O-磷酸絲氨酸巰解酶突變體以及利用其生產(chǎn)半胱氨酸的方法
【專利說明】〇-磷酸絲氨酸巰解酶突變體以及利用其生產(chǎn)半胱氨酸的 方法
[0001] 本申請要求2010年10月20日提交的韓國專利申請10-2010-0102665的優(yōu)先權(quán)； 本申請是國際申請日為2011年10月14日的中國專利申請No. 201180002041.9的分案申 請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及一種具有源自恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis)的對應(yīng)于 SEQ ID NO: 1氨基酸序列的0-磷酸絲氨酸巰解酶（又稱"0PSS"）突變體，其缺失三至七個 C-末端氨基酸殘基。本發(fā)明還涉及編碼該0PSS突變體的核酸分子、含有該核酸分子的表 達(dá)載體以及利用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化體。此外，本發(fā)明涉及一種在0PSS突變體存在 下，通過0-磷酰-L-絲氨酸（0PS)與硫化物發(fā)生反應(yīng)生產(chǎn)半胱氨酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 半胱氨酸是一種在所有生物體中的硫代謝過程中起重要作用的氨基酸。它用于蛋 白，如發(fā)角蛋白、谷胱甘肽、生物素、蛋氨酸和其它含硫代謝產(chǎn)物的生物合成，以及作為輔酶 A的前體。此外，已知半胱氨酸的生物合成與其它氨基酸，包括L-絲氨酸、L-甘氨酸和L-蛋 氨酸的生物合成密切相關(guān)。工業(yè)上，L-半胱氨酸及其衍生物被應(yīng)用于多種領(lǐng)域包括制藥業(yè) (用于治療支氣管疾病）、化妝品行業(yè)（洗發(fā)水、燙發(fā)用組合物等），以及食品行業(yè)（抗氧化 劑、調(diào)味劑、面團(tuán)助劑（dough aids)等）。
[0004] 傳統(tǒng)上，L-半胱氨酸在工業(yè)上是通過酸水解人類頭發(fā)或動物羽毛而獲得（Ko Aida 編，氨基酸生產(chǎn)的生物技術(shù)（Biotechnology of the Amino Acids Production)，p 217-223,1986)。然而，不僅由頭發(fā)或羽毛生產(chǎn)的半胱氨酸確實產(chǎn)量低至7-8%，而且使用鹽 酸或硫酸產(chǎn)生了大量的環(huán)境污染物。此外，消費者可能對從頭發(fā)或羽毛提取具有強(qiáng)烈的反 感。這些問題對于開發(fā)環(huán)保的L-半胱氨酸生產(chǎn)方法形成推動，導(dǎo)致了利用微生物發(fā)酵生產(chǎn) L-半胱氨酸。
[0005] 微生物生產(chǎn)L-半胱氨酸中的代表是利用微生物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化D, L-ATC (Ryu 0H，Ju JY,和 Shin CS,生物化學(xué)方法（Process Biochem.), 32:201-209, 1997)。然而，由 于D，L-ATC前體的低溶解度，該轉(zhuǎn)換方法難以適用于工業(yè)。另一種L-半胱氨酸的生產(chǎn)方 法是用大腸桿菌直接發(fā)酵（專利號EP 0885962B;Wada M *TakagiH，Appl.Microbiol. Biochem.，73:48-54, 2006)。微生物中L-半胱氨酸的過度積累產(chǎn)生胞內(nèi)毒性，導(dǎo)致高濃度 L-半胱氨酸的生產(chǎn)受限。為了克服這一缺陷，使用了 L-半胱氨酸轉(zhuǎn)運蛋白，然而產(chǎn)量沒有 出現(xiàn)顯著改善。
[0006] 關(guān)于L-半胱氨酸在細(xì)菌和植物中的生物合成途徑，0-乙酰絲氨酸（0AS) 作為中間體前體提供L-半胱氨酸的碳骨架（Kredich NM和Tomkins GM，J. Biol. Chem.，241:4955-4965, 1966)。酶0-乙酰絲氨酸巰解酶（0ASS)，用硫化氫作為硫供體，催化 0-乙酰絲氨酸向硫胱氨酸的轉(zhuǎn)化，最后生成半胱氨酸，釋放乙酸?；蛘?，S0 4可被還原成硫 代硫酸鹽用作半胱氨酸生產(chǎn)中的硫供體（Nakamura T，Kon Y，Iwahashi H,和Eguchi Y，J. Bacteriol.，156:656-662, 1983)。經(jīng)由OAS的半胱氨酸生物合成途徑使用兩種酶，催化絲 氨酸向0AS轉(zhuǎn)化的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（CysE)，催化0AS向半胱氨酸轉(zhuǎn)化的半胱氨酸合酶 (CysK)。值得注意的是，其中絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（CysE)對終產(chǎn)物半胱氨酸的反饋抑制高度 敏感（Wada M和 Takagi H，Appl. Microbiol. Biochem.，73:48-54, 2006)。因此，需要對反饋 抑制不敏感的改變的酶，但是其很難開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 技術(shù)問題
[0008] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中遇到的問題，本發(fā)明人對高產(chǎn)L-半胱氨酸進(jìn)行了深入和徹 底的研宄，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在超嗜熱古菌（Aeropyrumpernix)、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis)和陰道毛滴蟲（Trichomonasvaginalis)中存在著米用〇-磷酰-L-絲 氨酸（0PS)特異性途徑而非0AS-特異性途徑來合成L-半胱氨酸的0-磷酸絲氨 酸巰解酶（〇PSS)(MinoK和IshikawaK，F(xiàn)EBSletters，55l:l33_l38,2〇〇3;Burns KE,BaumgartS,DorresteinPC,ZhaiH,McLaffertyFff,和BegleyTP,J.Am.Chem. Soc.，127:11602-11603,2005;Westrop⑶，GoodallG，MottramJC，和CoombsGH，J.Biol. Chem.，281:25062-25075, 2006)，結(jié)核分枝桿菌的0PSS與額外的酶mec+和cysO-起催化 OPS向半胱氨酸的轉(zhuǎn)化，當(dāng)其被去除五個C-末端氨基酸殘基時，即使額外的酶不存在時也 可利用Na2S作為硫供體使0PS轉(zhuǎn)化成半脫氨酸（AgrenD,SchnellR和SchneiderG,FEBS letters, 583:330-336, 2009)，從而實現(xiàn)本發(fā)明。
[0009] 技術(shù)方案
[0010] 因此，本發(fā)明的目的是提供一種具有源自恥垢分枝桿菌的對應(yīng)于SEQ ID N0 :1的 氨基酸序列的0-磷酸絲氨酸巰解酶（又稱"0PSS"）突變，其缺失三至七個C-末端氨基酸 殘基。
[0011] 本發(fā)明另一個目的是提供編碼該0PSS突變體的核酸分子。
[0012] 本發(fā)明又一個目的是提供含有該核酸分子的表達(dá)載體。
[0013] 本發(fā)明還一個目的是提供用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化體。
[0014] 本發(fā)明又一個目的是提供一種在0PSS突變體存在下，用硫化物使0-磷酰-L-絲 氨酸轉(zhuǎn)化成半胱氨酸的方法。
[0015] 有益效果
[0016] 如上所述，酶活性提高的0PSS突變體對于由0-磷酸絲氨酸向L-半胱氨酸的酶轉(zhuǎn) 化是必不可少的，其可用于以簡單的方式大規(guī)模由0PS高產(chǎn)L-半胱氨酸。
【附圖說明】
[0017] 圖1所示為根據(jù)溫度的0PSS活性。
[0018] 圖2所示為0PSS對pH的敏感性的組圖。
[0019] 圖3所示為通過SDS PAGE分析的pET系統(tǒng)和pCL-Pcjl系統(tǒng)中酶的表達(dá)水平的照 片。
[0020] 圖4所示為將純化的0PS發(fā)酵培養(yǎng)液轉(zhuǎn)化成半胱氨酸的0PSS的酶活性。
[0021] 圖5所示為將OPS發(fā)酵培養(yǎng)液轉(zhuǎn)化成半胱氨酸的0PSS的酶活性。
[0022] 圖6所示為1L發(fā)酵罐中以0PS作為底物，通過0PSS轉(zhuǎn)化的0PS和半胱氨酸的生 產(chǎn)。
[0023] 圖7為含有編碼0PSS突變體的基因的pCL-Pcjl表達(dá)載體的示意圖。
[0024] 最佳實施方式
[0025] 按照其中一個方面，本發(fā)明提供一種源自恥垢分枝桿菌的具有SEQ ID N0 :1的氨 基酸序列的0PSS突變體，其較野生型0-磷酸絲氨酸巰解酶氨基酸序列缺少3~7個C-末 端氨基酸殘基。
[0026] 在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的0PSS突變體可具有SEQ ID N0S:2、3和4中 的一個氨基酸序列。具有SEQ ID N0 :2氨基酸序列的0PSS突變體可被進(jìn)一步修飾成77位 脯氨酸殘基（Pro)被絲氨酸殘基（Ser)取代。此外，具有SEQ ID N0:2氨基酸序列的0PSS 突變體可被進(jìn)一步修飾成131位蘇氨酸殘基（Thr)被丙氨酸殘基（Ala)取代，137位賴氨酸 殘基（Lys)被天冬酰胺殘基（Asp)取代，以及238位蘇氨酸殘基（Thr)被絲氨酸殘基（Ser) 取代。此外，與上述突變體的氨基酸序列同源性至少為50 %，優(yōu)選60 %、70 %、75 %和80 %， 更優(yōu)選85%、90%和95%，最優(yōu)選97%至99%的氨基酸序列落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0027] 術(shù)語"恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatics) "是指放線菌門中的桿狀菌株， 其為扁平的、直的或稍彎的，有不規(guī)則的分支，可被堿性染料苯胺染色。在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)當(dāng) 其氨基酸序列被修飾時，來自該菌株的〇-磷酸絲氨酸巰解酶能夠催化L-半胱氨酸以提高 的產(chǎn)量生物合成。
[0028] 如本文所使用，術(shù)語"0-磷酸絲氨酸巰解酶（0PSS) "是指催化0PS轉(zhuǎn)換成半胱氨酸 的酶。該酶首次發(fā)現(xiàn)于超嗜熱古菌（Aeropyrum pernix)中并被命名（Mino K和Ishikawa K，F(xiàn)EBS letters, 551:133-138, 2003, SEQ ID NO:6)。
[0029] 可使用各種眾所周知的方法獲得0PSS。這些方法的示例包括但不限于，基于密碼 子優(yōu)化的基因合成技術(shù)，通過該技術(shù)能獲得高產(chǎn)的目的酶，以及根據(jù)微生物遺傳信息的大 量儲存，利用生物信息學(xué)方法篩選有用的酶資源。在本發(fā)明的一個實施方案中，利用0PS作 為底物合成半胱氨酸的0PSS酶是從各種微生物中篩選到的。為此，使用合適的培養(yǎng)基及本 領(lǐng)域已知的培養(yǎng)條件獲得細(xì)胞沉淀（經(jīng)裂解），然后通過對含酶上清液的純化來提供0PSS 酶。
[0030] 如本文所使用，術(shù)語"突變體"是指顯示出遺傳或非遺傳表型的穩(wěn)定改變的培養(yǎng)物 或個體。當(dāng)與0PSS(0-磷酸絲氨酸巰解酶）結(jié)合使用時，術(shù)語"突變體"是指發(fā)生遺傳改變， 從而與野生型相比，活性得到有效提高