的主要原理在 一定時間內(nèi)，脂肪氧化酶的活性大小與其催化反應(yīng)生成的氫過氧化物的量呈 正比例，氫過氧化物在酸性條件下，能使碘化鉀氧化為碘，碘與淀粉反應(yīng)生
成藍色物質(zhì)，該顏色物質(zhì)在470nm處有特征吸收峰。因此，測定藍色物質(zhì)的 量就可以相應(yīng)計算出脂肪氧化酶的活性。本實驗的反應(yīng)原理如下-
脂肪氧化酶 亞油酸+02- 氫過氧化物
氫過氧化物+r+H+4 12+亞油酸醇 12+淀粉~>藍色物質(zhì)
本發(fā)明測定作物種子脂肪氧化酶活性的方法，包括以下步驟
(1) 、提取粗酶
取單粒作物種子，磨粉后加入0.6 3.0mlPH6.0 7.0磷酸緩沖液(小麥、 水稻、大麥、蕎麥加入0.6ml，玉米加入l.Oml，大豆加入2.0ml，花生加入 3.0ml)，于0。C靜置1小時，其間振蕩2次，每次30秒；離心，12,000轉(zhuǎn)/分 鐘，10分鐘，4°C,上清液過三層粗棉布即得粗酶液，立即放入-20。C保存； 采用考馬斯亮藍法測定提取液中可溶性蛋白的含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線由牛血清蛋白 (濃度10-60ng/ml)建立。
(2) 、配制亞油酸底物溶液
于800^1蒸餾水中加入15.6|xl吐溫20、 15.6nl亞油酸，搖勻后加入100^1、 lM的NaOH,加蒸餾水定容至5ml。
(3) 、配制淀粉液
于1.0克可溶性淀粉中加入100ml蒸餾水，沸水浴中加熱直到溶液透明，
冷卻后使用。
(4) 、配制碘化鉀溶液 稱取1.5克KI加入1.0ml蒸餾水，緩慢加熱溶解，冷卻后有KI沉淀。
(5) 、配制檸檬酸溶液
稱取52.5克檸檬酸，加入蒸餾水定容至250ml。
(6) 、粗酶活性的測定
取O.lml粗酶提取液，加入0.2ml亞油酸底物溶液，搖勻后再加入0.1ml 淀粉液，0.2ml碘化鉀液和2.4ml檸檬酸液，30'C靜置5分鐘后測定470nm處 的吸光值；另取0.1ml粗酶提取液作為空白對照，在沸水浴中煮10分鐘后， 加入0.2mi亞油酸底物溶液，搖勻后再加入0.1ml淀粉液，0.2ml碘化鉀液和 2.4ml檸檬酸液，3(TC靜置5分鐘后測定470nm處的吸光值。在上述反應(yīng)條件 下，將每分鐘催化每毫克總蛋白所需的酶量定義為1個活力單位(U)，由此 得出酶活力計算公式為U二(吸光值X1000)/(蛋白質(zhì)含量mgX時間min)。
本發(fā)明方法的用途如下
① 、用于開展控制脂肪氧化酶活性相關(guān)基因的遺傳學(xué)研究。
② 、用于耐儲藏作物育種的輔助選擇指標(biāo)。
③ 、供育種學(xué)家篩選脂肪氧化酶缺失或高活性的材料，于耐儲藏作物育 種的親本資源。
④ 、作為糧食貯藏部門中長期種子庫，及農(nóng)民儲糧大戶檢測其耐貯藏性、 食品加工品質(zhì)的依據(jù)。
⑤ 、作為種子部門鑒定品種耐貯藏性的指標(biāo)之一。 本發(fā)明具有如下優(yōu)點
① 、直接利用小麥等作物種子做材料，僅需單粒種子即可，解決了不能 對作物單個籽粒進行脂肪氧化酶活性的測定的問題；
② 、利用分光光度計對淀粉-碘化鉀的顏色變化進行測定，這樣做不僅具
有簡便、快速的優(yōu)點，而且能對脂肪氧化酶活性進行定量測定；
③ 、不需要復(fù)雜的實驗條件和高精密的實驗儀器。本方法只需可見分光 光度計和離心機即可，儀器設(shè)備費用低，能滿足國內(nèi)的絕大多數(shù)實驗室條件,
易于推廣； ④ 、本方法具有時間短，通量高的特點。完成單個樣品的測定只需2-3 小時，完成上百個樣品的測定需要l-2天即可，可滿足耐儲藏小麥等作物育種 過程中對大量分離后代的篩選；⑤ 、本發(fā)明提出測定脂肪氧化酶活性的方法，操作簡便、迅速。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。 實施例l:小麥品種脂肪氧化酶活性的單粒測定粗酶的提取取小麥品種日喀則23號種子一粒，磨粉后加入0.6ml PH7.0 磷酸緩沖液，于(TC靜置1小時，其間振蕩2次，每次30秒；l小時后離心， 12,000轉(zhuǎn)/分鐘，IO分鐘，4°C，上清液過三層粗棉布后即為粗酶液，立即放 入-2(TC保存。提取液中可溶性蛋白含量的測定應(yīng)用考馬斯亮藍方法，標(biāo)準(zhǔn)曲 線由牛血清蛋白(濃度10-60pg/ml)建立。亞油酸底物溶液的配制于80(^1蒸餾水中加入15.6^1吐溫20， 15.6^1 亞油酸，搖勻后加入10(^1， 1M的NaOH，加蒸餾水定容至5ml。淀粉液的配制于1.0克可溶性淀粉中加入100ml蒸餾水，沸水浴中加熱 直到溶液透明，冷卻后使用。碘化鉀溶液的配制稱取1.5克KI加入1.0ml蒸餾水，緩慢加熱溶解。 檸檬酸溶液的配制稱取52.5克檸檬酸，加入蒸餾水溶解，定容至250ml。 粗酶活性的測定30'C時，在0.11111粗酶提取液中加入0.21111亞油酸底物 溶液，搖勻后再加入O.lml淀粉液,0.2ml碘化鉀液和2.4ml檸檬黢液(另取O.lml 粗酶提取液在沸水浴中煮10分鐘作為空白對照，其它的操作同上)，靜置5 分鐘后測定470nm處的吸光值，由此測出日喀則23號脂肪氧化酶的活性為 179.9U。實施例2:小麥品種脂肪氧化酶活性的單粒測定取小麥品種日喀則54號種子一粒，其它方法同實施例l，測出日咯則54 號脂肪氧化酶的活性為177.3U。實旌例3:玉米品種脂肪氧化酶活性的單粒測定取玉米品種S37種子一粒，磨粉后加入1.0mlPH7.0磷酸緩沖液，其它方 法同實施例1，測出玉米品種S37脂肪氧化酶的活性為149.8U。
實施例4:蕎麥品種脂肪氧化酶活性的單粒測定-取黑水甜蕎地方品種種子一粒，其它方法同實施例1，測出黑水甜蕎地方 品種脂肪氧化酶的活性為83.8U。實施例5:水稻品種脂肪氧化酶活性的單粒測定取水稻品種明恢63種子一粒，其它方法同實施例l，測出明恢63脂肪氧 化酶的活性為126.6U。實施例6:花生品種脂肪氧化酶活性的單粒測定取花生品種天府10號種子一粒，磨粉后加入3.0ml PH7.D磷酸緩沖液， 其它方法同實施例1，測出天府10號花生的脂肪氧化酶的活性為188.6U。 實施例7:大豆品種脂肪氧化酶活性的單粒測定取大豆品種成豆1號種子一粒，磨粉后加入2.0mlPH6.0磷酸緩沖液，其 它方法同實施例1，測出成豆1號脂肪氧化酶的活性為583.6U。 實施例8:大麥品種脂肪氧化酶活性的單粒測定取大麥品種藏青311種子一粒，磨粉后加入0.6mlPH7.0磷酸緩沖液，其 它方法同實施例1,測出大麥藏青311脂肪氧化酶的活性為174.1U。
權(quán)利要求
1. 一種定量測定作物種子脂肪氧化酶活性的方法，其特征是包括以下步驟(1)、提取粗酶取單粒作物種子，磨粉后加入0.6～3.0ml PH6.0～7.0磷酸緩沖液，于0℃靜置1小時，其間振蕩2次，每次30秒，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，4℃，上清液過三層粗棉布即得粗酶液，立即放入-20℃保存，采用考馬斯亮藍法測定提取液中可溶性蛋白的含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線由濃度為10-60μg/ml的牛血清蛋白；(2)、配制亞油酸底物溶液于800μl蒸餾水中加入15.6μl吐溫20，15.6μl亞油酸，搖勻后加入100μl、1M的NaOH，加蒸餾水定容至5ml；(3)、配制淀粉溶液于1.0克可溶性淀粉中加入100ml蒸餾水，沸水浴中加熱直到溶液透明，冷卻后使用；(4)、配制碘化鉀溶液稱取1.5克KI，加入1.0ml蒸餾水，緩慢加熱，冷卻后有KI沉淀；(5)、配制檸檬酸溶液稱取52.5克檸檬酸，加入蒸餾水定容至250ml；(6)、粗酶活性的測定取0.1ml粗酶提取液，加入0.2ml亞油酸底物溶液，搖勻后再加入0.1ml淀粉液、0.2ml碘化鉀液和2.4ml檸檬酸液，30℃靜置5分鐘后測定470nm處的吸光值；另取0.1ml粗酶提取液作為空白對照，在沸水浴中煮10分鐘后，加入0.2ml亞油酸底物溶液，搖勻后再加入0.1ml淀粉液，0.2ml碘化鉀液和2.4ml檸檬酸液，30℃靜置5分鐘后測定470nm處的吸光值；在上述反應(yīng)條件下，將每分鐘催化每毫克總蛋白所需的酶量定義為1個活力單位(U)，由此得出酶活力計算公式為U＝(吸光值×1000)/(蛋白質(zhì)含量mg×?xí)r間min)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定作物種子脂肪氧化酶活性的方法，其特征 是磷酸緩沖液的加入量因作物種類的不同而不同，其中小麥、水稻、大 麥、蕎麥的加入量為0.6ml，玉米的加入量為l.Oml，大豆的加入量為2.0ml， 花生的加入量為3.0ml。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種對作物種子中脂肪氧化酶活性進行單粒、定量測定的方法。包括提取粗酶、亞油酸底物溶液的配制、淀粉液的配制、碘化鉀溶液的配制、檸檬酸溶液配制、粗酶活性的測定六個步驟。本發(fā)明具有可用單粒種子測定、使用設(shè)備簡單、操作簡便、測量迅速、通量高、測定結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點。
文檔編號G01N21/31GK101210877SQ200610022638
公開日2008年7月2日 申請日期2006年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月25日
發(fā)明者波 馮, 徐智斌, 濤 王 申請人:中國科學(xué)院成都生物研究所