專利名稱：一種脂肪酶抑制劑的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脂肪酶抑制劑的篩選方法，具體涉及一種利用薄層色譜生物自顯影技術(shù)篩選脂肪酶抑制劑的方法。
背景技術(shù)：
脂肪酶又稱三?；视王；饷福且活惔龠M脂質(zhì)(如甘油三酯、脂肪、油等)水解或合成的水溶性酯酶。它普遍存在于動植物和微生物中。而人體的胰臟和脂肪組織中含有較多的脂肪酶，腸液和胃液中也含有一定量的脂肪酶，各類脂肪酶控制著消化、吸收、 脂肪重建和脂蛋白代謝等過程。近年來，隨著人們生活水平的提高和生活方式的變化，脂質(zhì)代謝紊亂的患病率快速攀升，其不僅是動脈粥樣硬化、冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的重要危險因素，同時還與糖尿病、脂肪肝、腎病、高血壓、肥胖癥及代謝綜合征等諸多常見重大疾病密切相關(guān)。目前，醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的脂質(zhì)代謝紊亂調(diào)節(jié)途徑包括一、降低甘油三酯含量； 二、降低低密度脂蛋白膽固醇含量；三、升高高密度脂蛋白膽固醇含量?，F(xiàn)在，主要應(yīng)用他汀類藥物通過第三種途徑降低膽固醇，而前兩種調(diào)解途徑均可以通過脂肪酶抑制劑來得以實現(xiàn)。
脂肪酶抑制劑能有效抑制胃/胰脂肪酶活性，減少胃腸道飲食脂肪水解，抑制脂肪組織釋放非酯化脂肪酸，從而減少甘油三酯及低密度脂蛋白膽固醇的合成，最終使血清總膽固醇和甘油三酯水平下降，通過外源性代謝途徑調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。目前，臨床主要應(yīng)用的脂肪酶抑制劑是奧利司他，但是，2010年5月美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)警告其存在可能引起嚴(yán)重肝損害的風(fēng)險；2011年3月4日，我國藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心也發(fā)布了第36期 《藥品不良反應(yīng)信息通報》要求關(guān)注奧利司他安全性問題。相比之下，天然藥物來源的脂肪酶抑制劑的成分作用溫和、毒副作用小、來源廣泛以及價格相對低廉等優(yōu)勢突顯。
近年來針對天然藥物來源的脂肪酶抑制劑的篩選一直是相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點，如苦丁茶提取物、葡萄種籽提取物、木犀草素及熊果酸等均具有抑制脂肪酶的活性。但是傳統(tǒng)的體內(nèi)、體外多種實驗的篩選方法對有效化合物的純度及應(yīng)用量均有較高要求，而天然藥物的藥效成分不明確，且多為多成分、多靶點協(xié)同作用，給天然藥物來源的脂肪酶抑制劑的篩選帶來困難，而且該種篩選方法需要消耗大量樣品，勞動強度大，不能適應(yīng)大量藥品的同時篩選。采用紫外分光光度法及MTT比色法進行脂肪酶篩選時受到溶劑和樣品濃度的限制，因此受試樣品的范圍小。所以，建立快速從天然藥物提取物中篩選出具有抑制脂肪酶活性的成分及評價方法具有重要的現(xiàn)實意義。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是，針對上述技術(shù)的不足而提供了一種利用薄層色譜生物自顯影技術(shù)，快速從天然產(chǎn)物或單體化合物中篩選脂肪酶抑制劑的方法，該方法操作簡單、實驗耗費低、靈敏度和專屬性高。
本發(fā)明的篩選方法為薄層色譜生物自顯影法，通過如下步驟實現(xiàn)
(I)將供試品溶解于水和/或有機溶劑中，然后將供試品溶液點涂于薄層板上，并將該板放入展開劑中展開、取出、晾干、備用。所述有機溶劑可以是體積溶度為90% 98% 的甲醇溶液或是乙醇溶液。
(2)將步驟(I)中得到的薄層板浸潰于底物溶液中，揮干溶劑后再浸潰于脂肪酶溶液中，取出薄層板并置于溫度為20°C -40°C條件下進行酶促反應(yīng)，酶促反應(yīng)時間為5-60 分鐘。待反應(yīng)完全后將薄層板浸潰于顯色劑溶液中進行顯色反應(yīng)，顯色反應(yīng)時間為5-60分鐘。
所述薄層板為硅膠板。所述步驟(I)中的供試品溶液的點樣量為1-20 μ L，供試品的點樣量為10pg-lmg。。
所述步驟(I)中所述的展開劑為石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸、氨水、醋酸銨等中的一種或幾種的混合物。
優(yōu)選的，將石油醚和乙酸乙酯按照體積比為2:1的比例混合配制成展開劑。
所述底物溶液為肉豆蘧酸-2-萘酯粉末溶解于石油醚的溶液，肉豆蘧酸-2-萘酯溶液的濃度為O. 25-350mmol/L。
所述步驟(2)中的脂肪酶溶液的配制方法是，先將三羥甲基氨基甲烷和無水氯化鈣粉按照重量比為2. 5-4. 5:1的配比溶于去離子水中，調(diào)節(jié)混合液的pH值為6. 5-8. 0，配制成三羥甲基氨基甲烷摩爾濃度為20-100mmol/L的酶促反應(yīng)緩沖液并冷藏保存；將脂肪酶溶解于所述酶促反應(yīng)緩沖液，配制成濃度為5-200u/mL的脂肪酶溶液。
所述顯色劑溶液為固藍(lán)B鹽溶液，濃度為O. 1-lOOmg/mL。
薄層色譜生物自顯影法是結(jié)合了比色法與色譜分離技術(shù)兩者的優(yōu)點，是一種集鑒定、分離和活性測定于一體的藥物篩選方法。篩選原理為脂肪酶通過酶促反應(yīng)產(chǎn)生的 β -萘酚與固藍(lán)B鹽顯色反應(yīng)產(chǎn)生紫色物質(zhì)，具有抑制脂肪酶活性的物質(zhì)抑制該反應(yīng)發(fā)生， 在薄層板上表現(xiàn)為紫色背景下的白色和/或棕黃色斑點。
本發(fā)明的優(yōu)點是1、所述脂肪酶抑制劑的篩選方法不需要復(fù)雜的儀器和設(shè)備，操作簡單，實驗耗費低，適合一般實驗室操作，而且靈敏度和專屬性高于常規(guī)篩選方法。2、以彩色圖像形式提供篩選結(jié)果，形象直觀，易于辨識和記憶。3、篩選過程以薄層板為媒介，不受溶劑和樣品濃度的限制，使得受試樣品的種類更為廣泛。4、能從天然藥物中快速篩選出具有抑制脂肪酶活性的成分，而且相對與合成藥物，該天然脂肪酶抑制劑的價格相對低廉， 副作用小，使消費者獲得更大益處。


圖I為實施例
圖2為實施例
圖3為實施例
圖4為實施例
圖5為實施例
圖6為實施例
圖7為實施例
圖8為實施例I中兩種北沙參提取物的活性篩選結(jié)果圖。 2中奧利司他的活性檢測結(jié)果圖 3中奧利司他的檢測限檢測結(jié)果圖。4中齊墩果酸的活性篩選結(jié)果圖。5中迷迭香酸的活性篩選結(jié)果圖。6中木犀草素的活性篩選結(jié)果圖。7中葡萄籽水提物的活性篩選結(jié)果圖。8中白藜蘆醇的活性篩選結(jié)果圖。4
圖9為實施例9中β -谷甾醇的活性篩選結(jié)果圖。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步說明
實施例I
酶促緩沖液的配制準(zhǔn)確稱量三羥甲基氨基甲烷粉末I. 212g和無水氯化鈣粉末 O. 455g溶劑于去離子水中，用鹽酸調(diào)節(jié)混合液的pH值至6. 5，用去離子水將溶液最終定容至500mL，配制成三羥甲基氨基甲烷濃度為20mmol/L的酶促反應(yīng)緩沖液(pH=6. 5)，置于 2-4 °C冰箱中保存、備用。
底物溶液的配制將肉豆蘧酸-2-萘酯粉末溶于石油醚溶解中，配制成濃度為 16mmol/L的底物溶液。
脂肪酶溶液的配制在上述酶促緩沖液中加入豬胰脂肪酶，配制成濃度為lOu/mL 的溶液。
顯色劑溶液的配制將固藍(lán)B鹽粉末溶于去離子水中，配制成濃度為O. 5mg/mL的顯色劑溶液。
供試品溶液的制備分別稱取兩種北沙參藥材細(xì)粉(選自安徽亳州藥材市場)各 2g，分別加入體積濃度為95 %的甲醇溶液50mL，超聲波處理30分鐘后過濾、濾液棄去，在藥渣中加入ImL甲醇溶液溶解，得到兩種北沙參供試品溶液。
將上述供試品溶液分別點于兩塊娃膠板上，點樣量均為20 μ L,然后將娃膠板置于層析缸中展開后，展開劑為體積比為2:1的石油醚與乙酸乙酯的混合液，取出硅膠板并揮干展開劑，備用。
將上述硅膠板浸潰于底物溶液中，揮干溶劑后再浸潰于脂肪酶溶液中，然后將硅膠板放置于26°C條件下反應(yīng)6分鐘。反應(yīng)完成后將硅膠板浸潰于顯色劑中，26°C條件下顯色反應(yīng)15分鐘。
結(jié)果見附圖I所示，具有抑制脂肪酶活性的物質(zhì)，發(fā)生了抑制反應(yīng)的在薄層板上表現(xiàn)為紫色背景下的白色和/或棕黃色斑點。
實施例2
酶促緩沖液的配制準(zhǔn)確稱量三羥甲基氨基甲烷粉末3. 029g和無水氯化鈣粉末O.91g溶劑于去離子水中，用鹽酸調(diào)節(jié)混合液的pH值至7. 8，用去離子水將溶液最終定容至 500mL，配制成50mmol/L的酶促反應(yīng)緩沖液(PH=7. 8)，置于2_4°C冰箱中保存。
底物溶液的配制將肉豆蘧酸-2-萘酯粉末溶于石油醚溶解中，分別配制成濃度為O. 25mmol/L和350mmol/L的底物溶液。
脂肪酶溶液將上述酶促緩沖液中加入豬胰脂肪酶，分別配制成濃度為5u/ml和 200u/ml的溶液。
顯色劑溶液的配制將固藍(lán)B鹽粉末溶于去離子水中，分別配置成濃度為O. Img/ ml和100mg/ml的顯色劑溶液。
供試品溶液的制備將奧利司他(Orlistat，04139-25MG)粉末溶于濃度為95%的乙醇溶解中，配制成O. 05mmol/L的奧利司他溶液(根據(jù)現(xiàn)有文獻記載，該物質(zhì)具有脂肪酶抑制效果)。
將供試品溶液分別點于2塊硅膠板上，每板平行點3點，點樣量均為I μ L，無需展開，揮干溶劑，備用。
將上述一塊硅膠板浸潰于O. 25底物溶液中，揮干溶劑后再浸潰于5u/ml的脂肪酶溶液中，取出置于20°C環(huán)境條件下反應(yīng)60分鐘，反應(yīng)完成后將其浸潰于O. lmg/mL的顯色劑中，40°C條件下顯色反應(yīng)5分鐘。結(jié)果見圖2中A圖所示。
將上述另一塊硅膠板浸潰于350mmol/L底物溶液中，揮干溶劑后再分別浸潰于 200u/ml的脂肪酶溶液中，取出置于20°C環(huán)境條件下反應(yīng)60分鐘，反應(yīng)完成后將其浸潰于 100mg/mL的顯色劑中，40°C條件下顯色反應(yīng)5分鐘。結(jié)果見圖2中B圖所示。
根據(jù)圖2所示，具有抑制脂肪酶活性的物質(zhì)，發(fā)生抑制反應(yīng)的在薄層板上表現(xiàn)為紫色背景下的白色斑點。
實施例3
酶促緩沖液的配制準(zhǔn)確稱量三羥甲基氨基甲烷粉末3. 029g和無水氯化鈣粉末O.91g溶劑于去離子水中，用鹽酸調(diào)節(jié)混合液的pH值至7.0，用去離子水將溶液最終定容至 500mL，配制成10mmol/L的酶促反應(yīng)緩沖液(PH=7. 0)，置于2_4°C冰箱中保存。
底物溶液的配制將肉豆蘧酸-2-萘酯粉末溶于石油醚溶解中，配制成濃度為 25mmol/L的底物溶液。
脂肪酶溶液將上述酶促緩沖液中加入豬胰脂肪酶，配制成濃度為35u/ml的溶液。
顯色劑溶液的配制將固藍(lán)B鹽粉末溶于去離子水中，配置成濃度為O. 2mg/ml的顯色劑溶液。
供試品溶液的制備將奧利司他(Orlistat，04139-25MG)粉末溶于濃度為95%的乙醇溶解中，配制成4X 10_8mol/L，2X 10_8mol/L，I X 10_8mol/L的奧利司他溶液。
將不同濃度的供試品溶液分別點于3塊硅膠板上，每板平行點3點，點樣量均為Iμ L，無需展開，揮干溶劑，制得奧利司他硅膠板，備用。
將上述3塊硅膠板分別浸潰于底物溶液中，揮干溶劑后再分別浸潰于脂肪酶溶液中，取出置于37°C環(huán)境條件下反應(yīng)45分鐘，反應(yīng)完成后將3塊硅膠板浸潰于顯色劑中，37°C 條件下顯色反應(yīng)8分鐘。
結(jié)果見附圖3所示，具有抑制脂肪酶活性且達(dá)到檢測濃度的物質(zhì)，發(fā)生抑制反應(yīng)的在薄層板上表現(xiàn)為紫色背景下的白色斑點。
實施例4
酶促緩沖液的配制準(zhǔn)確稱量三羥甲基氨基甲烷粉末6. 058g和無水氯化鈣粉末2.275g溶于去離子水中，用鹽酸調(diào)節(jié)混合液的pH值至7. 8，用去離子水將溶液最終定容至 500mL，配制成100mmol/L的酶促反應(yīng)緩沖液(PH=7. 8)，置于2_4°C冰箱中保存。
底物溶液的配制將肉豆蘧酸-2-萘酯粉末溶于石油醚中，配制成濃度為 200mmol/L的底物溶液
脂肪酶溶液將上述酶促緩沖液中加入豬胰脂肪酶，配制成濃度為25u/mL的溶液。
顯色劑溶液的配制將固藍(lán)B鹽粉末溶于去離子水中，配置成濃度為70mg/mL的顯色劑溶液。
對照品溶液的制備將奧利司他粉末溶于體積濃度為95%的乙醇溶液中，配制成濃度為O. 008mmol/L的對照品溶液。
供試品溶液的制備將齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品(自上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心)溶于體積濃度95%的乙醇溶液中，配制成O. 161mmol/L的齊墩果酸供試品溶液。
將對照品溶液和供試品溶液點樣于一塊硅膠板上，平行點3點，對照品點樣量為1μ L，供試品點樣量為3 μ L，無需展開，揮干溶劑備用，制得齊墩果酸硅膠板。
將上述硅膠板在底物溶液中浸潰，揮干溶劑后再浸于25u/mL的脂肪酶溶液中，取出置于30°C環(huán)境條件下反應(yīng)36分鐘。反應(yīng)完成后將硅膠板浸潰于顯色劑中，36°C條件下顯色反應(yīng)25分鐘。
結(jié)果見附圖4所示，具有抑制脂肪酶活性的物質(zhì)，發(fā)生抑制反應(yīng)的在薄層板上表現(xiàn)為紫色背景下的白色斑點。
實施例5
酶促緩沖液的配制準(zhǔn)確稱量三羥甲基氨基甲烷粉末I. 515g和無水氯化鈣粉末0.569g溶于去離子水中，用鹽酸調(diào)節(jié)混合液的pH值至6. 5,用去離子水將溶液最終定容至 500mL，配制成25mmol/L的酶促反應(yīng)緩沖液(PH=6. 5)，置于2_4°C冰箱中保存
底物溶液的配制將肉豆蘧酸-2-萘酯粉末溶于石油醚中，配制成濃度為 180mmol/L的底物溶液
脂肪酶溶液將上述酶促緩沖液中加入豬胰脂肪酶，配制成濃度為200u/mL的溶液。
顯色劑溶液的配制將固藍(lán)B鹽粉末溶于去離子水中，配置成濃度為55mg/mL的顯色劑溶液。
對照品溶液的制備將奧利司他粉末溶于體積濃度為95%的乙醇溶液中，配制成濃度為I. Ommol/L的對照品溶液。
供試品溶液的制備將迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品(自上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心)溶于體積濃度95%的乙醇溶液中，配制成O. 0782mmol/L的迷迭香酸供試品溶液。
將對照品溶液和供試品溶液點樣于一塊硅膠板上，平行點3點，對照品點樣量為2μ L，供試品點樣量為I μ L，無需展開，揮干溶劑備用，制得迷迭香酸硅膠板。
將上述硅膠板在底物溶液中浸潰，揮干溶劑后再浸于200u/mL的脂肪酶溶液中， 取出置于35°C環(huán)境條件下反應(yīng)18分鐘。反應(yīng)完成后將硅膠板浸潰于顯色劑中，27°C條件下顯色反應(yīng)42分鐘。
結(jié)果見附圖5所示，具有抑制脂肪酶活性的物質(zhì)，發(fā)生抑制反應(yīng)的在薄層板上表現(xiàn)為紫色背景下的白色斑點。
實施例6
酶促緩沖液的配制準(zhǔn)確稱量三羥甲基氨基甲烷粉末3. 030g和無水氯化鈣粉末1.138g溶于去離子水中，用鹽酸調(diào)節(jié)混合液的pH值至6. 8，用去離子水將溶液最終定容至 500mL，配制成50mmol/L的酶促反應(yīng)緩沖液(PH=6. 8)，置于2_4°C冰箱中保存
底物溶液的配制將肉豆蘧酸-2-萘酯粉末溶于石油醚中，配制成濃度為25mmol/ L的底物溶液
脂肪酶溶液將上述酶促緩沖液中加入豬胰脂肪酶，配制成濃度為70u/mL的溶7液。
顯色劑溶液的配制將固藍(lán)B鹽粉末溶于去離子水中，配置成濃度為3mg/mL的顯色劑溶液。
對照品溶液的制備將奧利司他粉末溶于體積濃度為95%的乙醇溶液中，配制成濃度為O. 005mmol/L的對照品溶液。
供試品溶液的制備將木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品(購自上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心)溶于體積濃度95%的乙醇溶液中，配制成O. 156mmol/L的木犀草素供試品溶液。
將對照品溶液和供試品溶液點樣于一塊硅膠板上，平行點3點，對照品點樣量為 5 μ L，供試品點樣量為I μ L，無需展開，揮干溶劑備用，制得木犀草素硅膠板。
將上述硅膠板在底物溶液中浸潰，揮干溶劑后再浸于70u/mL的脂肪酶溶液中，取出置于39°C環(huán)境條件下反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)完成后將硅膠板浸潰于顯色劑中，25°C條件下顯色反應(yīng)50分鐘。
結(jié)果見附圖6所示，具有抑制脂肪酶活性的物質(zhì)，發(fā)生抑制反應(yīng)的在薄層板上表現(xiàn)為紫色背景下的棕黃色斑點。
實施例7
酶促緩沖液的配制準(zhǔn)確稱量三羥甲基氨基甲烷粉末I. 515g和無水氯化鈣粉末1.138g溶于去離子水中，用鹽酸調(diào)節(jié)混合液的pH值至7. 5，用去離子水將溶液最終定容至 500mL，配制成50mmol/L的酶促反應(yīng)緩沖液(PH=7. 5)，置于2_4°C冰箱中保存
底物溶液的配制將肉豆蘧酸-2-萘酯粉末溶于石油醚中，配制成濃度為5mmol/L 的底物溶液
脂肪酶溶液將上述酶促緩沖液中加入豬胰脂肪酶，配制成濃度為90u/mL的溶液。
顯色劑溶液的配制將固藍(lán)B鹽粉末溶于去離子水中，配置成濃度為7mg/mL的顯色劑溶液。
對照品溶液的制備將奧利司他粉末溶于體積濃度為95%的乙醇溶液中，配制成濃度為I. Ommol/L的對照品溶液。
供試品溶液的制備將葡萄籽水提物(購自四川同泰植物化工有限公司)溶于蒸餾水中，配制成20mg/mL的葡萄籽水提物供試品溶液。
將對照品溶液和供試品溶液點樣于一塊硅膠板上，平行點3點，對照品點樣量為 5 μ L，供試品點樣量為8 μ L，無需展開，揮干溶劑備用，制得葡萄籽水提物硅膠板。
將上述硅膠板在底物溶液中浸潰，揮干溶劑后再浸于90u/mL的脂肪酶溶液中，取出置于37°C環(huán)境條件下反應(yīng)10分鐘。反應(yīng)完成后將硅膠板浸潰于顯色劑中，35°C條件下顯色反應(yīng)5分鐘。
結(jié)果見附圖7所示，具有抑制脂肪酶活性的物質(zhì)，發(fā)生抑制反應(yīng)的在薄層板上表現(xiàn)為紫色背景下的棕黃色斑點。
實施例8
酶促緩沖液的配制準(zhǔn)確稱量三羥甲基氨基甲烷粉末6. 058g和無水氯化鈣粉末2.275g溶于去離子水中，用鹽酸調(diào)節(jié)混合液的pH值至7. 5，用去離子水將溶液最終定容至 500mL，配制成lOOmmol/L的酶促反應(yīng)緩沖液(PH=7. 5)，置于2_4°C冰箱中保存。
底物溶液的配制將肉豆蘧酸-2-萘酯粉末溶于石油醚中，配制成濃度為90mmol/ L的底物溶液
脂肪酶溶液將上述酶促緩沖液中加入豬胰脂肪酶，配制成濃度為90u/mL的溶液。
顯色劑溶液的配制將固藍(lán)B鹽粉末溶于去離子水中，配置成濃度為30mg/mL的顯色劑溶液。
對照品溶液的制備將奧利司他粉末溶于體積濃度為95%的乙醇溶液中，配制成濃度為O. lmmol/L的對照品溶液。
供試品溶液的制備將白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品(自上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心)溶于體積濃度95%的乙醇溶液中，配制成I. 25mmol/L的白藜蘆醇供試品溶液。
將對照品溶液和供試品溶液點樣于一塊硅膠板上，平行點3點，對照品點樣量為 I μ L，供試品點樣量為2 μ L，無需展開，揮干溶劑備用，制得白藜蘆醇硅膠板。
將上述硅膠板在底物溶液中浸潰，揮干溶劑后再浸于90u/mL的脂肪酶溶液中，取出置于37°C環(huán)境條件下反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)完成后將硅膠板浸潰于顯色劑中，30°C條件下顯色反應(yīng)35分鐘。
結(jié)果見附圖8所示，無抑制脂肪酶活性的物質(zhì)，在薄層板上表現(xiàn)為紫色背景下的深紫色斑點。
實施例9
酶促緩沖液的配制準(zhǔn)確稱量三羥甲基氨基甲烷粉末4. 545g和無水氯化鈣粉末I.707g溶于去離子水中，用鹽酸調(diào)節(jié)混合液的pH值至7. 0，用去離子水將溶液最終定容至 500mL，配制成75mmol/L的酶促反應(yīng)緩沖液(PH=7. 0)，置于2_4°C冰箱中保存。
底物溶液的配制將肉豆蘧酸-2-萘酯粉末溶于石油醚中，配制成濃度為15mmol/ L的底物溶液。
脂肪酶溶液將上述酶促緩沖液中加入豬胰脂肪酶，配制成濃度為45u/mL的溶液。
顯色劑溶液的配制將固藍(lán)B鹽粉末溶于去離子水中，配置成濃度為17mg/mL的顯色劑溶液。
對照品溶液的制備將奧利司他粉末溶于體積濃度為95%的乙醇溶液中，配制成濃度為O. 03mmol/L的對照品溶液。
供試品溶液的制備將β-谷甾醇準(zhǔn)品(自上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心)溶于體積濃度95%的乙醇溶液中，配制成O. 312mmol/L的β -谷甾醇溶液。
將對照品溶液和供試品溶液點樣于一塊硅膠板上，平行點3點，對照品點樣量為 5 μ L，供試品點樣量為5 μ L，無需展開，揮干溶劑備用，制得β -谷甾醇硅膠板。
將上述硅膠板在底物溶液中浸潰，揮干溶劑后再浸于45u/mL的脂肪酶溶液中，取出置于37°C環(huán)境條件下反應(yīng)20分鐘。反應(yīng)完成后將硅膠板浸潰于顯色劑中，40°C條件下顯色反應(yīng)20分鐘。
結(jié)果見附圖9所示，無抑制脂肪酶活性的物質(zhì)，在薄層板上表現(xiàn)為紫色背景下無斑點產(chǎn)生。
權(quán)利要求
1.一種脂肪酶抑制劑的篩選方法，其特征在于所述篩選方法為薄層色譜生物自顯影法，其步驟包括(1)將供試品溶解于水或有機溶劑或水與有機溶劑的混合物中，然后將供試品溶液點涂于薄層板上，并將該板放入展開劑中展開、取出、晾干、備用；(2)將步驟(I)中得到的薄層板浸潰于底物溶液中，揮干溶劑后再浸潰于脂肪酶溶液中，取出薄層板并置于溫度為20°C -40°C條件下進行酶促反應(yīng)，待反應(yīng)完全后將薄層板浸潰于顯色劑溶液中進行顯色反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種脂肪酶抑制劑的篩選方法，其特征在于所述薄層板為娃膠板。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種脂肪酶抑制劑的篩選方法，其特征在于所述步驟(I)中的供試品溶液的點樣量為1-20 μ L,供試品的點樣量為10pg-lmg。。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種脂肪酶抑制劑的篩選方法，其特征在于所述步驟(I)中所述的展開劑為石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸、氨水、醋酸銨中的一種或幾種的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種脂肪酶抑制劑的篩選方法，其特征在于所述底物溶液為肉豆蘧酸-2-萘酯石油醚溶液，其中肉豆蘧酸-2-萘酯溶液的濃度為O. 25-350mmol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種脂肪酶抑制劑的篩選方法，其特征在于所述步驟(2) 中的脂肪酶溶液的配制方法是，先將三羥甲基氨基甲烷和無水氯化鈣粉按照重量比為2.5-4. 5:1的配比溶于去離子水中，調(diào)節(jié)混合液的pH值為6. 5-8. 0，配制成三羥甲基氨基甲烷摩爾濃度為20-100mmol/L的酶促反應(yīng)緩沖液；將脂肪酶加入所述酶促反應(yīng)緩沖液中，配制成脂肪酶濃度為5-200u/mL的脂肪酶溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種脂肪酶抑制劑的篩選方法，其特征在于所述顯色劑溶液為固藍(lán)B鹽溶液，濃度為O. 1-lOOmg/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種脂肪酶抑制劑的篩選方法，其特征在于所述步驟(2)中的酶促反應(yīng)時間為5-60分鐘，顯色反應(yīng)時間為5-60分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種脂肪酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，顯色反應(yīng)后，在薄層板的紫色背景下出現(xiàn)白色斑點和棕黃色斑點中至少一種的為脂肪酶抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種脂肪酶抑制劑的篩選方法，具體涉及一種利用薄層色譜生物自顯影技術(shù)篩選脂肪酶抑制劑的方法，將供試品溶解于水和/或有機溶劑中，然后將供試品溶液點涂于薄層板上，并將該板放入展開劑中展開、取出、晾干、備用；將上述步驟中得到的薄層板浸漬于底物溶液中，揮干溶劑后再浸漬于脂肪酶溶液中，取出薄層板并置于溫度為20℃-40℃條件下進行酶促反應(yīng)，待反應(yīng)完全后將薄層板浸漬于顯色劑溶液中進行顯色反應(yīng)，得到紫色背景下的白色和/或棕黃色斑點結(jié)果圖。所述脂肪酶抑制劑的篩選方法不需要復(fù)雜的儀器和設(shè)備，操作簡單，實驗耗費低，適合一般實驗室操作，而且靈敏度和專屬性高于常規(guī)篩選方法，篩選結(jié)果直觀、易于辨識和記憶。
文檔編號G01N30/90GK102980969SQ20121049228
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月27日
發(fā)明者吳弢, 唐吉鶴, 陶宏迅 申請人:上海中醫(yī)藥大學(xué)